OPBC G03 C0542 (526) ProC® Ac R Screening test for APC resistance Russell Viper Venom-based screening test for the determination of resistance to Activated Protein C that may be caused by the FV (Leiden) gene defect. Stability of the sample at +2 to +8 °C 4 hours (fresh plasma) at -30 °C 6 months (if platelets are removed by double centrifugation prior to freezing). Intended Use Procedure The Dade Behring ProC® Ac R Test is a functional clotting test intended for screening of resistance to Activated Protein C (APC) in plasma from individuals with the Factor V (Leiden) defect. It can also be performed on plasma from patients on stabilized oral anticoagulant or heparin therapy. Manual: Test with activator: 1. Pre-warm a sufficient amount of PR3V Reagent, allowing 0.1 mL per test, to +37 ± 1 °C in a reagent reservoir. 2. Dispense 0.1 mL test plasma into a test tube. 3. Add 0.1 mL Activator to the test plasma and incubate for exactly 5 minutes at +37 ± 1 °C. 4. Add 0.1 mL of the PR3V Reagent prewarmed to +37 ± 1 °C, start the stop watch immediately and determine the clotting time. 5. Repeat the measurement for double determination and report the average of both determinations as the result. Summary and Explanation Activated Protein C Resistance (APC Resistance) is associated with a point mutation in the Factor V gene [e.g. Factor V (Leiden)]. The mutation results in the replacement of the amino acid Arginine 506 (R) with glutamine (Q) in the Factor V protein 1. This mutation slows the inactivation of factor Va by APC, causing a hypercoagulable state. The presence of Factor V (Leiden) is the most common cause of inherited thrombophilia, accounting for 20 - 50% of all cases.2 Principle of the Method The Dade Behring ProC® Ac R Test is based on the activation of endogenous Protein C by incubation of plasma with Agkistrodon contortrix contortrix (Southern Copperhead) venom. A dilute "Russell’s Viper Venom Time" (DRVVT, snake venom activator for Factor X) is then performed on the plasma. The DRVVT is sensitive to changes in concentration of Activated Protein C. In normal individuals, activation of their Protein C prolongs the result two- to three-fold, compared to plasma without activator. In individuals with Factor V (Leiden), the venom activation of Protein C induces only marginal prolongation of the result (usually less than 1.5 times the plasma without activator). To minimize the effect of other clotting variables, a ratio of clotting times obtained with and without venom activation should be determined. Activated Protein C resistance may also be caused by other mutations in the factor V gene [e.g. FV (Cambridge) and FV (Hong Kong)]. Reagents Materials provided ProC® Ac R Test Test Kit, Code No. OPBC with 5 x for 4.0 mL PR3V Reagent 5 x for 2.0 mL Activator Reagent Sufficient to perform 100 manual clotting assays (100 tests with activator and 100 tests without activator). Note: The number of tests obtained with specific coagulation analyzers may vary. Composition: Activator Reagent: Lyophylisate, contains Agkistrodon contortrix contortrix venom (< 0.1 g/L) in stabilizing-buffer solution. Preservative: sodium azide (< 0.01%) PR3V Reagent: Lyophilisate, contains diluted phospholipid rich Vipera Russeli venom (< 1 mg/L), plant derived phospholipids (< 10 g/L), calcium (0.1 M) and a heparin inhibitor (< 0.5 g/L). Preservative: sodium azide (< 0.01%) Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use only. 2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explosive azides if it comes into contact with heavy metals such as copper or lead. Preparation of the Reagents • Reconstitute Activator in 2.0 mL distilled or deionized water without preservatives, as indicated on the vial’s label. The reconstituted product should be a clear, pale green solution with no apparent particles. • Reconstitute PR3V Reagent in 4.0 mL distilled or deionized water without preservatives, as indicated on the vial’s label. The reconstituted product should be a translucent, pale solution with no apparent particles. • Gently invert to mix. Do not shake! • Incubate for 10 minutes at room temperature (+15 to + 25 °C) before use. • Mix reagents again carefully before use. Storage and Stability Freeze dried reagents must be stored at +2 to +8 °C and are stable up to the date indicated on the label. Stability after reconstitution (closed vial) Temperature: ProC® Ac R ProC® Ac R Activator PR3V Reagent at +2 to +8 °C 2 weeks 2 weeks at +20 to +25 °C 12 days 12 days at +37 °C 6 hours 6 hours at -20 °C 2 weeks 2 weeks Indication of expiration: If there is no evidence of a vacuum when the reagent vial is opened and/ or the reagent does not appear dry, it should be returned to Dade Behring. If reconstituted products show clear signs of particles or contamination or if they do not dissolve completely within 15 minutes of the addition of distilled or deionized water, please contact Dade Behring or your distributor. Do not freeze and then thaw again more than once after reconstitution! Materials required but not provided in the kit Sodium citrate (0.11 M or 3.2%) for blood collection Control Plasma N, Code No. ORKE ProC® Control Plasma, Code No. OQKE Distilled or deionized water without preservatives Plastic test tubes Pipettes for the exact measuring of 100 µL, 2.0 mL and 4.0 mL Water bath, maintained at +37 °C Timer or stop watch Physiological saline solution (0.15 M sodium chloride) for use with the BCS® coagulation analyzer Dade® CA System Buffer for use with Sysmex® CA Systems, Code No. B4265 or Dade® Owren’s Veronal Buffer, Code No. B4234 Coagulation analyzer (see ”Limitations of the Test Procedure”) Equipment The Dade Behring ProC® Ac R Test may be perform manually or with a multitude of coagulation analyzers. Observe the operating instructions of the instrument’s manufacturer! Specimen collection and preparation Important: Treat all plasmas as potentially infectious! To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution (0.11 M) with 9 parts freshly collected venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately for 10 minutes at 1,500 x g and pipette off the supernatant plasma. When separating the plasma, take care that no platelets are pipetted off as well. If the sample is to be frozen, centrifuge the separated plasma again and freeze immediately. OPBC G03 C0542 (526) H/CS 1 Test without activator: 1. Pre-warm a sufficient amount of PR3V Reagent, allowing 0.1 mL per test, to +37 ± 1 °C in a reagent reservoir. 2. Dispense 0.1 mL test plasma into a test tube. 3. Add 0.1 mL saline solution to the test plasma and incubate for exactly 5 minutes at +37 ± 1 °C. 4. Add 0.1 mL of the PR3V Reagent prewarmed to +37 ± 1 °C, start the stop watch immediately and determine the clotting time. 5. Repeat the measurement for double determination and report the average of both determinations as the result. Automatic: Test protocols for Dade Behring coagulation analyzers may be obtained from Dade Behring on request. Dade Behring has checked the use of these reagents in different analyzers for optimal product performance and adherence to product specifications. Dade Behring does not support modifications since these may influence the performance of the system and the test results. It is the responsibility of the user to validate modifications of these instructions or the use of these reagents in other analyzers besides those named by Dade Behring in the application directions or these instructions. Internal Quality Control Normal range: Control Plasma N Pathological range: ProC® Control Plasma Two controls (one in the normal range and one that is FV Leiden positive) should be measured. A normal control plasma may be established using a pool of freshly collected normal plasmas, all tested and found to be negative for the Factor V Leiden mutation. The plasmas should be pooled on the day of collection and frozen in small aliquots for later use. A positive control may be prepared from aliquots of a known Factor V Leiden positive individual. Plasma should be frozen at -70 °C for use. The controls should be prepared and handled in the same manner as the samples. Acceptable limits should be set for each control plasma by performing precision studies in accordance with NCCLS guidelines. These guidelines recommend that controls be assayed at the beginning of a measurement series, at least once in an 8-hour shift, and with each change in reagents. Each laboratory should determine its own quality control range for both controls, either by means of the target values and ranges provided by the manufacturer of the controls or by means of control values determined in the laboratory, with each lot of the ProC® Ac R Test. This normally amounts to ± 2.5 standard deviations from the mean control value. If the measured control values are outside of the predetermined control range, do not report patient results until the problem has been identified, corrected and documented. Determine which part of the instrument/reagent/control system did not function properly and correct it. After corrective measures are implemented and documented according to good laboratory practice (GMP), retest the controls. If they are now within the confidence range, patient samples can be tested and the results reported. Results Results should be expressed as a ratio: Clotting time PR3V with activator ––––––––––––––––––––––––––––––––––– Clotting time PR3V with saline solution or Dade® CA System Buffer The Dade Behring ProC® Ac R Test results on pooled normal plasma with Activator present should be 2 to 3 times longer than results on pooled normal plasma without Activator (see expected values). Dade Behring ProC® Ac R ratio = Limitations of the Procedure There are appropriate coagulation analyzers for which Dade Behring provides operating instructions. The utilization of the Dade Behring ProC® Ac R Test in other coagulation analyzers must be validated by the testing laboratory. In doing so, performance data other than that provided may be obtained. Tests with the Dade Behring ProC® Ac R Reagent were carried out with samples from patients on stabilized oral anticoagulant therapy, patients on heparin and low-molecular heparin therapy, and patients with lupus anticoagulant. Samples from such patients may exhibit significantly longer clotting times than samples from normal individuals. However, since the clotting times with saline solution or Dade® CA System Buffer are also prolonged, the quotient derived from the clotting time with/without activator remains reliable and the diagnostic significance is maintained. Therapeutic doses of hirudin or other direct thrombin inhibitors lead to prolonged clotting times. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history, clinical presentation and other findings. Interferences Icteric, lipemic and hemolytic samples and samples with a low hematocrit should not be used with this test, since they may lead to incorrect results (see NCCLS H21-A3 for further clarification3). Low activities of Factors VII, VIII, IX and XII do not interfere with the Dade Behring ProC® Ac R Test. Activities of Factors II and V of over 10% and of Factor X of over 20% also have no effect on the test. At the beginning of treatment with oral anticoagulants, i.e. before stabilization, the Dade Behring ProC® Ac R Test may provide ratios that are too low. The same applies for Protein C concentrations under 50%. Expected Values Values (ratios) for healthy individuals vary from laboratory to laboratory, depending on the procedure used. Therefore, each laboratory should determine its own reference ranges on the basis of the methods and coagulation analyzers used. In general, ratios smaller than or equal to 1.5 indicate the Factor V (Leiden) variant. A study with the Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 and CA-1500 systems yielded a decision limit of 1.8 for these assay applications. Ratios between 1.5 and 2.1 may indicate low concentrations of Protein C and should be further investigated. These investigations could include specific tests for Protein C and DNA tests. Samples with positive or equivocal results should be confirmed by genetic analysis. Specific Performance Characteristics Reagenzien Diagnostic Sensitivity and Diagnostic Specificity The Dade Behring ProC® Ac R Test was validated on a Stago STA• instrument against the DNA analysis method and a cut-off of 1.57 was established by ROC analysis. A clinical evaluation study was then performed at three independent test centers to evaluate the ability of the Dade Behring ProC® Ac R Test to detect the Factor V (Q506) mutation. The Dade Behring ProC® Ac R Test was compared with the Coatest•• APC•• Resistance V Test and DNA analysis, using a total of 164 samples (82 normal and 82 Factor V Leiden positive) from patients ranging in age from 2 to 87 years. The population included patients with the following clinical conditions: untreated (49), DVT/PE or other prothrombotic conditions (58), oral anticoagulants (36), heparin/LMW heparin (21), lupus anticoagulant (12) or familial studies (39). 