FIJACIÓN

FIJACIÓN
-La muerte celular se produce cuando los procesos vitales celulares se han detenido de forma
irreversible. En ese momento entran en funcionamiento dos procesos de destrucción del tejido:
-Putrefacción: debida a bacterias presentes como saprofitas.
-Autolisis: por las propias enzimas lisosómicas.
La importancia de cada uno de ellos es distinta según sea el tejido.
La Fijación pretende la consecución de una imagen fija similar en lo posible a la imagen viva.
Para que sea correcta debe tener constancia (igual en todos los tejidos iguales) y
reproductibilidad (igual con todas las coloraciones). Hay distintos métodos:
Métodos Físicos:
El único realmente practicable es la congelación: debe ser instantánea (no usar
congeladores), pero sin que el salto de temperatura sea excesivamente brusco, puesto que se
forman cristales y se vuelven quebradizas las piezas. Se emplea para las biopsias
intraoperatorias. Los métodos que se han usado son:
a) N2 líquido: a -70º C, sirve para conservar las piezas, pero no para congelar directamente
porque se vuelven quebradizos.
b) Isopentano (-50º C) el mejor
c) CO2: se emplea para el manejo de las muestras en el microtomo de congelación.
d) Criodesecación es un tipo de liofilización (frío mas deshidratación por vacío), bueno para la
conservación de elementos bioquímicos para técnicas histoquímicas.
e) Criosustitución: con mezcla de alcohol, propilenglicol y acetona a -50º C, sustituye al agua.
Métodos químicos:
Un buen método químico debe ser relativamente rápido en el bloqueo de la autolisis,
bactericida, no provocar artefactos de retracción y es recomendable que induzca cambios que
faciliten la tinción (efecto mordiente).
El procedimiento incluye cortar la pieza en trozos pequeños para facilitar la penetración
(mejor láminas de 0,5 cm). El volumen debe estar con el fijador en proporción entre 1/10 y 1/20
y con una presión osmótica similar. El pH, salvo que tenga ácidos, será similar al fisiológico. El
tiempo de fijación debe ser el necesario, ni más ni menos. Generalmente se suele lavar la
pieza con solución salina para evitar el contacto del colorante con los medios de fijación.
De acuerdo con el método de actuación podemos clasificarlos en:
1) Deshidratadores:
a Alcoholes etílico y metílico: como fijador de emergencia vale, pero tiene grandes
inconvenientes: no fija la cromatina, produce retracción, no tiene efecto mordiente y
produce fenómenos de desplazamientos. (sustitución de hidratos de carbono).
b Acetona: Rápido, pero provoca gran retracción y disuelve las grasas.
2) Ácidos:
a Acético: conserva bien el núcleo pero mal el citoplasma.
b Tricloroacético: se emplea como segundo fijador para descalcificación de huesos
c Crómico: En algunos casos.
3) Formadores de sales:
a Cl2Hg: conocido también como sublimado corrosivo. Muy bueno para morfología y muy
buen mordiente. Como inconveniente no es buen bactericida, forma precipitados
metálicos y puede endurecer los tejidos excesivamente. Tiene poca velocidad de
penetración. Se está dejando de usar por la dificultad de eliminación de residuos de
mercurio en los desechos del laboratorio.
b Dicromato potásico: Buen mordiente, excelente en lípidos. Indispensable en las
coloraciones argénticas. Poca velocidad de penetración.
c Ácido pícrico: Muy bueno, no provoca contracción, buen mordiente. Es explosivo
(manejar con cuidado).
d Acetato de uranilo: se emplea en microscopía electrónica.
4) Reticuladores de proteínas:
a
b
c
Formol: La solución al 35 % estabilizada con metanol se conoce con el nombre de
formalina. Para su uso se emplea al 4 % (partiendo de formalina, una parte de
formalina y nueve de agua. Su acción consiste en formar puentes entre radicales
laterales de proteínas. Como ventajas tiene el ser barato y fácil de preparar, buen
bactericida y buen conservante. Da buen resultado en lípidos. Su velocidad de acción
está en función de la temperatura, por lo que se puede acelerar o frenar el proceso
controlándola. Como inconvenientes: es irritante, forma ácido fórmico (destruye los
núcleos) aunque se puede evitar guardándolo en frascos opacos y tamponándolo. Se
consume a lo largo del tiempo de fijación y por ello incrementa el peso de las piezas.
La fórmula para el formol tamponado es: 100mL. de formalina, PO4H2Na, 4.0 g.,
PO4HNa2 6,5 g y H2O 900 mL.
Glutaraldehido: Muy bueno en microscopía electrónica. Rápido (3 horas).
Tetróxido de osmio: al 1 % en buffer fosfato. Es el mejor fijador estructural, por lo que
es indispensable en microscopía electrónica
Mezclas fijadoras:
Generalmente no se emplea un solo fijador sino una mezcla de dos o más
componentes. Los grupos de mezclas más usados son:
- Mezclas tipo Bouin: Se caracterizan por la presencia de formol adicionado con ácido pícrico,
con un pH cercano a 2,2. Hay varias composiciones posibles, de las que una de las más
usadas es el Bouin alcohólico (etanol 80º, 75,0 mL., ácido pícrico, 0,5 g., formalina 30,0 mL. y
acético glacial, 7,5 mL.) que es muy rápido en comparación con el Bouin original (acuoso),
siendo para fragmentos de 0,5 cm. de unas 2-3 horas.
-Mezclas tipo Zenker: se caracterizan por llevar en su composición cloruro mercúrico.
Proporcionan una excelente fijación nuclear y favorecen su tinción. Como inconveniente están
un excesivo endurecimiento, la dificultad de control del tiempo (no debe pasar de 4 horas y la
formación de precipitados metálicos, lo que obliga a lavar la muestra con una solución de lugol
(deszenkerización). El más usado es el llamado B5, que se prepara en solución stock (es
inestable) con 200 mL. de agua, 2,5 g. de acetato sódico y 12,0 g. de cloruro mercúrico. Esta
solución se convierte en solución de trabajo añadiendo por cada 10 mL. de solución stock 1mL.
de formalina. La solución de deszenkerización se prepara con:
a) IK, 2g, I metálico 1g., etanol 70º 100mL.
b) Tiosulfato sódico, 5g, agua destilada 100 mL.
El procedimiento consiste en lavar después de la desparafinación 10 minutos con solución
yodada, lavar con agua destilada, lavar dos minutos con tiosulfato y lavar a fondo con agua
corriente.
Las mezclas de Zenker o B5 se están sustituyendo por otros equivalentes debido a la alta
contaminación medioambiental que producen los derivados mercúricos.
Conservación:
Aunque el principal fijador que se usa, el formol, es un buen conservante, esto no es
así en los demás casos, de modo que para conservar piezas en un espacio de tiempo de
algunas horas podemos utilizar solución fisiológica. Si se va a conservar algo más, es preferible
utilizar alcohol de 70 º, aunque produce un cierto efecto de retracción y la deshidratación de las
piezas.