Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 9 Pruebas básicas y especiales para el estudio de la coagulación sanguínea 1 MECANISMO DE LA HEMOSTASIA NORMAL INTRODUCCIÓN Hemostasia es el conjunto de mecanismos encargados de mantener el flujo sanguíneo constante, evitando la producción de hemorragias excesivas y limitando la magnitud del coágulo formado. En ella participan distintos sistemas o factores: Sistema de coagulación. Sistema fibrinolítico. Endotelio vascular. Plaquetas. Factores reológicos (se refieren a la velocidad, viscosidad y características del flujo sanguíneo). Las alteraciones en alguno de ellos son las que provocan los cuadros hemorrágicos y/o las trombosis localizadas o generalizadas. El coágulo hemostático perfecto se forma específicamente en el lugar de la injuria y lleva a que la pared vascular detenga su sangrado, pero también implica que dicha activación del sistema de coagulación no se extienda al resto del árbol vascular. El coágulo formado constituye un marco delimitador para la reparación del tejido dañado y dicho tapón hemostático es lo suficientemente lábil para ser removido durante la remodelación. Cuando ocurre una injuria vascular se produce una vasoconstricción refleja, con exposición de la matriz subendotelial y reducción del flujo sanguíneo. El punto de partida lo constituye la unión de una proteína soluble, el factor von Willebrand (FvW), a la matriz subendotelial. El mismo, una vez pegado al subendotelio, expone múltiples sitios intrínsecos de unión para la glicoproteína Ib específica de la membrana plaquetaria (GPIb). La unión FvW al complejo GPIb-V-IX estimula a la plaqueta, la cual expone la glicoproteína IIb-IIIa (GPIIb-IIIa) que une más FvW y fibrinógeno. Los gránulos densos de las plaquetas liberan ADP, ATP, serotonina, calcio y por activación de la cascada del ácido araquidónico generan tromboxano A2, potente agregante plaquetario y vasoconstrictor. El calcio es esencial en la activación de las proteínas solubles del sistema de coagulación. Los gránulos alfa de las plaquetas liberan fibrinógeno, factor plaquetario 4, trombospondina, fibronectina, FvW, FV, FVIII, FXI y factores de crecimiento. En la plaqueta activada se produce una redistribución de los fosfolípidos de la membrana celular (fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina) quedando expuestos sobre la superficie externa. De esta manera se crea una superficie procoagulante que permite la interacción de las plaquetas con los factores de la coagulación, sirviendo de base esencial para el inicio de la coagulación. La coagulación se desencadena rápidamente cuando el factor tisular (FT: un complejo proteína-fosfolípido) es expuesto al FVII en presencia de calcio. El FT está normalmente presente en las células extravasculares que circundan los vasos sanguíneos y en otros tejidos. También está presente en leucocitos circulantes y monocitos, de forma encriptada, de manera que se expone cuando hay activación de la célula que lo contiene. MECANISMO DE COAGULACIÓN El proceso de coagulación se describió 1964 como un modelo que se 2 desarrolla en forma de cascada. Si bien con fines didácticos se describen dos mecanismos de activación, uno intrínseco y otro extrínseco, entre ambos existen interconexiones y sistemas de retroalimentación (positivos y negativos) que lo hace un mecanismo complejo y único. Este modelo de cascada se basa en una serie de reacciones proteolíticas que actúan como amplificadores de la reacción. El sistema intrínseco está compuesto por factores que se encuentran todos en circulación, mientras que el sistema extrínseco incluye el FT que, en condiciones normales, no se encuentra en circulación. El sistema de coagulación está constituído por proteínas plasmáticas llamadas factores de coagulación, que circulan en la sangre en forma inactiva como zimógenos o proenzimas. Los mismos se activan secuencialmente, al sufrir un clivaje enzimático, dando lugar a la formación de enzimas activas que culminan con la formación de trombina, que al actuar sobre el fibrinógeno forma la malla de fibrina. Hasta ahora han sido reconocidos como factores de coagulación diez glicoproteínas plasmáticas, que se designaron con números romanos por el Comité Internacional de Nomenclatura de Factores de la Coagulación, pero además existen otras proteínas que también