163 of 164 patients were correctly identified using a cut-off of 1.57 at all sites, giving a sensitivity of 100% (confidence limits: 95.6 to 100%) and a specificity of 98.8% (confidence limits 93.4 to 99.8%) relative to the DNA method. Validation was performed on a Stago STA•, an Organon Teknika MDA••• 180 and using the manual tilt tube technique. An additional clinical evaluation of the ProC® Ac R Test with the Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 and CA-1500 systems defined the decision limit by ROC analysis as 1.8. The diagnostic sensitivity and diagnostic specificity for these assay applications were evaluated. A minimum of 198 fresh and/or frozen samples from unselected volunteer healthy blood donors confirmed negative for Factor V Leiden by PCR, and from patients with different disease states confirmed positive for Factor V Leiden by PCR were tested. Please refer to Table 1 for the results. Inhalt der Handelspackung ProC® Ac R Test Testkit, Bestell-Nr. OPBC mit 5 x für 4,0 ml PR3V Reagenz 5 x für 2,0 ml Aktivator Reagenz Ausreichend um 100 manuelle Gerinnungstests durchzuführen (100 Tests mit Aktivator und 100 Tests ohne Aktivator). Hinweis: Die Anzahl an Tests, die mit einem spezifischen Gerinnungsmessgerät erhalten wird, kann variieren. Results of the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity study for ProC® Ac R Table 1: CA-1500 CA-7000 BCS® N 198 214 231 Cutoff 1.8 1.8 1.8 Specificity [%] 97.2 98.0 98.1 Sensitivity [%] 98.9 99.1 99.2 ® ® NPV [%] 99 99 99 PPV [%] 96.8 98.2 98.4 ® The ProC Ac R Test applications with the Dade Behring BCS , Sysmex CA-7000 and CA-1500 systems were compared to Coatest•• APC•• Resistance V on ACL 9000. A total of 139 fresh and/ or frozen samples from unselected volunteer healthy blood donors confirmed negative for Factor V Leiden by PCR, and from patients with different disease states confirmed positive for Factor V Leiden by PCR were tested. 138 out of the 139 samples were correctly identified by the ProC® Ac R Test with Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 systems and Coatest•• APC•• Resistance V on ACL 9000. 137 out of 139 were correctly identified by the ProC® Ac R Assay with the Sysmex® CA1500 system. Note: Sensitivity and specificity of the Dade Behring ProC® Ac R Test for non-FV Leiden APC resistance screening has not been established. Due to differences in sample populations, collection techniques and instrument technology, each testing laboratory should determine its own cut-off. Precision The within run precision maximum (intraassay coefficient of variation) was 1.9% The total precision maximum was 8.9% using two sites, instruments and operators with three plasmas, tested in double determination for 20 days. Bibliography 1. Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994; 369:64-7. 2. Dahlback B. Physiological anticoagulation. Resistance to activated protein C and venous thromboembolism. J Clin Invest 1994; 94:923-927. 3. NCCLS: Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulation Assays, Approved Guideline H21-A3. Wayne, PA 1998. Guarantee This product is guaranteed to perform as described in the labeling and the product literature. Dade Behring disclaims any implied warranty of merchantability or fitness for any other purpose, and in no event shall Dade Behring be liable for any consequential damages arising out of the aforesaid express warranty. Dade is a registered trademark of Dade Behring Inc. in the USA, in Germany and other countries. ProC and BCS are registered trademarks of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries. Sysmex is a registered trademark of SYSMEX CORPORATION in the USA, in Germany and other countries. • STA is a trademark of Diagnostica Stago •• Coatest and APC are trademarks of Chromogenix AB •••MDA is a trademark of Organon Teknika B.V. Edition February 2005 ® ProC Ac R Test zum Screening auf APC Resistenz Auf Russell Viper Schlangengift basierender Screening-Test zur Bestimmung der Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C, die durch den FV (Leiden) Gendefekt hervorgerufen wird. Anwendungsbereich ® Der Dade Behring ProC Ac R Test ist ein funktionaler Gerinnungstest, der für das Screening auf Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C (APC) in Plasma von Personen mit dem Faktor V (Leiden) Defekt geeignet ist. Der Test kann auch mit Plasma von Patienten unter stabiler oraler Antikoagulationstherapie oder unter Heparin-Therapie durchgeführt werden. Diagnostische Bedeutung Die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C (APC Resistenz) wird durch eine Punktmutation im Faktor V Gen [z.B. Faktor V (Leiden)] hervorgerufen. Die Mutation führt zu einem Austausch der Aminosäure Arginin 506 (R) gegen Glutamin (Q) im Faktor V Protein1. Diese Mutation verzögert die Inaktivierung des Faktors Va durch APC und führt dadurch zu einer erhöhten Gerinnungsneigung. Das Vorliegen des Faktor V (Leiden) ist in 20-50% aller Fälle die hauptsächliche Ursache für eine hereditäre Thrombophilie2. Prinzip der Methode Der Dade Behring ProC® Ac R Test beruht auf der Aktivierung von endogenem Protein C durch Inkubation von Plasma mit dem Schlangengift von Agkistrodon contortrix contortrix (Südlicher Kupferkopf). Anschließend wird mit der Plasmaprobe eine verdünnte „Russell’s Viper Venom Time“ (DRVVT, Schlangengiftaktivator für Faktor X) Bestimmung durchgeführt. Die DRVVT reagiert empfindlich auf Konzentrationsänderungen des aktivierten Protein C. Im Falle von normalen Individuen wird durch die Aktivierung von Protein C das Ergebnis des Tests mit Aktivator gegenüber dem mit Puffer zwei- bis dreifach verlängert. Bei Personen mit Faktor V (Leiden) verursacht die Schlangengiftaktivierung von Protein C nur eine geringfügige Verlängerung gegenüber dem Ergebnis für den Test mit Puffer (gewöhnlich kleiner als 1,5-fach). Um den Effekt anderer Gerinnungsparameter zu minimieren, sollte das Verhältnis der Gerinnungszeit mit Schlangengiftaktivator zu der ohne Schlangengiftaktivator bestimmt werden. Die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C kann auch durch andere Mutationen im Faktor V Gen hervorgerufen werden [z.B. durch FV (Cambridge) und FV (Hong Kong)]. OPBC G03 C0542 (526) H/CS 2 Zusammensetzung Aktivator Reagenz: Lyophilisat, enthält Schlangengift von Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/ l) in stabilisierender Pufferlösung. Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,01%) PR3V Reagenz: Lyophilisat, enthält verdünntes phospholipidreiches Schlangengift der Vipera Russeli (< 1 mg/l), pflanzliche Phospholipide (< 10 g/l), Calcium (0,1 M) und einen Heparinneutralisator (< 0,5 g/l). Konservierungsmittel: Natriumazid (< 0,01%) Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in-vitro diagnostischen Anwendung. 2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen in-vitro-Diagnostika ist zu beachten: Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden! Natriumazid kann mit Schwermetallen wie Kupfer oder Blei explosive Azide bilden. Vorbereitung der Reagenzien • Rekonstituieren Sie den Aktivator in 2,0 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser ohne Konservierungsstoffe, wie auf dem Fläschchenetikett angegeben. Das aufgelöste Produkt sollte eine klare blassgrüne Lösung ohne erkennbare Partikelrückstände ergeben. • Rekonstituieren Sie das PR3V Reagenz in 4,0 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser ohne Konservierungsstoffe, wie auf dem Fläschchenetikett angegeben. Das aufgelöste Produkt sollte eine leicht trübe Lösung ohne erkennbare Partikelrückstände ergeben. • Zur Durchmischung vorsichtig umschwenken - nicht schütteln! • Vor Gebrauch 10 Minuten bei Raumtemperatur (+15 bis + 25 °C) inkubieren. • Reagenzien vor Gebrauch noch einmal vorsichtig mischen. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Die gefriergetrockneten Reagenzien sind bei +2 bis +8 °C zu lagern und bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum haltbar. Stabilität nach Rekonstitution (geschlossenes Fläschchen) Temperatur: ProC® Ac R ProC® Ac R Aktivator PR3V Reagenz bei +2 bis +8 °C 2 Wochen 2 Wochen bei +20 bis +25 °C 12 Tage 12 Tage bei +37 °C 6 Stunden 6 Stunden bei -20 °C 2 Wochen 2 Wochen Hinweis auf Verfall: Im Falle von fehlendem Vakuum beim Öffnen des Fläschchens und/oder falls das Reagenz feucht erscheint, sollte es zu Dade Behring zurückgesendet werden. Wenn das rekonstituierte Produkt deutliche Anzeichen von Schwebstoffen oder Kontaminationen aufweist oder wenn es sich nicht innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe von destilliertem oder entionisiertem Wassers vollständig löst, kontaktieren Sie bitte Dade Behring oder Ihren lokalen Distributor. Nach Rekonstitution nicht häufiger als einmal einfrieren und wieder auftauen! Zusätzlich benötigte nicht im Kit enthaltene Materialien Natriumcitrat (0,11 M bzw. 3,2%ig) für die Blutabnahme Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE ProC® Kontrollplasma, Bestell-Nr. OQKE Destilliertes oder entionisiertes Wasser ohne Konservierungsstoffe Kunststoffröhrchen Pipetten für das genaue Abmessen von 100 µl, 2,0 ml und 4,0 ml Wasserbad, temperiert auf +37 °C Zeitmesser oder Stoppuhr Physiologische Kochsalzlösung (0,15 M Natriumchlorid) zur Verwendung mit dem BCS® Gerinnungsmessgerät Dade® CA System-Puffer zur Verwendung mit Sysmex® CA-Systemen, Bestell-Nr. B4265 oder Dade® Owren’s Veronal-Puffer, Bestell-Nr. B4234 Gerinnungsmessgerät (siehe "Einschränkung der Testdurchführung") Geräte Der Dade Behring ProC® Ac R Test kann manuell oder an einer Vielzahl von Gerinnungsmessgeräten verwendet werden. Beachten Sie die Bedienungsanleitung des Geräteherstellers! Probenabnahme und -vorbereitung Achtung: Alle Plasmen sind als potentiell infektiös zu behandeln! Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung (0,11 M) mit 9 Teilen frisch abgenommenem Venenblut sorgfältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort für 10 Minuten bei 1500 x g zentrifugieren und das überstehende Plasma abpipettieren. Beim Separieren des Plasmas darauf achten, dass keine Blutplättchen abpipettiert werden. Falls die Probe eingefroren werden soll, separiertes Plasma erneut zentrifugieren und unverzüglich einfrieren. Stabilität der Probe bei +2 bis +8 °C 4 Stunden (Frischplasma) bei -30 °C 6 Monate (wenn Plättchen vor dem Einfrieren durch doppelte Zentrifugation entfernt wurden). Testdurchführung Manuell Test mit Aktivator: 1. Eine ausreichende Menge an PR3V Reagenz, unter Berücksichtigung von 0,1 ml pro Test, bei +37 ± 1 °C in einem Reagenzgefäß vorinkubieren. 2. 0,1 ml des Testplasmas in ein Reaktionsgefäß geben. 3. 0,1 ml des Aktivators zu dem Testplasma geben und für genau 5 Minuten bei +37 ± 1 °C inkubieren. 4. Mit Zugabe von 0,1 ml des auf +37 ± 1 °C vorinkubierten PR3V Reagenzes Stoppuhr starten und die Gerinnungszeit bestimmen. 5. Messung für Doppelbestimmung wiederholen und den Mittelwert beider Bestimmungen als Ergebnis angeben. Test ohne Aktivator: 1. Eine ausreichende Menge an PR3V Reagenz, unter Berücksichtigung von 0,1 ml pro Test, bei +37 ± 1 °C in einem Reagenzgefäß vorinkubieren. 2. 0,1 ml des Testplasmas in ein Reaktionsgefäß geben. 3. 0,1 ml der Kochsalzlösung zu dem Testplasma geben und für genau 5 Minuten bei +37 ± 1 °C inkubieren. 4. Mit Zugabe von 0,1 ml des auf +37 ± 1 °C vorinkubierten PR3V Reagenzes Stoppuhr starten und die Gerinnungszeit bestimmen. 5. Messung für Doppelbestimmung wiederholen und den Mittelwert beider Bestimmungen als Ergebnis angeben. Automatisch: Testprotokolle für Dade Behring Gerinnungsmessgeräte werden auf Anfrage von Dade Behring zur Verfügung gestellt. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. Interne Qualitätskontrolle Normalbereich: Kontroll-Plasma N Pathologischer Bereich: ProC® Kontrollplasma Zwei Kontrollen (eine im Normalbereich und eine FV Leiden positive) sollten gemessen werden. Ein normales Kontrollplasma kann aus frisch abgenommenen Plasmen erstellt werden, die auf die FV Leiden-Mutation getestet wurden und dabei einen negativen Befund aufwiesen. Die Plasmen sollten am Tag der Abnahme vereinigt und für die spätere Verwendung in kleinen Aliquoten eingefroren werden. Zur Positivkontrolle kann ein Plasma-Aliquot eines FV Leiden Trägers verwendet werden. Die Plasmen sollten bis zur Verwendung bei -70 °C eingefroren werden. Das Kontrollmaterial sollte in derselben Weise vorbereitet und behandelt werden wie die Proben. Für jedes Kontrollplasma sollten geeignete Grenzen gesetzt werden, indem Präzisionsuntersuchungen nach den Richtlinien der NCCLS durchgeführt werden. Diese Richtlinien empfehlen die Bestimmung von Kontrollen zu Beginn einer Mess-Serie, zumindest einmal in einer 8-StundenSchicht, und bei jedem Wechsel des Reagenzes. Jedes Labor sollte für beide Kontrollen entweder anhand der vom Hersteller der Kontrollen angegebenen Sollwerte und- bereiche oder anhand im Labor bestimmter Kontrollwerte seinen eigenen Qualitätskontrollbereich mit jeder Charge des ProC® Ac R Tests ermitteln. Dieser beträgt in der Regel ± 2,5 Standardabweichungen vom mittleren Kontrollwert. Liegen die gemessenen Kontrollwerte außerhalb des vorher festgelegten Kontrollbereiches, dürfen die Patientenergebnisse nicht eher berichtet werden, bis das Problem identifiziert, korrigiert und dokumentiert ist. Überprüfen Sie, welcher Teil des Geräte/Reagenz/Kontroll-Systems nicht einwandfrei funktioniert hat und korrigieren Sie ihn. Nachdem korrigierende Maßnahmen implementiert und unter Einhaltung der Guten Laborpraxis (GMP) dokumentiert wurden, sind die Kontrollen erneut zu testen. Wenn sie nun innerhalb des Vertrauensbereiches liegen, können Patientenproben getestet und die erhaltenen Ergebnisse berichtet werden. Ergebnisse Die Messergebnisse sollten als Verhältnis (Ratio) ausgedrückt werden: Die ProC® Ac R-Applikationen mit den Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 und CA-1500 Systemen wurden mit dem Coatest•• APC•• Resistance V auf dem ACL 9000 System verglichen. Insgesamt wurden 139 frische und/oder gefrorene Proben von nicht ausgewählten, freiwilligen, gesunden Blutspendern, welche PCR-negativ für Faktor V Leiden waren, sowie von PCR-positiven Patienten für Faktor V Leiden mit verschiedenen Krankheitsstadien getestet. 