10.2 PCR anidada 10.2.1 iniciadores utilizados Iniciador Secuencia Temp. de Contenido de G+C Temp. de hibridación Tamaño del fusión (°C) (%) óptima (°C) amplicón (pb) 52 1015 52 883 53 900 62 944 69 591 67 767 Gen AH1 A CAGATGCAGACACAATATGT HA 55 40 AH1 FII AAACCGGCAATGGCTCCAAA HA 72 50 AH3 A CAGATTGAAGTGACTAATGC HA 55 40 AH3 DII GTTTCTCTGGTACATTCCGC HA 62 50 BHA A GTGACTGGTGTGATACCACT HA 56 50 BHA DII TGTTTTCACCCATATTGGGC HA 65 45 AH1 B ATAGGCTACCATGCGAACAA HA 63 45 AH1 EII CTTAGTCCTGTAACCATCCT HA 55 45 AH3 B AGCAAAGCTTTCAGCAACTG HA 63 45 AHE CII GCTTCCATTTGGAGTGATGC HA 65 50 BHA B CATTTTGCAAATCTCAAAGC HA 61 35 BHA CII TGGAGGCAATCTGCTTCACC HA 68 55 Referencia: Stock et al, 1998 10.2.2 Mezcla de reacción de la primera PCR La mezcla de reacción se preparó en tubos de 250 µL: 4 µL de 10x PCR buffer 4 µL de 10x iniciadores de la primera amplificación 0.2 µL de Taq DNA polimerasa de Roche 32 µL de agua destilada 10 µL de la solución de transcripción inversa realizada en el paso anterior. 10.2.3 Mezcla de reacción de la segunda PCR La mezcla de reacción se preparó en tubos de 250 µL: 4.8 µL de 10x PCR buffer 4.8 µL de 10x iniciadores de la segunda amplificación 4.8 µL de 2 mM dNTPs 0.2 µL de Taq DNA polimerasa 33.6 µL de agua destilada 2 µL de los productos de la primera amplificación 10.2.4 Solución 10x PCR Buffer 100 µL de solución 1 M TRIS– HCl con pH de 8.3 25 µL de solución 2 M de KCl 35 µL de solución 1 M de MgCl2 840 µL de H2O destilada 10.2.5 Solución 2 mM dNTPs 10 µL de solución 100 mM de cada nucléotido 460 µL de H2O DEPC al 0.1% 10.2.6 Solución 10x Iniciadores de la primera amplificación Inicialmente se prepararon soluciones stock de los iniciadores, diluyéndose 10 µL de la solución concentrada 0.5 mM en 190 µL de H20 destilada. Para preparan la solución de 10x Iniciadores, se 10 µL de solución stock de cada iniciador 440 µL de H2O destilada 10.2.7 Solución 10x Iniciadores de la segunda amplificación Inicialmente se prepararon soluciones stock de los iniciadores, diluyéndose 20 µL de la solución concentrada 0.5 mM en 180 µL de H20 destilada. Para preparan la solución de 10x iniciadores, se 50 µL de solución stock de cada iniciador 200 µL de H2O destilada