intervienen en la coagulación y aún no han sido designadas numéricamente (ver Tabla N° 1). MECANIMO EXTRÍNSECO El mecanismo extrínseco se inicia cuando la sangre entra en contacto con elementos tisulares. El FT se combina en forma estequiométrica con el FVII, en presencia de calcio, y forma un complejo enzimático capaz de activar al FVII en FVIIa, que es más activo que el FVII nativo (retroalimentación positiva), y a los factores X y IX formando FXa y FIXa. MECANISMO INTRÍNSECO En el modelo celular de la coagulación se observó que en la llamada fase de contacto sólo interviene el FXI ya que el FXII y precalicreínas no desempeñan un papel importante en la coagulación. El FXIa actúa sobre el FIX en una reacción dependiente del calcio formando el FIXa, el cual forma un complejo enzimático con los fosfolípidos (factor plaquetario 3), calcio y FVIII (complejo tenasa) para transformar el FX en FXa. A partir de allí se inicia la vía final común. VIA FINAL COMÚN Se inicia con la activación del FX por el mecanismo intrínseco o extrínseco. In vitro puede ser activado por otras enzimas proteolíticas como tripsina o veneno de víbora de Russell en presencia o no de fosfolípidos. El FXa forma el “complejo protrombinasa” con fosfolípidos, calcio y FV, el cual actúa sobre el FII para generar trombina. La trombina es la enzima coagulante por excelencia. Actúa sobre el fibrinógeno para formar la malla de fibrina, sobre los cofactores V y VIII aumentando su actividad, y sobre el FXIII, estabilizador de la fibrina. Participa además en la adhesividad y agregación plaquetaria. El fibrinógeno es un dímero constituído por tres pares de cadenas: 2A, 2B y 2. A y B son los fibrinopéptidos con densidad de carga negativa que producen 3 repulsión entre las moléculas de fibrinógeno. La trombina libera el fibrinopéptido A de la cadena alfa y luego el B de la cadena beta. Así se forman los monómeros que se polimerizan mediante uniones tipo hidrógeno formando un gel soluble, la fibrina. Los polímeros adquieren mayor cohesión y estabilidad cuando actúa sobre ellos el FXIII, previamente activado por trombina, introduciendo enlaces covalentes entre los monómeros de fibrina. TABLA N° 1. Componentes del sistema de coagulación Nivel Cc. Plasmática Hemostát (µg/mL) ico (%) Vida Media (horas) FACTOR SINONIMO PROTEINA FUNCION I Fibrinógeno Estructural Forma fibrina al sufrir un clivaje enzimático 300 50 72-120 II Protrombina Serinoproteasa vitamina K dependiente Activa a los factores I,V,VIII,XIII,Prot.C y plaquetas 100 40 67-106 V Proacelerina Unión Ayuda al FXa activación del FII 10 10-15 12-15 VII Proconvertina Serinoproteasa vitamina K dependiente 0.1 10 4-6 VIII Antihemofílico A Unión 0.1 25 10-16 IX Factor Christmas o antihemofílico B Serinoproteasa vitamina K dependiente Activa al FX 5 25-20 18-40 X Factor Stuart-Prower Serinoproteasa vitamina K dependiente Activa al FII 8 20 20-60 XI Antecedente tromboplástico Serinoproteasa Activa al FIX 5 15-20 48-80 XII Factor Hageman Serinoproteasa Activa al FXI y el sistema de las quininas 30 50-70 XIII Estabilizador de la fibrina Transglutaminasa o transpeptidasa Entrecruza la fibrina con uniones covalentes 10 10 FACTOR VON WILLEBRAND Factor VIII antígeno relacionado Unión Une plaquetas y FVIII 10 22-40 PRECALICREINA Factor Fletcher Serinoproteasa Activa al FXII y libera bradiquinina de los QAPM 50 FACTOR TISULAR Factor tisular Unión Se une al FVII formando un complejo que activa a FX y FIX 0 QUININOGENOS DE ALTO PESO MOLECULAR Factor Fitzgerald , Williams o Flaujeac Unión Une la precalicreína y el FXI al endotelio dañado 70 en la Activa FIX y FX Ayuda al FIXa activación del FX en la MODELO CELULAR DE LA COAGULACIÓN El concepto actual de la activación de la coagulación involucra la cascada de coagulación como mecanismo que se lleva a cabo en superficies celulares específicas; este modelo refleja más eficientemente el proceso de coagulación in vivo y la regulación del sistema. El modelo celular de coagulación requiere de la participación de dos tipos celulares: células que expresan factor tisular y 100-200 4 las plaquetas. La clave en la regulación del proceso de coagulación es mantener los dos tipos celulares separados hasta que una injuria requiera la activación de la coagulación. El mecanismo hemostático se desarrolla en tres etapas: iniciación, amplificación y