MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS KATHERIN SOCHA HIGUERA. TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de Microbiólogo industrial Microbióloga Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. 17 DE AGOSTO DE 2006 NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS KATHERIN SOCHA HIGUERA APROBADO ________________________ Marco Quijano Rico Dipl.Chem.,Ph.D Director ________________________ Christian Suárez Microbiólogo Industrial Codirector ________________________ David Gomez M.Sc. Jurado 1 ________________________ Andrea Aguirre M.Sc. Jurado 2 MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS KATHERIN SOCHA HIGUERA APROBADO ________________________ ANGELA UMAÑA M.Phil Decano académico ________________________ David Gomez M.Sc. Director de Carrera Dedico este trabajo a DIOS por su enorme ayuda en todos los momentos de mi vida, por hacer que de los tiempos difíciles tomemos las enseñanzas para poder construir tiempos mejores, por poner siempre en mi camino personas que hacen mejor mi existir, por darme la oportunidad de aprender de cada segundo que vivo y de darme las herramientas para poder culminar esta etapa tan importante en mi vida. A mi mamá: Ana Edilma Higuera, por darme su inmenso amor, que ha sido el principal instrumento para poder cumplir todas mis metas, por brindarme su apoyo y seguridad, por enseñarme a ser todo lo que soy y por que siempre ha estado en todos lo momentos de mi vida dándome lo mejor de ella. A mi amigo: Ronald Rojas, por su apoyo incondicional y su gran ayuda para que este sueño se hiciera realidad. A todos los que han estado a mi lado, Katherin Socha Higuera Agradezco especialmente a mi director, Dr. Marco Antonio Quijano Rico, por darme la oportunidad de aprender de sus grandes conocimientos, por su hospitalidad y su apoyo incondicional, así como también al equipo de trabajo del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, por su gran colaboración y acogida. A mi codirector, Christian Suárez por su cooperación, y tiempo dedicado a este proyecto. A la Dr. Adriana Morantes Higuera por su atención, asesoria y contribución. A el Dr. Rodolfo Gamboa Jefe del laboratorio de biología y Microbiología de la Universidad de Boyacá, por su colaboración y ayuda desinteresada. Y a todos los que me colaboraron para poder realizar este proyecto. vii ABSTRACT Aim of this work was the evaluation of carbon dioxyde under hyperbaric pressure for controlling microbiological off-odor producers: indigenous yeast and lactic acid bacteria, in crushed local Pinot noir grapes, prior selected yeast alcoholic fermentation. The procedure is equivalent to a carbonic maceration under pressure. Crushed grapes were subjected to a CO2 atmosphere at costant temperature and pressure of 15°C and 35 bar, during 360 minutes. Population changes were monitored by plate counting. Population reductions attained 97.8% in yeasts and 95.7% in lactid acid bacteria. Higher inhibition rates could possibly be expected in the absence of baroprotective effects, probably due to the 28°Brix grape juice reducing sugars ( fructose and glucose). Sensory characteristics of wines were scored by trained people, following OIV wine tasting protocols. Obtained results show that carbonic maceration under pressure, could ameliorate microbiological and sensory characteristics of wine. RESUMEN En esta investigación, se evaluó el potencial del dióxido de carbono bajo presión hiperbárica, para el control de poblaciones de microorganismos generadores de olores desagradables en el vino: levaduras y bacterias ácido lácticas indígenas, en estrujados de uvas locales de Pinot noir, antes de la fermentación alcohólica, con levaduras seleccionadas. La operación equivale a una maceración carbónica bajo presión. Los estrujados de uvas fueron tratados a presión y temperatura constantes: 35 bar y 15°C durante 360 minutos. Los cambios en las poblaciones se siguieron por recuento en placa. Se alcanzaron reducciones del 97.8% en las levaduras y del 95.7% en las bacterias ácido lácticas. Parece que la inhibición podría ser mayor, si no se presentara un efecto baroprotector atribuible al contenido relativamente elevado de los estrujados en ázucares reductores (glucosa y fructosa), 28°Brix. Las características sensoriales de los vinos obtenidos, se calificaron por personas previamente entrenadas, siguiendo la metodología de L’Office Internationale de la Vigne et du Vin (OIV). Los resultados obtenidos indican que el tratamiento propuesto posiblemente puede contribuir a mejorar las características microbiológicas y sensoriales del vino. TABLA DE CONTENIDO 18 1 INTRODUCCIÓN 2 MARCO TEÓRICO Y REVISION DE LITERATURA 20 2.1 Descripción de la uva 20 2.1.1 El raspón 20 2.1.2 Los hollejos 20 2.1.3 Las semillas 21 2.2 Maduración de la uva 21 2.2.1 Periodo herbáceo 21 2.2.2 Envero 21 2.2.3 Periodo de maduración 22 2.2.4 Sobremaduración 22 2.3 Composición de las uvas 22 2.3.1 Agua y sales minerales 22 2.3.2 Hidratos de carbono 22 2.3.3 Ácidos 23 2.3.4 Fenoles 23 2.3.4.1 Ácidos fenólicos 23 2.3.4.2 Flavonoides 24 2.3.5 Compuestos nitrogenados 24 2.3.6 Lípidos y compuestos relacionados 24 2.3.7 Terpenoides 25 2.3.8 Compuestos volátiles de aroma 25 2.3.9 Vitaminas 25 2.4 Estrujado 26 2.5 El mosto 26 2.5.1 Obtención y tratamiento del mosto de uva 26 2.5.2 Componentes de uvas y mosto 27 viii 2.6 Bacterias ácido lácticas 27 2.7 Levaduras 29 2.7.1 Brettanomyces sp 30 2.8 Defectos del vino 31 2.8.1 Bacterias ácido lácticas 32 2.8.2 Levaduras 34 2.8.2.1 Brettanomyces sp. 36 2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de vino tinto 38 2.9.1 Contaminación en el vino por Brettanomyces 38 2.10 Métodos empleados para el control de Bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp 41 2.11 Potencial de CO2 bajo presiones hiperbaricas para el control de bacterias ácido lácticas y levaduras ( Brettanomyces sp ) 42 2.12 Cinética de muerte microbiana 44 2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas presiones 45 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 46 3.1. Formulación del problema 46 3.2. Justificación 46 4. OBJETIVOS 48 4.1. General 48 4.2. Específicos 48 5. MATERIALES Y MÉTODOS 49 5.1 Sitio de estudio 49 5.2 Muestreo 50 5.2.1 Preparación de muestras 50 5.3 Parámetros de operación del tratamiento hiperbárico de CO2 50 5.4 Tratamiento de estrujados bajo presión 51 5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones 51 ix 5.4.2 Procedimiento 53 5.5 Recuento de bacterias acido lácticas 54 5.6. Recuento de levaduras 55 5.7 Fermentación alcohólica 55 5.8 Análisis microbiológico de los vinos 56 5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas 56 5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes 56 5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp 56 5.9 Parámetros físico-químicos 57 5.9.1 Determinación del contenido alcohólico por el método de Roessner 58 5.9.2 Determinación refractométrica del extracto del vino 58 5.9.3 Determinación potenciométrica del pH 58 5.9.4 Color comparativo 58 5.10 Evaluación sensorial 59 5.11 Análisis estadístico 59 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 60 6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2 sobre células de levaduras y bacterias ácido lácticas. 60 6.2 Parámetros Físico-Químicos de los vinos 69 6.3 Análisis microbiológico de los vinos 70 6.4 Análisis sensorial 71 7 CONCLUSIONES 77 8 RECOMENDACIONES 79 9 BIBLIOGRAFIA 10 ANEXOS x ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Fermentaciones heterolácticas y homolácticas. 29 Figura 2 Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino. 38 Figura 3 Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego extremo, 4 riesgo interno. 40 Figura 4 Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá. 49 Figura 5 Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2 51 Figura 6 Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de muestras de estrujados de uvas 53 Figura 7 Salida de muestra al ciclón de muestreo 54 Figura 8 Toma de muestra en el ciclón de muestreo 54 Figura 9 Equipo de filtración 57 Figura 10 Medio DBDM 57 Figura 11 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres montajes 61 Figura 12 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio de los tres montajes 62 Figura 13 Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de Aw=0.94 67 Figura 14 Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras. 68 Figura 15: Panel de catadores 72 Figura 16 Claridez de los vinos Pinot noir evaluados 73 Figura 17 Color de los vinos Pinot noir evaluados 73 Figura 18 Olor de los vinos Pinot noir evaluados 74 Figura 19 Sabor de los vinos Pinot noir evaluados 75 Figura 20: Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados 76 xi ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los componentes de las uvas y del mosto, en el momento de la vendimia. 27 Tabla 2 Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias ácido lácticas 32 Tabla 3 Características de las levaduras causantes de la flor del vino. 35 Tabla 4 Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp 36 Tabla 5 Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp. 41 Tabla 6 Partes del biorreactor y su función. 52 Tabla 7 Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes 60 Tabla 8 Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres montajes 60 Tabla 9 Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras. 67 Tabla 10 Resultado del análisis físico Químico de los vinos 69 xii ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO 1 Equipos ANEXO 2 Reactivos ANEXO 3 Composición de medios de cultivo 3.1 Agar MRS 3.2 Agar YGC 3.3 Agar WL 3.4 Medio DBDM 3.5 Medio YNB ANEXO 4 protocolo de procedimiento para tratamiento de estrujados de uvas en atmósfera hiperbárica de CO2 ANEXO 5 Tablas de resultados 5.1 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje 5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje 5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje 5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer Montaje 5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Segundo Montaje 5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer Montaje 5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras 5.8 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido lácticas ANEXO 6 Graficas 6.1 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 1 6.2 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 2 xiii 6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3 6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido lácticas, Montaje 1 6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido lácticas, Montaje 2 6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, Montaje 3 6.7 Grafica comparativa del recuento de levaduras de los tres montajes 6.8 Grafica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de los tres montajes ANEXO 7 Evaluación de características sensoriales ANEXO 8 Tabla normalizada de la OIV para la evaluación de características sensoriales ANEXO 9 Guía de catación ANEXO 10 Análisis Estadístico 10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1 10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2 10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3 10.4 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los promedios de los recuentos de levaduras 10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1 10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2 10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3 10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio de los recuentos de bacterias ácido lácticas xiv ANEXO 11 Interpretación del análisis estadístico xv INTRODUCCIÓN En la elaboración de vinos tintos de la variedad Pinot noir en la Loma de Puntalarga, ha sido cada vez más frecuente la aparición de defectos del perfil sensorial como: arratonado, sudor de caballo, pesebrera, tono de alquitrán, medicina, cuero, los cuales se atribuyen generalmente a la acción de levaduras del género Brettanomyces sp y/o a bacterias ácido lácticas del género Lactobacillus. Este problema parece estar asociado a los cambios en el proceso de vinificación que se han hecho para poder desarrollar una fermentación maloláctica con cepas seleccionadas de Oenococcus oeni, después de la fermentación alcohólica. Debido a la gran sensibilidad de Oenococcus oeni al dióxido de azufre, SO2, es necesario limitar la concentración de este en la masa estrujada alrededor de 20ppm. Bajo estas condiciones el riesgo de desarrollo de Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas indeseables es muy alto. En efecto, para el control de Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas, en general, se necesitan concentraciones de dióxido de azufre al menos de 40ppm. Como la fermentación maloláctica con Oenococcus oeni le da a los vinos de Pinot noir características sensoriales muy apreciadas, se requiere evitar el daño causado por levaduras y bacterias lácticas indeseables. Es decir, es necesario reducir considerablemente las poblaciones de esos microorganismos y con ello los daños que pueden introducir en el perfil sensorial. Investigaciones precedentes realizadas en el Viñedo de Puntalarga llevadas a cabo por Montaña, Ortegón (1997) y Álvarez, García (1998) muestran que en las condiciones usuales de vinificación, el gas carbónico a temperatura ambiente y bajo presiones hiperbáricas (10 a 50 bar) puede ser empleado con el fin mencionado. La utilización de gas carbónico es particularmente atractiva debido a que no es tóxico, abandona fácilmente el producto, no es demasiado costoso, hace parte 18 de la ecología de la vinificación y las presiones a las cuales se ha utilizado en Puntalarga son tecnológicamente accesibles con facilidad. La presente investigación busca establecer el tiempo de residencia necesario para controlar bacterias lácticas y levaduras contaminantes en estrujados de uvas operando a una temperatura de 15°C bajo una presión de 35 bar (25 Kg/cm2) y una concentración en SO2 de 20mg/l. 19 2. MARCO TEORICO Y REVISION DE LITERATURA 2.1 Descripción de la uva. Es un fruto procedente de una planta fanerógama sarmentosa y caducifoliar de ciclo anual en climas templados (Matiz y Prieto 1993). El racimo de la uva comprende una parte leñosa o raspón y los granos también llamados bayas que están constituidos por la piel, las semillas, y la pulpa que proporciona el zumo o mosto. El grano de uva esta compuesto por un epicarpio, la piel, película o pellejo, un mesocarpio carnoso, la pulpa y un endocarpio, el cual tapiza los lóculos que contienen las semillas (Galet 2000). 2.1.1. El raspón. Los tallos, también llamados raspón o escobajo, constan del vástago principal, que por lo común sale de la axila de una hoja, y de los tallitos ramificados, en los que se asientan los granos. Constituyen a la vez las vías de conducción de las sustancias nutricias, que se forman preferentemente en las hojas y durante la etapa de crecimiento y maduración se acumulan en la carne de las uvas como ácidos, azúcar, etc. (Galet 2000). Las uvas que se consideran bien maduras exhiben por lo general los tallos de color castaño y completamente lignificados (Riberéau et al. 1989). 2.1.2. Los hollejos. Las pieles u hollejos de las uvas están cubiertos por lo regular por una fina capa cérea llamada pruina que protege las células de la piel de la acción de la humedad atmosférica e impide la penetración de gérmenes patógenos en el interior de los granos. El componente más importante del 20 hollejo es el pigmento contenido en las capas de células y cuya cantidad e intensidad cromática desempeñan un papel relevante en la elaboración del vino tinto (Vogt et al.1986, Reynier 1991). 2.1.3. Las semillas. En todos los granos de la uva normalmente desarrollados existen semillas cuyo número oscila entre 2 y 4, cuyo peso constituye el 3 o 4% del de los granos, contienen 10-20% de aceite y 5-9% de taninos, pequeñas cuantías de ácidos volátiles y una sustancia resinosa muy amarga que presta al vino un desagradable sabor astringente cuando se disuelve a partir de las semillas (Riberéau et al. 1989, Navarre 1991). 2.2 Maduración de la uva. El estado de maduración de la uva condiciona la calidad e incluso el tipo de vino, es por tanto, uno de los principales factores de la vinificación. En la mayoría de las regiones vinícolas no se puede obtener vino de excelente calidad, si la uva no esta bien madura. La evolución de la uva se divide en cuatro periodos (Reyner 1991): 2.2.1. Periodo herbáceo. Durante este periodo se forma el grano, la uva es verde, coloreada por la clorofila, y presenta una consistencia dura (Riberéau et al. 1989, Galet 2000). 