138 dieser 139 Proben wurden sowohl vom ProC® Ac R-Test mit den Dade Behring BCS® und Sysmex® CA-7000 Systemen korrekt bestimmt, als auch vom Coatest•• APC•• Resistance V auf dem ACL 9000 System. 137 der genannten 139 Proben wurden mit dem ProC® Ac R-Test auf dem Sysmex® CA-1500 System korrekt erkannt. Hinweis: Die Sensitivität und Spezifität des Dade Behring ProC® Ac R Tests für das Screening von APC Resistenzen, die nicht auf den FV Leiden Gendefekt beruhen, wurde nicht ermittelt. Aufgrund von Unterschieden in der Probenpopulation, in der Abnahmetechnik und in der Gerätetechnik sollte jedes Untersuchungslabor seinen eigenen Cut-off bestimmen. Präzision Präzision in der Serie (Intra-Assay-Variationskoeffizient): maximal 1,9%. Die Gesamtpräzision wurde mit drei Plasmen an zwei Prüfstellen über 20 Tage in Doppelbestimmung ermittelt und lieferte einen Variationskoeffizienten von maximal 8,9%. Literatur Siehe englische Packungsbeilage. Garantie Es wird garantiert, dass die Wirkungsweise dieses Produktes den Angaben auf der Packung und in der Produktliteratur entspricht. Dade Behring haftet nicht für die handelsübliche Qualität oder die Eignung des Produktes, falls diese für irgendwelche anderen als die angegebenen Zwecke verwendet wird, noch für irgendwelche Folgeschäden, die sich aus den vorstehenden vertraglichen Gewährleistungen ergeben. Dade ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Inc. in den USA, Deutschland und anderen Ländern. ProC und BCS sind eingetragene Marken der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, in Deutschland und in anderen Ländern. Sysmex ist eine eingetragene Marke der SYSMEX CORPORATION in den USA, Deutschland und anderen Ländern. • STA ist eine Marke von Diagnostica Stago •• Coatest and APC sind Marken von Chromogenix AB ••• MDA ist eine Marke von Organon Teknika B.V. Gerinnungszeit PR3V mit Aktivator ––––––––––––––––––––––––––––––––––– Gerinnungszeit PR3V mit Kochsalzlösung oder Dade® CA System-Puffer Dade Behring ProC® Ac R Ratio = Die für ein Poolplasma im normalen Bereich unter Verwendung von Aktivator erhaltenen Ergebnisse für den Dade Behring ProC® Ac R Test sollten zwei- bis dreimal größer sein als die Ergebnisse für ein Poolplasma im normalen Bereich ohne Aktivator (siehe Erwartete Werte). Einschränkungen der Testdurchführung Es sind Gerinnungsmessgeräte geeignet, für die Dade Behring Anwendungsvorschriften bereitstellt. Die Verwendung des Dade Behring ProC® Ac R Tests an anderen Gerinnungsmessgeräten muss von dem Untersuchungslabor selbst validiert werden. Dabei können andere als die angegebenen Leistungsdaten erhalten werden. Tests mit dem Dade Behring ProC® Ac R Reagenz wurden mit Proben von Patienten unter stabiler oraler Antikoagulanzientherapie, Patienten unter Heparinund niedrigmolekularer Heparintherapie sowie Patienten mit Lupus Anticoagulans durchgeführt. Proben solcher Patienten können wesentlich längere Gerinnungszeiten zeigen als Proben von normalen Individuen. Da die Gerinnungszeiten mit Kochsalzlösung bzw. Dade® CA System-Puffer jedoch ebenfalls verlängert sind, bleibt der Quotient aus der Gerinnungszeit mit/ohne Aktivator verlässlich und die diagnostische Aussagekraft bleibt erhalten. Therapeutische Dosen von Hirudin oder anderen direkten Thrombin-Inhibitoren führen zu verlängerten Gerinnungszeiten. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Störfaktoren Ikterische, lipämische und hämolytische Proben sowie Proben mit niedrigem Hämatokrit sollten mit dem vorliegenden Test nicht verwendet werden, da sie zu fehlerhaften Ergebnissen führen können (vergleiche NCCLS H21-A3 für weitere Erklärungen3). Niedrige Aktivitäten der Faktoren VII, VIII, IX und XII beeinflussen den Dade Behring ProC® Ac R Test nicht. Aktivitäten der Faktoren II und V von über 10% und des Faktors X von über 20% haben ebenfalls keine Auswirkung auf den Test. Zu Beginn der Behandlung mit oralen Antikoagulanzien, d.h. vor dem Zustand der Stabilisierung, kann der Dade Behring ProC® Ac R Test zu niedrigen Ratios führen. Gleiches gilt für Protein C Konzentrationen unter 50%. Ausgabe Februar 2005 ProC® Ac R Test pour le dépistage de la résistance APC Test de dépistage basé sur du venin de vipère de Russell, qui permet de mesurer la résistance à la protéine C activée due à une mutation du gène du facteur V (facteur V Leiden). Domaine d’utilisation Le test Dade Behring ProC® Ac R est un test de coagulation fonctionnel qui permet de dépister une résistance à la protéine C activée (APC) dans le plasma de sujets ayant un facteur V Leiden. Le test peut également être effectué sur des plasmas de patients sous anticoagulants oraux ou sous héparinothérapie. Intérêt diagnostique La résistance à la protéine C activée (APC) est due à une mutation ponctuelle du gène du facteur V (par ex. le facteur V Leiden). La mutation entraîne le remplacement de la glutamine (Q) par l’acide aminé arginine 506 (R) dans la protéine facteur V1. Cette mutation ralentit l’inactivation du facteur Va par l’APC, provoquant ainsi une plus grande tendance au saignement. La présence de facteur V Leiden est, dans 20 à 50% des cas, la cause principale d’une thrombophilie héréditaire2. Principe de la méthode Die Werte (Ratio) gesunder Personen variieren von Labor zu Labor in Abhängigkeit vom angewendeten Verfahren. Daher sollte jedes Labor auf der Grundlage der verwendeten Methode und des Gerinnungsmessgerätes eigene Referenzbereiche ermitteln. Im Allgemeinen deuten Verhältnisse kleiner oder gleich 1,5 auf die Faktor V (Leiden) Variante hin. In einer Studie mit den Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 und CA-1500 Systemen wurde eine Entscheidungsgrenze von 1,8 für diese Applikation ermittelt. Ratios zwischen 1,5 und 2,1 lassen niedrige Konzentrationen an Protein C vermuten und sollten weiter untersucht werden. Diese Untersuchungen könnten spezifische Tests für Protein C und DNA-Tests beinhalten. Proben mit positiven oder grenzwertigen Ergebnissen sollten durch Genanalyse bestätigt werden. Le test Dade Behring ProC® Ac R est basé sur l’activation de la protéine C endogène par incubation du plasma à tester avec du venin de serpent Agkistrodon contortrix contortrix (mocassin à tête cuivrée du sud). On mesure ensuite sur ce plasma un temps de venin de vipère de Russell dilué (DRVVT, « Diluted Russell’s Viper Venom Time », venin de serpent qui active le facteur X). Le DRVVT réagit de façon sensible aux modifications de concentration de la protéine C activée. Dans le cas de sujets normaux, le résultat du test avec activateur qui active la protéine C, par rapport à celui obtenu avec le test réalisé avec du tampon, est allongé de 2 à 3 fois. Chez les sujets ayant un facteur V Leiden, l’activation de la protéine C par le venin de serpent ne provoque qu’un allongement négligeable par rapport au test réalisé avec du tampon (en général, l’allongement est inférieur à 1,5 fois). Afin de minimiser les effets des autres paramètres de la coagulation, il est recommandé de calculer le rapport entre le temps de coagulation obtenu avec l’activateur venin de serpent et celui obtenu sans activateur. La résistance à la protéine C activée peut également être due à d’autres mutations du gène du facteur V, comme par ex. le facteur V Cambridge ou le facteur V Hong Kong. Leistungsmerkmale des Tests Réactifs Diagnostische Sensitivität und diagnostische Spezifität Der Dade Behring ProC® Ac R Test wurde auf einem Stago STA•-Gerät im Vergleich zur DNAAnalysenmethode validiert und ein Cut-off von 1,57 wurde durch ROC-Analyse ermittelt. An drei unabhängigen Testzentren wurden klinische Validierungsstudien durchgeführt, um die Wirksamkeit des Dade Behring ProC® Ac R Testes zum Nachweis der Faktor V (Q506)-Mutation zu evaluieren. Der Dade Behring ProC® Ac R Test wurde mit dem Coatest•• APC•• Resistance V Test und der DNA-Analyse verglichen. Dabei wurde eine Gesamtzahl von 164 Proben (82 normale und 82 Faktor V Leiden positive) von Patienten im Alter zwischen 2 und 87 Jahren verwendet. Die Population umfasste Patienten mit folgenden klinischen Bedingungen: unbehandelt (49), DVT/PE oder andere prothrombotische Bedingungen (58), oral antikoaguliert (36), Heparin/LMW Heparin (21), Lupus Antikoagulans (12) oder Familienverwandtschaftsstudien (39). 163 von 164 Patienten wurden mit Hilfe eines Cut-offs von 1,57 an allen Prüfstellen korrekt identifiziert. Das ergab eine Sensitivität von 100% (Vertrauensbereich: 95,6 bis 100%) und eine Spezifität von 98,8% (Vertrauensbereich 93,4 bis 99,8%) relativ zur DNA-Methode. Die Validierung wurde auf einem Stago STA•, und einem Organon Teknika MDA••• 180 und mit einer manuellen Technik ("tilt tube") durchgeführt. Eine weitere klinische Bewertung des ProC® Ac R Testes mit den Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 und CA-1500 Systemen ergab mittels ROC-Analyse 1,8 als Entscheidungsgrenze. Für diese Applikationen wurden diagnostische Sensitivität und diagnostische Spezifität evaluiert. Mindestens 198 frische und/oder gefrorene Proben von nicht ausgewählten, freiwilligen, gesunden Faktor-V-Leiden negativen Blutspendern (Status bestätigt durch PCR), sowie von PCR-positiven Faktor V Leiden-Trägern mit verschiedenen Krankheitsstadien wurden getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Conditionnement Test ProC® Ac R Coffret, code OPBC, contenant 5 x pour 4,0 ml Réactif PR3V 5 x pour 2,0 ml Réactif Activateur permet de réaliser 100 tests de coagulation manuels (100 tests avec activateur et 100 sans activateur). Remarque : le nombre de tests peut varier selon l’appareil de coagulation spécifique utilisé. Composition Réactif Activateur : lyophilisat contenant du venin de serpent Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/l) en solution tampon stabilisante. Conservateur : azide de sodium (< 0,01%) Réactif PR3V : lyophilisat contenant du venin de serpent Vipera Russell dilué riche en phospholipides (< 1 mg/l), des phospholipides végétaux (< 10 g/l), du calcium (0,1 M) et un neutralisateur de l’héparine (< 0,5 g/l). Conservateur : azide de sodium (< 0,01%) Zu erwartende Werte Tabelle 1: Ergebnisse der diagnostischen Sensitivitäts- und Spezifitätsstudie für ProC® Ac R CA-1500 CA-7000 BCS® N 198 214 231 Cutoff 1,8 1,8 1,8 OPBC G03 C0542 (526) H/CS Spezifität [%] 97,2 98,0 98,1 3 Sensitivität [%] 98,9 99,1 99,2 NPV [%] 99 99 99 PPV [%] 96,8 98,2 98,4 Mises en garde et précautions d’emploi 1. Réservé à un usage de diagnostic in vitro. 2. Les réactifs in vitro contenant de l’azide de sodium doivent être utilisés avec précaution : ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb. Préparation des réactifs • Reconstituer le Réactif Activateur avec 2,0 ml d’eau distillée ou désionisée exempte de conservateur, comme indiqué sur l’étiquette du flacon. Une fois reconstituée, la solution doit être limpide, vert pâle, sans aucune particule visible. • Reconstituer le Réactif PR3V avec 4, 0 ml d’eau distillée ou désionisée exempte de conservateur, comme indiqué sur l’étiquette du flacon. Une fois reconstituée, la solution doit être légèrement trouble et ne contenir aucune particule visible. • Bien homogénéiser les solutions en retournant les flacons - ne pas les agiter ! • Avant emploi, les laisser incuber 10 minutes à la température ambiante (+15/+25 °C). • Homogénéiser à nouveau les réactifs avec précaution avant emploi. Stabilités et conditions de conservation Conservés lyophilisés à +2/+8 °C, les réactifs du coffret peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur l’étiquette. Stabilités après reconstitution (dans flacon fermé) : Température : ProC® Ac R ProC® Ac R Activateur Réactif PR3V +2/+8 °C 2 semaines 2 semaines +20/+25 °C 12 jours 12 jours +37 °C 6 heures 6 heures -20 °C 2 semaines 2 semaines Signes de détérioration des réactifs : en l’absence de vide à l’ouverture d’un flacon ou si le lyophilisat apparaît humide, renvoyer le flacon à Dade Behring. Si le produit reconstitué présente des particules, est contaminé ou n’est pas totalement reconstitué dans les 15 minutes qui suivent l’addition de l’eau distillée ou désionisée, contacter Dade Behring. Une fois reconstituées, les solutions ne peuvent être congelées qu’une seule fois ! Autres réactifs et matériel nécessaires non contenus dans le coffret Citrate de sodium (0,11 M ou 3,2%) pour les prélèvements sanguins Plasma de contrôle N, code ORKE ProC® Plasma de contrôle, code OQKE Eau distillée ou désionisée exempte de conservateur Tubes à essai en plastique Pipettes exactes de 100 µl, 2,0 ml et 4,0 ml Bain-marie thermostaté à +37 °C Timer ou chronomètre Sérum physiologique (chlorure de sodium 0,15 M) pour une utilisation sur l’appareil de coagulation BCS® Dade® Tampon pour systèmes CA pour une utilisation sur les systèmes CA Sysmex®, code B4265 ou Dade® Tampon véronal d’Owren, code B4234 Appareil de coagulation (cf. « Limites de réalisation du test ») Appareils de coagulation Le test ProC® Ac R de Dade Behring peut être utilisé aussi bien manuellement que sur un grand nombre d’automates de coagulation. Respecter le manuel d’utilisation de l’automate utilisé ! Prélèvement et préparation des échantillons Attention : considérer tous les plasmas comme potentiellement infectieux lors de leur manipulation ! Pour obtenir les plasmas, mélanger 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 M) avec 9 volumes de sang veineux fraîchement prélevé, et homogénéiser avec précaution en évitant la formation de mousse. Centrifuger aussitôt 10 min à 1500 x g et prélever le plasma surnageant à l’aide d’une pipette en veillant à ne pas aspirer de plaquettes. Si l’échantillon doit être congelé, centrifuger de nouveau le plasma prélevé, et le congeler immédiatement. Stabilité de l’échantillon +2/+8 °C 4 heures (plasma frais) -30 °C 6 mois (à condition que les plaquettes aient totalement été éliminées par double centrifugation avant la congélation) Réalisation du test Méthode manuelle : Test avec activateur : 1. Préincuber la quantité nécessaire de Réactif PR3V (compter 0,1 ml par test) à +37 ± 1 °C dans un récipient pour réactif. 