propagación. Fase de Iniciación: La etapa de iniciación de la coagulación se localiza en células que expresan FT en la circulación sanguínea. Dichas células normalmente se encuentran fuera de la vasculatura y la injuria expone el FT. Inmediatamente se forma el complejo FT-VIIa el cual activa pequeñas cantidades de FIX y FX. El factor Xa se asocia con el Va para formar el complejo protrombinasa en las células que expresan el FT, lo cual genera pequeñas cantidades de trombina. El FXa unido a las células está relativamente protegido de la inactivación por inhibidores de proteasas; cuando el FXa se libera de las superficies es rápidamente inhibido por el Inhibidor del vía del Factor Tisular (TFPI) o por Antitrombina. La presencia de inhibidores circulantes localiza al FXa en el lugar de la lesión. Por el contrario, el FIXa no es neutralizado por los inhibidores (la AT lo inhibe muy lentamente) y se puede desplazar a las plaquetas cercanas y otras células, llevando la activación de la coagulación de la célula endotelial a otras células (principalmente plaquetas). Fase de Amplificación: Como consecuencia de la iniciación se forman pequeñas cantidades de trombina que cumplirán al menos tres funciones: 1activar las plaquetas; 2- promover la activación de los cofactores FVIII y FV en las superficies de las plaquetas; 3- activar también al FXI en la superficie plaquetaria. Al promediar el proceso de amplificación se generaron las condiciones necesarias para que en la propagación de produzcan grandes cantidades de trombina. Fase de Propagación: La finalidad de la fase de propagación es generar grandes cantidades de trombina de modo de llegar a la formación del coágulo de fibrina. La propagación se lleva a cabo sobre la superficie de las plaquetas activadas. En esta fase se incluyen tres conceptos: 1- El FIXa formado durante la iniciación se une al FVIIIa en la superficie plaquetaria formando el complejo tenasa; 2- El factor XIa unido a plaqueta provee mayor cantidad de FIXa y 3Mediante el complejo FIXa/FVIIIa en la plaqueta se debe formar nuevo FXa ya que el generado en la célula que presenta FT no se puede desplazar a las plaquetas. De esta manera se forma el complejo protrombinasa (FXa/FVa) que es generador de grandes cantidades de trombina. INTERRELACIONES ENTRE MECANISMO INTRÍNSECO Y EXTRÍNSECO El FIX es activado por el FVIIa El FVII es activado por el FIXa , el FXIa 5 GRAFICO N° 1. Activación de la coagulación: a) vía extrínseca in vitro (modelo de cascada) y b) in vivo (modelo celular) GRAFICO N° 2. Activación de la coagulación: a) vía intrínseca in vitro (modelo de cascada a) e b) in vivo (modelo celular) REACTIVOS DE USO GENERAL 1) Soluciones 1-a) Solución fisiológica (cloruro de sodio 0,15 M) Cloruro de sodio ................... 9g Agua destilada ...................... 1000 mL 1-b) Solución sulfocrómica 6 Bicromato de potasio ................. 100 g Acido sulfúrico .......................... 500 mL Agua destilada ...........................1000 mL Disolver el bicromato de potasio en agua y agregar lentamente el ácido sulfúrico en pequeños volúmenes, enfriando la solución. Llevar a volumen. 2) Anticoagulantes o descalcificantes 2-a) Citrato de sodio 0.11 M Citrato de sodio (2 H 20) ........ 31,3 g Agua destilada ....................csp. 1000 mL 2-b) Oxalato de sodio 0,1 M Oxalato de sodio .................. 13,4 g Agua destilada ..................csp. 1000 mL 2-c) Cloruro de calcio 0,1 M (Solución Madre) Cloruro de calcio anhidro ......... 11,1 g Agua destilada ...................csp. 1000 mL 2-d) Cloruro de calcio 0,025 M (Solución de trabajo) Se preparan a partir de la solución madre realizando una dilución ¼ en agua destilada. 3) Soluciones tampones Tampón de Owren modificado pH 7,35 Tampón de Owren pH 7,35 .............. 200 mL Citrato de sodio 0,025 M .................. 