Monolisa™ HBs Ag ULTRA 1 placa - Bio-Rad

Monolisa™ HBs Ag ULTRA
1 placa - 96 pruebas
5 placas - 480 pruebas
72346
72348
KIT PARA LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS
DE LA HEPATITIS B POR EL MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO
EN EL SUERO O EL PLASMA HUMANO
IVD
Control de calidad del fabricante
Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad se hallan bajo un
sistema de garantía de calidad desde la recepción de las materias primas hasta la
comercialización de los productos finales.
Cada lote de producto final se somete a un control de calidad y sólo se comercializa si está en
conformidad con los criterios de aceptación.
El fabricante conserva la documentación referente a la producción y al control de cada lote.
ÍNDICE DE MATERIAS
1 - OBJETIVO DE LA VALORACIÓN
2 - INTERÉS CLÍNICO
3 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA Monolisa™ HBs Ag ULTRA
4 - COMPOSICIÓN DEL KIT Monolisa™ HBs Ag ULTRA
5 - PRECAUCIONES
6 - RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD
7 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
8 - PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
9 - CONSERVACIÓN - VALIDEZ
10 - MUESTRAS
11 - PROCEDIMIENTO
12 - ADAPTACIÓN
13 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
14 - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN
DE LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO
15 - ESPECIFICACIONES
16 - LÍMITES DE LA PRUEBA
17 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1 - OBJETIVO DE LA VALORACIÓN
Monolisa™ HBs Ag ULTRA es una técnica inmunoenzimática de tipo "sandwich" en 1 tiempo para la
detección del antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (Ag HBs) en el suero o el plasma humano.
2 - INTERÉS CLÍNICO
La presencia del Ag HBs en el suero indica una infección por el virus de la Hepatitis B. Es el primer marcador
que aparece y puede preceder de 2 a 3 semanas a los signos clínicos y biológicos de la enfermedad. Su
presencia puede ser muy breve (algunos días) o muy larga (varios años). Cuando la persistencia del Ag HBs
supera los 6 meses, la Hepatitis se considera "crónica".
La existencia de numerosos portadores crónicos asintomáticos hace que la Hepatitis B represente un
importante riesgo transfusional. La prevención de la transmisión se basa en la detección del Ag HBs en cada
donación de sangre.
3 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA Monolisa™ HBs Ag ULTRA
Monolisa™ HBs Ag ULTRA es una técnica inmunoenzimática de tipo "sandwich" en 1 tiempo utilizando
anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales seleccionados por su capacidad de unirse a los
diferentes subtipos del Ag HBs actualmente reconocidos por la OMS y la mayoría de las cepas variantes de la
hepatitis B.
La fase sólida de Monolisa™ HBs Ag ULTRA está sensibilizada con anticuerpos monoclonales.
Los conjugados de Monolisa™ HBs Ag ULTRA se basan en la utilización de anticuerpos monoclonales de
ratón y de anticuerpos policlonales de cabra contra el Ag HBs. Estos anticuerpos están conjugados con
peroxidasa.
La valoración incluye las siguientes etapas :
1) Distribución de las muestras y de los sueros control en los pocillos de la microplaca.
Esta distribución puede controlarse visualmente: en efecto, se observa una clara diferencia de coloración
entre un pocillo vacío y un pocillo que contenga una muestra. También puede controlarse mediante la
lectura espectrofotométrica a 490/620-700 nm (opcional).
2) Distribución del conjugado.
Esta distribución también puede controlarse visualmente: en efecto, tras añadir el conjugado, de color
rojo, el pocillo se colorea en rojo. Además de verificarse mediante la lectura espectrofotométrica a
490/620-700 nm (opcional), en esta etapa de la manipulación también puede controlarse la distribución
de las muestras por la lectura espectrofotométrica a 490/620-700 nm.
3) Tras la incubación durante una hora y media a 37°C, el conjugado no unido se elimina con el lavado.
4) Distribución de la solución de revelado de la actividad enzimática.
Igualmente, esta distribución puede controlarse visualmente : hay una clara diferencia de coloración entre
un pocillo vacío y un pocillo que contiene el sustrato de color rosa. Así mismo, puede verificarse mediante
la lectura espectrofotométrica a 490 (opcional).
5) Tras 30 minutos de incubación en presencia del sustrato, en oscuridad y a temperatura ambiente (1830°C), la presencia del conjugado se demuestra con un cambio en el color.
6) Distribución de la solución de parada.
Esta distribución puede controlarse también visualmente: la coloración del sustrato, rosada (para las
muestras negativas) o azul (para las muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven
incoloros (en el caso de muestras negativas) o amarillos (en el caso de las muestras positivas) tras la
adición de la solución de parada.
7) Lectura de las densidades ópticas a 450/620-700 nm e interpretación de los resultados.