2. Verser 0,1 ml de plasma à tester dans un tube à essai. 3. Ajouter 0,1 ml de Réactif Activateur au plasma à tester et laisser incuber exactement 5 minutes à +37 ± 1 °C. 4. Ajouter 0,1 ml de Réactif PR3V préincubé à +37 ± 1 °C, déclencher simultanément le chronomètre et mesurer le temps de coagulation. 5. Retester le plasma pour un dosage en double et rendre la moyenne des deux dosages comme résultat. Test sans activateur : 1. Préincuber la quantité nécessaire de Réactif PR3V (compter 0,1 ml par test) à +37 ± 1 °C dans un récipient pour réactif. 2. Verser 0,1 ml de plasma à tester dans un tube à essai. 3. Ajouter 0,1 ml de sérum physiologique au plasma à tester et laisser incuber exactement 5 minutes à +37 ± 1 °C. 4. Ajouter 0,1 ml de Réactif PR3V préincubé à +37 ± 1 °C, déclencher simultanément le chronomètre et mesurer le temps de coagulation. 5. Retester le plasma pour un dosage en double et rendre la moyenne des deux dosages comme résultat. Méthode automatique : Les protocoles spécifiques aux appareils de coagulation Dade Behring sont envoyés sur demande par Dade Behring. Dade Behring a contrôlé l’efficacité optimale des réactifs ainsi que le respect de leurs spécifications dans le cadre de leur utilisation sur différents appareils de coagulation. Dade Behring n’encourage pas les utilisateurs à modifier les protocoles, dans la mesure où les modifications peuvent influencer la performance du système et les résultats du test. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de valider toute modification par rapport au protocole indiqué , ou l’utilisation de ces réactifs sur d’autres appareils de coagulation que ceux indiqués par Dade Behring dans les protocoles d’application ou les fiches techniques. Contrôle de qualité interne Domaine normal : Plasma de contrôle N Domaine thérapeutique : ProC® Plasma de contrôle Tester deux contrôles (un dans le domaine normal et un positif en facteur V Leiden). Comme plasma de contrôle normal, on peut utiliser des plasmas fraîchement prélevés sur lesquels on fait une recherche de mutation du facteur V Leiden et qui donnent un résultat négatif. Purifier les plasmas le jour de leur prélèvement et les congeler en petites parties aliquotes pour une utilisation ultérieure. Comme contrôle positif, on peut utiliser un plasma aliquoté porteur du facteur V Leiden. Congeler les plasmas à -70 °C jusqu’à leur utilisation. Préparer et tester les contrôles comme des échantillons de patients. Déterminer des valeurs-limites pour chaque plasma de contrôle en réalisant une étude de précision selon les lignes directrices du NCCLS. Ces lignes directrices recommandent de tester les contrôles au début de chaque série de mesures, au moins une fois toutes les 8 heures de travail, et à chaque changement de réactif. Chaque laboratoire doit déterminer, pour chacun des deux contrôles et pour chaque lot du test ProC® Ac R, son propre domaine de contrôle de qualité soit à partir des valeurs théoriques et domaines de confiance indiqués par le fabricant des contrôles, soit à partir de valeurs de contrôle déterminées dans son laboratoire. Le domaine de contrôle de qualité correspond en général à ± 2,5 déviations standard par rapport à la valeur moyenne des contrôles. Si les valeurs obtenues pour les contrôles sortent des domaines préalablement établis, ne pas rendre les résultats de patients tant que le problème n’aura pas été identifié, corrigé et documenté. Déterminer quel élément du système appareil/réactifs/contrôles a présenté un dysfonctionnement et corriger celui-ci. Une fois les mesures correctives mises en place et documentées selon les bonnes pratiques de laboratoire (GMP), tester à nouveau les contrôles. S’ils sont trouvés à l’intérieur de leur domaine de confiance respectif, les échantillons de patients peuvent être testés et les résultats rendus. Résultats Rendre les résultats sous forme de ratio : Temps de coagulation PR3V avec activateur –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Temps de coagulation PR3V avec sérum physiologique ou avec Dade® Tampon pour systèmes CA Ratio Dade Behring ProC® Ac R = OPBC G03 C0542 (526) H/CS 4 Les résultats obtenus dans le test Dade Behring ProC® Ac R pour un pool de plasmas dans le domaine normal en utilisant l’activateur doivent être deux à trois fois supérieurs à ceux obtenus pour le même pool de plasmas sans activateur (cf. « Valeurs attendues »). Limites de réalisation du test Dade Behring propose des protocoles d’adaptation pour les automates de coagulation adaptés à la réalisation du test. L’utilisation du test Dade Behring ProC® Ac R sur d’autres automates de coagulation doit être validée par le laboratoire utilisateur. Celui-ci peut alors obtenir des données de performance différentes de celles indiquées comme caractéristiques du test. Le test Dade Behring ProC® Ac R a été effectué sur des échantillons de patients sous traitement aux anticoagulants oraux stabilisé, sous traitement à l’héparine et sous traitement à l’héparine de faible poids moléculaire, ainsi que chez des patients avec un Lupus anticoagulant : les temps de coagulation de ces patients peuvent être largement supérieurs à ceux obtenus chez des sujets normaux. Dans la mesure cependant où les temps de coagulation obtenus avec du sérum physiologique ou le Dade® Tampon pour systèmes CA sont également allongés, le ratio entre temps de coagulation avec activateur et temps de coagulation sans activateur reste fiable, et l’interprétation diagnostique est maintenue possible. Les doses thérapeutiques d’Hirudin ou d’autres inhibiteurs directs de la thrombine entraînent un allongement du temps de coagulation. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations. Facteurs d’interférences Ne pas utiliser d’échantillons ictériques, lipémiques, hémolytiques, ni ayant un faible hématocrite pour ce test, au risque d’obtenir de faux résultats (cf. NCCLS H21-A3 pour plus de précisions3). Des activités faibles de facteur VII, VIII, IX ou XII n’ont pas d’influence sur le test Dade Behring ProC® Ac R. Des activités de facteur II ou V augmentées de 10% ou de facteur X augmentées de 20% n’ont pas non plus d’influence sur le test. Au début d’un traitement aux anticoagulants oraux, c’est-à-dire avant la phase de stabilisation, le test Dade Behring ProC® Ac R peut donner des ratios diminués. Le même phénomène est observé avec des concentrations de protéine C diminuées de 50%. Valeurs attendues Les valeurs (ratios) des sujets sains varient d’un laboratoire à l’autre selon la technique utilisée. Aussi chaque laboratoire doit-il déterminer ses propres domaines de référence par rapport à la méthode et à l’appareil de coagulation utilisés. En règle générale, un ratio égal ou inférieur à 1,5 indique la présence de la mutation du facteur V (Leiden). Une étude effectuée avec les systèmes Dade Behring BCS®, Syxmex® CA-7000 et CA-1500 a donné un seuil de décision à 1,8 pour ces applications. Un ratio compris entre 1,5 et 2,1 fait penser à une concentration diminuée de protéine C et nécessite la poursuite de l’exploration. Effectuer alors des tests spécifiques de protéine C et des tests d’ADN. Les résultats positifs et douteux doivent être confirmés par une analyse génétique. Caractéristiques du test Sensibilité diagnostique et spécificité diagnostique Le test Dade Behring ProC® Ac R a été validé par comparaison avec une méthode d’analyse d’ADN sur un appareil Stago STA•. Le cut-off a été déterminé à 1,57 selon une analyse ROC. Des études de validation cliniques ont été menées dans trois centres indépendants afin d’évaluer l’efficacité du test Dade Behring ProC® Ac R à révéler la mutation du facteur V (Q506). Le test Dade Behring ProC® Ac R a été comparé avec le test Coatest•• APC Resistance V et l’analyse d’ADN. Au total, 164 échantillons (82 normaux et 82 positifs en facteur V Leiden) provenant de patients âgés de 2 à 87 ans ont été utilisés. La population comprenait des patients aux caractéristiques suivantes : non traités (49), DVT/PE ou autres conditions prothrombotiques (58), sous anticoagulants oraux (36), sous héparine ou héparine de bas poids moléculaire (21), avec Lupus anticoagulant (12) ou faisant partie d’études familiales (39). 163 des 164 patients ont été correctement identifiés par les trois centres à partir d’un cut-off à 1,57. Cela donne une sensibilité de 100% (domaine de confiance : 95,6 à 100%) et une spécificité de 98,8% (domaine de confiance : 93,4 à 99,8%) par rapport à la méthode d’ADN. La validation a été effectuée sur un Stago STA•, un Organon Teknika MDA••• 180 et une technique manuelle (retournement du tube). Une autre évaluation clinique du test ProC® Ac R effectuée sur les systèmes Dade Behring BCS®, Syxmex® CA-7000 et CA-1500 a donné par une analyse ROC 1,8 comme seuil de décision. La sensibilité diagnostique et la spécificité diagnostique ont été évaluées pour ces applications. Au moins 198 échantillons frais et/ou congelés provenant de donneurs de sang non sélectionnés, volontaires, sains et trouvés négatifs en facteur V Leiden (statut confirmé par PCR) ainsi que de patients trouvés positifs en facteur V Leiden par PCR, à différents stades de la maladie. Les résultats sont représentés dans le tableau 1. Tableau 1 : Résultats d’une étude de sensibilité et de spécificité diagnostiques pour le test ProC® Ac R CA-1500 CA-7000 BCS® N 198 214 231 Cut-off 1,8 1,8 1,8 Spécificité [%] 97,2 98,0 98,1 Sensibilité [%] 98,9 99,1 99,2 VPN [%] 99 99 99 VPP [%] 96,8 98,2 98,4 Les applications du test ProC® Ac R sur les systèmes Dade Behring BCS®, Syxmex® CA-7000 et CA-1500 ont été comparées avec le Coatest•• APC•• Resistance V sur le système ACL 9000. Au total, 139 échantillons frais et/ou congelés ont été testés, provenant de donneurs de sang non sélectionnés, volontaires, sains et trouvés négatifs en facteur V Leiden par PCR, ainsi que de patients trouvés positifs en facteur V Leiden par PCR, à différents stades de la maladie. 138 de ces 139 échantillons ont été correctement trouvés, aussi bien avec le test ProC® Ac R sur les systèmes Dade Behring BCS® et Syxmex® CA-7000, qu’avec le Coatest•• APC•• Resistance V sur le système ACL 9000. 137 des 139 échantillons ont été correctement trouvés avec ProC® Ac R sur le système Syxmex® CA-1500. Remarque : la sensibilité et la spécificité du test Dade Behring ProC® Ac R pour le dépistage des résistances APC qui ne sont pas dues à une mutation du gène du facteur V Leiden n’ont pas été déterminées. Du fait de différences de populations, de techniques de prélèvement et de techniques des appareils utilisés, chaque laboratoire doit déterminer son propre cut-off. Précision Répétabilité (coefficient de variation dans la série) : maximum 1,9%. La précision globale a été déterminée avec trois plasmas testés dans deux centres. Les tests ont été effectués en double sur 20 jours. Les coefficients de variation obtenus ont été de 8,9% maximum. Littérature Cf. texte anglais. Garantie La performance de ce produit n’est garantie que si celui-ci est utilisé selon les indications du coffret et la littérature spécifique au produit. Dade Behring n’est pas responsable de la qualité ni de l’adéquation du produit, si celui-ci est utilisé à d’autres fins que celles indiquées, et ne pourra en aucun cas être poursuivi pour des dommages survenus en dehors des garanties contractuelles. Dade est une marque déposée de Dade Behring Inc. aux USA, en Allemagne et dans d’autres pays. ProC et BCS sont des marques déposées de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans d’autres pays. Sysmex est une marque déposée de SYSMEX CORPORATION aux USA, en Allemagne et dans d’autres pays. • STA est une marque de Diagnostica Stago •• Coatest et APC sont des marques de Chromogenix AB •••MDA est de marque de Organon Teknika B.V. Edition Février 2005 ProC® Ac R Test di screening per la resistenza all’APC Test di screening basato sul Veleno di Vipera Russell per la determinazione della resistenza alla Proteina C Attivata che può essere causata da difetto genetico del FV (Leiden). Settore d'impiego Il test Dade Behring ProC® Ac R è un test coagulativo funzionale destinato allo screening della resistenza alla Proteina C Attivata (APC) sul plasma di soggetti con difetto del Fattore V (Leiden). Il test può anche essere eseguito sul plasma di pazienti in terapia anticoagulante orale stabilizzata o in terapia eparinica. Significato diagnostico La Resistenza alla Proteina C Attivata (APC Resistance) è associata ad una mutazione del gene del Fattore V [Fattore V Leiden]. La mutazione consiste nella