2.2.2. Envero. Corresponde a la época fisiológica de la coloración de la uva, al mismo tiempo engorda y adquiere elasticidad. La uva blanca pasa del verde al amarillo, la uva tinta pasa del verde al rojo claro y después al rojo oscuro. Este fenómeno es muy brusco, durante este periodo el azúcar de las uvas aumenta de modo repentino (Galet 2000). 21 2.2.3. Periodo de maduración. Es el periodo comprendido entre el envero y la madurez de la uva en donde, la pulpa acumula rápidamente azúcar y al mismo tiempo disminuye la acidez, se presenta engrosamiento del grano de uva, formación de taninos, coloración del fruto y formación de aromas. Este periodo es irregular y depende de las condiciones meteorológicas (Ribéreau et al. 1989, Galet 2000). 2.2.4. Sobremaduración. Se presenta cuando la uva se deja en la vid después de la madurez normal. Durante este periodo el fruto no recibe nada más de la planta, vive de sus reservas y pierde agua (Vogt et al. 1986 y Galet 2000). 2.3 Composición de las uvas. 2.3.1. Agua y sales minerales. Por medio del agua las raíces de la vid toman también sales minerales del suelo necesarias para la constitución de la cepa, principalmente se trata de fosfatos de potasio, calcio y magnesio, pero también de pequeñas cuantías de sulfatos, cloruros y silicatos. De acuerdo con la variedad de la uva y el grado de maduración de esta, el contenido de agua oscila entre 780 y 850 g/l (Vogt et al. 1986, Boulton et al. 2002). 2.3.2. Hidratos de carbono. El azúcar se forma como resultado de la fotosíntesis en la que hay asimilación del anhídrido carbónico (CO2) del aire por las hojas verdes de la cepa bajo la acción de la luz, desde allí se transporta el azúcar hasta los granos de uvas, donde se acumula en grandes cantidades en el curso de la maduración. El azúcar presente en los racimos maduros se compone, aproximadamente en partes iguales de glucosa (azúcar de uva) y fructosa. También se encuentra sacarosa pero en escasa 22 concentración, y otros azúcares, que se sabe están presentes debido a la biosíntesis, entre ellos están: arabinosa, ribosa, xilosa, mucosa, maltosa, manosa, melobiosa, rafinosa y estaquiosa (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002). 2.3.3. Ácidos La cantidad de ácidos en las uvas o en los productos derivados de ellas es pequeña. La acidez de las uvas sanas esta constituida, por 95%, de los ácidos tartárico y málico, se encuentran igualmente pequeñas cantidades de cítrico, isocítrico, aconitico, glutárico, fumárico, pirrolidincarboxilico, 2-cetoglutárico y sikímico, que también se encuentran en mostos. En uvas y vinos dañados aparecen los ácidos propionico y butírico (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002). 2.3.4. Fenoles Las sustancias fenólicas son muy importantes para las características de la uva y del vino, así como para su calidad. En ellas se incluyen los pigmentos colorantes, los compuestos que forman compuestos de color marrón, los aromas, los gustos astringentes y las conocidas sustancias amargas de las uvas y del vino (Boulton et al. 2002). 2.3.4.1. Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos encontrados se incluyen en dos grupos. El primer grupo son los hidroxibenzoatos considerados derivados del ácido phidroxibenzóico, como lo son el ácido p-hidroxibenzoico, ácido protocatetico, ácido gálico, ácido vainillínico, ácido siríngico, ácido salicílico y el ácido gentísico. El segundo grupo los hidroxicinamatos se consideran derivados del ácido p- cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico. Entre los contenidos más elevados se encuentran al ácido siríngico y al 23 ácido P-cumárico (30mg/l), después el ácido vainillínico y el cafeico (15mg/l) (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002). 2.3.4.2. Flavonoides Los antocianinos, son las sustancias que esencialmente caracterizan las uvas. En la piel de las uvas, incluso de las blancas, hay una mezcla de pigmentos verdes y amarillos. En las uvas rojas y azules se encuentra al iniciarse la maduración un pigmento rojo azulado (enina, enocianina), este corresponde a las sustancias colorantes vegetales rojas y azules comprendidas bajo la denominación común de “antocianina“(Blouin et al. 2000). La sustancia tánica (enotanino) esta contenida en el escobajo, pieles y semillas y tiene un marcado sabor astringente (Ribéreau et al. 1989). 2.3.5. Compuestos nitrogenados Los compuestos nitrogenados contenidos en la uva son principalmente las sales amonicas, aminoácidos , péptidos, proteínas y derivados de ácidos nucleicos, resultan de gran interés para la elaboración del vino por ser sustancias nutricias imprescindibles para las levaduras (Blouin et al. 2000). 2.3.6. Lípidos y compuestos relacionados El contenido de extracto graso en las semillas de la baya esta constituido en un 90% por triglicéridos con alrededor del 75% de ácido linoleico y 10% de ácido oleico; en otras partes de la baya, como en la pruina del hollejo, también hay materiales lipoides extraíbles, incluyendo glucolipidos, fosfolipidos y ácidos grasos (Vogt et al. 1986, Boulton et al. 2002). 24 2.3.7. Terpenoides Los grupos de mayor interés en la elaboración del vino, son los monoterpenos y sus derivados. Los monoterpenos son compuestos de 10 átomos de carbono, mucho de los cuales son volátiles y poseedores de aroma (Boulton et al. 2002). 2.3.8. Compuestos volátiles del aroma En las uvas están presentes muchos compuestos volátiles de aroma y sus precursores, cantidades importantes de estos compuestos, especialmente etanol, alcoholes amílicos, acetato de etilo y derivados del acetaldehído, se producen en todas las fermentaciones por levaduras (Boulton et al. 2002). Las diversas clases de uvas se diferencian, únicamente en los valores cuantitativos de las sustancias que la componen, así, las variedades de “bouquet “se caracterizan por un elevado contenido en alcoholes y óxidos terpénicos (Ribéreau et al. 1989). 2.3.9. Vitaminas Las vitaminas solubles en grasas y sus precursores, con la excepción de la vitamina E en el aceite de semilla de uva, son muy escasas o están ausentes en las uvas y en el vino. Las vitaminas B, solubles en agua, aparecen normalmente, pero no en niveles suficientes para hacer de ellas una fuente especialmente atractiva para la nutrición de los seres humanos. La vitamina C, ácido ascórbico, esta normalmente presente en cifras de alrededor de 100 mg/kg de uvas frescas. Esta cantidad es mas o menos la décima parte de la que hay en frutos cítricos, pero puede ser importante (Boulton et al. 2002). 25 2.4 Estrujado Consiste en romper el hollejo de la uva de modo que libere la pulpa y el zumo, el estrujado puede ser más o menos intenso según el hollejo sea simplemente aplastado o triturado. La estructura de la pulpa puede permanecer casi intacta o por el contrario las gruesas vacuolas de las células ceden todo su zumo (Ochoa et al. 1991, Bryce 2000). 2.5 El mosto El zumo de uva que fluye al prensar los granos “machacados “es un líquido turbio y dulce que exhibe color entre amarillento claro y rojizo, si se deja en reposo, se clarifica dejando un pozo compuesto principalmente por restos celulares de las uvas. El mosto de uva contiene numerosas sustancias disueltas, entre las que prevalecen por su cantidad e importancia, azúcares como glucosa y fructosa y ácidos como tartárico, málico y cítrico. El “peso” del mosto, su contenido en azúcar, ácidos y otros componentes, dependen de la clase de uva, del tipo de suelo del que procede, de las condiciones atmosféricas que imperaron durante el desarrollo y maduración de los racimos (Matiz et al. 1993, Ribéreau et al. 1989). 2.5.1. Obtención y tratamiento del mosto de uva Los racimos cortados cuidadosamente de la cepa, con tijeras especiales para vendimiar, se limpian de uvas resecas y podridas, se eliminan con la mayor rapidez posible de los escobajos, luego se estrujan en molinos de uva sin romper los granos (semillas), y a continuación se prensan en prensas mecánicas, hidráulicas o neumáticas, en cuya operación se separa el jugo (mosto) de la masa de uvas (bagazo). Una parte del mosto fluye sin ejercer presión (mosto, flor) pero la mayor parte del mismo se obtiene prensando (mosto de prensado) y todavía se obtiene una fracción 26 residual esponjando el bagazo y volviendo a prensar (mosto de extracción, post extracto). En los vinos tintos la uva se fermenta sin eliminar el hollejo y el color es extraído durante la fermentación (Lizarazo y Martínez 1996). 2.5.2. Componentes de uvas y mosto Tabla 1: Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los componentes de las uvas y del mosto, en el momento de la vendimia. COMPUESTOS BAYAS MOSTO Agua 74 76 Sales inorgánicas 0.5 0.4 Hidratos de carbono 24 23 Alcoholes 0 0 Ácidos 0.6 0.7 Fenoles 0.2 0.01 Compuestos nitrogenados 0.2 0.1 Lípidos 0.2 0.01 Terpenoides 0.02 0.01 Otros compuestos volátiles 0.01 0.01 Varios 0.1 0.01 Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino 2.6 Bacterias ácido lácticas Las bacterias ácido lácticas forman un grupo heterogéneo, que presenta características generales como ser, Gram positivas, catalasa negativas, no esporuladas, microaerofilas, no presentan motilidad, no tienen actividad citocromo oxidasa, ni reducen los nitratos, no producen pigmentos y algunas presentan gránulos metacromáticos. Anaerobias facultativas y fermentadoras de azúcares en condiciones diversas, respondiendo a diversos tipos morfológicos, se distinguen los cocos de forma redondeada u oval y los bacilos o bastones en forma de trazos mas o menos largos. Los cocos tienen de 0.4 a 1.0ų de diámetro, los bacilos 27 pueden tener 0.5ų de espesor y de 2 a 5ų de longitud (Zambonelli 1988, Álvarez et al. 1998). Según el catabolismo de los azúcares, las bacterias ácido lácticas tienen carácter homo y heterofermentativo. Las homofermentativas originan ácido láctico (80-90%) utilizando la vía glicolitica de Embden-Meyerhof; y las heterofermentativas metabolizan la glucosa siguiendo la ruta de Warburg-Dickens ( figura 1 ), originando además de ácido láctico, importantes cantidades de anhídrido carbónico, ácido acético, acetaldehído, etanol, acetoina, diacetilo, etc. ( Hernández 1995 ) El manual de Bergeys las ha dividido en cuatro grupos considerando un amplio número de elementos como son: la taxonomía molecular, la determinación de peptidoglicano de la pared celular, la definición de los grupos antigénicos y el isómero de ácido láctico obtenido. Se dividen en los Géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Pediococcus (Krieg 1994, Zambonelli 1988). 28 Figura 1: Fermentaciones heterolacticas y homolacticas Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino 2.7 Levaduras Las levaduras se definen como hongos unicelulares, que se diferencian de otros eucariotas, protozoos y algas, porque tienen paredes celulares rígidas y no tienen pigmentos fotosintéticos y de las bacterias, porque tienen núcleos con membrana. Las levaduras por su interés enológico se clasifican en tres grupos : los agentes de fermentación alcohólica , los de refermentación, las cuales causan la fermentación de los restos de azúcar 29 de los vinos dulces y pueden enturbiar o dar sedimentos en los vinos secos; y las de contaminación, que se encuentran en gran cantidad en bodegas de conservación destacándose los géneros Pichia, Hansenulla y Candida , causantes de velos que se forman en la superficie de los vinos o en paredes empapadas de vino y en contacto con el aire ( Dittrich 1987, Loureiro et al. 2003). 2.7.1. Brettanomyces sp. Brettanomyces es una levadura que pertenece a los ascomycetos y es la responsable de olores y sabores desagradables principalmente en vinos tintos de la variedad Pinot noir (Gerbaux et al. 2000). Dekkera es la forma esporulada de la levadura Brettanomyces. El género Brettanomyces, presenta 5 especies: B. nanus, B. anomalus, B. custersianus y B. naardenensis y B. bruxellensis, siendo ésta última la que interesa desde el punto de vista enológico (Egli and Kling 2001). Brettanomyces es un microorganismo fermentador relativamente lento, por esta razón es raramente el organismo dominante durante la fermentación primaria y puede encontrarse al final de la fermentación alcohólica y maloláctica (FML), puede fermentar cantidades pequeñas de azúcares residuales, es frecuentemente encontrada en vinos y puede fermentar bajo condiciones aerobias y anaeróbicas. Es una levadura fuertemente acidogénica, que produce grandes cantidades de ácido acético de la oxidación del etanol (Parish et al. 2003, Chatonnet, 2002). Brettanomyces puede usar varios sustratos y crecer rápidamente sobre cualquier residuo de azúcar, como glucosa, fructosa, arabinosa y trehalosa encontrada en el vino. La celobiosa, un componente de la celulosa es otro sustrato que puede ser utilizado por Brettanomyces (Licker et al. 1998). Un amplio espectro de sabores y aromas han sido asociados con el carácter de Brettanomyces incluyendo los clavos de olor, corral, cuero, 30 medicinal, pelo del caballo, sudor del caballo, antiséptico, plástico, ratón, y metálico (Chassagne 2005, Ibeas et al. 1996). 2.8 Defectos del vino No siempre se consigue que un vino fermente y madure de manera que satisfaga las expectativas de los conocedores. Desde el prensado hasta el embotellado el vino esta expuesto al peligro de sufrir daños que pueden llegar a motivar su completo deterioro, los microorganismos responsables de esto son todos aquellos indeseables en un lugar y tiempo particular. Obviamente, incluyen los microorganismos que producen aromas y gustos extraños, olores, colores o precipitados, además de sustancias indeseables que pueden incluso afectar a la aptitud del vino para el consumo, es decir, que no solo afectan a los caracteres sensoriales (ejemplo: producción de aminas biogenas), estos compuestos pueden progresar- lo que resulta especialmente característico- y hacer al vino incomestible (Suárez et al. 1990, Boulton et al. 2002). La reproducción de los microorganismos se ve influenciada de manera determinante por la composición del vino, pero, el crecimiento de estos se puede frenar mediante la utilización de temperaturas suficientemente bajas, altos contenidos en dióxido de azufre (H2SO3) libre sobre todo eficaz frente a bacterias y levaduras, cuando se cuenta con elevados grados de acidez. Sin embargo, grandes poblaciones de microorganismos hacen que incluso cuando se utilizan las dosis mas altas de sustancias antimicrobianas, la estabilidad no sea garantizable. El llenado de botellas con las dosis mas altas de dióxido de azufre libre (50mg/l) tampoco garantiza la estabilidad microbiológica del vino. La aparición de enfermedades en el vino pueden prevenirse solo creando condiciones que inhiban el crecimiento de microorganismos indeseables, partiendo del principio que es más fácil prevenir los defectos y enfermedades que corregirlos o curarlos (Vogt et al. 1984, Ditrrich 1987). 31 2.8.1. Bacterias ácido lácticas Tabla 2: Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias ácido lácticas DEFECTO AGENTE CARACTERISTICAS SUSTANCIAS RESPONSABLES PICADO Bacterias Se reconoce por el Ácido láctico, acético, LACTICO heterolácticas penetrante sabor glicerina, etanol y pertenecientes al ácido dulce y olor de diacetilo. Formados género coles fermentadas por la transformación Lactobacillus frescas (Guillaume de azúcares (Guillaume 2001). 2001). residuales presentes en el vino (Suárez et al. 1990) (Pardo 2004). Streptococcus Se caracteriza por el Polisacáridos exentos ENFERMEDAD mucilaginus var. aspecto aceitoso o de nitrógeno, DE LA GRASA vini, bacterias filante (Suárez, integrados por heterofermentativas 1990). glucanos, del género Cambio de la glucomananos, y Lactobacillus. consistencia fluida, polímeros Especies del normal en vinos compuestos de género sanos, en otra mas galactosa, manosa, Leuconostoc viscosa (Pardo arabinosa y ácido (Suárez et al. 2004). galacturónico (Suárez AHILADO O 1990). VUELTA O REBOTE et al. 1990) Bacterias del Los vinos presentan Ácido láctico o género enturbiamiento, succínico, acético y Lactobacillus cambio de color, CO2. Formados por la (plantarum, brevis) aspecto degradación del (Guillaume 2001). achocolatado ácido tartárico negruzco en tintos y (Guillaume 2001). oscurecimiento en los blanco, en la 32 superficie burbujas de gas (Guillaume 2001).Se observan irisaciones coloreadas como islotes flotantes de grasa. El sabor y el olor llegan a ser repugnantes, siendo este relacionado con el olor a chucroutte (Guillaume 2001). Lactobacillus casei, Color del vino rancio, Acroleína en DEL Lactobacillus presenta combinación con los AMARGOR fructivorans, enturbiamiento y se polifenoles Lactobacillus genera un sedimento (Guillaume 2001). hilgardii, castaño. Leuconostoc Sabor amargo gracile, elevado (Suárez et Leuconostoc oenos al. 1990). ENFERMEDAD (Suárez et al. 1990) AMINAS BIOGENICAS Pediococcus, Efectos sobre la Formación de aminas Oenococcus oeni, salud humana, biogénicas, Bacterias absorbidas en alta histamina, tiramina, heterolácticas concentración feniletilamina, pertenecientes al producen dolores de cadaverina, género cabeza, alteraciones putrescina y Lactobacillus respiratorias, hiper o agmanita, por (Moreno et al. hipotensión y descarboxilación de 2003). fenómenos de los aminoácidos alergia. El carbamato (Guillaume 2001). de etilo es Formación de considerado como carbamato de etilo, un compuesto por la degradación de 33 cancerigeno (Orduña la arginina ( Orduña 2000). 