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4 – COMPOSICIÓN DEL KIT Monolisa™ HBs Ag ULTRA
Todos los reactivos están exclusivamente destinados para uso de diagnóstico in vitro.
ETIQUETADO
NATURALEZA DE LOS REACTIVOS
R1
MICROPLACA : 12 tiras de 8 pocillos sensibilizados
con anticuerpos monoclonales anti-HBs (ratón)
R2
SOLUCIÓN DE LAVADO concentrada (20X)
Tampón tris, NaCI, pH = 7,4
Conservante : ProClinTM 300 (0,04%)
R3
CONTROL NEGATIVO
Tampón Tris HCl, que contiene SAB.
Conservante : ProClinTM 300 (0,1%)
R4
PRESENTACIÓN
72346
72348
1 microplaca 5 microplacas
1 frasco
70 ml
1 frasco
235 ml
2 frascos
2 x 2,5 ml
2 frascos
2 x 2,5 ml
CONTROL POSITIVO (Humano)
Tampón Tris HCl, que contiene SAB adicionado con una
mezcla de Ag HBs purificados de los subtipos ad y ay, (humanos)
Conservante : ProClinTM 300 (0,1 %)
1 frasco
2,5 ml
1 frasco
2,5 ml
R6
DILUYENTE CONJUGADO Tampón Tris HCl pH 7.4
adicionado con BSA, Tween® 20, inmunoglobulinas de buey y
de ratón, y de un indicador coloreado como control
de la distribución.
Conservantes : Ciprofloxacina (10 μg/ml), ProClinTM 300 (0,1%)
1 frasco
8 ml
2 frascos
2 x 18 ml
R7
CONJUGADO Anticuerpos monoclonales anti-HBs
de ratón y anticuerpos policlonales anti-HBs de cabra
conjugados con peroxidasa. Liofilizado.
1 frasco
csp 8 ml
2 frascos
csp 2 x 18 ml
R8
TAMPÓN SUSTRATO DE LA PEROXIDASA
Solución de ácido cítrico y acetato de sodio pH 4,0 que
contiene 0,015% de H2O2 y 4% de dimetilsulfóxido (DMSO)
1 frasco
60 ml
2 frascos
2 x 60 ml
R9
CROMÓGENO coloreado en rosa :
Solución que contiene tetrametilbenzidina (TMB)
1 frasco
5 ml
2 frascos
2 x 5 ml
SOLUCIÓN DE PARADA
Solución de ácido sulfúrico 1 N
1 frasco
28 ml
3 frascos
3 x 28 ml
R10
5 - PRECAUCIONES
La calidad de los resultados depende del respecto de las buenas prácticas de laboratorio siguientes :
Todas las microplacas llevan escrito el nombre de la prueba y el número de identificación de la prueba. Este
número de identificación figura también en cada una de las tiras.
MONOLISA® HBs Ag ULTRA : Número de identificación = 51.
Comprobar el número de identificación antes de su uso. En caso de que falte el número de identificación, o
no coincida con el número antes indicado, no utilizar la tira.
• No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad.
• No mezclar en un mismo ensayo reactivos que procedan de lotes diferentes.
NOTA : se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta : 20X color
verde), de tampón sustrato (R8, identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB 11X
en violeta) y de solución de parada (R10, identificado 1N en rojo), diferentes a los suministrados en el kit
siempre y cuando se utilice un mismo y único lote durante todo el ensayo. Estos reactivos también pueden
utilizarse con otros productos de Bio-Rad. Además, la solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta:
20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones de lavado incluidas en los distintos kits de
reactivos de Bio-Rad (R2, identificaciones en la etiqueta : 10X color azul o 10X color naranja) cuando se
reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla en cada tanda de pruebas. Contacte con
nuestros servicios técnicos para una información más detallada.
• Antes de la utilización, esperar 30 minutos para que los reactivos se equilibren a temperatura ambiente
(18-30°C) y una hora en el caso de la solución de lavado diluida (R2).
• Reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando toda contaminación.
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• No realizar la prueba en presencia de reactivos que produzcan vapores (ácidos, alcalinos, aldehídos) o
polvos que puedan alterar la actividad enzimática del conjugado.
• Utilizar preferentemente material de uso único. En su defecto, utilizar una cristalería perfectamente lavada
y enjuagada con agua destilada.
• No dejar secar la microplaca entre el final del lavado y la distribución de los reactivos.
• La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones metálicos. Por tanto, ningún elemento
metálico debe entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o la solución
sustrato.
• La solución de revelado (tampón sustrato + cromógeno) debe estar coloreada en rosa. La aparición de
otra coloración en los minutos siguientes a la reconstitución indica que el reactivo es inutilizable y se debe
sustituir.
Para esta preparación, utilizar preferentemente recipientes y material de distribución de plástico de uso
único o una cristalería previamente lavada con ácido clorhídrico 1N y perfectamente enjuagada con agua
destilada y secada. Conservar esta preparación protegida de la luz.