sostituzione dell’Aminoacido Arginina 506 (R) con glutamina nella molecola proteica del Fattore V1. Tale mutazione rallenta l’inattivazione del fattore Va da parte dell’APC, provocando uno stato di ipercoagulabilità. La presenza di Fattore V (Leiden) è la più comune causa di trombofilia ereditaria, ricorrente nel 20 - 50% dei casi.2 Principio del metodo Il test Dade Behring ProC® Ac R si basa sull’attivazione della Proteina C endogena mediante incubazione del plasma con veleno di Agkistrodon contortrix contortrix (Southern Copperhead). Il ”Tempo di Veleno di Vipera Russell” diluito (DRVVT, veleno di serpente come attivatore del Fattore X) viene poi eseguito sul plasma. Il DRVVT è sensibile alla variazioni di concentrazione della Proteina C Attivata. Nei soggetti normali, l’attivazione della Proteina C endogena prolunga da due a tre volte il risultato, in confronto al plasma senza attivazione. In soggetti con Fattore V (Leiden), l’attivazione mediante veleno della Proteina C induce solo un incremento marginale del risultato (solitamente, meno di 1,5 volte il valore su plasma senza attivazione). Per minimizzare l’effetto di altre variabili coagulative, occorre determinare il rapporto dei tempi di coagulazione ottenuti con e senza attivazione mediante veleno. La resistenza alla Proteina C Attivata può essere provocata anche da altre mutazioni del gene del fattore V [FV (Cambridge) e FV (Hong Kong)]. Reagenti Materiali forniti Test ProC® Ac R Kit analitico, Codice OPBC contenente 5 x 4,0 mL Reagente PR3V 5 x 2,0 mL Reagente Attivatore Sufficiente per eseguire 100 dosaggi coagulativi manuali (100 test con attivatore e 100 test senza attivatore). Nota: Il numero di test ottenibili con specifici analizzatori per coagulazione può variare. Composizione Reagente Attivatore: Liofilizzato, contiene veleno di Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/L) in soluzione con tampone stabilizzante. Conservante: sodio azide (<0,01%) Reagente PR3V: Liofilizzato, contiene veleno di Vipera Russell diluito (< 1 mg/L) arricchito con fosfolipidi, fosfolipidi di origine vegetale (< 10 g/L), calcio (0.1 M) e un inibitore dell’eparina (< 0,5 g/L). Conservante: sodio azide (<0,01%) Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in vitro. 2. I reagenti contenenti sodio azide devono essere manipolati con la dovuta cautela: Non ingerire né lasciare a contatto con la pelle o le membrane mucose ! La sodio azide può formare azidi esplosive a contatto con metalli pesanti come rame o piombo. Preparazione del reagente • Ricostituire l’Attivatore con 2,0 mL di acqua distillata o deionizzata priva di conservanti, come indicato sull’etichetta del flacone. Il prodotto ricostituito dovrebbe apparire come una soluzione limpida, di colore verde pallido senza evidenza di particelle. • Ricostituire il Reagente PR3V con 4,0 mL di acqua distillata o deionizzata priva di conservanti, come indicato sull’etichetta del flacone. Il prodotto ricostituito dovrebbe apparire come una soluzione translucida, pallida senza evidenza di particelle. • Capovolgere delicatamente per miscelare. Non agitare ! • Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (+15 - +25 °C) prima dell’uso. • Mescolare ancora accuratamente i reagenti prima dell’uso. Conservazione e stabilità I reagenti liofilizzati devono essere conservati a +2 - +8 °C e sono stabili fino alla data indicata sull’etichetta. Stabilità dopo ricostituzione (flacone chiuso) Temperatura: Attivatore Reagente PR3V ProC® Ac R ProC® Ac R a +2 - +8 °C 2 settimane 2 settimane a +20 - +25 °C 12 giorni 12 giorni a +37 °C 6 ore 6 ore a -20 °C 2 settimane 2 settimane Indice di deterioramento: In caso di assenza di vuoto all’apertura del flacone e/o di aspetto non secco del reagente, il prodotto deve essere restituito a Dade Behring. Se i prodotti ricostituiti mostrano chiaramente presenza di particelle o di contaminazione ovvero non si sciolgono completamente entro 15 minuti dall’aggiunta dell’acqua distillata o deionizzata, contattare Dade Behring o il Distributore di zona. Non congelare e scongelare più di una volta dopo ricostituzione ! Materiale necessario ma non fornito nel kit Sodio citrato (0,11M o 3,2%) per la raccolta del sangue Plasma di Controllo N, Codice ORKE ProC® Plasma di Controllo, Codice OQKE Acqua distillata o deionizzata priva di conservanti Provette di reazione in plastica Pipette per misurare con precisione 100 µL, 2,0 mL e 4,0 mL Bagno termostatato, tenuto a +37 °C Orologio o cronometro Soluzione salina fisiologica (sodio cloruro 0,15 M) da utilizzare sull’analizzatore BCS® Soluzione Diluente CA Dade® da utilizzare con i Sistemi CA Sysmex®, Codice B4265 oppure Tampone di Owren Dade®, Codice B4234 Analizzatore per coagulazione (vedere ”Limiti della Procedura”) Strumentazione Il Test Dade Behring ProC® Ac R può essere eseguito manualmente oppure con numerosi analizzatori per coagulazione. Attenersi alle istruzioni operative del produttore dello strumento ! Raccolta e preparazione dei campioni Importante: Trattare tutti i plasmi come potenzialmente infettivi ! Per ottenere il plasma, miscelare con cura 1 parte di sodio citrato (0,11 M) con 9 parti di sangue venoso appena prelevato, evitando la formazione di schiuma. Centrifugare immediatamente per 10 minuti a 1,500 x g e trasferire il plasma sovranatante. Durante la separazione del plasma, fare attenzione a non trasferire piastrine. Se il campione deve essere congelato, centrifugare il plasma separato in precedenza e congelare immediatamente. OPBC G03 C0542 (526) H/CS 5 Stabilità dei campioni a +2 - +8 °C 4 ore (plasmi freschi) a -30 °C 6 mesi (dopo rimozione delle piastrine con doppia centrifugazione prima del congelamento) Esecuzione del test Manuale: Test con attivatore: 1. Preriscaldare una quantità sufficiente di Reagente PR3V, tenendo 0,1 mL per test a +37 ± 1 °C in un adeguato contenitore. 2. Dispensare 0,1 mL di plasma in esame in una provetta di reazione. 3. Aggiungere 0,1 mL di Attivatore al plasma in esame e incubare esattamente per 5 minuti a + 37 ± 1 °C. 4. Aggiungere 0,1 mL di Reagente PR3V preriscaldato a +37 ± 1 °C, avviare immediatamente il cronometro e determinare il tempo di coagulazione. 5. Ripetere la misurazione per la determinazione in doppio e riportare come risultato la media di entrambe le determinazioni. Test senza attivatore: 1. Preriscaldare una quantità sufficiente di Reagente PR3V, tenendo 0,1 mL per test a +37 ± 1 °C in un adeguato contenitore. 2. Dispensare 0,1 mL di plasma in esame in una provetta di reazione. 3. Aggiungere 0,1 mL di soluzione salina al plasma in esame e incubare esattamente per 5 minuti a + 37 ± 1 °C. 4. Aggiungere 0,1 mL di Reagente PR3V preriscaldato a +37 ± 1 °C, avviare immediatamente il cronometro e determinare il tempo di coagulazione. 5. Ripetere la misurazione per la determinazione in doppio e riportare come risultato la media di entrambe le determinazioni. Automatica: I protocolli analitici per gli analizzatori Dade Behring possono essere ottenuti a richiesta da Dade Behring. Dade Behring ha verificato che l’utilizzo di questi reagenti su differenti analizzatori dia prestazioni ottimali e sia conforme alle specifiche di prodotto. Dade Behring non supporta modifiche poiché queste potrebbero influenzare le prestazioni del sistema ed i risultati analitici. È responsabilità dell’Utilizzatore validare le modifiche a queste istruzioni o l’utilizzo di questi reagenti su analizzatori che non siano quelli indicati da Dade Behring nelle istruzioni applicative o nelle presenti istruzioni. Controllo di qualità interno Intervallo normale: Plasma di Controllo N Intervallo patologico: ProC® Plasma di Controllo Occorre analizzare due controlli (uno nell’intervallo normale e uno positivo per il FV Leiden). Un plasma di controllo normale può essere definito utilizzando un pool di plasmi normali prelevati di fresco, tutti analizzati e trovati negativi per la mutazione del Fattore V Leiden. Il pool di plasmi deve essere preparato nello stesso giorno del prelievo e congelato in piccole aliquote per il successivo utilizzo. Un controllo positivo può essere preparato da aliquote di un soggetto sicuramente positivo per il Fattore V Leiden. I plasmi devono essere congelati a -70 °C per l’utilizzo. I controlli devono essere preparati e gestiti esattamente come i campioni. I limiti di accettabilità devono essere definiti per ciascun plasma di controllo eseguendo studi di precisione secondo le indicazioni NCCLS. Tali indicazioni raccomandano di analizzare i controlli all’inizio di ogni serie di analisi, almeno una volta ogni otto ore di lavoro,, e ad ogni cambiamento dei reagenti. Ogni laboratorio deve determinare il proprio intervallo di controllo di qualità per entrambi i controlli, tramite i valori dichiarati e gli intervalli forniti dal produttore dei controlli oppure mediante i valori di controllo definiti nel laboratorio, per ogni lotto di Test ProC® Ac R. Tali intervalli di norma sono pari a ± 2,5 deviazioni standard dal valore medio del controllo. Se i valori ottenuti per il controllo sono al di fuori dell’intervallo di controllo predefinito, non refertare i risultati dei pazienti finché il problema non sia stato identificato, corretto e documentato. Individuare quale parte del sistema strumento/reagente/controllo non ha funzionato adeguatamente e correggerla. Dopo aver messo in atto le misure correttive documentandole secondo la buona pratica di laboratorio (GMP), rianalizzare i controlli. Se rientrano nell’intervallo di accettabilità, è possibile analizzare i campioni dei pazienti e refertarne i risultati. Risultati I risultati dovrebbero essere espressi come ratio: Ratio Dade Behring ProC® Ac R = tempo di coagulazione PR3V con attivatore –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– tempo di coagulazione PR3V con soluzione salina oppure con Soluzione Diluente CA Dade® I risultati del Test Dade Behring ProC® Ac R su pool di plasmi normali con Attivatore dovrebbero risultare da 2 a 3 volte più lunghi dei risultati ottenuti su pool di plasmi normali senza Attivatore (vedere valori attesi). Limitazioni della esecuzione del test Per taluni analizzatori da coagulazione Dade Behring può fornire le istruzioni operative. L’utilizzo del Test Dade Behring ProC® Ac R su altri analizzatori per coagulazione deve essere validato dal laboratorio. È possibile che i dati così ottenuti differiscano da quelli forniti. Il Reagente Dade Behring ProC® Ac R è stato utilizzato per analizzare campioni di pazienti in terapia anticoagulante orale stabilizzata, di pazienti in terapia eparinica e con eparina a basso peso molecolare, e di pazienti con anticoagulanti lupus. I campioni di tali pazienti possono presentare tempi di coagulazione significativamente più lunghi rispetto ai campioni di soggetti normali. Tuttavia, poiché risultano prolungati anche i tempi di coagulazione con soluzione salina o con Soluzione Diluente CA Dade®, il rapporto ottenuto per il tempo di coagulazione con/senza attivatore rimane affidabile e mantiene il significato diagnostico. Dosi terapeutiche di irudina o di altri inibitori diretti della trombina mostrano tempi di coagulazione allungati. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti. Interferenze Campioni itterici, lipemici ed emolizzati e campioni con basso ematocrito non dovrebbero essere utilizzati per questo test, perché possono generare risultati non corretti (vedere NCCLS H21-A3 per ulteriori chiarimenti3). Attività bassa per i Fattori VII, VIII, IX e XII non interferiscono con il Test Dade Behring ProC® Ac R. Anche attività dei Fattori II e V superiori al 10% e di Fattore X superiori al 20% non hanno effetto sul test. All’inizio della terapia con anticoagulanti orali, es. prima della stabilizzazione, il Test Dade Behring ProC® Ac R può generare valori di ratio troppo bassi. Lo stesso fatto si verifica per concentrazioni di Proteina C inferiori al 50%. Valori attesi I valori (ratio) per i soggetti sani variano da laboratorio a laboratorio, in base alla procedura utilizzata. Pertanto, ogni laboratorio deve definire i propri intervalli di accettabilità in rapporto ai metodi e agli analizzatori utilizzati. In generale, valori di ratio inferiori o uguali a 1,5 indicano la variante Fattore V Leiden. Uno studio con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 ha evidenziato un limite decisionale pari a 1,8 per queste applicazioni analitiche. Valori di ratio tra 1,5 e 2,1 possono indicare basse concentrazioni di Proteina C e richiedono ulteriori indagini. Tali indagini potrebbero comprendere analisi specifiche per la Proteina C e per il DNA. Campioni con risultati positivi o dubbi dovrebbero essere confermati con analisi genetiche. Caratteristiche analitiche Sensibilità Diagnostica e Specificità Diagnostica Il Test Dade Behring ProC® Ac R è stato validato su strumentazione Stago STA• rispetto al metodo di analisi del DNA ed è stato definito un cut-off di 1,57 mediante analisi ROC. È stato poi eseguito uno studio di valutazione clinica presso tre centri indipendenti per valutare la capacità del Test Dade Behring ProC® Ac R di rilevare la mutazione del Fattore V (Q506). Il Test Dade Behring ProC® Ac R è stato confrontato con il Test Coatest•• APC•• Resistance V e con l’analisi del DNA, utilizzando un totale di 164 campioni (82 normali e 82 positivi per il Fattore V Leiden) di pazienti di età compresa tra 2 e 87 anni. La popolazione comprendeva pazienti con le seguenti condizioni cliniche: non trattati (49), DVT/PE o altre condizioni protrombotiche (58), terapia anticoagulante orale (36), eparina/eparina LMW (21), anticoagulanti lupus (12) e studi familiari (39). 