2000) Bacterias El olor de estos vinos Formación de OLOR A heterofermentativas recuerda el olor de piperidinas, RATON del género los nidos de ratones 2-acetil-3, 4, 5,6- Lactobacillus como o la orina de raton tetrahidropiridina Lactobacillus brevis (Boulton et al. (Boulton et al. 2002). y Lactobacillus 2002). VINOS CON hilgardii. ( Heresztyn 1986, Boulton et al. 2002). DETERIORO Bacterias lácticas Gusto a vinagre y a Formación de PRODUCIDO heterofermentativas ester. Producción de manitol, butanol, (Boulton et al. viscosidad (Boulton propanol y ácido 2002). et al. 2002). acético (Boulton et al. POR MANITOL 2002). 2.8.2. Levaduras Las levaduras salvajes podrían no tomarse como contaminantes en vinos, es decir, los géneros que se encuentran en concentraciones mas bien altas sobre las uvas, y que logran fermentaciones alcohólicas limitadas: Kloeckera, Hansenulla y Hanseniaspora; la influencia de estos microorganismos sobre la fermentación alcohólica depende de las condiciones de elaboración, el uso de dióxido de azufre y/o los cultivos iniciadores de levaduras vínicas, pero en cualquier caso llegaran a ser inactivas cuando la concentración de etanol alcanza el 5% aproximadamente(Boulton et al. 2002, Pina et al. 2004). Otras levaduras silvestres como Pichia y Candida son contaminantes en vinos jóvenes, especialmente si no se conservan adecuadamente con SO2 y evitando el oxígeno; Metschnikowia, Torulospora, y Debaryomyces 34 pueden estar en concentraciones bajas en el vino joven, pero nunca crean problemas durante la conservación (Dittrich 1987, Boulton et al. 2002) Tabla 3: Características de las levaduras causantes de la flor del vino MICROORGANISMO CARACTERISTICAS PRINCIPALES • Pichia membranefaciens Se desarrolla en mostos de uva (Suárez et al. 1990). • A veces puede iniciar una levísima fermentación sobre estos (Montaña et al. 1997, Loureiro et al. 2003). • En mostos de uva forma un velo muy tenue, liso o con rugosidad, muy fino (Flor del vino) (Suárez et al. 1990). • Fermentan únicamente glucosa y fructosa (Dittrich 1987). • Son células de forma oval, alargadas o cilíndricas (Dittrich 1987). • Candida mycoderma Fermenta débilmente la glucosa (Suárez et al. 1990). • Asimila el etanol como única fuente de carbono (Montaña et al. 1997). • Produce la enfermedad de flor del vino (Suárez et al. 1990). • Son células de forma oval, alargadas, cilíndricas (Suárez et al. 1990). • Hansenula anomala Presenta células redondeadas y alargadas (Dittrich 1987). 35 • Esporas con forma típica de sombrero de hongo (Suárez et al. 1990). • Fermenta azucares: débilmente glucosa, los rafinosa, sacarosa (Montaña et al. 1997). • Forma velo sobre el mosto antes de fermentar (Suárez et al. 1990). • Zygosaccharomyces acidifaciens Células ovales-alargadas de gran tamaño (Dittrich 1987). • Presenta poder fermentativo medio (Suárez et al. 1990). • Forma velo sobre vinos de baja graduación alcohólica (Suárez et al. 1990). • Se desarrolla en medios con alta concentración de azúcar (Dittrich 1987). 2.8.2.1 Brettanomyces sp. Tabla 4: Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp. CARACTERÍSTICAS Perdida de los sabores COMPUESTOS RESPONSABLES frutales, ESTERASAS. producidos por los esteres. Secretadas por Se pierde parcialmente el carácter enzimas promueven la perdida de esteres varietal de un vino contaminado por (Eder 2003). Brettanomyces, estas Brettanomyces (Eder 2003). Aroma desagradable, relacionado con ACETATO DE ETILO Y ACIDO ACETICO. El el aroma del acetato es formado por oxidación del etanol. chucroutte (Berger 2003) (Guillaume 2001). (Berger 2003). 36 El aroma específico depende de la TETRAHIDROPIRIDINAS. Para la síntesis de concentración de estas se requiere de los sustratos lisina, responsables. En los compuestos concentraciones etanol o propanol bajas huele como a pan o palomitas (Heresztyn 1986). de maíz. En grandes concentraciones como ratón o pelo y sudor de caballo (Heresztyn 1986). Aroma y sabor a analgésico y 4 etil fenol y 4-etil guaiacol, son fenoles medicina gracias a la presencia del 4 volátiles, formados por la degradación del 4- etil fenol, picante y humeante por el 4 vinil fenol y 4-vinil guaiacol , respectivamente etil guaiacol (Eder 2003, Chassagne ( Chatonnet 1992, Gerbeaux et al. 2000, 2005). Stender et al. 2001, Dias et al. 2003, Loureiro et al, 2003). Los compuestos fenólicos sólo se producen por Brettanomyces , su presencia en el vino puede servir como una indicación absoluta de contaminación por este microorganismo, en tanto los ácidos grasos volátiles no confirman una directa contaminación por parte de Brettanomyces , ya que estos compuestos son producidos también por muchas bacterias ácido lácticas y ácido acéticas, así como las tetrahidropidridinas producidas también por lactobacilos heterofermentativos (Heresztyn 1986 , Peyron 1998 , Berger, 2003). Los vinos tintos tienen un nivel alto de taninos como el ácido ferúlico y cumárico que son extraídos de los hollejos de las uvas durante la fermentación. La levadura del vino Saccharomyces y algunas bacterias ácido lácticas tienen enzimas las cuales degradan estos ácidos a intermediarios débiles llamados 4 vinil fenol y 4 vinil guaiacol (paso 1, figura 2). Estos compuestos son enzimáticamente degradados por Brettanomyces a 4 etil fenol y 4 etil guaiacol respectivamente (paso 2, figura 2) (Chatonnet et al. 1992). 37 Figura 2: Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino Fuente: Gawel, 2004. Brettanomyces character in wine 2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de vino tinto. 2.9.1. Contaminación en el vino por Brettanomyces. La relación de Brettanomyces con el vino comienza en la vid. Se ha hallado en el hollejo de la uva de todo tipo de cepas de Vitis vinifera y en casi todas aquellas regiones donde se ha estudiado con las técnicas apropiadas, pero no causa ningún tipo de enfermedad ni al fruto ni a la planta, simplemente se aprovecha de las soluciones azucaradas secretadas. Cuando llega la época de la vendimia la levadura llega al lugar adherida a la uva, por lo que es la propia materia prima la que constituye la principal fuente de contaminación (Licker et al. 1998). Las operaciones de previnificación que van desde la recolección de la materia prima (uva) hasta el estrujado de la misma, es una fase de moderado riesgo en cuanto a la contaminación se refiere; las operaciones de vinificación que van desde la masa estrujada hasta el embotellado es una fase en la que las condiciones pueden ser reguladas y controladas dentro del proceso, la fermentación tampoco es una fase en la que suela causar dificultades. Si los mostos se encuentran poco sulfitados puede comenzar a desarrollarse al comienzo de la fermentación, pero muy 38 pronto es eclipsada por la levadura Saccharomyces cerevisiae. Posteriormente, tras la fermentación, es muy posible que entre la flora microbiana presente en el vino comience a sobresalir Brettanomyces, sobre todo si las condiciones higiénicas durante la fermentación no han sido adecuadas (Figura 3) (Caridi et al. 1993). Las principales habilidades que tiene Brettanomyces para desarrollarse en un vino son la gran capacidad para fermentar azúcares residuales y una extraordinaria adaptación a condiciones ambientales adversas como las que presenta el vino (alta concentración de alcohol, pH ácido, falta de oxígeno, etcétera) Después de la fermentación del mosto aún permanecen trazas de azúcares que pueden ser utilizadas por este tipo de levaduras para su desarrollo, su crecimiento es lento y su metabolismo es complejo. En muchos casos la presencia de este contaminante no implica que el vino vaya a enfermar ni siquiera en un período prolongado. En otros, una barrica o una botella pueden pasar de tener un vino excelente a otro con una alta acidez volátil y unos aromas desagradables en cuestión de semanas. El ácido acético contribuye a aumentar la acidez volátil, el olor a vinagre, también producido por muchas bacterias indeseables, normalmente el aumento en ácido acético conlleva a la aparición de acetato de etilo, que da olores a acetona (Chatonnet 2002, Chatonnet et al. 1992). Un vector de contaminación es la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que es muy abundante en la época de la vendimia, y se encarga de llevar Brettanomyces a todos los rincones de la cava. Si las condiciones de desinfección no han sido apropiadas, en los instrumentos e instalaciones de la cava pueden existir células que se pueden propagar y contaminar los vinos (Berger 2003). 39 1. Entorno 2. Cepa + uvas. Alto riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces sp.) 3. Uvas, operaciones de previnificación. Moderado riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces sp.) 4. Uvas, operaciones de vinificación y acondicionamiento. Bajo riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces sp.) Figura 3: Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego externo, 4 riesgo interno Fuente: Quijano-Rico 2005. 40 2.10 Métodos empleados para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp. Tabla 5: Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp. METODO Bacterias ácido lácticas SO2 Son muy sensibles a este, La adición de 20ppm no comienzan tiene ningún efecto en las a verse afectadas a Brettanomyces sp poblaciones de concentraciones bajas de Brettanomyces sp, la 20ppm inhibición del crecimiento (Suárez y Leal 1990). de esta levadura se da adicionando 40ppm (Fevillat 1997). REDUCCION DE LA ACIDEZ Un pH mas básico Se crea un ambiente mas disminuye la eficacia del favorable para el desarrollo, anhídrido sulfuroso como habría que utilizar el triple antiséptico. Permitiendo así de anhídrido sulfuroso para un mejor desarrollo de las conseguir la bacterias protección frente lácticas indeseables NATAMICINA (Gerbeaux misma a los microorganismos et al. 2002) ( Gerbeaux et al. 2002) No inhibe el crecimiento Es estos microorganismos sobre ( Gerbeaux et al. 2002) cuando se utiliza a una un fungicida, actúa Brettanomyces concentración de 20mg/l, su eficacia decrece con el tiempo ( Gerbeaux et al. 2000) LISOZIMA Inhibe el crecimiento de Su crecimiento no se ve bacterias lácticas a una inhibido por esta (Gerbeaux concentración et al. 2000). de 10g/l (Gerbeaux et al. 2000). 41 Estas FILTRACION células se ven filtros de membrana con tamaño de membrana con un tamaño poro de 0.45 micras. La de poro de 0.65 micras. filtración atrapadas ESTERIL en Se utilizan filtros despoja de del carácter frutal, reduciendo la viscosidad, y creando un tanino más fuerte en el vino tinto (Chatonnet et al. se ve 1999). DIMETIL DICARBONATO ( DMDC ) Inhibe el crecimiento de Su estas inhibido, ya que, el DMDC bacterias. (Egli y Kling 2001). crecimiento es esterilizante (Egli y Kling 2001). 2.11 Potencial del CO2 bajo presiones hiperbáricas para el control de bacterias ácido lácticas y levaduras. Los efectos inhibitorios de gases bajo presión sobre células microbianas han sido extensivamente estudiados. Sin embargo, el mecanismo general de inhibición de microorganismos no es todavía bien entendido, aunque existe la posibilidad de que se ejerza la absorción de gas por las células, así, cuando las células microbianas son presurizadas, el gas gradualmente penetra dentro de las ellas. Este fenómeno de gas puede causar la inactivación de enzimas claves relacionadas con los procesos metabólicos esenciales por cambios en el pH de las células y/o solubilización de sustancias intracelulares tales como fosfolípidos de las paredes de la célula y membrana citoplasmática (Haas et al. 1989). Se ha observado que después del tratamiento con gas bajo presión, hay presencia de hoyos y arrugas en las células de levadura. Algunas células se encontraron totalmente estalladas, mientras las células no tratadas aparecen como esferas, con superficie lisa. Las observaciones de los cambios morfológicos sugieren que las células de levadura o al menos algunas de ellas, son rotas mecánicamente o desgarradas por el 42 tratamiento con gas comprimido (Haas et al. 1989, Nakamura et al. 1994). El efecto del dióxido de carbono comprimido sobre diferentes tipos de microorganismos ha sido estudiado por diversos investigadores. La inactivación microbiana por CO2 es dependiente de muchos parámetros. Algunas de las condiciones experimentales como temperatura, presión, humedad, contribuye a un efectivo tratamiento por incremento de la difusibilidad de CO2. Dentro de ciertos límites, una prolongada duración de exposición al dióxido de carbono puede permitir la esterilización (Wei., et al. 1991) (Lin et al. 1993). La resistencia microbiana al dióxido de carbono también depende de el tipo de microorganismo, la fase de crecimiento, y el medio de suspensión, este último puede inhibir el efecto bactericida de CO2 comprimido, especialmente en sustratos ricos en proteínas .Varias hipótesis han sido propuestas para explicar la actividad microbicida del dióxido de carbono Lin et al (1993), ha observado que a alta presión, el dióxido de carbono penetra las células haciendo que estás se rompan de repente. Los autores pudieron mejorar la velocidad de ruptura disminuyendo súbitamente la presión de CO2. Nakamura et al (1994) y Kumagai et al (1997) observaron que el mejor resultado de destrucción microbiana fue obtenido cuando la presión de CO2 fue reducida muy rápido. En alimentos con alto contenido de agua, el CO2 disuelto produce ácido carbónico, de acuerdo a la siguiente reacción de equilibrio: H2O + CO2 ↔ H+ + HCO3- ↔ H2CO3 ↔ 2H+ + CO32- Ecuación 1: Producción de acido carbónico Fuente: Louka, 1999. Effect of compressed carbon dioxide on microbial cell viability Así el CO2 disuelto actúa bajando el pH del medio, y el resultado de la acidez permite interferir con algunos sistemas biológicos dentro de las 43 células. Esto sugiere que la inhibición microbiana puede resultar de alteración en las propiedades de la célula (membrana, citoplasma, enzimas, etc.). Por tanto una reducción en el pH del medio no es suficiente para explicar la acción antimicrobiana con CO2, la cual muestra un efecto inhibitorio específico, mayor que el de otros ácidos usados para bajar la acidez del medio (ácido hidroclórico, ácido fosfórico), estos ácidos no penetran en las células microbianas tan fácilmente como el dióxido de carbono (Louka et al. 1999). 2.12 Cinética de muerte microbiana La cinética de muerte celular es un factor importante que debe tenerse en cuenta a la hora de diseñar procesos de esterilización. En un medioambiente letal, las células de una población no mueren todas a la vez sino que la desactivación del cultivo se produce durante un periodo finito de tiempo que depende del número inicial de células viables y de la severidad de las condiciones impuestas (Doran 1995). La muerte de una población, al igual que su crecimiento, es generalmente exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en niveles iguales a intervalos constantes. Si se representa el logaritmo del número de microorganismos de la población que sobrevive, frente al tiempo de exposición a un agente determinado, resulta en una línea recta. Cuando la población se ha reducido notablemente, la velocidad de destrucción puede disminuir debido a la supervivencia de las cepas microbianas mas resistentes (Mañas et al. 2005). 44 2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas presiones La aplicación de cualquier nueva tecnología en la preservación de alimentos requiere un modelo fiable que describa con presición la tasa de inactivación. El modelo debe poder establecer las condiciones de tratamiento apropiadas para lograr los niveles de inactivación microbiana, permitiendo la producción de estabilidad y seguridad en los alimentos (Mañas et al. 2005). Los parámetros del proceso térmico generalmente han sido calculados a través del modelo cinético de primer orden. Como resultado una curva de supervivencia recta (gráfico de Log de células sobrevivientes vs tiempo de tratamiento) es obtenida, un tiempo de reducción decimal (valor D) y valor Z son usados para calcular los parámetros del proceso (Smelt et al. 2002). Los primeros experimentos para dilucidar la cinética de destrucción de los microorganismos por las altas presiones se hicieron imitando los modelos muy bien conocidos de los tratamientos térmicos, es decir, representando, a presión constante, el logaritmo de supervivientes frente al tiempo de tratamiento (Mañas et al. 2005). Sin embargo, en los últimos 10 años la conveniencia de la cinética de primer orden para modelos de inactivación por calor, así como para las nuevas tecnologías esta revisándose. Esto es debido a la ocurrente frecuencia de desviaciones (Chen et al. 2003). Algunos autores admiten que la naturaleza de la cinética de desactivación por las altas presiones difiere de la de la muerte térmica y otros tipos de tratamientos pudiendo variar incluso entre cepas de la misma especie y de la presión que se aplique (Simpson y Gilmour 1997). 