• Utilizar una punta de pipeta desechable para cada suero.
• El lavado de los pocillos es una etapa esencial de la manipulación : respetar el número de ciclos de lavado
prescrito y comprobar que todos los pocillos están completamente llenos, y después completamente
vacíos. Un mal lavado puede producir resultados incorrectos.
• No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución de revelado.
• Comprobar la exactitud y la precisión de las pipetas, así como el correcto funcionamiento de los aparatos
utilizados.
• No modificar el procedimiento.
6 - RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD
Todos los reactivos del kit están destinados para uso de diagnóstico "in vitro".
• Utilizar guantes de un solo uso durante la manipulación de los reactivos y de las muestras y lavarse
cuidadosamente las manos tras su manipulación.
• No “pipetear con la boca".
• El control positivo (R4) contiene Ag HBs de los subtipos ad y ay purificado a partir de plasmas humanos
negativos en anticuerpos anti-VIH1 y 2 y anticuerpos anti-VHC, inactivados por calor.
• Ningún método puede garantizar de forma absoluta la ausencia de los virus VIH, VHB, VHC u otros
agentes infecciosos. Por tanto, los reactivos de origen humano, al igual que las muestras de los
pacientes, deben ser considerados y manipulados como productos potencialmente infecciosos y
respetando las precauciones de uso.
• Considerar el material directamente en contacto con las muestras, los reactivos de origen humano y las
soluciones de lavado, como productos contaminados.
• Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan.
• Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido,
neutralizar previamente las superficies manchadas con bicarbonato de sosa, y después limpiar con lejía
y secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá ser desechado en un
contenedor especial para residuos contaminados.
• Eliminar las muestras y los reactivos de origen humano, así como el material y los productos
contaminados después de su descontaminación:
- ya sea sumergiéndolos en lejía con una concentración final del 5% de hipoclorito de sodio (1 volumen
de lejía por 10 volúmenes de líquido contaminado o de agua) durante 30 minutos,
- o bien por calentamiento en autoclave a 121°C durante 2 horas como mínimo. El autoclave es el mejor
método para inactivar los virus VIH y VHB.
ATENCIÓN : NO INTRODUCIR EN EL AUTOCLAVE SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO
DE SODIO.
• No olvidar neutralizar y/o esterilizar en autoclave las soluciones y residuos de lavado, y cualquier líquido
que contenga muestras biológicas, antes de desechar por el desagüe.
• La manipulación y la eliminación de los productos químicos debe efectuarse según las buenas prácticas
de laboratorio.
• Evitar todo contacto del tampón sustrato, del cromógeno o de la solución de parada con la piel y las
mucosas (toxicidad, irritación o quemadura).
• Algunos reactivos contienen ProClin™ 300 (0,04%, 0,1% y/o 0,5%)
Xi Irritante
R43 : puede causar una sensibilización al contacto con la piel
S28-37 : Si se produce un contacto con la piel, lávese de inmediato con agua y jabónabundantes.
Utilice guantes adecuados.
• La ficha de datos de seguridad está disponible bajo petición.
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7 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
• Agua destilada.
• Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio.
• Pipetas automáticas o semiautomáticas, regulables o fijas, para distribuir 50 μl, 100 μl, 1000 μl y 10 ml.
• Probetas graduadas de 100 ml y 1000 ml.
• Contenedor para residuos contaminados.
• Baño maría o incubador seco*, con termostato a 37°C ± 1°C*.
• Sistema de lavado automático*, semiautomático* o manual para microplacas.
• Aparato de lectura* para microplacas equipado con filtros de 450, 490 y 620-700 nm.
• Papel absorbente.
(*) Consúltenos para una información detallada sobre los aparatos validados por nuestros servicios técnicos.
8 - PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Antes de utilizar los reactivos del kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA, dejar que se equilibren a
temperatura ambiente (18-30°C).
1) Reactivos listos para usar
Reactivo 1 (R1) : Microplaca
Cada soporte marco que contiene 12 tiras está incluido en una bolsa aluminio sellada. Abrir la bolsa con unas tijeras
o un escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del la soldadura. Sacar el marco y volver a introducir inmediatamente en
la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8°C.
Reactivo 3 (R3) : Control Negativo
Reactivo 4 (R4) : Control Positivo
Reactivo 10 (R10) : Solución de parada
2) Reactivos para reconstituir
Solución de lavado (concentrada 20X) : Reactivo 2 (R2)
Diluir a 1/20 la solución de lavado R2 en agua destilada. Preparar 800 ml para una microplaca de 12 tiras.
Conjugado (R6 + R7)
Golpear suavemente el frasco de conjugado liofilizado (R7) en la mesa para que se desprenda el producto que
se haya podido quedar adherido al tapón de goma.