200 mL LIMPIEZA Y ACONDICIONAMIENTO DEL MATERIAL Para la toma de las muestras y la realización de ciertas pruebas es importante el empleo de tubos y pipetas de plástico, a fin de evitar la activación por contacto. En cambio, para la realización de las pruebas que miden tiempos de coagulación se utilizan tubos de vidrio, aprovechando en ciertos casos (TTPA, por ejemplo) la propiedad de este material de activar la vía intrínseca de la coagulación. Se prefiere el uso de tubos de vidrio a base de borosilicatos, de 11 x 74 mm. Se descartarán aquellos tubos que presenten rayaduras, ya que afectarán los tiempos de coagulación. Es imprescindible la limpieza perfecta del material. De ordinario se realiza del siguiente modo: Lavado del material con agua y detergente no iónico, cepillar enérgicamente. Enjuagar con agua destilada (repetir este paso varias veces). Secar en estufa. Ocasionalmente puede colocarse el material de vidrio en mezcla sulfocrómica para eliminar restos de reactivos y proceder a una limpieza más profunda aún. 7 CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA Para obtener un buen resultado de laboratorio es imprescindible que se cumplan correctamente con todas las etapas de una buena metodología diagnóstica: Preanalítica, Analítica y Postanalítica. Etapa Preanalítica: Las variables preanalíticas son todos aquellos factores que afectan a la calidad de la muestra (identificación, condiciones previas del paciente, correcta toma, conservación y transporte de la muestra) hasta el momento de su procesamiento. A todo paciente que consulta por una alteración de la hemostasia se le debe realizar una correcta anamnesis. La misma debe contener datos como edad, ocupación, ingesta de medicamentos, sangrados por mucosas (gingivorragias, epistaxis, melena, hematuria, menstruaciones), operaciones previas, embarazos, abortos, enfermedades metabólicas como diabetes, insuficiencia renal, dislipemias y antecedentes familiares. Para la toma de muestra el paciente debe concurrir con 8-12 hs de ayuno previo y con escasa actividad física. Dentro de la etapa preanalítica se considera el perfecto estado y la adecuada selección de los materiales a utilizar para la extracción, incluyendo el anticoagulante y la limpieza del material. La calidad del examen de coagulación depende muy estrechamente de la toma de muestra. Etapa Analítica: Involucra la realización de la técnica solicitada, la cual debe estar perfectamente estandarizada. Se deben procesar los controles de calidad correspondientes. El término control de calidad describe el conjunto de medidas que se realizan para asegurar la veracidad del dato obtenido en el laboratorio, es decir la calidad analítica. El programa de administración de calidad debe comprender: 1- Mantenimiento del equipamiento (coagulómetros). 2- Calibración de pipetas automáticas y sistemas dilutores. 3- Realizar diariamente el procesamiento del control de calidad interno. 4- Participar de un control de calidad externo. 5- Evaluar la veracidad del dato. Etapa Postanalítica: Comprende la validación y la emisión de los resultados. La emisión de los resultados debe ser rápida y clara; los informes deben incluir la técnica utilizada, los valores de referencia para la técnica y la firma del profesional responsable del sector. Es responsabilidad del personal del laboratorio validar clínicamente los resultados, para lo cual se requiere combinar los datos clínicos con los hallazgos del laboratorio para investigar si estos hallazgos son causa o efecto de la patogénesis de la enfermedad. TOMA DE MUESTRA Consideraciones 8 Para la extracción de sangre se debe utilizar jeringas plásticas y agujas descartables calibre 19 o 20 G. Los tubos para recoger la muestra deben ser de plástico. La punción debe ser precisa y rápida, logrando una buena canalización. La velocidad de salida de la sangre debe ser semejante a la del flujo sanguíneo. Evitar la entrada de aire y la formación de burbujas, el éstasis y la contaminación con tromboplastina tisular (evitar el uso prolongado de torniquete). Ante una extracción dificultosa se debe proceder al cambio de jeringa luego de extraer 2-3 mL de sangre. Transvase: retirar la aguja de la jeringa y verter la sangre por la pared de los tubos suavemente, a igual velocidad que la extracción, hasta la marca prevista. Mezclar inmediatamente por inversión suave varias veces. Anticoagulante: la proporción de anticoagulante habitual es 1 parte para 9 partes de sangre. Tener presente que se deberá ajustar la relación anticoagulante/sangre en caso de hematocritos superiores a 55% (Figura N°1 y Tabla N° 2). Centrifugación: Inmediata (antes de los 20 minutos de realizada la extracción). Para obtener: Plasma rico en plaquetas (PRP): centrifugar a 900 r.p.m. durante 5 minutos. Plasma pobre en plaquetas (PPP): se obtiene por doble centrifugación (primero de sangre entera y luego el plasma citratado y separado) a 3.000 r.p.m. durante 10 minutos cada vez. Transvase: transferir el plasma inmediatamente a tubos plásticos con pipetas plásticas. En caso de no poder realizar las pruebas dentro de las 2 horas posteriores a la extracción, el plasma se mantendrá a 4ºC. Si las muestras no se procesan en el día, guardar el plasma en freezer (-20ºC). FIGURA N°1: La relación del anticoagulante con el volumen plasmático depende del hematocrito Alto 9 TABLA N° 2. Relación anticoagulante/sangre según el hematocrito HEMATOCRITO (%) Volumen de anticoagulante (mL) para un volumen total de sangre de 5 mL 10 mL 30 0,62 1,20 35 0,57 1,13 40 0,54 1,07 45 0,50 1,00 50 0,46 0,94 55 0,43 0,87 60 0,39 0,80 65 0,35 0,74 70 0,32 0,66 75 0,28 0,60 80 0,25 0,53 PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA ORIENTACIÓN POR EL LABORATORIO DE LOS TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA La realización e interpretación de las pruebas de hemostasia deben siempre subordinarse a los hallazgos del examen clínico. Las pruebas pueden dividirse en: a) Pruebas globales de coagulación: se investigan, en conjunto, los diferentes componentes del mecanismo hemostático (vascular, plaquetario, pro coagulante o fibrinolítico) o vías de activación de algunos de estos componentes. Sus resultados indican que hay una alteración pero sin identificar los factores implicados en ella. Tiempo de protrombina: (TP): vía extrínseca. Tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT): vía intrínseca. Tiempo de trombina (TT): etapa final de la coagulación. Tiempo de Sangría (TS): cantidad y calidad de plaquetas, fibrinógeno y subendotelio. Retracción del coágulo (RC): cantidad y calidad de plaquetas. Lisis de sangre entera: evalúa activadores e inhibidores del sistema fibrinolítico. Lisis de euglobulinas: evalúa los activadores del sistema fibrinolítico. 10 Tromboelastografía: brinda una visión global del proceso de coagulación desde la formación inicial de trombina hasta el proceso de fibrinolisis incluyendo las plaquetas b) Pruebas específicas: se analizan en forma selectiva los factores o elementos que intervienen o forman parte del compartimiento que se halló anormal con la realización de las pruebas globales. 1) Pruebas para el estudio de la vía intrínseca de la coagulación Tiempo de coagulación Tiempo de coagulación activado* Prueba de generación de tromboplastina* Tiempo de tromboplastina parcial* Tiempo de tromboplastina parcial activado Consumo de protrombina* Tromboelastografía* 2) Prueba para el estudio de la vía extrínseca de la coagulación Tiempo de protrombina en una etapa o tiempo de Quick 3) Pruebas para el estudio de la transformación del fibrinógeno en fibrina Tiempo de trombina Tiempo de trombina-calcio* Tiempo de reptilasa 4) Prueba para el estudio de la vía final común Tiempo de Stypven o tiempo del veneno de víbora de Russell *Las técnicas de estas pruebas pueden consultarse en la bibliografía TÉCNICAS TIEMPO DE COAGULACIÓN (Modificado de Lee-White) Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular la sangre in vitro, al ser extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular. Procedimiento: Obtener, mediante punción venosa 3,5 mL de sangre. Desconectar la aguja y vaciar 1,0 mL de sangre en cada uno de 3 tubos de hemólisis, previamente colocados en un baño a 37° C. Poner en marcha el cronómetro al añadir la sangre al primer tubo (al llegar el tercer tubo no deben haber transcurrido más de 5 segundos). Inclinar ligeramente el primer tubo e investigar el deslizamiento de sangre por las paredes del tubo. Repetir la operación cada 30 segundos hasta que la sangre coagule (deja de escurrir por 11 las paredes del tubo). Seguidamente observar el segundo tubo y se anota como definitivo el tiempo obtenido en el tercer tubo. Resultados Valores de referencia: 5-15 minutos Observaciones Este tiempo de coagulación in vitro reflejará mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos se modifique o manipule esta sangre, pero al carecer de sensibilidad sólo se modifica ante deficiencias severas de factores de la coagulación. Entre los factores de orden técnico que modifican esta prueba podemos mencionar: 1) Contaminación con líquidos tisulares (tromboplásticos). 2) Formación de espuma. 3) Inadecuada limpieza del material. 