45 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION. 3.1. Formulación del problema. Para la realización de la fermentación maloláctica bajo condiciones controladas es necesario reducir considerablemente las dosis usuales de SO2. En estas condiciones diversos microorganismos perjudiciales para las características sensoriales del vino tales como: bacterias ácido lácticas y levaduras por ejemplo del género Brettanomyces, pueden multiplicarse sin grandes limitaciones y causar daños importantes e irremediables en el perfil sensorial de los vinos. La utilización del CO2 hiperbárico para el tratamiento de los estrujados de uvas debe permitir una reducción suficiente de las poblaciones de estos microorganismos para evitar las mencionadas alteraciones del perfil sensorial del vino, o por lo menos reducirlas a niveles aceptables. 3.2. Justificación. La elaboración de vinos tintos de calidad superior consta de cuatro etapas en el proceso de vinificación: 1. maceración de la masa estrujada de la vendimia, 2. fermentación alcohólica en la cual se transforman los principales azúcares de la uva, glucosa y fructosa, en etanol y dióxido de carbono, 3. fermentación maloláctica que tiene por objeto transformar el ácido málico relativamente áspero en ácido láctico mucho más suave, y 4. en el caso de los vinos Pinot noir una etapa ulterior a la fermentación maloláctica, que se ha observado incide sobre la estabilidad del color, que es el reposo del vino sobre el deposito de células no viables de levadura. En estas cuatro etapas el riesgo de daño del perfil sensorial del vino por la acción de bacterias ácido lácticas y/o levaduras como las pertenecientes al género Brettanomyces sp es muy alto. Probablemente la eliminación de una parte importante de las poblaciones de los microorganismos mencionados, puede permitir la 46 reducción del riesgo. Por las características químicas, toxicológicas, tecnológicas, el dióxido de carbono bajo presión parece ser promisorio para alcanzar este objetivo, ya que el uso del dióxido de azufre como antiséptico es limitado en el presente caso por la sensibilidad a este de Oenococcus oeni (agente de la fermentación maloláctica controlada). El tratamiento con dióxido de carbono bajo presión no produce alteraciones en el perfil sensorial. En cambio la pasteurización y la termovinificación que vienen a ser una alternativa, introducen cambios notables en el perfil sensorial de los vinos. No sobra anotar que actualmente cerca de setenta viticultores están asociados al proyecto vitivinícola de Puntalarga y por lo tanto su ingreso depende en gran medida del éxito de los vinos regionales en el mercado. 47 4. OBJETIVOS 4.1. GENERAL Evaluar el potencial del CO2 bajo presión hiperbárica, para el control de poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas, en uvas estrujadas de la variedad Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga. 4.2. ESPECIFICOS • Establecer el tiempo necesario para reducir en mas de 95% las poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras bajo las siguientes condiciones: Presión: 35 bar, pH: 3.2-3.3, temperatura 15°C y concentración de azúcares 28°Brix. • Evaluar la respuesta al tratamiento hiperbárico de CO2 de poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras por medio de la técnica de “recuento en placa”. • Evaluar la presencia de Brettanomyces sp. en medio DBDM después de la fermentación alcohólica. • Comparar los perfiles sensoriales de vinos obtenidos a partir de estrujados tratados y no tratados con CO2 bajo presión hiperbárica. 48 5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Sitio de estudio El trabajo se llevó a cabo en el viñedo “Loma de Puntalarga” Nobsa, Boyacá (Figura 4), situado a 5°46'47.1” latitud norte y 72°58'36.5” longitud oeste, altitud de 2618 m.s.n.m. la loma esta localizada al borde del denominado Valle del Sol, Valle de Sogamoso en la proximidad del curso del rió Chicamocha en la vertiente occidental de la cordillera oriental de los Andes. En el año se tienen promedios de temperatura y precipitación de 16.5°C y 830mm respectivamente (Chaparro 2001). Figura 4: Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá Fuente: Quijano-Rico 2005 49 5.2 Muestreo Se escogió aleatoriamente una parcela dentro del viñedo, cultivada con cepas de Pinot noir. Posteriormente se tomaron 100 uvas de diferentes plantas, con el fin de determinar el grado de maduración de la uva, por medio del contenido en azúcar grados Brix (gramos de azúcar en 100 ml de solución: 1° Brix equivale a 10g de azúcar/ L), el cual aumenta con el grado de maduración (Matiz et al. 1993, Bryce 2000). Una vez conocido el grado de maduración de las uvas se llevo a cabo la vendimia o cosecha, de plantas seleccionadas aleatoriatoriamente. Se procedió con precaución al momento de cortar el racimo de la mata. Los racimos fueron recolectados y depositados en baldes (Matiz et al. 1993, Paipilla et al. 1997,). 5.2.1 Preparación de muestras Se realizó un despalillado manual de los racimos seleccionando las uvas por color y sanidad. Se pesaron 8Kg de uvas. Y se procedió a realizar un estrujado manual de los granos de uva, se adicionó 0.35g de metabisulfito de sodio, y se procedió a almacenarlo en bolsas de polietileno con 250g de estrujado c/u. Se sellaron y se almacenaron a -18°C. (Gutiérrez et al. 1993, Steild et al. 2001, Archer 2004, Zdenek 2003). 5.3 Parámetros de operación del tratamiento hiperbárico de CO2 En este estudio se empleo el CO2 para probar su poder de inactivación sobre el crecimiento de células microbianas. En los estrujados de uvas. Se experimentó con un método de control de CO2 a una presión de operación de 35 bar, temperatura 15°C, 28°Brix y pH: 3.3. Para cada montaje se tomaron muestras a los 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 y 360 minutos de tratamiento, a cada muestra se le 50 realizó recuento en placa de bacterias ácido lácticas y levaduras (Anexo 5) (Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998, Quijano 2005). Con el fin de obtener una mayor exactitud en los resultados, el procedimiento se realizó por triplicado (montaje 1,2 y 3) 5.4 Tratamiento de estrujados bajo presión 5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones Figura 5: Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2 Fuente: Montaña 1997, Quijano-Rico 2005. 51 Tabla 6: Partes del biorreactor y su función PARTES DEL FUNCIÓN BIOREACTOR A. Válvula Abre el cilindro que contiene el CO2. B. Válvula Regula el paso de CO2. C. Válvula Permite el paso de CO2 del cilindro al autoclave. D. Válvula Se utiliza para la extracción de la muestra desde la cámara de presión. Un medidor de presión (manómetro de 0-100 bar). E. Manómetro F. Válvula de Permite regular la presión del biorreactor. alivio G. Tapones y Para sellar y conectar tramos de tubería de ¼ de pulgada uniones “T” respectivamente. H. Conectores Al cilindro de CO2. Conducto Paso del CO2, del cilindro al recipiente de la muestra. J. central Para salida de muestra, en tela de acero inoxidable. K. Filtro Recipiente Fabricado en acero inoxidable 316. L. contenedor del liquido M. Ciclón de Para toma de muestras. muestreo N. Cilindro de CO2 Contiene CO2. O. Doble pared Para la regulación de temperatura, mediante la circulación de un líquido caloportador. P. Abrazadera Ajusta herméticamente el biorreactor. El biorreactor, esta conectado a un sistema de refrigeración para mantener constante la temperatura del biorreactor a un valor de 15°C, compuesto por: un recipiente de doble camisa, uno en acero inoxidable 316, y otro en icopor, una bomba de recirculación de agua, compresor, radiador y ventilador (Sanabria y Zarate 2005). 52 5.4.2 Procedimiento Descongelación de muestras 15°C por 15 h Carga del biorreactor con 750g de estrujado Cierre hermético del equipo Expulsión de aire por corriente de CO2 durante 5 minutos Presurización con CO2 35 bar, 15°C Toma de muestras (minutos) (Figuras 7 y 8) 0 30 60 90 120 150 180 Recuento Levaduras Bacterias ácido lácticas 210 240 300 Lavado y desinfección del ciclón de muestreo Después de cada toma de muestra Figura 6: Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de muestras de estrujados de uvas 53 360 Figura 7: Salida de muestra al ciclón de muestreo Figura 8: Toma de muestra en el ciclón de muestreo 5.5 Recuento de bacterias ácido lácticas Para realizar el conteo de bacterias ácido lácticas, se realizaron diluciones seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-6 en agua peptonada al 0.1%p/v Se sembraron en superficie 0.1ml de estas diluciones en agar MRS (Anexo 3.1) y se incubaron a 30ºC por 72 horas, en microaerofília. La aparición de colonias blancas, Gram positivas y catalasa negativas se considero indicativo de bacterias ácido lácticas (Álvarez et al. 1998 y Carrascal et al. 2002). Para la lectura se escogieron placas con 30 a 300 colonias y el número final de bacterias se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml). 54 5.6 Recuento de levaduras Para realizar el conteo de levaduras, se realizaron diluciones seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-6 en agua peptonada al 0.1%p/v. Se sembraron en superficie 0.1ml de las diluciones en agar YGC (Anexo 3.2) y se llevaron a incubar a 25°C por 3 días, adicionalmente se realizo coloración de Gram (Lizarazo et al. 1996, Zagorc et al. 2001, Carrascal et al. 2002). Para la lectura se escogieron placas con 15 a 150 colonias y el número final de levaduras se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml) 5.7 Fermentación alcohólica Una vez establecido el tiempo de tratamiento en el cual se redujeron las poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas a más de un 95 por ciento, se realizó la fermentación alcohólica. Para realizar la fermentación se procedió a descongelar 1500g de estrujado de uvas (15°C por 15 horas), de los cuales 750g fueron sometidos a tratamiento hiperbárico con CO2 a 35bar, 15°C y 360 minutos, esta muestra llevó el nombre de muestra con tratamiento hiperbárico de CO2. Los 750g restantes, no tuvieron ningún tratamiento con dióxido de carbono, esta muestra llevó el nombre de “muestra control”. La muestra con tratamiento hiperbárico de CO2, y la muestra control fueron sometidas a fermentación alcohólica bajo condiciones controladas, utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae, cepa ATCC procedente de Lallemand, Canadá, selección comercial en forma de levadura liofilizada (Rojas 1991 y Quijano 2005). 55 5.8 Análisis microbiológico de los vinos 5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas Para determinar la presencia o ausencia de bacterias ácido lácticas, se realizaron siembras en superficie del producto final (vino con tratamiento hiperbárico de CO2 y vino control) en medio MRS (Anexo 3.1), selectivo para bacterias ácido lácticas, se incubaron a 30°C por 72h en microaerofília. La aparición de colonias blancas, Gram positivas y catalasa negativas se considero indicativo de presencia de bacterias acido lácticas (Álvarez et al.1998; Carrascal et al. 2002, Sanabria et al. 2005). 5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes Para verificar la presencia o ausencia de levaduras salvajes, se realizo una siembra en superficie de las muestras de vino en agar WL (Anexo 3.3), luego se llevaron a incubar a 25°C por tres días, adicionalmente se realizo coloración de Gram (Carrascal et al. 2002, Sanabria et al. 2005). 5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp Para determinar la presencia de Brettanomyces sp se realizaron siembras en superficie de los vinos obtenidos, en agar DBDM (anexo 3.4). El medio sembrado se llevó a incubar a 25°C por 14 días (Mitrakul et al. 1999, Gerbeaux et al.2000, Rodríguez et al. 2001, Días et al. 2003, Silva et al. 2004). Este medio de cultivo es parcialmente selectivo y completamente diferencial para Brettanomyces sp. en vinos, la aparición de colonias amarillo crema como puntos de alfiler, el cambio de color del medio de azul a amarillo y la detección de olores fenólicos (olor a ratón, sudor de caballo, establo, analgésico y/o ahumado) es indicativo de la presencia 56 de Brettanomyces sp. (Gerbeaux et al. 2000, Rodríguez et al. 2001, Días et al. 2003). Figura 9: Equipo de filtración Figura 10: Medio DBDM 5.9 Parámetros físico-químicos Para el análisis físico-químico se utilizaron muestras del vino con tratamiento hiperbárico de CO2 y vino control. 57 5.9.1 Determinación del contenido alcohólico por el método de Roessner Para la determinación del grado alcohólico de los vinos se utilizó un areómetro, con escala entre 980 y 1020 g/l, y un refractómetro calibrado, con escala en °Brix (Quijano 2005). Seguido a esto se aplicó la formula de Roessner: CETL = [(CRFT°Brix.4,17) + (1000-d)] X 0,365 5.9.2 Determinación refractométrica del extracto del vino Se utilizó una muestra de 25 ml de vino, y se redujo el volumen en un dispositivo evaporador en corriente de aire caliente a 90°C, hasta aproximadamente 15 ml. Se completó con agua destilada a 25 ml, se mezcló bien, seguido a esto se leyó en el refractómetro el valor en °Brix de la solución. Se expresó el resultado en g/100g (Quijano 2005). 5.9.3 Determinación potenciométrica del pH Para realizar esta medida se utilizó pH-metro metrohm , pH 0,0-14,0 ±0,1 (Quijano 2005). 5.9.4 Color comparativo Se utilizaron copas blancas especiales para evaluar el color del vino, esta evaluación también se llevó a cabo en el vino con tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino control (Quijano 2005). 58 5.10 Evaluación sensorial El análisis sensorial se llevó a cabo por 4 jueces entrenados de acuerdo con la metodología establecida en el viñedo & Cava Loma de Puntalarga por un tiempo aproximado de 1-20 años, incluyendo a la autora del presente trabajo. Se evaluaron las características sensoriales de tres muestras correspondientes a vino Pinot noir del Viñedo de Puntalarga, vino con tratamiento hiperbárico con CO2 y vino control. Las pruebas de análisis sensorial se realizaron en un salón ventilado e iluminado, se sirvió aproximadamente 30ml de las muestras a temperatura ambiente en copas de degustación transparentes e incoloras, codificadas con un digito (1, 2,3) (Anexo 8 y 9) (Porras et al 2003, Quijano 2005, Sanabria et al. 2005). 5.11 Análisis estadístico Los resultados de los recuentos realizados a las muestras con tratamiento hiperbárico de CO2 se analizaron usando el programa statistiXL versión 1.4; con el cual se trabajo a un nivel de significancía de α=0.05. Para el análisis de los datos se aplicó el modelo estadístico de Regresión Lineal Simple, el cual explica la variación en los recuentos en UFC/mL que es la variable dependiente numérica (y) en términos de una variable numérica independiente (x), en este caso el tiempo (Anexo 10 y 11) (Walpole et al. 1992, Morantes 2006) 59 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2 sobre células de levaduras y bacterias ácido lácticas. En este trabajo de investigación se evaluó el efecto de la presión de CO2 sobre bacterias ácido lácticas y levaduras como metodología alternativa de tratamiento para mejorar la calidad de vinos de la variedad Pinot noir. Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 7 y 8. Tabla 7: Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes. TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS 0 30 60 90 120 150 180 210 240 300 360 Log 10 LN Porcentaje(%) UFC/ml UFC/ml de inhibición 4 5,619789 12,940042 0 4 5,392110 12,4157932 40.48 3 4.942834 11,381297 79.05 3 4,873126 11,220789 82.14 3 4,790050 11,0294988 85.24 3 4,721536 10,871738 87.38 3 4,587337 10,5627332 90.71 3 4,552262 10,4819718 91.19 3 4,472268 10,2977794 92.86 3 4,308208 9,92001685 95.24 3,3970037 9,1413475 97.86 42x10 25x10 88x10 75x10 62x10 53x10 39x10 37x10 30x10 20x10 3 9x10 Tabla 8: Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres montajes. TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS 0 30 60 90 120 Log 10 LN Porcentaje de UFC/ml UFC/ml inhibición 4 5,44715803 12,5425449 0 4 5,18563658 11,9403695 46.43 3 4,95744765 11,4149451 67.5 3 4,92771246 11,3464773 69.64 3 4,88460658 11,2472223 72.5 28x10 15x10 91x10 85x10 77x10 60 150 69x103 4,83674597 11,1370192 75.36 3 4,71321044 10,8525681 81.43 3 4,56427143 10,5096234 86.79 3 4,4366926 10,2158622 91.79 3 4,23044892 9,74096862 93.93 3 4,09108047 9,4200609 95.71 52x10 180 37x10 210 23x10 240 17x10 300 12x10 360 Estos resultados mostraron que con un tiempo de residencia de 360 minutos bajo presión de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujados de uvas, se obtuvó una reducción de la población de levaduras del 97.9 por ciento correspondiente a una población final de 9X103 UFC/mL y de 95.7 por ciento de bacterias ácido lácticas con una biomasa final de 12X103 UFC/mL, datos obtenidos del promedio de los tres montajes realizados. Las figuras 11 y 12 muestran que la disminución de la viabilidad celular depende no solo de la presión sino también del tiempo de exposición, se ha reportado que el tiempo requerido para la inactivación completa, depende de factores tales como: tipo de microorganismo (bacteria, hongo), estado en que se encuentra (vegetativa, espora), fase de crecimiento, composición del medio y condiciones del tratamiento (Louka et al. 1999, Karama et al. 2001 y Spilimbergo et al. 2003). 