Abrir el frasco de conjugado liofilizado (R7) y añadir el contenido de un frasco de diluyente para conjugado (R6).
Volver a tapar y mantener en reposo durante 10 minutos, homogeneizando de vez en cuando para facilitar la
disolución.
Solución de revelado enzimático (R8 + R9)
Diluir el reactivo R9 en el reactivo R8 a 1/11 (ejemplo : 1 ml de reactivo R9 en 10 ml de reactivo R8) sabiendo
que para tratar 12 tiras se necesitan, y son suficientes, 10 ml. Esta solución es estable 6 horas si se conserva en
oscuridad. Homogeneizar.
9 - CONSERVACIÓN - VALIDEZ
Conservar el kit a + 2-8°C hasta su utilización.
Una vez abierto, cada elemento del kit Monolisa™ HBs Ag ULTRA conservado a +2-8°C puede utilizarse hasta
la fecha de caducidad indicada en la caja, excepto si existe una indicación específica :
R1 : Una vez abierta la bolsa sellada al vacío, las tiras de micropocillos almacenadas a +2-8°C en la bolsa
cuidadosamente sellada se pueden usar durante 1 mes.
R2 : La solución de lavado diluida se puede conservar a temperatura ambiente (2-30°C) durante 2 semanas.
La solución de lavado concentrada (R2) se puede conservar a +2- 30°C.
R6 + R7 : Después de su reconstitución, los reactivos se pueden usar durante 1 mes si se conservan a +28°C y 8 horas si se almacenan a temperatura ambiente (18-30°C).
R8 + R9 : Después de su reconstitución, el reactivo almacenado en la oscuridad se puede usar durante 6
horas a temperatura ambiente (18-30°C).
10 - MUESTRAS
Extraer una muestra de sangre según las prácticas habituales.
Las pruebas se efectúan sobre muestras no diluidas de suero o de plasma (obtenidas con anticoagulantes
como EDTA, heparina, citrato, ACD).
Separar el suero o el plasma del coágulo o de los glóbulos rojos lo antes posible para evitar la hemólisis.
Una hemólisis muy pronunciada puede afectar a las especificaciones de la prueba. Las muestras que
presenten agregados deben centrifugarse antes de realizar la prueba para obtener una muestra límpida. Las
partículas o agregados de fibrina en suspensión pueden dar resultados falsos positivos.
Las muestras podrán almacenarse a + 2 - 8°C cuando la detección se realice en los 7 días siguientes o
pueden conservarse congeladas a -20°C durante varios meses.
Evitar las congelaciones/descongelaciones repetidas. No deben utilizarse muestras que se hayan congelado
y descongelado más de 3 veces.
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Si las muestras deben viajar, embalarlas según la reglamentación vigente para el transporte de agentes
etiológicos y transportarlas preferiblemente congeladas.
NO UTILIZAR SUEROS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS O HIPERHEMOLIZADOS.
NOTA : No se ha observado ninguna interferencia en las muestras que contienen hasta 90 g/l de albúmina y
100 mg/l de bilirrubina, así como en las muestras lipémicas que contienen hasta 36 g/l de trioleína y en las
muestras hemolizadas que contienen hasta 10 g/l de hemoglobina.
11 - PROCEDIMIENTO
Seguir estrictamente el protocolo propuesto.
Utilizar los controles positivo (R4) y negativo (R3) en cada serie de determinaciones para validar los
resultados de la prueba.
Aplicar las buenas prácticas de laboratorio.
1) Establecer cuidadosamente el plan de distribución e identificación de las muestras.
2) Preparar la solución de lavado R2 (ver apartado 8).
3) Preparar la solución de conjugado (R6 + R7) (ver apartado 8).
4) Sacar el marco soporte y el número de tiras necesarias (R1) del embalaje protector. Guardar las tiras no
utilizadas en el embalaje y cerrarlo cuidadosamente.
5) Distribuir en los pocillos manteniendo el orden siguiente (plan recomendado para la placa) :
• Pocillos A1, B1, C1 y D1 : 100 μl de control negativo (R3)
• Pocillo E1: 100 μl de control positivo (R4)
• Pocillo F1:100 μl de la primera muestra a ensayar si este pocillo no se utiliza como pocillo control para
la validación del depósito de las muestras y del conjugado (opcional)
• Pocillos G1, H1,... etc: 100 μl de las muestras a ensayar.
En función del sistema utilizado, se puede modificar la posición o el orden de distribución de los
controles.
NOTA : en esta etapa se puede comprobar la distribución de las muestras puesto que existe una clara
diferencia de coloración entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene una muestra (ver apartado 14 para
la comprobación automática - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE
LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO).
6) Agitar la solución del conjugado antes de usar. Homogeneizar. Distribuir rápidamente 50 μl de la solución
reconstituida de conjugado (R6 + R7) en todos los pocillos. Homogeneizar la mezcla de reacción.