163 su 164 pazienti sono stati correttamente identificati applicando il cut-off di 1,57 in tutti i siti, mostrando una sensibilità pari al 100% (limiti fiduciari: da 95,6 a 100%) e una specificità pari al 98.8% (limiti fiduciari 93,4 a 99,8%) rispetto al metodo su DNA. La validazione è stata eseguita su Stago STA•, Organon Teknika MDA••• 180 e utilizzando il metodo manuale ("tilt tube"). Un’ulteriore valutazione clinica del Test ProC® Ac R con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA7000 e CA-1500 ha definito il limite decisionale a 1,8 mediante analisi ROC. Sono state valutate la sensibilità diagnostica e la specificità diagnostica di queste applicazioni. Sono stati analizzati almeno 198 campioni freschi o congelati di donatori volontari sani non selezionati confermati negativi per il Fattore V Leiden, e di pazienti con stati patologici diversi confermati positivi per il Fattore V Leiden mediante PCR. I risultati sono riportati in Tabella 1: Tabella 1: Risultati dello studio di sensibilità diagnostica e specificità diagnostica per ProC® Ac R CA-1500 CA-7000 BCS® N 198 214 231 Cutoff 1,8 1,8 1,8 Specificità (%) 97,2 98,0 98,1 Sensibilità (%) 98,9 99,1 99,2 NPV (%) 99 99 99 PPV (%) 96,8 98,2 98,4 Le applicazioni del Test ProC® Ac R con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 sono stati confrontati con Coatest•• APC•• Resistance V su ACL 9000. Sono stati analizzati in totale 139 campioni di plasma fresco o congelato da donatori volontari sani non selezionati confermati negativi per il Fattore V Leiden mediante PCR e da pazienti con stati patologici diversi confermati positivi per il Fattore V Leiden mediante PCR. 138 campioni su 139 sono stati correttamente identificati dal Test ProC® Ac R con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e con Coatest•• APC•• Resistance V su ACL 9000. 137 su 139 sono stati correttamente identificati dal Test ProC® Ac R sul sistema Sysmex® CA-1500. Nota: Sensibilità e specificità del Test Dade Behring ProC® Ac R per lo screening dell’APC Resistance non FV Leiden dipendente non sono state definite. A causa delle differenze di popolazione, di tecniche di prelievo e di tecnologia strumentale, ogni laboratorio dovrebbe determinare il proprio cut-off. Precisione La massima precisione intra-serie (coefficiente di variazione intra-serie) è risultata pari a 1,9%. La massima precisione totale è risultata pari a 8,9% basandosi su due siti, strumenti e operatori con tre plasmi ripetuti in doppio per 20 giorni. Bibliografia Vedi testo Inglese. Garanzia Dade Behring garantisce che questo prodotto è conforme alle caratteristiche riportate sulla etichetta e nel materiale bibliografico relativo al prodotto stesso. Dade Behring declina ogni responsabilità per la commercializzazione o utilizzo del prodotto per scopi diversi da quelli dichiarati e in nessun caso Dade Behring potrà essere ritenuta responsabile di alcun danno che possa eventualmente verificarsi al di fuori di questa forma di garanzia. Dade è un marchio registrato di Dade Behring Inc. negli USA, in Germania ed in altri Paesi. ProC e BCS sono marchi registrati di Dade Behring Marburg in USA, Germania e altri Paesi. Sysmex è un marchio registrato della SYSMEX CORPORATION in USA, in Germania e in altri Paesi. • STA è un marchio registrato di Diagnostica Stago. •• Coatest e APC sono marchi registrati di Chromogenix AB •••MDA è un marchio registrato di Organon Teknika B. V. Reactivo PR3V: Liofilizado, contiene veneno de la serpiente Vipera Ruseli, diluido, rico en fosfolípidos (< 1 mg/l), fosfolípidos derivados de plantas (< 10 g/l), calcio (0,1 M) y un neutralizador de heparina (< 0,5 g/l). Agente de conservación: azida de sodio (< 0,01%) Advertencias y medidas de seguridad 1. Sólo para usar en diagnósticos in vitro 2. En el manejo de diagnósticos in vitro que contengan azida de sodio se debe observar: No ingerir y evitar el contacto con la piel y mucosas. La azida de sodio puede formar azidas explosivas con metales pesados como cobre y plomo. Preparación de los reactivos • Reconstituir el activador en 2,0 ml de agua destilada o desionizada sin agentes de conservación, como está descrito en la etiqueta. El producto diluido debe dar una solución azul verdosa, clara, sin partículas reconocibles. • Reconstituir el reactivo PR3V en 4,0 ml de agua destilada o desionizada, sin agentes de conservación, como está descrito en la etiqueta. El producto diluido debe dar una solución ligeramente turbia sin partículas reconocibles. • Para mezclar invierta cuidadosamente - no agite! • Incubar a temperatura ambiente (entre +15 y +25 °C) durante 10 minutos, antes de usar. • Mezclar los reactivos cuidadosamente una vez más antes de usarlos. Estabilidad y almacenaje Los reactivos liofilizados almacenados entre +2 y +8 °C, son estables hasta la fecha de vencimiento dada en la etiqueta. Estabilidad después de la reconstitución (frascos cerrados) Temperatura: ProC® Ac R ProC® Ac R Activador Reactivo PR3V entre +2 y +8 °C 2 semanas 2 semanas entre +20 y +25 °C 12 días 12 días a +37 °C 6 horas 6 horas a -20 °C 2 semanas 2 semanas Indicaciones de expiración: Si no existe vacío al abrir el frasco y/o el reactivo parece húmedo, devolver el reactivo a Dade Behring. Si el producto reconstituido muestra, claramente, señales de partículas o de contaminación o si no se disuelve completamente después de 15 minutos de agregarle el agua destilada o desionizada, póngase en contacto con Dade Behring o con su representante local. No congele y descongele más de una vez después de la reconstitución! Materiales adicionales necesarios pero no contenidos en el kit Citrato de sodio (0,11M o al 3,2%) para la toma se sangre Plasma control N, N° de pedido ORKE ProC® Plasma control, N° de pedido OQKE Agua destilada o desionizada sin agentes de conservación Tubos de plástico Pipetas para la medida exacta de 100 µl, 2,0 ml y 4,0 ml Baño de agua, mantenido a +37 °C Medidor de tiempo o cronómetro Solución salina fisiológica (0,15 M cloruro de sodio) para usar con los aparatos de medida de la coagulación BCS® Dade® Sistema tampón CA para usar con el sistema Sysmex® CA, N° de pedido B4265 o Dade® Tampón Veronal de Owren, N° de pedido B4234 Aparatos de medida de la coagulación (ver „Limitaciones del procedimiento“) Aparatos El test Dade Behring ProC® Ac R se puede usar manualmente o en una gran variedad de aparatos de medida de la coagulación. Observe el manual de operaciones dado por el fabricante del aparato! Toma y preparación de la muestra Edizione Febbraio 2005 ProC® Ac R Atención: Tratar todos los plasmas como potencialmente infecciosos! Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente 1 parte de solución de citrato de sodio (0,11 M) con 9 partes de sangre venosa recién tomada, evitando la formación de espuma. Centrifugar a continuación aprox. 1 500 x g durante 10 min. y pipetear el plasma sobrenadante. Al separar el plasma tener cuidado de no pipetear también las plaquetas. En caso de congelar la muestra, centrifugar de nuevo el plasma separado y congelarlo inmediatamente. Test para el screening de la resistencia a PCA Estabilidad de la muestra entre +2 y +8 °C 4 horas (plasma fresco) a -30 °C 6 meses (cuando antes de congelar, las plaquetas se retiran por doble centrifugación). Test de screening basado en el veneno de serpiente de Russell, para determinar la resistencia a la proteína C activada que puede ser causada por el defecto genético FV (Leiden). Procedimiento Campos de aplicación El test de Dade Behring ProC® Ac R es un test de coagulación funcional apropiado para el screening de la resistencia a la proteína C activada (PCA) en plasmas de personas con el defecto genético factor V (Leiden). El test se puede también realizar con plasmas de pacientes bajo una terapéutica con anticoagulantes orales estabilizada o bajo una terapéutica con heparina. Significado diagnóstico La resistencia a la proteína C activada (Resistencia PCA) está asociada con una mutación genética puntual del factor V [por ej., factor V (Leiden)]. La mutación conduce a un cambio del aminoácido arginina 506 (R) por glutamina (Q) en la proteína factor V1. Esta mutación retarda la inactivación del factor Va por medio de la PCA, aumentando de está forma la tendencia a la coagulación. La existencia del factor V (Leiden), en un 20-50% de todos los casos, es la causa más común de una trombofilia hereditaria2. Principio del método El test Dade Behring ProC® Ac R se basa en la activación de la proteína C endógena, por incubación del plasma con el veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix contortrix (Cabeza del cobre del sur) y en la realización posterior, con la muestra de plasma, de la determinación del „Russell’s Viper Venon Time“ (Tiempo de veneno de serpiente de Rusell) diluido (DRVVT, activador de veneno de serpiente para el factor X). El DRVVT reacciona de manera sensible a los cambios de concentración de la proteína C activada. En el caso de individuos normales, por medio de la activación de la proteína C, se van a prolongar los resultados del test de dos a tres veces en comparación con los del plasma sin activador. En personas con el factor V (Leiden) la activación de la proteína C con el veneno de serpiente causa solamente una prolongación marginal de los resultados, en comparación con los resultados del test sin activador (normalmente menos de 1,5 veces). Para minimizar el efecto sobre otros parámetros de la coagulación, se debe determinar la relación del tiempo de activación con y sin el activador del veneno de serpiente. La resistencia a la proteína C activada puede, también, ser ocasionada por otras mutaciones del gen del factor V [por ej., por FV (Cambrige) y FV (Hong Kong)]. Reactivos Contenido del envase comercial Test ProC® Ac R Test kit, N° de pedido OPBC con 5 x para 4,0 ml Reactivo PR3V 5 x para 2,0 ml Reactivo activador Suficiente para realizar 100 ensayos manuales de coagulación (100 ensayos con activador y 100 ensayos sin activador). Nota: El número de ensayos obtenidos con un aparato de medida de la coagulación específico puede variar. Composición: Reactivo activador: Liofilizado, contiene veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/l) en solución tampón estabilizante. Agente de conservación: azida de sodio (< 0,01%) OPBC G03 C0542 (526) H/CS 6 Manual: Test con activador: 1. Precalentar a +37 ± 1 °C una cantidad suficiente del reactivo PR3V en un tubo de ensayo, calculando 0,1 ml por test. 2. Colocar 0,1 ml del plasma test en un tubo de ensayo. 3. Agregar 0,1 ml del activador al plasma test e incubar a +37 ± 1 °C por exactamente 5 minutos. 4. Añadir 0,1 ml del reactivo PR3V precalentado a +37 ±1 °C y accionar inmediatamente el cronómetro para determinar el tiempo de coagulación. 5. Repetir la medida para una doble determinación y dar el valor promedio de ambas determinaciones como resultado del test. Test sin activador: 1. Precalentar a +37 ± 1 °C una cantidad suficiente del reactivo PR3V en un tubo de ensayo, calculando 0,1 ml por test. 2. Colocar 0,1 ml del plasma test en un tubo de ensayo. 3. Agregar 0,1 ml del solución salina al plasma test e incubar a +37 ± 1 °C por exactamente 5 minutos. 4. Añadir 0,1 ml del reactivo PR3V precalentado a +37 ±1 °C y accionar inmediatamente el cronómetro para determinar el tiempo de coagulación. 5. Repetir la medida para una doble determinación y dar el valor promedio de ambas determinaciones como resultado del test. Automático: Protocolos del test para los aparatos de medida de la coagulación de Dade Behring pueden ser solicitados a Dade Behring. Dade Behring ha comprobado el uso de este reactivo en diferentes aparatos de análisis con relación al rendimiento optimo del producto y al cumplimiento de las especificaciones del producto. Dade Behring no apoya modificaciones propuestas por el usuario, ya que esto puede influenciar las características del sistema y los resultados del test. Es la responsabilidad del usuario validar las variaciones de estas instrucciones o el uso del reactivo en otros aparatos de análisis diferentes a los dados por Dade Behring en las direcciones de aplicación o los nombrados en este boletín. Control de calidad interno Rango normal: Plasma control N Rango patológico: ProC® Plasma control Se deben medir dos controles (uno en el rango normal y uno con FV Leiden positivo). Un plasma de control normal se puede preparar a partir de plasma frescos, recién tomados, que hayan sido chequeados para la mutación FV-Leiden y que hayan dado un resultado negativo. Los plasmas deben purificarse el día de la toma y congelarse en alícuotas pequeñas, para usar más tarde. Como control positivo se puede usar una alícuota del plasma de un portador del FV Leiden. Los plasmas se deben mantener a -70 °C hasta el momento de usarse. El material de control debe prepararse y tratarse de la misma forma que las muestras. Para cada plasma control se deben establecer límites apropiados, realizando para esto estudios de precisión según las normas del NCCLS. Estas normas recomiendan la determinación de los controles al comienzo de una serie de medidas, por lo menos una vez en un turno de 8 horas y para cada cambio de reactivo. Cada laboratorio debe, con cada lote del test ProC® Ac R, determinar para los dos controles sus propios rangos de control de calidad, ya sea en base a los valores y rangos teóricos