6 Log UFC/mL 5,5 5 4,5 Log UFC/mL 4 3,5 3 0 100 200 300 400 Tiempo ( min ) Figura 11: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres montajes 61 6 Log UFC/mL 5,5 5 4,5 Log UFC/mL 4 3,5 3 0 100 200 300 400 Tiempo ( min ) Figura 12: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio de los tres montajes Con el fin de comprobar la acción del dióxido de carbono bajo presión sobre las poblaciones de microorganismos evaluadas, se calcularon los valores D y K. El valor K definido como la velocidad de muerte constante o tasa de inactivación, fue calculado del reciproco de la pendiente de la curva de sobrevivencia siguiendo un análisis cinético tradicional, los resultados de este presentaron un valor de 0.0133 min –1 para levaduras y para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min –1 . Los valores K obtenidos en el tratamiento bajo presiones hiperbáricas de CO2 indican que este tratamiento afecta significativamente la respuesta microbiana, como fue reportado previamente por Shimoda et al. 2001 (Erkmen et al. 2000 y Karaman et al. 2001 ). El tiempo de reducción decimal, valor D para levaduras y bacterias ácido lácticas hallados a partir del promedio de los montajes, señaló que se necesitan 173 y 238 minutos respectivamente, para reducir una población a su décima parte a una presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujado de uvas de la variedad Pinot noir, es decir disminuir una unidad logarítmica, lo cual comprueba que las levaduras son menos 62 resistentes a la presión de CO2 que las bacterias ácido lácticas quienes necesitan mayor tiempo de exposición (Anexo 5.7 y 5.8). Los resultados señalaron que la cinética de inactivación por presión para los dos tipos de microorganismos evaluados sigue un modelo cinético de primer orden debido a la baja dispersión de los datos (Ver anexo 10) demostrado en sus altos coeficientes de correlación (r2>0.9); resultados similares fueron obtenidos por Shimoda et al. 2001, Erkmene et al. (2000) y Karaman et al. (2001). A pesar que los efectos inactivantes del CO2 sobre los microorganismos son utilizados en la industria alimenticia, el mecanismo de inactivación no ha sido claramente definido. A continuación se presentan algunos posibles mecanismos basados en la información obtenida en la literatura consultada. Karaman et al. (2001) atribuyeron el poder inactivante de este proceso a la alteración de las proteínas responsables para la replicación, integridad y metabolismo. La alta presión al parecer no rompe enlaces covalentes, pero si altera uniones tipo puentes de hidrógeno y uniones iónicas responsables para mantener a las proteínas en su forma biológicamente activas. Erkemen 2000 , piensa que se origina en la difusión del dióxido de carbono dentro de la membrana celular, acumulandose dentro de las células. A presión suficiente es posible que un gran número de moléculas de CO2 pasen continuamente la membrana celular y reduzcan el pH interno copando la capacidad buffer del citoplasma. Cuando el pH intracelular cae por debajo de 3, procesos vitales biológicos como la glicólisis son inhibidos . Según Louka et al. 1999, Erkmen 2000 y Karaman et al. 2001, el dióxido de carbono se disuelve en solución acuosa formando ácido carbónico, lo cual baja el pH del medio, aunque 63 es difícil esperar que este sea el único mecanismo responsable del efecto letal en las células. Hass et al. 1989 y Nakamura et al. 1994, observaron que después del tratamiento con gas bajo presión, hay presencia de hoyos y arrugas en las células, esto sugiere que las células o al menos algunas de ellas, son rotas mecánicamente o desgarradas por el tratamiento con gas comprimido. En estudios realizados anteriormente en el Viñedo & Cava Loma de Puntalarga se utilizó el tratamiento con CO2 para inactivar células de levadura (Montaña y Ortegón 1997), y bacterias ácido lácticas en vinos por Álvarez y García 1998. En mostos de uvas a 30 bar se observó una reducción del 96 por ciento de la población de levaduras a los 120 min en mostos de uvas con 14°Brix, mientras en vino de 11.5 volúmenes% en alcohol y menos de 1g/L de azúcar residual se logro inactivación de bacterias ácido lácticas a 30 bar por 30 minutos. Comparando estos resultados con la presente investigación, deduce la importancia que tiene el medio en el cual se encuentran suspendidas las células microbianas, ya que la eliminación de las poblaciones evaluadas en este proyecto fue menos rápida, debido talvez en parte a la naturaleza del medio (estrujado de uvas), esta diferencia podría atribuirse también al contenido en sustancias disueltas en las muestras evaluadas. Se trabajó con una concentración de azúcares de 28°Brix, mayor a la utilizada en mostos de uva (14ºBrix). Según Mohio (1993) cuanto más alta sea la presión de CO2 y más bajo el contenido de azúcar, será mas rápida la inactivación, demostrando así que la inhibición de los microorganismos por alta presión de CO2 esta sujeta a gran variedad de parámetros, que hacen que las condiciones de operación se limiten a un caso específico (Karama et al. 2001). 64 Montaña y Ortegón (1997), utilizando la misma técnica que la aquí descrita, pero nitrógeno en cambio de dióxido de carbono, no observaron reducciones significativas en poblaciones naturales de levaduras de mostos de uvas. Los autores aplicaron presiones de 40 y 100 bar hasta por 120 minutos, a una temperatura promedio de 17°C. Estos resultados pueden atribuirse a la inercia química del nitrógeno, frente a la actividad química del dióxido de carbono, en las condiciones experimentales. Dillow et al. (1999) ya anotaron que la toxicidad del CO2 para microorganismos, en un medio acuoso, esta relacionada esencialmente con la formación de acido carbónico en solución acuosa, que resume la reacción: H2O + CO2 ↔ H+ + HCO3- ↔ H2CO3 ↔ 2H+ + CO32- El equilibrio de esta reacción, es desplazado por incremento de la presión, en la dirección de la formación de ácido carbónico, de acuerdo con el principio de Le Chatelier. La concentración de H2CO3 en un sistema acuoso es directamente proporcional a la solubilidad del CO2 en el sistema. A su turno, esta dimensión es directamente proporcional a la presión ejercida por el gas sobre el sistema. Además aumenta con el contenido del sistema en etanol, pero disminuye con la temperatura y con la concentración de otras sustancias en solución (glucosa, fructosa, glicerol, taninos) Cavazzani (1985). Aunque los mecanismos de inhibición de microorganismos por medio de altas presiones hidrostáticas (1000 a 10000 bar), difieren considerablemente de los que operan en presencia de un gas con actividad química, bajo presiones relativamente bajas (10 a 50 bar), como el aquí estudiado ( Quijano 2006 ), es interesante tener presentes los fenómenos de baroprotección y baropromoción de la inhibición de microorganismos por presión, debidos a sustancias disueltas en sistemas acuosos hidrostáticos, descritos por Knoor (1995). En la figura 13 tomada 65 de dicho autor, se observan los efectos baroprotector de la fructosa y glucosa y baropromotor de NaCl, en la inhibición de poblaciones de Rhodotorula rubra, bajo una presión de 4000 bar. La sacarosa, en las condiciones experimentales, es un baroprotector más eficaz que la fructosa, mientras que NaCl al 10% es un baropromotor muy eficaz. Guardando todas las proporciones del caso, el análisis del comportamiento de poblaciones de bacterias acido lácticas y levaduras en estrujados de uvas y vinos tratados con dióxido de carbono bajo presión, puede dar algunas luces sobre manifestaciones similares a las que se acaban de describir, Figura 14. El efecto baroprotector, en principio es atribuible al contenido en glucosa y fructosa (28°Brix) de los estrujados de uvas, es notorio, mas en el caso de las bacterias ácido lácticas, que en el de las levaduras. En cambio, la curva referente a un vino (contenido en etanol 11,5 vol%, en azúcar residual <1g/l) muestran un efecto baropromotor que recuerda al del NaCl. En primera aproximación estos fenómenos pueden ser atribuidos al contenido relativamente elevado, en sólidos solubles ( glucosa, fructosa 28°Brix) de los estrujados de uvas y al del etanol (11.5 vol%), en el caso del vino. Parece que el método, de inhibición de microorganismos por CO2 bajo presión, se encuentra, como los sistemas de inhibición hidrostáticos, con barreras y ventajas asociadas respectivamente con los fenómenos de baroprotección y baropromoción, pese a las diferencias del orden de un factor de 100 en los valores de las presiones aplicadas. 66 Figura 13: Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de Aw=0.94. Fuente: Knoor, R.1995. Food process design and evaluation Tabla 9: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias ácido lácticas y levaduras. Tiempo 0 30 60 90 120 150 180 210 240 300 360 % de células vivas de bacterias acido lácticas en estrujados de uvas a 35bar(este trabajo) 100 53.57 32.5 30.3 27.5 24.64 18.57 13.21 8.21 6.07 4.29 % de células vivas de levaduras en estrujados de uvas a 35bar(este trabajo 100 59.5 20.9 17.8 14.8 12.61 9.29 8.81 7.14 4.76 2.14 67 %de células vivas de bacterias ácido lácticas en vino a 30bar(Álvarez et al.,1998) 100 0 0 0 0 0 - Porcentaje de celulas vivas 100 90 80 70 60 Bacterias acido lacticas en estrujados de uvas a 35bar 50 Levaduras en estrujados de uvas a 35bar 40 30 Bacterias acido lacticas en vino 30bar 20 10 0 0 100 200 300 400 Tiempo ( min ) Figura 14: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y levaduras. Finalmente, el análisis estadístico de la reducción de poblaciones microbianas por presiones hiperbáricas de CO2 realizado por la técnica de recuento en placa, a través del modelo de regresión lineal simple, demostró que existe una fuerte correlación lineal negativa entre los datos, ya que a medida que aumenta el tiempo, el número de Unidades Formadoras de Colonia disminuye en forma lineal, tal como se verifica por el Coeficiente de Correlación de Pearson obtenido(> -0.95), el hecho de que el valor de significancía del coeficiente obtenido, sea muy pequeño (0.000001), indica la fuerte relación existente entre las variables. El análisis de varianza ANOVA ( One way AOV) dentro de los resultados de la regresión evaluó la hipótesis de si existía relación entre la variable dependiente para este caso las UFC/mL y la independiente el tiempo de tratamiento, los valores obtenidos del estadístico F: 257.0777 para bacterias ácido lácticas y 103.2667 para levaduras ( F(0.05,1,9) = 5.12) , reveló que existía una innegable relación entre las variables, y sugirió que la variable independiente es un indicador significativo de la variable dependiente. El modelo de regresión lineal se ajusto al tipo de datos manejado, mostrando obviamente una disminución en la población tanto 68 de levaduras como de bacterias ácido lácticas, siendo dicha disminución debida al efecto del tratamiento sobre las poblaciones, en relación con el tiempo de tratamiento (ver anexo 10 y 11). 6.5 Parámetros Físico-Químicos de los vinos Al vino obtenido de los estrujados de uvas sometidos a 35 bar de presión de CO2 y al vino control (sin tratamiento), se les determinó porcentaje de alcohol, extracto seco (g/L) y pH; para saber si el tratamiento con presiones hiperbáricas de CO2 afectaba algunos parámetros. En la composición química del vino influyen factores como el manejo de las vides, del mosto y del vino, así como el clima y las condiciones atmosféricas (Porras y Santos 2003). Tabla 10: Resultado del análisis físico Químico de los vinos VINO % Alcohol 15.27% Extracto seco g/L 32.0 Control Tratamiento de CO2 pH 3.56 15.27% 32.0 3.58 El pH es una medida del equilibrio de la concentración del ion hidrógeno y se ve afectado por la medida en que se neutralizan los ácidos de la solución. Se mide fácilmente usando un pH-metro, pero los factores que determinan su valor son más complicados y menos evidentes. Este parámetro es importante ya que el grado de ionización de diversos compuestos químicos, la velocidad de numerosas reacciones químicas, las propiedades físicas y la estabilidad microbiológica de mostos y vinos, son función del pH (Boulton et al. 2002). Como se observa en la tabla 10 en relación con el valor de pH en el vino obtenido con estrujados de uvas tratadas con presión respecto al vino control, este parámetro no presenta una variación significativa, lo que muestra que el pH del vino no es alterado por el tratamiento del estrujado. 69 El porcentaje de alcohol se encuentra relacionado con la concentración de azúcares que están disponibles para ser convertidos en etanol por la acción de las levaduras. El resultado de este análisis en los dos vinos no presentó variación alguna (Tabla 10), en consecuencia el tratamiento hiperbárico de CO2 no afecta los azúcares presentes en los estrujados de uvas, además de esto las muestras con las cuales se realizó la vinificación tenían el mismo contenido de azúcar (28°Brix), lo que explica la no diferencia en los resultados de este análisis (Boulton et al. 2002). El extracto seco de un vino se refiere a los sólidos solubles libres de alcohol, corresponde a los componentes naturales del vino, es importante en la expresión sensorial de los vinos, ya que un bajo contenido en estas materias los hace flojos y ligeros al paladar (Porras y Santos 2003). El resultado de este análisis fue igual tanto para el vino de estrujado tratado como para el vino control, mostrando que el proceso al que fueron sometidos, no modificó el contenido en extracto seco, como era de esperar. La comparación de color deja ver que la intensidad del rojo en el vino con tratamiento de CO2 y el vino control era la misma. En cuanto a la tonalidad, el vino con tratamiento de CO2 presentaba un mayor desplazamiento hacia el naranja que el control. Estos resultados indican que el tratamiento con CO2 bajo presión podrían tener efecto perceptible sobre el color del vino. 6.6 Análisis microbiológico de los vinos En esta investigación se pretendía lograr una disminución de las poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras presentes en estrujados de uvas de la variedad Pinot noir, para reducir la población de microorganismos indeseables en el vino y con esto, defectos en el perfil sensorial de los mismos. A pesar de haber usado tiempos de exposición relativamente prolongados al tratamiento hiperbárico de CO2, no logró eliminar el total de las poblaciones evaluadas, pero si una alta proporción. 70 El resultado obtenido en el recuento de bacterias ácido lácticas en el vino control fue de 1,2x103 UFC/mL y en el vino con tratamiento hiperbárico de CO2 fue de 3,0x102 UFC/mL, lo que indica que las disminución de la población de bacterias ácido lácticas por el método de alta presión con CO2 sirvió para disminuir el contenido de células presentes en el vino. Además este vino se encontró por debajo del valor máximo permitido que es 1x103 UFC/mL, contrario a lo que sucedió con el vino control (Boulton 2002). Por otro lado el valor obtenido el recuento de levaduras salvajes en el vino control fue de 2x101 UFC/ml, por debajo del valor límite permitido que es 1x103UFC/ml. En el vino con tratamiento hiperbárico de CO2 no hubo crecimiento de levaduras salvajes (Zarzoso et al. 2002). En el medio DBDM no hubo crecimiento, lo que indica, que dentro de las levaduras salvajes presentes en el vino control no se encontraban levaduras del genero Brettanomyces sp. , causantes de los denominados olor a sudor de caballo, pesebrera, medicina y cuero (Chatonnet et al. 1992, Gerbeaux et al. 2000, Stender et al. 2001, Días et al. 2003). El bajo recuento de los vinos obtenidos de estrujados de uvas tratados con dióxido de carbono bajo presiones hiperbáricas muestra la utilidad del proceso para la aplicación industrial. En cuanto a la diferencia conseguida en el recuento de levaduras salvajes, se podría sugerir que estas levaduras que podrían estar como contaminantes en el vino fueron eliminadas por el tratamiento hiperbárico de CO2 (Chassagne 2005; Pina et al. 2004; Días et al. 2003, Romano et al, 2003, Graham et al, 2003). 