4) Diámetro de los tubos (se recomienda usar tubos de 11 mm de diámetro) 5) Los movimientos de los tubos. 6) La temperatura. TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (TTPA) Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular el plasma pobre en plaquetas en presencia de un activador de la fase de contacto (caolín, celite, ácido elágico), un substituto plaquetario (cefalina o inositina) e iones calcio. El agregado de activadores (sustancia inerte con carga negativa), tiene por objeto uniformar la activación por contacto de todos los plasmas. El substituto plaquetario, al ser aportado como reactivo, se encuentra disponible en su totalidad en el momento de la recalcificación plasmática. Cuando el activador es el caolín la prueba se denomina tiempo de tromboplastina parcial activado con caolín (TTPK). Esta prueba estudia globalmente calicreínas, quininógenos de alto peso molecular, factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I. La sensibilidad de la técnica no es la misma para todos los factores, en orden decreciente tenemos: FVIII, FIX, XI, XII y para fibrinógeno cuando su concentración es inferior a 100 mg % Procedimiento: En un tubo de Kahn pipetear: - 100 µL del reactivo cefalina-caolín - 100 µL del PPP (muestra) Incubar el tubo en baño a 37ºC y al cabo de 3 minutos adicionar 100 µL de cloruro de calcio 0,025 M. Simultáneamente poner en marcha un cronómetro. A los 30 segundos observar la formación del coágulo. En el momento de su aparición, detener el cronómetro y registrar la lectura correspondiente. Esta determinación se efectúa por duplicado y se calcula el promedio de ambas lecturas. 12 Resultados Valores de referencia: 35-45 segundos. Cada laboratorio debe establecer los valores de referencia de acuerdo al reactivo y a la técnica empleada (manual o automatizada). El TTPa se usa para evaluar la vía intrínseca de la coagulación, y por lo tanto se encontrará prolongado en: Déficit congénito de los factores XII, XI, IX, VIII, X, II y V Alteración cualitativa de algún factor Déficit adquirido de factores (hepatopatía, antibiótico-terapia, alimentación parenteral, etc) Presencia de inhibidores (específicos o de interferencia) Pacientes heparinizados El acortamiento del TTPA puede ser tomado como un indicio de hipercoagulabilidad. MONITOREO DE LA ANTICOAGULACION CON HEPARINA Introducción Las complicaciones tromboembólicas arteriales y venosas son susceptibles de terapéuticas preventivas y/o resolutivas por medio de medicamentos que afectan alguno de los mecanismos normales de la hemostasia. Los medicamentos que afectan la cinética de la coagulación directa o indirectamente son las heparinas y los anticoagulantes orales (dicumarínicos). La heparina es el anticoagulante más usado por vía parenteral en medicina clínica humana. Ejerce su efecto uniéndose a ciertas proteínas plasmáticas llamadas serpinas, de las cuales la Antitrombina (AT) es la única que expone su sitio activo, normalmente inaccesible, por unión a heparina. El papel fisiológico de la AT es regular las serinoproteasas de la coagulación, incluyendo trombina y los factores XIIa, XIa, Xa y IXa. La acción de la heparina consiste en unirse a la AT provocando cambios conformacionales en ésta, que hacen más asequible su sitio neutralizante y por lo tanto acelerando enormemente su capacidad inhibitoria sobre la trombina y FXa. Las heparinas son glicosaminoglicanos sulfatados con fuerte carga negativa, extraídos de pulmón o mucosa intestinal de origen bovino o porcino, que se presentan en forma de polímeros. Su efecto sobre la trombina y FXa varía de acuerdo al peso molecular de las mismas. En general, acción anticoagulante y antitrombótica no son términos sinónimos, ya que la acción anticoagulante puede ser observada in vitro; la sangre en general es poco coagulable y los tiempos de coagulación suelen estar prolongados, siendo un proceso esencialmente plasmático; mientras que el efecto antitrombótico es un fenómeno primordialmente observable in vivo, los tiempos de coagulación podrían ser normales aún con buen efecto antitrombótico, siendo un proceso multicelular en el que participan componentes plasmáticos junto a componentes celulares como endotelio, plaquetas, eritrocitos y leucocitos. Las heparinas de bajo peso molecular (PM entre 4.000 y 6.500) tienen reducida su capacidad