NOTA : en esta etapa de la manipulación se puede comprobar visualmente la distribución de las muestras
así como la distribución del conjugado: tras añadir el conjugado, los pocillos que contienen muestras se
colorean en rojo (ver apartado 14 para la comprobación automática - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS Y DEL CONJUGADO).
7) Cuando sea posible, cubrir con una película autoadhesiva e incubar durante 1 hora y 30 ± 5 minutos a 37± 1°C.
8) Retirar la película adhesiva. Aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar un mínimo de 5 veces.
Comprobar que el volumen residual es inferior a 10 μl (si fuera necesario, secar la placa dándole la vuelta
sobre una hoja de papel absorbente).
9) Distribuir rápidamente en todos los pocillos 100 μl de la solución de revelado de la actividad enzimática
(R8 + R9) previamente preparada. Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 ± 5
minutos a temperatura ambiente (18 a 30°C). Durante esta incubación, no utilizar película adhesiva.
NOTA : La distribución de la solución de revelado, que presenta un color rosa, puede controlarse
visualmente en esta etapa de la manipulación: hay una diferencia de coloración significativa entre un
pocillo vacío y un pocillo que contiene la solución de revelado rosada (ver apartado 14 para la
comprobación automática - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE
LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS)
10) Añadir 100 μl de solución de parada (R10) manteniendo la misma secuencia y el mismo ritmo de
distribución que para la solución de revelado. Homogeneizar la mezcla de reacción.
NOTA : La distribución de la solución de parada, que es incolora, puede controlarse visualmente en esta
etapa de la manipulación. La coloración del sustrato, rosa (en caso de muestras negativas) o azul (en caso
de muestras positivas), desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros (si las muestras son negativas)
o amarillos (si las muestras son positivas) tras la adición de la solución de parada.
11) Limpiar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar un mínimo de 4 minutos entre la
distribución de la solución de parada y la lectura y en los 30 minutos siguientes a la parada de la
reacción leer la densidad óptica a 450/620 nm con un lector de placas.
12) Antes de transcribir los resultados, comprobar la concordancia entre la lectura y el plan de distribución y
de identificación de las placas y de las muestras.
21
12 - ADAPTACIÓN
LAVADO : para obtener las mejores especificaciones de la prueba es indispensable respetar el
procedimiento de lavado.
En ciertos lavadores, puede ser necesario optimizar el proceso de lavado (aumento del número de ciclos de lavado
y/o del volumen de tampón de lavado en cada ciclo, tiempo de remojo) para obtener un nivel aceptable de ruidos
de fondo (DO) en las muestras negativas.
Consulte con nosotros sobre los procedimientos específicos y las adaptaciones.
13 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1) Cálculo de la densidad óptica media del control negativo : DO R3
Ejemplo
Control negativo R3
1
2
3
4
Total DO R3 = 0,120
Total DO R3 /4 = 0,030
DO
0,030
0,031
0,032
0,027
= media DO R3
2) Cálculo del valor de corte
Para cada placa, el valor umbral es igual a : DO R3 + 0,050
Ejemplo
DO R3 = 0,030
Valor umbral (VS) = 0,030 + 0,050 = 0,080
3) Condiciones de validación de la prueba
Todos los valores del control negativo deben ser inferiores o iguales a 0.080 unidades de densidad óptica.
El control positivo (DO R4) debe ser superior o igual a 1,00.
Si el valor del control negativo no respeta la norma o es superior en controles negativos (DO R3), eliminar
ese valor y repetir el cálculo de 3 valores. Sólo se puede eliminar un valor.
Si el ruido de fondo es muy débil para el control negativo R3 (media de los valores negativos R3 inferior a
0,010) no utilice el criterio de rechazo para el control negativo R3.
Se repetirá toda la prueba si todos los controles se encuentran fuera del intervalo de los valores
mencionados anteriormente.
4) Cálculo de las relaciones
Para cada muestra, calcular la relación :
DO muestra
Relación = --------------VS
5) Interpretación de los resultados
Las muestras cuya relación sea inferior a 1 se considerarán negativas según la prueba Monolisa™ HBs Ag ULTRA.
Las muestras cuya relación se encuentre entre 0,9 y 1 deben interpretarse con prudencia. Se recomienda
repetir el ensayo con las muestras correspondientes por duplicado cuando los sistemas utilizados y los
procedimientos del laboratorio lo permitan.
Las muestras cuya relación es igual o superior a 1 se consideran como inicialmente positivas y deben volver
a ensayarse por duplicado antes de la interpretación final.
Si tras repetir el ensayo, en una muestra la relación de los dos duplicados es inferior a 1, el resultado inicial
es no reproducible y la muestra se considera negativa según el ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA.