dados o a los valores de control determinados por el mismo laboratorio. Este es normalmente ± 2,5 desviaciones estándar del valor control promedio. Si los valores de control medidos se encuentran por fuera del rango de control antes establecido, los resultados del paciente no se deben entregar hasta que el problema no haya sido identificado, corregido y documentado. Comprobar que parte del sistema aparato/reactivo/control no ha funcionado correctamente y corregirla. Después de implementar las medidas correctivas y de documentar de acuerdo a good laboratory practice (GMP), medir de nuevo los controles. Si después de esto, los controles se encuentran dentro del rango de confianza, se pueden chequear las muestras de los pacientes y reportar sus resultados. Resultados Los resultados de las medidas se deben expresar como relación (radio): Tiempo de coagulación PR3V con activador ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Tiempo de coagulación PR3V con sol. salina o Dade® Sistema tampón CA Dade Behring ProC® Ac R Radio= Bibliografía Ver boletín informativo en inglés. Garantía Se garantiza, que el modo de acción de este producto corresponde con los datos dados en el envase y en este boletín informativo. Dade Behring no responde por la calidad usual en el comercio o la idoneidad del producto, en caso de que el producto sea utilizado con otros fines diferentes a los indicados, como tampoco por daños consecutivos que resulten de la garantía arriba estipulada. Dade es una marca de fabrica registrada de Dade Behring Inc. en USA, Alemania y otros países. ProC y BCS son marcas de fábrica registradas de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países. Sysmex es una marca de fábrica registrada de SYSMEX CORPORATION en USA, Alemania y otros países. • STA es una marca de fábrica de Diagnostica Stago •• Coatest y APC son marcas de fábrica de Chromogenix AB ••• MDA es una marca de fábrica de Organon Teknika B.V. Los resultados obtenidos en el test Dade Behring ProC® Ac R para un pool de plasmas en el rango normal, usando activador deben ser dos a tres veces más grandes que los resultados para el pool de plasmas en el rango normal sin activador (ver Valores esperados). Limitaciones del procedimiento Hay aparatos de medida de la coagulación, apropiados, para los cuales Dade Behring facilita las instrucciones de operación. El uso del test Dade Behring ProC® Ac R en otros aparatos de medida de la coagulación debe ser validado por el laboratorio investigador. En este caso, se pueden presentar valores diferentes a los dados para las características del test. Ensayos con los reactivo Dade Behring ProC® Ac R fueron hechos con muestras de pacientes bajo una terapéutica con anticoagulantes orales, estabilizada, pacientes bajo una terapéutica con heparina y con heparina de bajo peso molecular, así como, con pacientes con anticoagulante lúpico. Las muestras de estos pacientes pueden mostrar tiempos de coagulación significantemente más largos que las muestras de individuos normales. Sin embargo, dado que los tiempos de coagulación con la solución salina o con el Dade® Sistema tampón CA, están igualmente prolongados, el cociente derivado de los tiempos de coagulación con/sin activador permanece confiable y el significado diagnóstico se mantiene. Dosis terapéuticas de hirudina o de otros inhibidores directos de trombina conducen a prolongación de los tiempos de coagulación. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones. Interferencias Muestras ictéricas, lipémicas y hemolíticas, así como, muestras con un hematócrito bajo no deben ser usadas en este test, ya que estas pueden conducir a resultados incorrectos (comparar con NCCLS H21-A3 para mayor aclaración3). Las bajas actividades de los factores VII, VIII, IX y XII no influyen sobre el test Dade Behring ProC® Ac R Las actividades de los factores II y V superiores al 10% y del factor X por encima del 20% no tienen, igualmente, ninguna influencia sobre el test. Al comienzo del tratamiento con anticoagulantes orales, por ej., antes de la estabilización, el test Dade Behring ProC® Ac R puede dar radios que son demasiado bajos. Lo mismo es válido para concentraciones de proteína C por debajo del 50%. Valores esperados Los valores (radio) de personas sanas varían de laboratorio a laboratorio dependiendo del procedimiento usado. Por esto, cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de referencia basados en el método y en el aparato de medida de la coagulación usados. En general, radios más pequeños o iguales a 1,5 indican la variante del factor V (Leiden). En un estudio con los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 y CA- 1500 se calculó un limite de decisión de 1,8 para esta aplicación. Radios entre 1,5 y 2,1 permiten suponer concentraciones bajas de proteína C y deben seguirse investigando. Estas investigaciones pueden incluir test específicos para proteína C y test para DNA. Las muestras con resultados positivos o de valor limítrofe deben ser comprobadas por análisis genético. Características del test Sensibilidad diagnóstica y especificidad diagnóstica El test Dade Behring ProC® Ac R fue validado en un aparato Stago STA• en comparación con un método de análisis del DNA y se estableció un cut-off de 1,57 mediante un análisis ROC. En tres centros de investigación independientes, se efectuaron estudios de validación clínica para evaluar la habilidad del test Dade Behring ProC® Ac R para detectar la mutación del factor V (Q506). El test Dade Behring ProC® Ac R se comparó con el test Coatest•• APC•• Resistance V y el análisis del DNA. Para esto, se usaron un total de 164 muestras (82 normales y 82 con factor V Leiden positivo) de pacientes con edades entre 2 y 87 años. La población cubría pacientes con las siguientes condiciones clínicas: sin tratar (49), DVT/PE u otras condiciones protrombóticas (58), anticoagulantes orales (36), Heparina/ Heparina LMW (21), anticoagulante lúpico (12) o estudios familiares (39). 163 de los 164 pacientes fueron identificados correctamente en todos los sitios con ayuda de un cut-off de 1,57, dando una sensibilidad del 100% (rango de confianza: 95,6 hasta 100%) y una especificidad del 98,8% (rango de confianza de 93,4 hasta 99,8%) relativo al método del DNA. A validação foi executada no Stago STA•, no Organon Teknika MDA••• 180 e com uma técnica manual ("tilt tube"). Una evaluación clínica adicional del test ProC® AC R con los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 y CA-1500 dio, mediante un análisis - ROC, un límite de desición de 1,8. Para estas aplicaciones se evaluaron la sensibilidad diagnóstica y la especifidad diagnóstica. Se estudiaron por lo menos 198 muestras frescas y/o congeladas de donantes de sangre, no seleccionados, voluntarios, sanos, con factor V de Leiden negativo (estado confirmado por PCR), así como de portadores del factor V de Leiden, PCR positivo, con diferentes estadios de la enfermedad. Los resultados están dados en la Tabla 1. Tabla 1: Resultados de la sensibilidad y especificidad diagnóstica para ProC® AC R CA-1500 CA- 7000 BCS® N 198 214 231 Cutoff 1,8 1,8 1,8 Especificidad (%) 97,2 98,0 98,1 Sensibilidad (%) 98,9 99,1 99,2 NPV (%) 99 99 99 PPV (%) 96,8 98,2 98,4 Las aplicaciones con el ProC® AC R en los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 y CA-1500 se compararon con el test Coatest•• APC•• Resistance V en el sistema ACL 9000. En general, se estudiaron 139 muestras frescas y/o congeladas de donantes de sangre, no seleccionados, voluntarios, sanos, los cuales eran PCR negativos para factor V de Leiden, así como de pacientes PCR positivos para factor V de Leiden, en diferentes estadios de la enfermedad. 138 de las 139 muestras fueron determinadas correctamente tanto por el test ProC® AC R, con los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000, como por el test Coatest•• APC•• Resistance V en el sistema ACL 9000. 137 de las 139 muestras antes nombradas fueron reconocidas correctamente por el test ProC® AC R en el sistema Syxmex® CA-1500. Nota: La sensibilidad y la especificidad del test Dade Behring ProC® Ac R para el screening de la resistencia a APC, que no se atribuya al defecto genético Factor V (Leiden), no fueron estudiadas. Debido a las diferencias en la población de las muestras, en la técnica de la toma y en la técnica de los aparatos, cada laboratorio investigador deberá determinar su propio cut-off. Precisión Precisión en la serie (Coeficiente de variación intra assay): máximo 1,9%. La precisión total se determinó en tres plasmas, en dos sitios, con determinaciones dobles, durante más de 20 días obteniéndose un coeficiente de variación de máximo 8,9%. OPBC G03 C0542 (526) H/CS 7 Edición Febrero 2005 ProC® Ac R Teste de rastreio da resistência APC Teste de rastreio baseado no veneno da víbora Russel, para determinação da resistência à proteína C activada, causada pelo defeito genético FV (Leiden). Campo de aplicação O teste ProC® Ac R da Dade Behring é um teste de coagulação funcional, adequado para o rastreio da resistência à proteína C activada (APC) no plasma de indivíduos com o factor V (Leiden). O teste também pode ser executado com plasma de pacientes sujeitos a uma terapia oral estável de anticoagulantes ou terapia de heparina. Significado diagnóstico A resistência à proteína C activada (resistência APC), é causada pela mutação de um ponto no gene do factor V [p. ex., factor V (Leiden]. A mutação provoca uma substituição do aminoácido arginina 506 (R) pela glutamina (Q) na proteína do factor V1. Esta mutação retarda a inactivação do factor Va pela APC, provocando, assim, um aumento da tendência de coagulação. Em 20 a 50% de todos os cacos, a existência do factor V (Leiden) é a causa principal da trombofilia hereditária2. Princípio metodológico O teste ProC® Ac R da Dade Behring baseia-se na activação da proteína C endógena através da incubação do plasma com o veneno da serpente Agkistrodon contortrix contortrix (cabeça de cobre meridional). Seguidamente, com a amostra de plasma é executada uma determinação com diluição do “Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, activador de veneno de serpente para o factor X). O DRVVT reage de forma sensível às alterações da concentração da proteína C activada. Nos indivíduos normais, devido à activação da proteína C, o resultado do teste com o activador é prolongado duas a três vezes, quando comparado com o resultado do teste com tampão. Nos indivíduos com o factor V (Leiden), a activação da proteína C pelo veneno de serpente provoca apenas um prolongamento insignificante em relação ao resultado do teste com o tampão (normalmente inferior a 1,5 vezes). Para minimizar o efeito dos outros parâmetros de coagulação, deverá ser determinada a relação entre o tempo de coagulação com activador do veneno de serpente e a coagulação sem o activador do veneno de serpente. A resistência à proteína C activada também pode ser causada por outras mutações no gene do factor V [p. ex., pelo FV (Cambridge) e o FV (Hong Kong)]. Reagentes Conteúdo da embalagem comercial Teste ProC ® Ac R Kit de teste, ref. OPBC com 5 x para 4,0 ml de reagente PR3V 5 x para 2,0 ml de reagente activador Suficiente para executar 100 testes de coagulação manuais (100 testes com activador e 100 testes sem activador). Nota: O número de testes que se pode obter com um coagulómetro específico pode variar. Composição: Reagente activador: Liofilizado, contém veneno de serpente Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/l) numa solução tampão estabilizada. Conservante: Azida de sódio (< 0,01%) Reagente PR3V: Liofilizado, contém veneno de serpente diluído, rico em fosfolípidos, da Vipera Russeli, (< 1 mg/l), fosfolípidos vegetais (< 10 g/l), cálcio (0,1 M) e um neutralizador de heparina (< 0,5 g/l). Conservante: Azida de sódio (< 0,01%) Advertências e medidas de precaução 1. Só para uso diagnóstico in vitro. 