antitrombínica (anti-IIa) medida por el alargamiento del TTPA mientras que conservan su capacidad antitrombótica medido por su acción inhibitoria sobre el FXa. En cambio las heparinas no fraccionadas (HNF), de alto peso molecular o convencionales tienen tanto efecto anti-IIa como efecto anti-Xa. 13 Control de la terapéutica con heparina Se puede realizar por varios métodos: 1. Tiempo de tromboplastina parcial activado 2. Tiempo de trombina 3. Determinación del nivel de heparinemia La prueba de elección será aquella que tenga precisión, reproducibilidad y se procese en un tiempo corto. El TTPA tiene la ventaja de poder ser realizado en pocos minutos y su reproducibilidad dentro de los rangos terapéuticos es mayor que con el tiempo de coagulación, que ha sido el método más usado en el control. Si bien el tiempo de trombina es un método rápido y reproducible, tiene la desventaja de que el reactivo de trombina es inestable aún conservado a bajas temperaturas. En el monitoreo de la terapia con HNF empleando el TTPA, se considera que el tratamiento es adecuado cuando el APTT del paciente prolonga entre 1,5 a 2,5 veces los valores del APTT basal (esta relación se denomina razón) razón = TTPA paciente TTPA basal Debe establecerse el rango terapéutico del sistema de TTPa usado (de acuerdo al reactivo y sistema de detección), ya que para un mismo valor de heparinemia el rango varía según el sistema de TTPA empleado. En la práctica lo que se hace es evaluar la respuesta del sistema de TTPA en plasma de pacientes con diferentes dosis de HNF y adoptar la razón (rango terapéutico) que corresponda a una concentración de heparina en sangre de 0,2 a 0,4 UI/mL. Por lo tanto, se debe ajustar la dosis de heparina de manera de mantener el TTPA entre 1,5 y 2,5 del valor basal. PRUEBA DE CORRECCIÓN CON PLASMA NORMAL Un TTPA prolongado se debe corregir con plasma normal. La prueba consiste en determinar el valor de TTPA en una mezcla constituida por 1 volumen de plasma del paciente y 1 volumen de plasma normal (relación 1/1). De esta manera se podrá evaluar si la alteración es debida a un déficit de factores o a la presencia de inhibidores. P (paciente): PPP paciente TTPA (M) - TTPA (N) Índice de Rossner (IR) = TTPA (P) N (normal): PPP normal M (mezcla): P+N Interpretación IR < 0,1 Corrige. Por lo tanto hay déficit de factores de la vía intrínseca. IR > 0,1 No corrige. Hay un efecto inhibitorio. Este valor también debe ser establecido en cada laboratorio. En nuestro sistema se considera que corrige cuando es inferior a 0,1. DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE HEPARINEMIA Se puede valorar la acción de la heparina de bajo peso molecular mediante metodología que mide directamente su capacidad de potenciar la inhibición del 14 FXa por la AT, para ello se desarrollaron métodos coagulables y métodos amidolíticos. TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA EN UNA ETAPA Fundamento: Es la medida del tiempo de coagulación de un plasma citratado en presencia de un exceso de tromboplastina tisular e calcio. Esta prueba evalúa la eficiencia del mecanismo extrínseco de la coagulación. Es más sensible a los defectos de los factores VII, X y V que a la deficiencia de factor II. La presencia de heparina en concentraciones mayores a 150 µg/mL, niveles disminuidos de fibrinógeno (< 50 mg/mL) y productos de degradación de la fibrina por encima de 40 µg/mL prolongan el valor del TP y modifican su validez como prueba de screening de la vía extrínseca del sistema de coagulación. La sensibilidad de la prueba depende de la tromboplastina utilizada y las hay de distintos orígenes (placenta, cerebro de conejo, recombinante). Las tromboplastinas recombinantes desarrollan una cinética de activación demasiado rápida arrojando valores muy cortos de manera que no se detectan variaciones muy pequeñas en las actividades de los factores de coagulación. Procedimiento Colocar un tubo de Kahn en baño a 37ºC y agregar los siguientes reactivos: - 100 µL del PPP normal o del paciente e incubar 1 minuto - 200 µL de tromboplastina cálcica Disparar el cronómetro cuando se adiciona el reactivo y registrar el tiempo de coagulación. La prueba se realiza por duplicado. Resultados El tiempo de protrombina (TP) puede ser expresado de diferentes maneras: 1. En segundos: los valores de referencia están entre 11-14 segundos (con tromboplastina humana o de conejo) según la actividad de la tromboplastina. Los duplicados no deben diferir en más de 0,5 segundos con tiempos cortos y no más de 2-3 segundos en tiempos mayores de 30 segundos. 