Para las muestras iniciales reactivas o dudosas (0.9<índice<1), si tras repetir el ensayo, al menos una
relación de los 2 duplicados es igual o superior a 1, el resultado inicial es reproducible y la muestra se
considera positiva según el ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA, teniendo en cuenta los límites del ensayo
descritos a continuación.
Las muestras en las que se ha repetido la prueba por duplicado y que han resultado negativas según el
ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA, pero en las que uno de los valores es cercano al valor umbral (relación
entre 0,9 y 1) deberían considerarse con prudencia. Se recomienda volver a estudiar a estos pacientes
utilizando otro método o repetir la extracción de sangre.
Cuando existe una densidad óptica muy débil para las muestras testadas (DO negativa) y la presencia tanto
de las muestras como de los reactivos está bajo control, los resultados pueden interpretarse como
negativos.
Para comprobar la especificidad de la reacción, todas las muestras positivas según los criterios de
interpretación del ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA deberán confirmarse con una técnica de neutralización
del Ag HBs.
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Las reacciones no repetibles normalmente se deben a :
• Lavado incorrecto de las microplacas.
• Contaminación de las muestras negativas de suero o de plasma con una alta concentración de Ag HBs,...
• Contaminación de la solución de revelado por agentes químicos oxidantes (lejía, iones metálicos, etc).
• Contaminación de la solución de parada.
14 - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS
Y DEL CONJUGADO
Comprobación de la distribución de las muestras y del conjugado
1)Comprobación de la distribución de las muestras
Antes de la distribución del conjugado, la presencia de las muestras en los pocillos puede verificarse
mediante la lectura espectrofotométrica a 490/620-700 nm : un pocillo que contiene una muestra presenta
una DO comprendida entre 0,050 y 0,900.
ADVERTENCIA : existe una clara diferencia de coloración entre un pocillo vacío transparente y un pocillo
que contiene una muestra.
2)Comprobación de la distribución del conjugado
Cuando la presencia de las muestras se ha comprobado espectrofotométricamente como se ha descrito
anteriormente, la adición de conjugado puede controlarse mediante una lectura espectrofotométrica a
490-620/700 nm : un pocillo que contiene conjugado presenta entonces una DO superior a 1,100.
ADVERTENCIA : Los pocillos que contienen las muestras son amarillentos y viran a rojo cuando se añade
el conjugado coloreado.
3)Comprobación de la distribución de las muestras y del conjugado simultáneamente (técnica únicamente
espectrofotométrica).
Cuando la presencia de las muestras no se ha comprobado con la lectura automática tal y como se ha
indicado anteriormente, la presencia simultánea de las muestras y del conjugado en los pocillos puede
confirmarse con la lectura automática a 490/620-700 nm con la condición de que exista un pocillo sólo
con el conjugado. El delta de sus DO debe ser superior a 0,35 tal y como se expresa a continuación :
[DO (muestra + conjugado) – DO conjugado sólo] ≥ 0,35
Comprobación de la distribución de la solución de revelado
Se puede comprobar la presencia de la solución de revelado rosada mediante la lectura automática a 490 nm :
un pocillo que contiene la solución de revelado debe tener una densidad óptica superior a 0,100 (una DO más
baja indica una distribución incorrecta de la solución de revelado).
15 - ESPECIFICACIONES
Las especificaciones de Monolisa™ HBs Ag ULTRA se han determinado a partir de ensayos realizados en
muestras de donantes de sangre no seleccionados, en muestras de pacientes hospitalarios que presentan
hepatitis B aguda o hepatitis B crónica, en muestras de pacientes que presentan diferentes patologías sin
relación con el virus de la hepatitis B, y en muestras comerciales así como en paneles de seroconversión.
El umbral de sensibilidad se ha evaluado a partir del panel francés de la SFTS y del patrón de la OMS.
Especificidad
La especificidad en 9894 donantes de sangre no seleccionados procedentes de 3 centros diferentes se ha estimado
en un 99.94% (9887/9893). Una reacción repetida de una muestra se ha confirmado como positiva para el Ag HBs.
El estudio de la especificidad clínica se ha realizado en un laboratorio hospitalario (Centro de Hepatología).
De 200 muestras hospitalarias ensayadas, 2 muestras han resultado reactivas repetibles (una resultó dudosa en un
primer ensayo (relación = 0,97) y positiva con 1,87 tras la repetición, y la segunda con relaciones 2,29 y 1,99).