2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de azida de sódio: Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas! Com metais pesados, como o cobre ou o chumbo, a azida de sódio pode formar azidas explosivas! Preparação dos reagentes • Reconstituir o activador em 2,0 ml de água destilada ou desionizada sem substâncias conservantes, como indicado no rótulo do frasco. O produto diluído deverá resultar numa solução verde pálida clara sem resíduos de partículas perceptíveis. • Reconstituir o reagente PR3V em 4,0 ml de água destilada ou desionizada sem substâncias conservantes, como indicado no rótulo do frasco. O produto diluído deverá resultar numa solução ligeiramente turva sem resíduos de partículas perceptíveis.. • Para misturar, inverter cuidadosamente - não agitar! • Antes de usar, incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (+15 a + 25 °C). • Antes de usar, misturar os reagentes cuidadosamente uma vez mais. Estabilidade e condições de conservação Os reagentes liofilizados deverão ser conservados entre +2 e +8 °C e são estáveis até à data indicada no rótulo. Estabilidade após reconstituição (frasco fechado) Temperatura: ProC® Ac R ProC® Ac R Activador Reagente PR3V entre +2 e +8 °C 2 semanas 2 semanas entre +20 e +25 °C 12 dias 12 dias a +37 °C 6 horas 6 horas a -20 °C 2 semanas 2 semanas Indício de deterioração: No caso de não existir vácuo ao abrir o frasco e/ou o reagente ter o aspecto molhado, deverá ser devolvido à Dade Behring. Se o produto reconstituído apresentar sinais claros de substâncias suspensas ou contaminação ou não se dissolver integralmente 15 minutos após a adição de água destilada ou desionizada, por favor contacte a Dade Behring ou o seu distribuidor local. Depois da reconstituição, não congelar ou descongelar mais do que uma vez! Outros materiais necessários não constantes do kit Citrato de sódio (0,11 M ou 3,2%) para a colheita do sangue Plasma de controlo N, ref. ORKE Plasma de controlo ProC®, ref. OQKE Água destilada ou desionizada sem substâncias conservantes Tubinhos de plástico Pipetas de 100 µl, 2,0 ml e 4,0 ml para uma medição precisa Banho-maria temperado a +37 °C Cronómetro ou cronógrafo Solução fisiológica de cloreto de sódio (0,15 M de cloreto de sódio) para utilizar com o coagulómetro BCS® Tampão sistema CA da Dade® para utilizar com os sistemas CA Sysmex®, ref. B4265 ou Tampão veronal de Owren da Dade®, ref. B4234 Coagulómetro (veja “Limite de execução do teste”) Instrumentos O teste ProC® Ac R da Dade Behring pode ser utilizado manualmente ou numa multiplicidade de coagulómetros. Por favor observe o manual de utilização do fabricante do aparelho! Colheita e preparação de amostras Atenção: Todos os plasmas deverão ser tratados como potencialmente infecciosos! Para obtenção do plasma, misturar cuidadosamente 1 parte de solução de citrato de sódio (0,11 M) com 9 partes de sangue venoso colhido de fresco, evitando a formação de espuma. Centrifugar, imediatamente, durante 10 min., no mínimo, a 1500 x g e retirar com a pipeta o plasma sobrenadante. Ao separar o plasma, prestar atenção a que não sejam retiradas com a pipeta plaquetas sanguíneas. Se for necessário congelar a amostra, centrifugar, novamente, o plasma separado e congelá-lo imediatamente. Estabilidade da amostra Entre +2 e +8 °C 4 horas (plasma fresco) a -30 °C 6 meses (se, antes da congelação, as plaquetas forem eliminadas através de centrifugação dupla). Execução do teste Manual: Teste com activador: 1. Incubar, previamente, a +37 ± 1 °C uma quantidade suficiente de reagente PR3V num recipiente de reacção, tomando em consideração que a quantidade por teste deve ser de 0,1 ml. 2. Adicionar 0,1 ml do plasma de teste ao recipiente de reacção. 3. Adicionar 0,1 ml de activador ao plasma de teste e incubar, exactamente, durante 5 minutos a +37 ± 1 °C. 4. Ao adicionar 0,1 ml do reagente PR3V pré-incubado a +37 ± 1 °C, por em marcha o cronógrafo e determinar o tempo de coagulação. 5. Repetir a medição para a determinação dupla e indicar o valor médio das duas determinações como resultado. Teste sem activador: 1. Incubar, previamente, a +37 ± 1 °C uma quantidade suficiente de reagente PR3V num recipiente de reacção, tomando em consideração que a quantidade por teste deve ser de 0,1 ml. 2. Adicionar 0,1 ml do plasma de teste ao recipiente de reacção. 3. Adicionar 0,1 ml de solução de cloreto de sódio ao plasma de teste e incubar, exactamente, durante 5 minutos a +37 ± 1 °C. 4. Ao adicionar 0,1 ml do reagente PR3V pré-incubado a +37 ± 1 °C, por em marcha o cronógrafo e determinar o tempo de coagulação. 5. Repetir a medição para a determinação dupla e indicar o valor médio das duas determinações como resultado. Automática: A pedido, a Dade Behring disponibiliza protocolos de teste para os coagulómetros. A Dade Behring controlou a utilização destes reagentes em vários analisadores, em termos de performance e manutenção das especificações do produto. As alterações efectuadas pelo utilizador não são promovidas pela Dade Behring, uma vez que podem afectar a performance do sistema e os resultados do teste. As alterações destas instruções ou a utilização destes reagentes noutros analisadores que não os validados nas instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização são da responsabilidade do utilizador. Controlo de qualidade interno Intervalo normal: Plasma de controlo N Intervalo patológico: Plasma de controlo ProC® Deverão ser medidos dois controlos (um no intervalo normal e um FV Leiden positivo). O plasma de controlo normal pode ser preparado a partir de plasmas colhidos de fresco, que foram testados em termos de mutação do FV Leiden e apresentaram um resultado negativo. Os plasmas deverão ser juntos no dia da colheita e congelados em pequenas alíquotas para utilização posterior. Para o controlo positivo, pode ser utilizada uma alíquota de plasma de um portador de FV Leiden. Até serem utilizados, os plasmas deverão ser congelados a -70 °C. O material de controlo deverá ser preparado e tratado da mesma forma que as amostras. Para cada plasma de controlo deverão ser estabelecidos limites adequados, executando-se análises precisas de acordo com as directivas do NCCLS. Estas directivas recomendam que se faça a determinação de controlos no início de uma série de medições, uma vez num turno de 8 horas, no mínimo, e sempre que o reagente seja substituído. Para cada lote do teste ProC® Ac R, cada laboratório deverá determinar para os dois controlos o seu intervalo de controlo de qualidade próprio, com base nos valores e intervalos teóricos do fabricante dos controlos, ou com base em valores de controlo determinados no laboratório. Geralmente, este perfaz ± 2,5 desvios standard do valor de controlo médio. Se os valores de controlo medidos se situarem fora do intervalo de controlo definido previamente, os resultados dos pacientes não devem ser reportados até o problema ser identificado, corrigido e documentado. Verifique qual a parte do aparelho/reagente/sistema de controlo que não funciona irrepreensivelmente e corrija-a. Depois de terem sido implementadas medidas correctivas e documentadas com respeito pelas boas práticas laboratoriais (GMP), os controlos deverão ser testados de novo. Se se situarem agora dentro do intervalo de confiança, as amostras dos pacientes podem ser testadas e os resultados obtidos podem ser reportados. Resultados Os resultados de medição deverão ser expressos numa relação (ratio): Tempo de coagulação PR3V com activador –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Tempo de coagulação PR3V com solução de cloreto de sódio ou tampão sistema CA Dade® Ratio ProC® Ac R Dade Behring = Os resultados obtidos com o teste ProC® Ac R da Dade Behring no intervalo normal para um pool de plasma utilizando o activador, deverão ser duas a três vezes superiores aos resultados para um pool de plasma no intervalo normal sem activador (veja Resultados expectáveis). Limites de execução do teste São adequados os coagulómetros para os quais a Dade Behring disponibiliza instruções de utilização. A utilização do teste ProC® Ac R da Dade Behring noutros coagulómetros tem de ser validada pelo laboratório da análise. Neste caso, podem obter-se outras características de performance que não as indicadas. Com o reagente ProC® Ac R da Dade Behring foram executados testes com amostras de pacientes sujeitos a uma terapia oral estável de anticoagulantes, terapia de heparina ou terapia de heparina com baixo teor de moléculas e amostras de pacientes com anticoagulante Lúpus. As amostras destes pacientes podem apresentar tempos de coagulação substancialmente mais prolongados do que as amostras dos indivíduos normais. Contudo, como os tempos de coagulação também são prolongados com solução de cloreto de sódio ou o tampão sistema CA da Dade®, o quociente resultante do tempo de coagulação com/sem activador permanece fiável e a validade do diagnóstico mantém-se. OPBC G03 C0542 (526) H/CS 8 Doses terapêuticas de hirudina ou outros inibidores directos da trombina provocam tempos de coagulação prolongados. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse. Interferências As amostras ictéricas, lipémicas e hemolíticas, assim como as amostras com hematócrito baixo não deverão ser utilizadas com o presente teste, uma vez que podem causar resultados erróneos (compare com NCCLS H21-23, para mais explicações3). Baixas actividades dos factores VII, VIII, IX e XII não afectam o teste ProC® Ac R da Dade Behring. Actividades dos factores II e V superiores a 10% e do factor X superiores a 20% também não têm qualquer influência sobre o teste. No início do tratamento com anticoagulantes orais, ou seja, antes do estado de estabilização, o teste ProC® Ac R da Dade Behring pode conduzir a ratios baixos. O mesmo é válido para as concentrações de proteína C inferiores a 50%. Valores expectáveis Os valores (ratio) de indivíduos saudáveis variam de laboratório para laboratório em função do processo utilizado. Por isso, cada laboratório deverá determinar intervalos de referência próprios, com base no método e coagulómetro utilizados. Geralmente, as relações inferiores ou iguais a 1,5 indiciam a variante do factor V (Leiden). Num estudo com os sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 foi determinado um limite de decisão de 1,8 para esta aplicação. Os ratios entre 1,5 e 2,1 fazem supor a existência de concentrações baixas de proteína C e deverão continuar a ser investigados. Essas investigações podem conter testes específicos para a proteína C e testes de DNA. As amostras com resultados positivos ou duvidosos deverão ser confirmadas por uma análise genética. Características de performance do teste Sensibilidade e especificidade diagnósticas O teste ProC® Ac R da Dade Behring foi validado num aparelho Stago STA•, em comparação com o método analítico DNA e foi determinado um Cut-off de 1,57 através da análise ROC. Foram executados estudos clínicos de validação em três centros de teste independentes, para avaliar a eficácia do teste ProC® Ac R da Dade Behring na detecção da mutação do factor V (Q506). O teste ProC® Ac R da Dade Behring foi comparado com o teste Coatest•• APC•• Resistance V e a análise de DNA. Neste caso, foi utilizado um total de 164 amostras de pacientes (82 normais e 82 positivas com factor V Leiden) com idade compreendida entre os 2 e os 87 anos. A população abrangeu pacientes com as seguintes condições clínicas: não tratados (49) DVT/PE e outras condições pró –trombóticas (58), anticoagulados oralmente (36), heparina/heparina LMW (21), anticoagulante Lúpus (12) ou estudos com afinidade familiar (39). Com a ajuda de um Cut-off de 1,57 foram identificados por todas as entidades examinadoras 163 pacientes de um total de 164. Resultou, daí, uma sensibilidade de 100% (intervalo de confiança: 95,6 a 100%) e especificidade de 98,8% (intervalo de confiança de 93,4 a 99,8%), relativamente ao método DNA. A validação foi executada no Stago STA•, no Organon Teknika MDA••• 180 e com uma técnica manual ("tilt tube"). Uma outra avaliação clínica do teste ProC® Ac R com os sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 através da análise ROC, produziu um resultado de limite de decisão de 1,8. Foram avaliadas a sensibilidade e a especificidade diagnósticas para estas aplicações. Foram testadas, no mínimo, 198 amostras de sangue frescas e/ou congeladas de dadores voluntários saudáveis, não seleccionados, com factor V Leiden negativo (estado confirmado por PCR), assim como amostras de portadores do factor V Leiden positivo com vários estádios da doença. Os resultados estão apresentados na tabela 1. Tabela 1: Resultados do estudo de sensibilidade e especificidade diagnósticas para ProC® Ac R CA-1500 CA-7000 BCS N 198 214 231 Cutoff 1,8 1,8 1,8 Especificidade % 97,2 98,0 98,1 Sensibilidade % 98,9 99,1 99,2 NPV % 99 99 98 PPV % 96,8 98,2 98,4 As aplicações ProC® Ac R nos sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 foram comparadas com o Coatest•• APC•• Resistance V no sistema ACL 9000. Foi testado um total de 139 amostras frescas e/ou congeladas de dadores voluntários saudáveis, não seleccionados, que eram PCR -negativos para o factor V Leiden, assim como amostras de pacientes PCR -positivos para o factor V Leiden com vários estádios da doença. Destas 139 amostras, 138 foram determinadas, correctamente, pelo teste ProC® Ac R, com os sistemas Dade Behring BCS® e Sysmex® CA-7000, assim como pelo Coatest•• APC•• Resistance V no sistema ACL 9000. Das 139 amostras, 137 foram detectadas, correctamente, com o teste ProC® Ac R no sistema Sysmex® CA-1500. Nota: Não foram determinadas a sensibilidade e a especificidade do teste ProC® Ac R da Dade Behring para rastreio das resistências APC que não se baseiam no defeito genético FV Leiden. Devido às diferenças na população de amostras, técnica de colheita e técnica instrumental, cada laboratório deverá determinar o seu cut-off próprio. Precisão Precisão na série (coeficiente de variação intra-ensaio): máximo 1,9%. A precisão total foi determinada por duas entidades examinadoras com determinações duplas durante um período de tempo superior a 20 dias e forneceu um coeficiente de variação máximo de 8,9%. Bibliografia Veja o folheto da embalagem em inglês. Garantia Garante-se que a eficácia deste produto corresponde aos dados indicados na embalagem e na bibliografia do produto. Dade Behring declina a garantia habitual na actividade comercial e de adequação do produto, caso este seja utilizado para outros fins que não os indicados e em caso algum será responsabilizada pelos prejuízos decorrentes das garantias contratuais acima referidas. Dade é uma marca registada da Dade Behring Inc. nos EUA, Alemanha e noutros países. ProC e BCS são marcas registadas da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, Alemanha e noutros países. Sysmex é uma marca registada da SYSMEX CORPORATION nos EUA, Alemanha e noutros países. • STA é uma marca da Diagnostica Stago •• Coatest e APC são marcas da Chromogenix AB •••MDA é uma marca da Organon Teknika B.V. Edição Fevereiro 2005