6.7 Análisis sensorial Para este análisis, se utilizo el vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2, vino control realizado con muestras sin tratamiento hiperbárico de CO2 y un vino Pinot noir tradicional del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga (figura 15). 71 Color, olor, claridez y sabor son los parámetros que dan las características típicas a cada clase de vino. Los vinos obtenidos fueron sometidos a una evaluación sensorial a cargo de cuatro catadores, Se calificaron los caracteres organolépticos utilizando la tabla normalizada de la OIV (anexo 8 y 9) (Paipilla et al. 1997 y Quijano 2005). Figura 15: Panel de catadores La figura 16 muestra la claridez de los vinos evaluados. Se observa que el vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino control fueron claros a diferencia del vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, el cual presento alguna turbidez. Esto indica que el tratamiento hiperbárico de CO2 no altera la claridez del vino, como era de esperar (Anexo 7). 72 Pinot noir Tratamiento hiperbarico de CO2 Control 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Puntaje Figura 16: Claridez de los vinos Pinot noir evaluados Por otra parte, en la figura 17 se observa que el vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino control se caracterizan por presentar un color típico correspondiente a los vinos de la variedad Pinot noir, mientras que el vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga presenta un color atípico. Estos resultados demuestran también que el tratamiento con CO2 no afecta el pígmento (taninos) que se encuentra en las capas de las células del hollejo de la uva cuya cantidad e intensidad cromática desempeñan un papel especialmente importante en la elaboración del vino tinto (Anexo 7) (Vogt, et al., 1986). Pinot noir Tratamiento hiperbarico de CO2 Control 0 1 2 Puntaje Figura 17: Color de los vinos Pinot noir evaluados 73 3 4 En cuanto a el olor, se observa en la figura 18 que el vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino control no presentan notas extrañas. El vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga presentó notas finas (Anexo 7). Así el tratamiento hiperbárico de CO2 no presenta ningún efecto en el olor del vino, su similaridad con el vino control tal vez se deba al corto período de maduración que presentaban. El vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga presentó leves notas extrañas relacionadas con fenoles volátiles, esto podría ser atribuido a la producción de ácido p-cumárico y ácido-ferúlico por parte de Brettanomyces sp. Los resultados obtenidos anteriormente muestran que la ausencia de Brettanomyces sp en el vino control pudo se debida al buen manejo de las prácticas higiénicas en el proceso de elaboración ya que como sugiere Cocolin en el 2004, esta especie de levadura puede sobrevivir, multiplicarse y contaminar vinos trasladados a sitios que no han tenido un óptimo proceso de limpieza y desinfección después del uso. Pinot noir Tratamiento hiperbarico de CO2 Control 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Puntaje Figura 18: Olor de los vinos Pinot noir evaluados El sabor del vino (figura 19) producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 se caracterizo por ser armónico con una calificación de 6.75 y el vino control con un puntaje inferior de 5.75 lo cual lo clasifica como liviano con carácter. El vino Pinot noir del Viñedo & 74 Cava Loma de Puntalarga obtuvo un puntaje de 7.5 el cual también esta dentro del rango para vinos armónicos. La mayor calificación fue obtenida por este vino debido posiblemente al mayor tiempo de maduración en el momento de la catación (Anexo 7). Pinot noir Tratamiento hiperbarico de CO2 Control 0 2 4 6 8 Puntaje Figura 19: Sabor de los vinos Pinot noir evaluados En la figura 20 se observa la impresión global de los vinos, la cual permite considerar que el vino control y el vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga usados para la catación fueron los adecuados. El vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2, obtuvo un puntaje de 13.75 que lo clasifica como un vino de calidad media, mientras que los otros dos vinos alcanzaron un menor nivel. Los resultados señalaron que el vino con mayor puntaje fue el vino con tratamiento de dióxido de carbono, esto debido posiblemente a la disminución de poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas en los estrujados de uvas tratados con CO2 a altas presiones, pues los microorganismos tienen un papel prominente en la determinación de la composición química del vino, ya que durante la fermentación metabolizan los azúcares de la uva y otros componentes en etanol, dióxido de carbono y cientos de productos finales y secundarios que, colectivamente contribuyen a la sutileza e individualidad del carácter del 75 vino. Esto hace que el uso de altas presiones de dióxido de carbono originen un vino de mejor calidad, pues en la industria vinícola cuando las fermentaciones ocurren en presencia de muchas especies de levaduras y bacterias es difícil señalar las actividades fermentativas benéficas y dañinas que se llevan a cabo, por lo tanto cuando se trabaja bajo condiciones controladas se evita la producción de compuestos indeseables por parte de los microorganismos que llevan a la perdida de atributos en el producto final (Graham 2003, Loureiro et al. 2003). Pinot noir Tratamiento hiperbarico de CO2 Control 12 12,5 13 13,5 Puntaje Figura 20: Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados 76 14 7. CONCLUSIONES • Se determinó que a los 360 minutos evaluados a una presión de CO2 de 35 bar se obtiene una reducción de la población de levaduras de 97.9% y de 95.7% para bacterias ácido lácticas, sobre estrujados de uvas de la variedad Pinot noir. • El tiempo de reducción decimal (valor D) fue de 173 minutos para levaduras y 238 minutos para bacterias ácido lácticas, lo cual indica el tiempo necesario para reducir las poblaciones a su décima parte a una presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujado de uvas de la variedad Pinot noir. • Los resultados obtenidos en los recuentos muestran que las bacterias ácido lácticas son mas resistentes a la presión hiperbárica de CO2 que las levaduras, según lo señalado por el valor D y los porcentajes de inhibición. • La velocidad de muerte constante (valor K) para levaduras fue de 0.0133 min –1 y para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min –1 siguiendo un análisis tradicional cinético de primer orden. • Los análisis físico-químicos medidos en el vino (control y tratamiento) señalaron que la presión de dióxido de carbono no tiene efecto alguno sobre: pH, extracto seco y % de alcohol. • Los resultados microbiológicos de los vinos evaluados, señalan que el uso de altas presiones mejora la calidad microbiológica de los vinos. • La no detección de Brettanomyces sp. en los vinos puede ser debida al buen manejo de prácticas higiénicas en el proceso de vinificación. 77 • El análisis sensorial mostró que la utilización de presiones hiperbáricas de CO2 como tratamiento esterilizante no afecta las cualidades organolépticos del vino Pinot noir, proponiendo este tratamiento como una nueva alternativa para ser implementada en la producción de vinos. 78 RECOMENDACIONES • Se recomienda realizar investigaciones encaminadas al uso de técnicas moleculares para la identificación de Brettanomyces sp. • Con el fin de evaluar cuales son los microorganismos mas resistentes al tratamiento, se debería realizar identificación de las especies presentes en estrujados de uvas, seguido de un análisis individual para cada una de las especies encontradas. • Implementar el sistema de tratamiento por presión a escala industrial para estrujados de uva utilizados en la elaboración de vinos de la variedad Pinot noir para disminuir así, el riesgo de contaminaciones microbiológicas. • Encaminar estudios hacia la evaluación de mayores presiones con menores tiempos de exposición en búsqueda de la optimización del proceso. 79 BIBLIOGRAFÍA ALVAREZ, P y GARCIA, J. (Quijano-Rico M.).1998. Identificación y control de microorganismos en la fermentación maloláctica espontánea de vinos tintos en la Cava de Puntalarga. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogotá. ARCHER, D. 2004. Freezing: an underutilized food safety technology?. International Journal of Food Microbiology. 90:127-138. ARIAS, J. 2004. Manual de aplicaciones a la microbiología industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Departamento de Microbiología. Santafé de Bogotá. BERGER, S. 2003. Brettanomyces–Pferdeschweisston. I – Mikrobiologie. Der Winzer, Austria. 1: 19-21. BLOUIN, J. and GUIMBERTEAU, G. 2000. Maturation et maturité. Des raisins. Éditions Féret. Bordeaux. 151pg. BOULTON, R., SINGLETON, V., BISSON, L. and KUNKEE, R. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza. España. 634p. BRYCE,R. 2000. A manual of winemaking practice for Australia and New Zealand. 3ªEd. Editorial Pan Macmillan Australia PTY Ltd. Sydney. Australia. 686p. CARIDI, A. and AUDINO P. 1993. Evoluzione de la microflora lievitiforme durante la maturazione e la passitura delle uve. Rivista di viticoltura e di enologia. 3: 3-8. CAVAZZANI, N. 1985. Fabricación de vinos espumosos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza. España. 166p. CARRASCAL, A., PAEZ, A. y BURBANO, M. 2002. Manual de laboratorio de microbiología de alimentos. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Departamento de Microbiología. Santafé de Bogota. 140p. COCOLIN, L. 2004. Molecular detection and identification of Brettanomyces/Dekkera bruxelensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines. Applied and Environmental Microbiology. 70: 1347-1355. CHAPARRO, I. (Quijano-Rico M.). 2001. Asimilación carbónica de la vid Vitis vinífera l., en condiciones de baja latitud tropical y alta irradiación UV-B. Trabajo de grado. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología. Santafé de Bogota. CHASSAGNE, D. 2005. Sorption of wine volatile phenols by yeast lees. Food Chemistry. 91:39-44. CHATONNET, P., DUBOURDIEU, D., BOIDRON, J. and PONS, M. 1992. The origin of ethyl phenols in wine. Journal of the Science of Food and Agrilculture. 60: 165-178. CHATONNET, P., MASNEUF, I., GUBBIOTTI, M. and DUBOURDIEU, P. 1999. Prevention et detection des contaminations par Brettanomyces au cours de la vinification et de I’elevage des vins. Revue francaise d´ Enologie. 179: 20-24. CHATONNET, P. 2002. La contaminazione dei vini da parte di Brettanomyces durante la vinificazione e I’ affinamiento. OICCE TIMES. 2: 18-21. CHEN, H and HOOVER, D. (2003). Pressure inactivation kinetics of Yersinia enterocolitica ATCC 35669. Journal Food Microbiology. 87: 167–171. DIAS,L., DIAS,S., SANCHO,T., STENDER,H ., QUEROL,A ., MALFEITO,M and LOUREIRO,V. 2003. Identification of yeast isolated from wine-related environments and capable of producing 4ethilphenol. Food Microbiology.20: 567-574. DILLOW,A., DEHGHANI,F.,HRKACH,J., FOSTER,N and LANGER,R. 1999. Bacterial inactivation by using carbon dioxide. Medical Science. 96 (18): 10344-10348. DITTRICH, H.1987. Mikrobiologie des weines. Ed.ULMER, Stutgart. 357pg. DIXON, N. and KELL, D. 1989. The inhibition by CO2 of the growth and metabolism of microorganisms. Journal of Applied Bacteriology. 67:109-136. DORAN, P. 1995. Principios de ingeniería de los bioprocesos. Ed.Acribia S.A. Zaragoza. Pg. 468. EDER, R. 2003. Brettanomyces – Pferdeschweisston. II – Chemische und oenologische Aspecte. Der winzer, Austria. 1: 22-25. EGLI, C. and KLING, H. 2001. Identification of Brettanomyces/Dekkera species based on polymorphism in the rRNA internal transcribed spacer region. American Journal of enology and Viticulture. 52 (3): 241-247. ERKMEN,O. 2000. Effect of dioxide pressure on Listeria monocytogenes in physiological salines and foods. Food Microbiology. 17: 589-596. FEVILLAT, M. 1997. Vinification du Pinot noir in Bourgogne par maceration prefermentaire a froid. Revue des Enologues. 82: 29-31. GALET,P. 2000. Précis de viticulture. 7ªEd. JF impression. Montpellier. 600pg. GRAHAM,F. 2003. Yeast interactions and wine flavour. International Journal of Food Microbiology. 86 :11-22. GERBAUX, V., JEUDY, S. and MONAMY, C. 2000. Etude des phenols volatils dans les vins de Pinot noir en Bourgogne. Bulletin OIV. 73: 835-836. GERBAUX, V., VINCENT, B. and BERTRAND A. 2002. Influence of maceration temperature and enzymes on the content of volatile phenols in Pinot noir wines. American Journal of Enology and Viticulture. 2: 131-137. GAWEL, R. 2004. Australian society of wine education National Convention. [En line]. Australia. Brettanomyces character in wine.<http://www.Aromadictionary.com/articles/brettanomyces_article. html> [Consulta : 12 mar.2005]. GUILLAUME,G. 2001. Bases scientifiques et technologiques de l´oenologie. Lavoisier, Technique & documentation. Paris. 332pg. GUTIERREZ, D y MORILLO, C. (Quijano-Rico M.).1993. Actividad de la levadura y duración optima de la maceración en la producción de vinos tintos de Punta Larga (Boyacá). Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. HAAS,G., PRESCOTT, E., DUDLEY, R., DICK,C., HINTLIAN,C. and KEANE, L. 1989. Inactivation of microorganisms by carbon dioxide under pressure. . Journal of Food Safety. 9: 253-265. HERESZTYN, T. 1986. Formation of substituted tetrahydropyridines by species of Brettanomyces and Lactobacillus isolated from mousy wines. American Journal of Enology and Viticulture. 37(2): 127-132. HERNANDEZ, V. (Quijano-Rico M.). 1995. Desacidificación biológica de vinos tintos por fermentación malolactica. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Programa de postgrado. Santafé de Bogota. IBEAS, I., LOZANO, I., PERDIGONES, F. and JIMENEZ, J. 1996. Detection of Dekkera-Brettanomyces strains in sherry by a nested PCR. Applied and Environmental Microbiology. 62(3): 998-1003. KARAMAN,H. and ERKMEN,O. 2001. High carbon dioxide pressure inactivation kinetics of Escherichia coli in broth. Food Microbiology. 18:11-16. KNOOR, B. 1995. Advances in high-pressure food preservation methods in: Singh, R. Food process design and evaluation. Technomic Publishing Company, Inc. Indiana. 257pg KRIEG, N. 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 9ªEd. Editorial Williams & Wilkins. Baltimore. KUMAHAI,H., HATA,C. and NAKAMURA,K.1997. CO2 sorption by microbial cells and sterilization by high-pressure CO2. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 61: 931-949. LICKER, J., ACREE, T. and KLING, H. 1998. What is “Brett” (Brettanomyces) flavor. Chemistry of wine flavor. 714: 96-115. LIN, H., YANG, Z. and CHEN, F. 1993. Inactivation of Leuconostoc dextranicum with carbon dioxide on Listeria monocytogenes. International Journal of Food Science and Technology. 59: 657-659. LIZARAZO, P Y MARTINEZ, C. (Quijano-Rico M.).1996. Actividad metabólica de Saccharomyces cerevisiae a temperaturas de 10°C sobre un mosto en fermentación. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. LOUKA,E., LOUKA,N., ABRAHAM,G., CHABOT,V. and ALLAF, K. 1999. Effect of compressed carbon dioxide on microbial cell viability. Applied and Environmental Microbiology. 65(2): 626-631. LOUREIRO,V. and MALFEITO-FERREIRA,M. 2003. Spoilage yeast in the wine industry. International Journal of Food Microbiology. 86:23-50. MAÑAS, P. and PAGÁN,R. 2005. Microbial inactivation by new technologies of food preservation. Journal of Applied Microbiology. 98: 1387-1399. MATIZ, A. Y PRIETO, A. (Quijano-Rico M.). 1993. Reducción de efectos perjudiciales asociados con fenómenos enzimáticos mediante la selección de la temperatura de la vendimia, para la producción de vinos de calidad. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. Merck.2000. Microbiology Manual. Alemania. 1440pg. MITRAKUL, C., HENICK, T. and EGLI, C. 1999. Discrimination of Brettanomyces/ Dekkera yeast isolates from wine by using various DNA finger-printing methods. Food Microbiology. 16: 3-14. MONTAÑA, J y ORTEGON, S. (Quijano-Rico M.). 1997. Inactivación de microorganismos por altas presiones en la industria vinícola. Trabajo de grado. Universidad de América. Facultad de Ingeniería Química. Santafé de Bogota. MORANTES, A. 2006. Universidad Nacional de Colombia. Comunicación personal. MORENO, M.,POLO,C., JORGANES,F. y MUÑOZ,R. 2003. Screening of biogenic amine production by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine. International Journal of Food Microbiology.vol. 84: 117– 123. NAVARRE,C. 1991. L’oenologie. 2ªEd. Ed. Lavoisier. 