289 pacientes que mostraban patologías o estados clínicos sin relación alguna con la hepatitis B (mujer
embarazada, factor reumatoide, inmunoglobulinas antinucleares, ratones Ig u otras infecciones víricas o
bacterianas) fueron sometidos a prueba con el Monolisa™ HBs Ag ULTRA. 11 muestras positivas y repetibles
fueron controladas con una prueba inmunoenzimática comercial e igualmente con la ayuda de una prueba
de neutralización. 10 de las 11 muestras positivas retetibles con Monolisa™ HBs Ag ULTRA dieron positivo
con la prueba Ag HBs EIA comercial. Una muestra fue considerada no interpretable con la prueba de
neutralización y fue retirada del cálculo final; 2 muestras no fueron neutralizadas; la una provenía de una
muestra positiva IgG HSV, la otra de una muestra de mieloma igualmente positiva con la prueba
inmunoenzimática comercial utilizada en la comparación, lo que condujo a una especificidad del 99,28%
(276/278). Las otras 9 muestras positivas IgG HSV y las 9 muestras de mieloma dieron negativo con
Monolisa™ HBs Ag ULTRA.
Sensibilidad analítica
El umbral de sensibilidad del ensayo se ha estimado inferior a 0,06 ng/ml de Ag HBs a partir del panel francés
SFTS 2001. El limite de detección del segundo panel internacional del WHO NIBSC codigo 00/588 ha sido
valorado inferior a 0.130 IU/ml y resultó a 0.025 IU/ml con un intervalo de confianza de 95% [0.019-0.037 IU/ml].
Todos los siguientes subtipos del panel SFTS 2001: adw2, adw4, adr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayw5 y ayr
se han encontrado positivos con una relación superior a 5 con el ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA.
23
Sensibilidad
Los estudios de sensibilidad se han efectuado en 428 muestras positivas procedentes del seguimiento de
pacientes que presentan hepatitis B crónica o hepatitis B aguda, han demostrado una sensibilidad de 100%.
Con Monolisa™ HBs Ag ULTRA se ha ensayado y se ha detectado totalmente un panel de 15 proteínas
recombinantes reproduciendo las más importantes mutaciones en las secuencias de aminoácidos del Ag HBs.
Se ha ensayado un total de 60 paneles de seroconversiones comerciales de hepatitis B (293 muestras) y se
ha comparado con las pruebas inmunoenzimáticas disponibles en el mercado.
Monolisa™ HBs Ag ULTRA ha mostrado resultados equivalentes a Monolisa™ HBs Ag Plus en 29 seroconversiones.
Monolisa™ HBs Ag ULTRA ha detectado las seroconversiones con 1 muestra de adelanto en 28 seroconversiones,
con 2 muestras de adelanto en 2 seroconversiones y con 5 muestras de adelanto en 1 seroconversión.
25 muestras adicionales positivas y recien colectadas (con menos de 1 dia) fueron analizadas y todas resultaron
positivas.
Precisión
La precisión del ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA se ha determinado con el análisis de 4 muestras :
1 muestra negativa, 2 muestras positivas en Ag HBs (m. 2 y 3) y una muestra muy positiva en Ag HBs.
La repetibilidad (intra-ensayo) se ha evaluado con el análisis de estas 4 muestras que se han ensayado 30
veces durante una misma manipulación.
La reproducibilidad (inter-ensayo) se ha evaluado con el análisis de estas 4 mismas muestras, que se han
ensayado por duplicado durante 20 días a razón de 2 ensayos independientes cada día. Los resultados se
reagrupan en las siguientes tablas :
Tabla 1 : Repetibilidad intra - ensayo
n = 30
m1
m2
m3
m4
Media de las relaciones
0.38
3.17
8.92
14.63
Desviación estándar (SD)
CV (%) relaciones
0.04
0.12
0.34
0.91
10.59 %
3.83 %
3.77 %
6.19 %
Tabla 2 : Reproducibilidad inter - ensayo
n = 40
m1
m2
m3
m4
Media de las relaciones
0.48
3.06
8.02
13.85
Desviación estándar (SD)
CV (%) relaciones
0.087
0.251
0.751
1.471
18.1 %
8.2 %
9.36 %
10.63 %
16 - LÍMITES DE LA PRUEBA
• Un resultado negativo significa que la muestra ensayada no contiene Ag HBs detectable con la prueba
Monolisa™ HBs Ag ULTRA. No obstante, en la medida en la que no pueden detectarse valores muy bajos de Ag
HBs, ese resultado negativo no excluye la posibilidad de una infección por el virus de la hepatitis B.
• Según el equipo usado (lavador, lector, procesador automatizado) se puede observar una variabilidad debíl de
los resultados.
• Además, varios autores han comunicado en la literatura casos de hepatitis vírica B (aguda o crónica) en
los que es detectable DNA virico en ausencia del antígeno de superficie (pacientes HBs Ag negativos).
Estos perfiles anormales, si bien son raros, son consecuencia de una posible mutación genética, bien a
nivel del gen S y pre-S (impidiendo el reconocimiento del Ag por algunos reactivos inmunológicos) o,
normalmente, a nivel del gen X y pol, induciendo una replicación vírica débil. Se recomienda ensayar
marcadores adicionales (anticuerpos específicos del HBs Ag, o si es posible, DNA vírico amplificado) para
establecer el diagnóstico final de la infección en estos casos muy particulares.