322pg. NAKAMURA, K, et al. 1994. Disruption of microbial cells by the flash discharge of high-pressure carbon dioxide. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 58(7): 1291-1301. OCHOA, E y TORRES, A. (Quijano-Rico M.). 1991. Comparación de características organolépticas de vinos tintos obtenidos por fermentación maceración y por calentamiento de la vendimia. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. ORDUÑA, R. 2000. Ethyl carbamate precursor citrulline formation from arginine degradation by malolactic wine lactic acid bacteria. FEMS Microbiology . 183:31-35. OSSA, F. (Quijano-Rico M.). Aplicación a la vendimia de técnicas de concentración por congelación y por deshidratación de las uvas y su incidencia sobre el desarrollo de la fermentación y la calidad de los vinos. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. PAIPILLA, E. y RANGEL, S. (Quijano-Rico M.).1997. Efecto de la recirculación forzada del mosto en la vinificación en tinto, sobre la actividad y metabolismo, esencialmente hidrogeno sulfurado, de Saccharomyces cerevisiae var. bayanus. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. PARDO, I. 2004. Metabolismo de sustratos del mosto y vino por bacterias lácticas y sus implicaciones en la calidad del vino [en línea]. Laboratorio de microbiología enologica.Universidad de Valencia. España. <http://www.acenologia.com/ciencia64_1.htm > [Consulta: 10 mar. 2005]. PARISH, M., KELLY, M. and GARY, B. 2003. Managing Brettanomyces. The Australian & New Zealand Wine Industry Journal. 18(3):12-18. PEYRON, D. 1998. Le potentiel polyphenolique du Pinot noir. Revue Francaise d´ Enologie. 170: 42-45. PINA, C., SANTOS, C., COUTO, J and HOGG T. 2004. Ethanol tolerance of five non-Saccharomyces wine yeast in comparison with a strain of Saccharomyces cerevisiae – influence of different culture conditions. Food Microbiology. 21:439-447. PORRAS, N. y SANTOS, G. (Quijano-Rico M.). 2003. Incidencias de las propiedades ópticas de bolsas de protección de racimos de uvas, sobre las características sensoriales de sus vinos. Tesis de pregrado. UPTC. Facultad de Química de Alimentos. Tunja (Boy). QUIJANO, M. 2005. Viñedo & Cava Loma de Puntalarga. Comunicación personal. REYNIER, A. 1991. Manuel de Viticulture. 6ªEd. Ed. Lavoisier. Paris. 513pg. RIBERÉAU, G et al. 1989. Tratado de enología. 1ªEd. Tomo II. Editorial Hemisferio Sur. Buenos Aires. Argentina. 537pg. RODRIGUEZ,N., GONÇALVES, S., DA-SILVA,S., MALFEITO, F. and LOUREIRO,V. 2001. Development and use of a new médium to detect yeast of genera Dekkera/Brettanomyces. Microbiology. Portugal. 90: 588-599. Journal of Applied ROJAS,C y VASQUEZ,D. (Quijano-Rico M.).1991. Uso de la maceración carbónica para mejorar la calidad de vinos tintos obtenidos de uvas de Puntalarga (Boyacá). Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Santafé de Bogota. SANABRIA, A y ZARATE, J. (Quijano-Rico M.). 2005. Elaboración experimental de vinos espumosos por los métodos champañez y charmat a partir de una “cuvee Riesling-Pinnot noir” de Puntalarga. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Carrera de Microbiología industrial. Santafé de Bogota. SHIMODA,M., COCUNUBO, C., KAGO, H., MIYAKE,M., OSAJIMA,Y and HAYAKAWA,I. 2001. The influence of dissolved CO2 concentration on the death kinetics of Saccharomyces cerevisiae . Journal of Applied Microbiology. 91(2): 306-311. SILVA,P., CARDOSO,H. and GERÓS,H. 2004. Studies on the wine spoilage capacity of Brettanomyces/Dekkera spp. American Journal of Enology and Viticulture. 55:65-72. SINGH, R. Food process design and evaluation. Techonomic Publishing Company, Inc. Indiana. 257pp. SMELT, J., HELLEMONS,J., WOUTERS,P. and GERWEN, V. (2002) Physiological and mathematical aspects in setting criteria for decontamination of foods Microbiology. 78: 57–77. by physical means. Journal Food SPILIMBERGO,S. and BERTUCCO,A. 2003. Non-thermal bacteria inactivation with dense CO2. Biotechnology and Bioengineering. 84(6): 627-638. STEILD, R and RENNER, W. 2001. Moderne rotweinbereitung. Ed. Ulmer Agraverlag. Stutgart. STENDER, H., KURTZMAN, C. and COULL, J. 2001. Identification of Dekkera bruxellensis (Brettanomyces) from wine by fluorescence and in situ hibridization using peptide nucleic acid probes. Applied and Environmental Microbiology. 67(2): 938-941. SUAREZ, J. Y LEAL, B. 1990. Microbiología Enologica. Ediciones Mundi-prensa. Madrid. España. VOGHT, et al. 1986. El vino. 9ªEd. Editorial, Acribia, S.A. Zaragoza. España. 294pg. WALPOLE, et al. 1992. Probabilidad y estadistica. 4a ed. Mc Graw Hill. Mexico. 797pg WEI, C., BALABAN,S. and PEPLOW A. 1991. Bacterial effects of high pressure CO2 treatment on foods spiked with Listeria or Salmonella. Journal of Food Protection. 54:189-193 ZAGORC,T., MARAZ,A., CADEZ,N., RESNIK,M., NEMANIC,J. and RASPOR,P. 2001. Indigenous wine killer yeasts and their application as a starter culture in wine fermentation. Food Microbiology. 18:441451. ZAMBONELLI, C. 1988. Microbiología e Biotecnología dei Vini. 9ªEd. Editorial Edagricole. Bologna. Italia. 230pg. ZARZOSO, E., TORAN, E., GARCIA,M., URUBURU,F and QUEROL,A. 2001. Yeast population dynamics during the fermentation and biological aging af sherry wines. Applied and Environmental Microbiology. 67(5): 2056-2061. ZDENEK,H. 2003. Protectants used in the cryopreservation of microorganism. Cryobiology. 46:205-229. ANEXO 1 EQUIPOS • Biorreactor bajo presión Viñedo & Cava Loma de Puntalarga • Medidor de pH ( pH-metro) Metrohm, Suiza • Incubadora a 37°C Arthur Tomas Co Philadelphia USA • Incubadora a 25°C Memmert, Alemania • Equipo de filtración Millipore, California • Termostato y termómetro digital Jhonson’s controls MR12 • Manómetro Linde, Mainz-Alemania • Refractómetro Zeiss, Oberkochem-Alemania • Microscopio Olympus, España • Balanza analítica BOECO ANEXO 2 REACTIVOS Reactivos N° de catalogo Casa comercial 1.01614 Merck 128708-56 Aldrich 1.04699 Merck C9008-16 Sigma Agar MRS 01-135 Scharlau Agar YGC 1.16000 Merck Agar WL 1.10866 Merck Alcohol etílico 1.00983 Merck Campygen® 1.13682 Merck Ciclohexamida 1.09228CASE Merck Cristal violeta 1.09228 Merck C020 Millipore Fucsina de Gram 1.09217 Merck Hidróxido de sodio 1.06462 Merck Medio YNB 239210 DifcoTM Peptona A1070431000 Merck Verde de bromocresol VE00700001 Scharlau Agar-Agar Acido ferúlico Aceite de inmersión Acido p-cumárico Filtro 0.2µm ANEXO 3 COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 3.1 Agar MRS • Peptona proteasa 10g/L • Extracto de carne 8g/L • Extracto de levadura 4g/L • Glucosa • Acetato de sodio 5g/L • Citrato triamonico 2g/L • Sulfato de magnesio • Sulfato de manganeso • Fosfato dipotásico 2g/L • Polisorbato 80 1g/L • Agar-Agar 14g/L • Ciclohexamida 4mg/L • pH 6.2 ( +/-0.2 ) 20g/L 0.2g/L 0.05g/L 3.2 Agar YGC • Glucosa • Extracto de levadura • Cloranfenicol • Agar-Agar • pH 6.6 ( +/- 0.2 ) 20g/L 5g/L 0.1g/L 15g/L 3.3 Agar WL • Extracto de levadura 4g/L • Hidrolizado de caseína 5g/L • D (+) glucosa • Fosfato diácido de potasio 0.005g/L • Cloruro de potasio 0.425g/L • Cloruro de calcio 0.125g/L • Sulfato de magnesio • Verde de bromocresol • Agar-Agar • Cloruro de hierro (III) • Ciclohexamida • Sulfato de manganeso • pH 5 ( +/-0.2 ) 50g/L 0.0025g/L 0.022g/L 15g/L 0.125g/L 0.01g/L 0.125g/L 3.4 Medio DBDM • Medio YNB 6.7 g/L • Etanol 6%v/v • Acido p-cumárico 100mg/L • Acido ferúlico 100mg/L • Verde de bromocresol • Agar-agar • Ciclohexamida 22mg/L 2g/L 10mg/L El agar-agar fue adicionado después de su esterilización en autoclave a una temperatura de 50°C, los demás componentes del medio de cultivo fueron esterilizados por filtración, utilizando filtros de membrana de 0.2µm de diámetro, a excepción de la ciclohexamida que se adicionó al final. El pH del medio fue ajustado a 5.4 con hidróxido de sodio 0.1N. 3.5 Medio YNB • Sulfato de amonio 5.0g • Fosfato monopotásico 1.0g • Sulfato de magnesio 0.5g • Cloruro de sodio 0.1g • Cloruro de calcio 0.1g • L-histidina monohidroclorada • LD metionina 20mg • LD triptofano 20mg • Inositol • Acido bórico 500µg • Niacina 400µg • Sulfato de manganeso 400µg • HCL piridoxina 400µg • Sulfato de zinc 400µg • HCL tiamina 400µg • Pantetonato de calcio 400µg • Cloruro ferrico 200µg • Molibdato de sodio 200µg • Riboflavina 200µg • Acido p-aminobenzoico 200µg • Yoduro de potasio 100µg • Acido fólico 2µg • Biotina 2µg 10.0mg 2000µg ANEXO 4 PROTOCOLO DE PROCEDIMIENTO PARA TRATAMIENTO DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA HIPERBARICA DE CO2 1. Descongelación de las muestras a 15°C por 15 horas. 2. Lavado del autoclave 3. Desinfección del biorreactor con 200ppm de Hipoclorito de sodio 4. Lavado con agua destilada estéril 5. Carga del recipiente contenedor con 750g de estrujado de uva (3 muestras), el cual se dispuso en el interior del biorreactor. 3. Cierre hermético del equipo con el cierre de la abrazadera. 4. Purga del biorreactor, abriendo la válvula A, B, C, F y manteniendo cerrada la válvula D. Durante 5 minutos. 5. Lograda la saturación del estrujado con el gas se cierra la válvula F. 6. Alcanzada la presión deseada (35 bar) en el manómetro se cerrara la válvula C para mantener la presión constante en el interior del autoclave. 7. Toma de muestras a los 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 y 360 minutos, abriendo la válvula D, esta válvula se cerró después de la salida de la muestra. 8. La muestra se deposito en el ciclón de muestreo, de donde se tomaron alícuotas de 4ml en jeringas estériles. 9. Se realizo recuento de levaduras y bacterias acido lácticas, a cada una de las muestras tomadas. 10. Después de haber tomado la muestra correspondiente a cada tiempo de tratamiento, el ciclón de muestreo se enjuago con agua destilada estéril, se desinfecto con 200ppm de hipoclorito de sodio durante 15 minutos, y finalmente se volvió a enjuagar con agua destilada estéril. 12. Finalizado el último tiempo de tratamiento (360min), se despresurizo el biorreactor, abriendo lentamente la válvula F. 13. Se retiro la abrazadera y se saco el recipiente contendor. 14. Lavado y desinfección del equipo. 11. Los pasos descritos anteriormente (1-14) se repitieron dos veces mas (Ossa 1992, Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998,Quijano 2005, Arias 2004). ANEXO 5 TABLAS DE RESULTADOS 5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS Log 10 LN Porcentaje(%) UFC/ml UFC/ml de inhibición 0 30 60 90 120 150 180 210 240 300 360 4 5,579783 5,579784 0 4 5,342422 5,342423 42.11 3 4,924279 4,924279 77.9 3 4,857332 4,857333 81.05 3 4,792392 4,792391 83.69 3 4,716003 4,716003 86.32 3 4,568201 4,568202 90.26 3 4,544068 4,544068 90.79 3 4,477121 4,477121 92.11 3 18x10 4,255273 4,255273 95.26 3 3,903089 3,903089 97.9 38x10 22x10 84x10 72x10 62x10 52x10 37x10 35x10 30x10 8x10 5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS Log 10 LN Porcentaje(%) UFC/ml UFC/ml de 0 45x104 5,653212 13,01700 inhibición 0 30 28x104 5,447158 13,01700 37.78 3 4,963788 11,42954 79.56 3 4,886491 11,25156 82.89 3 4,812913 11,08214 85.56 3 4,740363 10,91509 87.78 3 4,602059 10,59663 91.11 3 4,579783 10,54534 91.56 3 4,477121 10,30895 93.33 60 90 120 150 180 210 240 92x10 77x10 65x10 55x10 40x10 38x10 30x10 300 360 23x103 4,361728 10,04325 94.89 3 4,041393 9,30565 97.56 11x10 5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS Log 10 LN Porcentaje(%) UFC/ml UFC/ml de 0 42x104 5,623249 12,94801 inhibición 0 30 24x104 5,380211 12,38832 42.86 3 4,939519 11,37366 79.29 3 4,875061 11,22524 82.14 3 4,763428 10,96819 86.19 3 4,707570 10,83958 87.86 3 4,591065 10,57132 90.71 3 4,531479 10,43412 91.90 3 4,462398 10,27505 93.09 3 4,30103 9,90349 95.24 3,954242 9,10498 97.86 60 90 120 150 180 210 240 300 360 87x10 75x10 58x10 51x10 39x10 34x10 29x10 20x10 3 9x10 5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer Montaje TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS 0 30 60 90 120 150 180 210 240 300 360 Log 10 LN Porcentaje de UFC/ml UFC/ml inhibición 4 5,414973 12,468436 0 4 5,113943 11,775289 50 3 4,949390 11,396391 65.77 3 4,913813 11,314474 68.46 3 4,875061 11,225243 71.15 3 4,819543 11,09741 74.62 3 4,707570 10,839580 80.38 3 4,531478 10,434115 86.92 3 4,380211 10,085809 90.77 3 4,204119 9,680344 93.85 3 4,079181 9,3926619 95.38 26x10 13x10 89x10 82x10 75x10 66x10 51x10 34x10 24x10 16x10 12x10 5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Segundo Montaje TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS 0 30 60 90 120 150 180 210 240 300 360 Log 10 LN Porcentaje de UFC/ml UFC/ml inhibición 4 5,477121 12,611538 0 4 5,255272 12,100712 40 3 4,968482 11,440355 69 3 4,944482 11,385092 70.67 3 4,908485 11,302204 73 3 4,851258 11,170435 76.33 3 4,748188 10,933107 81.33 3 4,591065 10,571317 87 3 4,477121 10,308953 90 3 4,30103 9,9034876 93.33 3 4,146128 9,5468126 95.33 30x10 18x10 93x10 88x10 81x10 71x10 56x10 39x10 30x10 20x10 14x10 5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer Montaje TIEMPO EN UFC/ml MINUTOS Log 10 LN Porcentaje de UFC/ml UFC/ml inhibición 4 5,447158 12,542545 0 4 5,176091 11,918391 46.43 3 4,954243 11,407565 67.86 3 4,924279 11,338572 70 3 4,869232 11,211820 73.57 150 3 69x10 4,838849 11,141862 75.36 180 48x103 4,681241 10,778956 82.86 3 4,568202 10,518673 86.79 3 4,447158 10,239959 90 3 4,176091 9,6158055 94.64 3 4,041393 9,3056506 96.07 0 30 60 90 120 210 240 300 360 28x10 15x10 90x10 84x10 74x10 37x10 28x10 15x10 11x10 5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras Montaje 1 2 3 Promedio 5.8 VALOR D(min.) 178 169 172 173 VALOR k 0.0129 0.0136 0.0134 0.0133 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido lácticas MONTAJE 1 2 3 promedio VALOR D (min.) 233 240 240 238 VALOR k 0.0099 0.0096 0.0096 0.0097 ANEXO 6 GRAFICAS 6.1 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 1 6 Log UFC/mL 5,5 5 Log UFC/ml 4,5 4 3,5 3 0 100 200 300 400 Tiem po ( m in ) 6.2 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 2 6 Log UFC/mL 5,5 5 4,5 Log UFC/ml 4 3,5 3 0 100 200 Tiem po ( m in ) 300 400 6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3 6 Log UFC/mL 5,5 5 4,5 Log UFC/ml 4 3,5 3 0 100 200 300 400 Tiem po ( m in ) 6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido lácticas, Montaje 1 6 Log UFC/mL 5,5 5 Log UFC/ml 4,5 4 3,5 3 0 100 200 Tiem po ( m in ) 300 400 6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido lácticas, Montaje 2 6 Log UFC/mL 5,5 5 Log UFC/ml 4,5 4 3,5 3 0 100 200 300 400 Tiem po ( m in ) 6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, Montaje 3 6 Log UFC/mL 5,5 5 4,5 Log UFC/ml 4 3,5 3 0 100 200 Tiem po ( m in ) 300 400 6.7 Gráfica comparativa del recuento de levaduras de los tres montajes 6 Log UFC/mL 5,5 5 Montaje 1 4,5 Montaje 2 Montaje 3 4 3,5 3 0 100 200 300 400 Tiempo ( min ) 6.8 Gráfica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de los tres montajes 6 Log UFC/mL 5,5 5 Montaje 1 4,5 Montaje 2 Montaje 3 4 3,5 3 0 100 200 Tiempo ( min ) 300 400 ANEXO 7 EVALUACION DE CARACTERISTICAS SENSORIALES Vino control Vino Pinot noir Claridez Vino con tratamiento hiperbárico de co2 1 1 0.75 Color 4 4 1.75 Olor 2 2 2.75 Sabor 6.75 5.75 7.5 IMPRESIÓN 13.75 12.75 12.75 Características GLOBAL ANEXO 8 TABLA NORMALIZADA DE LA OIV ( ORGANIZACIÓN INTERNACIONAL DEL VINO) PARA LA EVALUACIÓN DE CARACTERISTICAS SENSORIALES Nombre: ___________________ Fecha: ___________________ CARACTERISTICAS CLARIDEZ: Turbio Claro Claro brillante COLOR: Atípico Típico OLOR: Defectuoso Neutro Sin notas extrañas Fino Floral SABOR: Defectuoso Neutro ( 1-3 ) Liviano con carácter ( 1-3 ) Armónico (1-3 ) Maduro y noble (10-12 ) CALIDAD DEL VINO: Superior Medio Menos que medio Inaceptable Muestra:____________________ CALIFICACION 0 1 2 0 4 0 1 2 3 4 0 1-3 4-6 7-9 10-12 17-20 13-16 9-12 0-8 ANEXO 9 GUIA DE CATACIÓN Nombre: ___________________ Fecha: ___________________ Muestra:____________________ CARACTERISTICAS VINO 1 CLARIDEZ: Turbio Claro Claro brillante COLOR: Atípico Típico OLOR: Defectuoso Neutro Sin notas extrañas Fino Floral SABOR: Defectuoso Neutro ( 1-3 ) Liviano con carácter ( 1-3 ) Armónico (1-3 ) Maduro y noble (10-12 ) CALIFICACION VINO 2 VINO 3 ANEXO 10 ANALISIS ESTADISTICO 10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1. Linear Regression Results for: Y = Hoja1!$C$3:$C$14 X = Hoja1!$A$3:$A$14 Descriptive Statistics Variable ln UFC/ml Tiempo (Min) Mean Std Dev. N 10,877 1,077 11 158,182 113,121 11 Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo (min) ln UFC/ml Tiempo (Min) 1,000 -0,966 -0,966 1,000 Significance for Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo (min) ln UFC/ml 0,000 Tiempo (Min) 0,000 - Summary R2 0,932 ANOVA Source Regression R 0,966 Sum Sq. 10,819 Adj. R2 0,925 D.F. 1 S.E. of Estimate 0,295 Mean Sq. 10,819 F 124,129 Prob. 0,000 Residual Total 0,784 11,604 9 10 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,331 Tiempo (Min) -0,009 Std Error 0,158 0,087 -95% C.I. 11,974 +95% C.I. 12,689 t 78,039 Prob. 0,000 -0,011 -0,007 -11,141 0,000 Std Pred Pred Norm Std Pred Y Y Residual Res Residual 12,331 1,398 0,517 0,474 2,072 12,055 1,133 0,246 0,307 0,944 11,779 0,868 -0,441 -0,474 -1,635 11,504 0,603 -0,319 -0,307 -1,157 11,228 0,338 -0,193 -0,209 -0,689 10,952 0,072 -0,093 -0,064 -0,330 10,676 -0,193 -0,157 -0,132 -0,560 10,400 -0,458 0,063 0,064 0,226 10,124 -0,723 0,185 0,132 0,676 9,573 -1,254 0,226 0,209 0,881 9,021 -1,784 -0,034 0,000 -0,148 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Stu. Residual 2,702 0,937 -1,839 -1,182 -0,668 -0,313 -0,537 0,214 0,654 0,869 -0,140 2,306 3,900 0,001 Std Beta -0,966 Residuals Normal Prob. Plot 0,6 Residuals 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 Normal Distribution Residuals vs Pred ln UFC/ml 0,6 Residuals 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 0 5 10 15 Predicted ln UFC/ml Scatter Plot 14 ln UFC/ml 12 10 8 6 4 2 0 0 100 200 300 Tiempo (Min) 400 10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2. Linear Regression Results for: Y = Hoja2!$C$2:$C$13 X = Hoja2!$A$2:$A$13 Descriptive Statistics Variable Ln UFC/ml Minutos Mean Std Dev. N 11,003 1,065 11 158,182 113,121 11 Pearson Correlations Ln UFC/ml Ln UFC/ml 1,000 Tiempo (min) -0,950 Tiempo (min) -0,950 1,000 Significance for Pearson Correlations Ln UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml 0,000 Tiempo (min) 0,000 - Summary R2 0,903 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,950 Sum Sq. 10,247 1,096 11,343 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,419 Minutos -0,009 Adj. R2 0,893 D.F. 1 9 10 Std Error 0,187 0,001 S.E. of Estimate 0,349 Mean Sq. 10,247 0,122 Std Beta -0,950 F 84,161 Prob. 0,000 -95% C.I. 11,996 -0,011 +95% C.I. 12,841 -0,007 t 66,501 -9,174 Prob. 0,000 0,000 Residuals Std Pred Pred Norm Std Y Res Residual Pred Y Residual 12,419 1,398 0,598 0,560 2,029 12,150 1,133 0,392 0,363 1,272 11,882 0,868 -0,452 -0,560 -1,420 11,614 0,603 -0,362 -0,363 -1,110 11,345 0,338 -0,263 -0,248 -0,795 11,077 0,072 -0,162 -0,076 -0,486 10,808 -0,193 -0,212 -0,157 -0,637 10,540 -0,458 0,006 0,000 0,017 10,271 -0,723 0,038 0,076 0,117 9,734 -1,254 0,309 0,248 1,021 9,197 -1,784 0,108 0,157 0,403 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred Ln UFC/ml 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 Residuals 0,8 0,2 0,0 -0,2 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -1,0 -0,4 -0,6 -0,5 0,0 0,5 1,0 0 Normal Distribution 5 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted Ln UFC/ml Scatter Plot Ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot Stu. Residual 2,597 1,324 -1,520 -1,127 -0,778 -0,464 -0,615 0,016 0,110 1,024 0,384 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(min) 400 15 10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3. Linear Regression Results for: Y = Hoja3!$C$2:$C$13 X = Hoja3!$A$2:$A$13 Descriptive Statistics Variable Ln UFC/ml Minutos Mean Std Dev. N 10,912 1,081 11 158,182 113,121 11 Pearson Correlations Ln UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml 1,000 -0,958 Tiempo(min) -0,958 1,000 Significance for Pearson Correlations Ln UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary 2 R 0,919 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,958 Sum Sq. 10,726 0,951 11,677 2 Adj. R 0,910 D.F. 1 9 10 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,360 Minutos -0,009 Std Error 0,174 0,001 Residuals Pred Y Residual Std Pred S.E. of Estimate 0,325 Mean Sq. 10,726 0,106 Std Beta -0,958 Pred Norm F 101,510 Prob. 0,000 -95% C.I. 11,967 -0,011 +95% C.I. 12,754 -0,007 Std Stu. t 71,045 -10,075 Prob. 0,000 0,000 Y Res Residual 12,360 1,398 0,588 0,521 2,141 12,086 1,133 0,303 0,338 1,054 11,811 0,868 -0,437 -0,521 -1,473 11,536 0,603 -0,311 -0,338 -1,024 11,262 0,338 -0,293 -0,231 -0,953 10,987 0,072 -0,147 -0,146 -0,475 10,712 -0,193 -0,141 -0,071 -0,456 10,438 -0,458 -0,003 0,000 -0,011 10,163 -0,723 0,112 0,146 0,373 9,614 -1,254 0,290 0,231 1,028 9,064 -1,784 0,041 0,071 0,163 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred Ln UFC/ml 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 Residuals 0,8 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -1,0 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,5 0,0 0,5 1,0 0 Normal Distribution 5 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted Ln UFC/ml Scatter Plot Ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot Residual 2,880 1,062 -1,594 -1,027 -0,947 -0,454 -0,435 -0,011 0,354 1,032 0,154 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(min) 400 15 10.4 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los promedios de los recuentos de levaduras. Linear Regression Results for: Y = Hoja1!$G$3:$G$14 X = Hoja1!$F$3:$F$14 Descriptive Statistics Variable Ln UFC/ml Tiempo(min) Mean Tiempo(min) N 10,933 1,073 11 158,182 113,121 11 Pearson Correlations Ln UFC/ml Ln UFC/ml Std Dev. Tiempo(min) 1,000 -0,959 -0,959 1,000 Significance for Pearson Correlations Ln UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary 2 R 0,919 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,959 Sum Sq. 10,571 0,933 11,504 2 Adj. R 0,910 D.F. 1 9 10 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,371 Tiempo(min) -0,009 Std Error 0,172 0,001 Residuals Pred Y Residual Std Pred S.E. of Estimate 0,322 Mean Sq. 10,571 0,104 Std Beta -0,959 Pred Norm F 101,928 Prob. 0,000 -95% C.I. 11,981 -0,011 +95% C.I. 12,761 -0,007 Std Stu. t 71,775 -10,096 Prob. 0,000 0,000 Y Res Residual 12,371 1,398 0,569 0,516 2,093 12,098 1,133 0,318 0,335 1,117 11,825 0,868 -0,444 -0,516 -1,510 11,553 0,603 -0,332 -0,335 -1,103 11,280 0,338 -0,251 -0,228 -0,821 11,007 0,072 -0,136 -0,070 -0,442 10,735 -0,193 -0,172 -0,144 -0,561 10,462 -0,458 0,020 0,000 0,066 10,189 -0,723 0,108 0,144 0,364 9,644 -1,254 0,276 0,228 0,988 9,099 -1,784 0,043 0,070 0,172 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred Ln UFC/ml 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 Residuals 0,8 0,2 0,0 -0,2 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,4 -0,6 -0,5 0,0 0,5 0 1,0 5 Scatter Plot 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted Ln UFC/ml Normal Distribution Ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot -0,6 -1,0 Residual 2,754 1,134 -1,648 -1,118 -0,805 -0,421 -0,539 0,062 0,345 0,987 0,163 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(min) 400 15 10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1. Linear Regression Results for: Y = Hoja4!$C$2:$C$13 X = Hoja4!$A$2:$A$13 Descriptive Statistics Variable Mean Std Dev. N ln UFC/ml 10,883 0,918 11 MINUTOS 158,182 113,121 11 Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml Tiempo(min) 1,000 -0,983 -0,983 1,000 Significance for Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary R2 0,966 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,983 Sum Sq. 8,140 0,289 8,429 Adj. R2 0,962 D.F. 1 9 10 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,144 MINUTOS -0,008 Std Error 0,096 0,001 Residuals Pred Y Residual Std Pred S.E. of Estimate 0,179 Mean Sq. 8,140 0,032 Std Beta -0,983 Pred Norm F 253,149 Prob. 0,000 -95% C.I. 11,927 -0,009 +95% C.I. 12,361 -0,007 Std Stu. t 126,543 -15,911 Prob. 0,000 0,000 Y Res Residual 12,144 1,398 0,324 0,288 2,140 11,905 1,133 -0,130 -0,127 -0,819 11,666 0,868 -0,269 -0,288 -1,645 11,426 0,603 -0,112 -0,080 -0,669 11,187 0,338 0,038 0,039 0,224 10,948 0,072 0,149 0,187 0,874 10,709 -0,193 0,131 0,127 0,767 10,469 -0,458 -0,035 0,000 -0,209 10,230 -0,723 -0,144 -0,187 -0,870 9,752 -1,254 -0,071 -0,039 -0,458 9,273 -1,784 0,120 0,080 0,867 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred ln UFC/ml 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 Residuals 0,4 0,1 0,0 -0,1 -0,2 0,1 0,0 -0,1 -0,2 -0,3 -0,2 0,0 0,2 0 0,4 5 Scatter Plot 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted ln UFC/ml Normal Distribution ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot -0,3 -0,4 Residual 2,879 -0,802 -1,855 -0,647 0,212 0,862 0,748 -0,197 -0,857 -0,437 0,854 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(min) 400 15 10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2. Linear Regression Results for: Y = Hoja5!$C$2:$C$13 X = Hoja5!$A$2:$A$13 Descriptive Statistics Variable ln UFC/ml Tiempo (min) Mean Std Dev. N 11,025 0,908 11 158,182 113,121 11 Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo (min) ln UFC/ml Tiempo(min) 1,000 -0,981 -0,981 1,000 Significance for Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml 0,000 Tiempo (min) 0,000 - Summary R2 0,962 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,981 Sum Sq. 7,931 0,313 8,244 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,270 Tiempo (min) -0,008 Adj. R2 0,958 D.F. 1 9 10 Std Error 0,100 0,001 S.E. of Estimate 0,186 Mean Sq. 7,931 0,035 Std Beta -0,981 F 228,066 Prob. 0,000 -95% C.I. 12,044 +95% C.I. 12,496 t 122,939 Prob. 0,000 -0,009 -0,007 -15,102 0,000 Residuals Std Pred Pred Norm Std Y Res Residual Pred Y Residual 12,270 1,398 0,341 0,299 2,167 12,034 1,133 0,067 0,041 0,405 11,798 0,868 -0,358 -0,299 -2,100 11,562 0,603 -0,177 -0,194 -1,014 11,326 0,338 -0,023 -0,041 -0,132 11,089 0,072 0,081 0,132 0,456 10,853 -0,193 0,080 0,084 0,451 10,617 -0,458 -0,046 -0,084 -0,260 10,381 -0,723 -0,072 -0,132 -0,416 9,908 -1,254 -0,005 0,000 -0,030 9,436 -1,784 0,111 0,194 0,773 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred ln UFC/ml 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 Residuals 0,4 0,1 0,0 -0,1 0,1 0,0 -0,1 -0,2 -0,2 -0,3 -0,3 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0 0,4 5 Scatter Plot 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted ln UFC/ml Normal Distribution ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot -0,4 -0,4 Stu. Residual 2,953 0,385 -2,771 -1,015 -0,124 0,435 0,430 -0,246 -0,396 -0,029 0,754 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(Min) 400 15 10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3. Linear Regression Results for: Y = Hoja6!$C$2:$C$13 X = Hoja6!$A$2:$A$13 Descriptive Statistics Variable Mean Std Dev. N ln UFC/ml 10,911 0,955 11 MINUTOS 158,182 113,121 11 Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml Tiempo(min) 1,000 -0,985 -0,985 1,000 Significance for Pearson Correlations ln UFC/ml Tiempo(min) ln UFC/ml 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary R2 0,970 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,985 Sum Sq. 8,852 0,275 9,126 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,226 MINUTOS -0,008 Residuals Adj. R2 0,967 D.F. 1 9 10 Std Error 0,094 0,000 S.E. of Estimate 0,175 Mean Sq. 8,852 0,031 Std Beta -0,985 F 290,018 Prob. 0,000 -95% C.I. 12,015 -0,009 +95% C.I. 12,438 -0,007 t 130,762 -17,030 Prob. 0,000 0,000 Std Pred Pred Norm Std Y Res Residual Pred Y Residual 12,226 1,398 0,316 0,280 2,142 11,977 1,133 -0,059 -0,078 -0,380 11,727 0,868 -0,320 -0,280 -2,005 11,478 0,603 -0,139 -0,182 -0,854 11,228 0,338 -0,017 -0,038 -0,100 10,979 0,072 0,163 0,182 0,978 10,729 -0,193 0,050 0,078 0,298 10,480 -0,458 0,039 0,038 0,235 10,230 -0,723 0,010 0,000 0,059 9,731 -1,254 -0,116 -0,124 -0,763 9,232 -1,784 0,073 0,124 0,546 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred ln UFC/ml 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 Residuals 0,4 0,1 0,0 -0,1 0,1 0,0 -0,1 -0,2 -0,2 -0,3 -0,3 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0 0,4 5 Scatter Plot 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted ln UFC/ml Normal Distribution ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot -0,4 -0,4 Stu. Residual 2,883 -0,361 -2,542 -0,840 -0,095 0,976 0,282 0,223 0,056 -0,744 0,523 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(min) 400 15 10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio de los recuentos de bacterias ácido lácticas. Linear Regression Results for: Y = Hoja2!$G$4:$G$15 X = Hoja2!$F$4:$F$15 Descriptive Statistics Variable Ln UFC/ml Tiempo(min) Mean Tiempo(min) N 10,943 0,925 11 158,182 113,121 11 Pearson Correlations Ln UFC/ml Ln UFC/ml Std Dev. Tiempo(min) 1,000 -0,984 -0,984 1,000 Significance for Pearson Correlations Ln UFC/ml Tiempo(min) Ln UFC/ml 0,000 Tiempo(min) 0,000 - Summary R2 0,968 ANOVA Source Regression Residual Total R 0,984 Sum Sq. 8,285 0,273 8,558 Regression Coefficients Source Coefficient Intercept 12,215 Tiempo(min) -0,008 Adj. R2 0,965 D.F. 1 9 10 Std Error 0,093 0,000 S.E. of Estimate 0,174 Mean Sq. 8,285 0,030 Std Beta -0,984 F 273,392 Prob. 0,000 -95% C.I. 12,005 -0,009 +95% C.I. 12,426 -0,007 Std Residual Stu. Residual Residuals Pred Y Std Pred Y Residual Pred Norm Res t 131,107 -16,535 Prob. 0,000 0,000 12,215 1,398 0,327 0,279 2,225 11,974 1,133 -0,034 -0,038 -0,218 11,733 0,868 -0,318 -0,279 -1,998 11,491 0,603 -0,145 -0,181 -0,890 11,250 0,338 -0,003 0,038 -0,015 11,008 0,072 0,129 0,181 0,775 10,767 -0,193 0,086 0,078 0,517 10,526 -0,458 -0,016 0,000 -0,097 10,284 -0,723 -0,068 -0,124 -0,424 9,801 -1,254 -0,060 -0,078 -0,400 9,319 -1,784 0,101 0,124 0,758 1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05) Residuals vs Pred Ln UFC/ml 0,4 0,3 0,3 0,2 0,2 Residuals 0,4 0,1 0,0 -0,1 -0,2 -0,3 -0,4 -0,4 0,1 0,0 -0,1 -0,2 -0,3 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0 Normal Distribution 5 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 Predicted Ln UFC/ml Scatter Plot Ln UFC/ml Residuals Normal Prob. Plot 3,128 -0,206 -2,525 -0,878 -0,014 0,757 0,495 -0,092 -0,404 -0,381 0,739 2,306 3,900 100 200 300 Tiempo(min) 400 15 ANEXO 11 INTERPRETACION DEL ANALISIS ESTADISTICO • La primera tabla muestra las estadísticas descriptivas (Media y desviación estándar) tanto para la variable dependiente (UFC/ml) como para la independiente (tiempo) y el número de datos que forman parte del análisis estadístico. • La siguiente tabla muestra el Coeficiente de Correlación Pearson para cada par posible de valores de las variables dependiente e independiente. Estos valores pueden variar desde –1 a 1. Un valor de –1 indica una CORRELACION LINEAL NEGATIVA PERFECTA (Mientras la variable independiente aumenta, la variable dependiente disminuye en una forma lineal consistente); por consiguiente un valor de 1 indica una CORRELACION LINEAL POSITIVA PERFECTA (Mientras la variable independiente aumenta, la variable dependiente aumenta en una forma lineal consistente). La tabla siguiente indica la Significancia del Coeficiente de Correlación de Pearson precedente; los valores menores a 0.05 en esta tabla sugieren una fuerte relación entre las variables que difícilmente puede verse afectada. • En la tabla Resumen se presenta el valor R2 para el modelo de regresión lineal. R2 o Coeficiente de Determinación; es la fracción de la variación en la variable dependiente (y) que es explicada por la variación en la variable independiente (x) y su rango va desde 0 (No se explica la variación) hasta 1 (Variación totalmente explicada). • ANÁLISIS DE VARIANZA (ANOVA): Con frecuencia el problema de analizar la calidad de la línea de regresión se maneja a través de un enfoque de análisis de varianza. El análisis de varianza dentro de los resultados de la regresión evalúa la hipótesis de si existe relación entre la variable dependiente y la independiente. • La columna Cuadrados Medios informa la medida de la variación asociada a la variable dependiente que es explicada por la variable independiente (Cuadrado Medio de la Regresión) y el nivel de variación que no es explicado por la variable independiente (Cuadrado Medio de Residuales). Al realizar la división de estos dos valores se obtiene en Valor F, que es el estadístico de prueba usado para evaluar la significancía del modelo de regresión. Un valor grande de F significa que la variación explicada es mucho mayor que la variación no explicada, sugiriendo que la variable independiente es un predictor significativo de la variable dependiente. En la última columna del ANOVA, se presenta el valor de Probabilidad P; este se evalúa teniendo en cuenta que un valor P menor que 0.05 se toma usualmente como fuerte indicador. • Por último y cumpliendo con el objetivo de la Regresión Lineal se presentan los Coeficientes de Regresión con los cuales se construye la línea de regresión del sistema de datos. En el caso del primer montaje de las levaduras, la línea de regresión estimada es: ln y = -0.009x + ln 12,331 • El gráfico de residuales es útil para determinar si los residuales reúnen uno de los requisitos del modelo de regresión lineal: Que estos estén distribuidos normalmente. Los residuales normalmente distribuidos deben caer a lo largo de la línea continua. • Grafico de Residuales versus Valor esperado por el cálculo de regresión. • Grafica de dispersión: correspondiente a la dispersión de los datos y la línea de regresión correspondiente.