• Para comprobar la especificidad de la reacción, toda muestra que resulte positiva (según los criterios de
interpretación del ensayo Monolisa™ HBs Ag ULTRA) debería confirmarse mediante una técnica de
neutralización de los Ag HBs eventualmente presentes en la muestra (prueba Monolisa™ HBs Ag
confirmación, referencia 72408).
• El método colorimétrico de comprobación de la distribución de las muestras y/o de los conjugados y/o
de la solución de revelado no permite comprobar la exactitud de los volúmenes dispensados: únicamente
señala la presencia de muestras y/o de conjugado. El grado de respuestas erróneas obtenidas con este
método está relacionado con la precisión del sistema utilizado (los CV acumulados de pipeteo y de lectura
superiores al 10% pueden rebajar significativamente la calidad de esta comprobación).
24
• En el caso de un lavado incorrecto tras la etapa de incubación del conjugado, la comprobación
automática de la distribución de la solución de revelado (mediante la lectura a 490 nm de las densidades
ópticas de los pocillos) puede dar resultados erróneos con densidades ópticas superiores a 0,100 en
ausencia de solución de revelado. Sin embargo, este fenómeno no se ha observado durante las
evaluaciones realizadas en 939 muestras ensayadas.
17 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. COUROUCE A.M., LEE H., DROUET J., CANAVAGGIO M. and SOULIER J.P. (1983)
Monoclonal antibodies to HBs Ag : a study of their specificities for eight different HBs subtypes.
Developments in Biological Standardization, 54, 527-534.
2. COUROUCE A.M., PLANCON A. and SOULIER J.P. (1983)
Distribution of HBs Ag subtypes in the world. Vox Sang. 44, 197-211.
3. DAVID G.S., PRESENT W., MARTINIS J., WANG R., BATHOLOMEW R., DESMOND W. and SEVIER E.D.,
(1981)
Monoclonal antibodies in the detection of hepatitis infection. Medical Laboratory Sciences, 38, 341-.348.
4. DROUET J., COUROUCE A.M., KALIL J., LEE H., and FELLOUS M. (1981)
Monoclonal antibodies to HBs Ag produced by murine hybridomas. In viral hepatitis, edited by
Szmuness W. Alter H.J., Maynard J.E. The Franklin Institute Press, 706.
5. FIELDS H.A., DAVID C.L., BRADLEY D.W. and MAYNARD J.E. (1983)
Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection
of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) - Bulletin of the World Health Organization, 61, 1, 135-142.
6. LEE H.H., COUROUCE A.M., PERE M., CANAVAGGIO M., DROUET J. and SOULIER J.P. (1983)
Monoclonal antibodies to HBs Ag; a study of their specificities against HBs Ag subtypes and their
utilization in ELISA. International Association of Biological Standardization. International Symposium on
Monoclonal Antibodies : Paris, France.
7. SOULIER J.P., COUROUCE A.M., LEE H. DROUET J., MULLER A. and CANAVAGGIO M. (1983)
Monoclonal antibodies against HBs antigen. Bulletin Biotest (vol. 4, 353-358).
8. WANDS J.P., CARLSON R.L., SCHOEMAKER H., ISSELBACHER K.J. and ZURAWSKI V.R. (1981)
Immunodiagnosis of hepatitis B with high-affinity IgM monoclonal antibodies. Proc. Nat. Acad. Sci.,
78, 2, 1214-1218.
9. M. CANAVAGGIO, A.M. COUROUCE, M. PERE, H. LEE
Spécificité d'anticorps monoclonaux dirigés contre le déterminant a de l'Ag HBs (1985). Nouvelle Revue
Française d'Immunohématologie (Springer International), 27, 2, 134.
10. J. DROUET, G. CHARRIER, A.M. COUROUCE, M. PERE, J.F. DELAGNEAU, J. ROISIN (1985)
Nouveaux réactifs de dépistage de l'Ag HBs et de dosage de l'anticorps anti-HBs. Nouvelle Revue
Française d'Immunohématologie (Springer International), 27, 2, 134.
25
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-
CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro)
Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro)
CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik)
CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
CE ( 98/79/CE in vitro )
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For in vitro diagnostic use
Pour diagnostic in vitro
Para diagnóstico in vitro
Per uso diagnostico in vitro
In-vitro-Diagnostikum
Para uso em diagnóstico in vitro
In vitro-diagnostik
In vitro diagnose
in vitro CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro)
CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų)
CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről)
CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta)
CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy)
CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro)
(NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk)
(RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro)
(BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия)
Do stosowania in vitro
in vitro diagnostikai
Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra
In vitro diagnostiliseks kasutamiseks
Na diagnostiku in vitro
Pro diagnostiku in vitro
(NO) - Til in vitro-diagnostikk
(RO) - Pentru diagnostic in vitro
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Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN
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