2. Concentración o actividad protrombínica %: calculado en relación a curvas de referencia obtenidas por dilución de plasmas normales en solución fisiológica (ver más adelante). Valores de referencia: 70-120 % Esta es la forma más indicada de informar en los estudios de rutina. 3. Cociente o razón TP del plasma del paciente Razón= ————————————————— TP promedio de los plasmas normales Esta expresión ha mostrado ser la más indicada para el control de la anticoagulación con antagonistas de la vitamina K (anticoagulantes orales), al disminuir los efectos de las variaciones intra como interlaboratorio, si bien ello no es suficiente para eliminar las variaciones debidas a la utilización de reactivos de distinta sensibilidad. 15 CURVA DE CALIBRACIÓN Preparar diluciones de un pool de plasmas normales (mezcla en partes iguales de plasma fresco citratado, de por lo menos 20 dadores normales) en solución fisiológica, según se indica en la tabla y determinar el TP para cada dilución. Realizar cada determinación por duplicado. Al usar solución fisiológica como diluyente, se produce una dilución progresiva del fibrinógeno, que afecta la formación y visualización de la malla de fibrina. Por ello, se aconseja mover lentamente el tubo para observar la formación del coágulo, luego de transcurrido un tiempo equivalente al tiempo de coagulación de la dilución anterior. TUBO Nº 1 2 3 4 5 6 7 SOLUCION FISIOLOGICA (mL) 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 1,75 POOL NORMAL (mL) 1 0,7 0,5 0,4 0,3 0,2 0,25 CONCENTRACION (%) 100 70 50 40 30 20 12,5 TIEMPO DE COAGULACIÓN (SEG) Graficar en papel milimetrado el tiempo promedio de cada dilución, expresado en segundos, en función del porcentaje de actividad. Trazar la hipérbola correspondiente. Cuando se grafican logaritmos, la curva se transforma en una recta. ACTIVIDAD PROTROMBÍNICA (%) Resultados Se expresan en porcentaje de actividad en relación a la mezcla de plasmas normales, al cual se asigna por definición 100% de actividad. Obtenido el tiempo de coagulación, extrapolar en la curva de calibración e informar la actividad del plasma analizado. La curva se debe realizar para cada lote de tromboplastina, para cada aparato y metodología utilizada (una curva para el método manual y una curva para cada coagulómetro). 16 Valores de referencia: 70-120 % Cada laboratorio debe establecer su rango de referencia determinando el TP en por lo menos 20 individuos sanos que incluyan mujeres y varones, con edad entre 14-70 años. La prolongación del TP puede deberse a: Síntesis disminuida por alteraciones en la función hepática. Alteraciones en el ciclo de la vitamina K (alteración en la actividad procoagulante pero con síntesis normal). Deficiencia congénita de alguno de los factores. Presencia de un inhibidor adquirido que interfiera en la vía extrínseca. Observaciones Cuando el plasma se diluye en solución fisiológica, todos los factores están igualmente reducidos, en cambio, en los pacientes tan sólo uno o algunos de estos factores pueden estar disminuidos; por lo tanto el porcentaje global obtenido no es reflejo proporcional del defecto presente. La expresión del TP en porcentaje es útil en los pacientes sin anticoagulación oral y es la más indicada en los estudios de rutina. PRUEBA DE CORRECCIÓN CON PLASMA NORMAL Un TP prolongado se debe corregir con plasma normal, en una relación 1/1, para evaluar si la alteración es debida a un déficit de factores o a la presencia de inhibidores. Si la prolongación de la prueba es debida al déficit de uno o más factores intervinientes en el TP, el valor obtenido en el TP de la mezcla (TPM) tendrá un valor igual o superior al TP teórico calculado. Es decir, la prueba CORRIGE porque el plasma normal aporta el o los factores ausentes en el plasma del paciente. TPM ≥ TPteórico calculado → CORRIGE Se considera que la prueba de corrección NO CORRIGE cuando la misma exhibe tiempos prolongados, sugiriendo la presencia de un inhibidor. TPM < TPteórico calculado → NO CORRIGE El TP teórico se calcula de la siguiente manera: TPP + TPN TPteórico calculado = ————————— 2 TP P : paciente TP N : normal Ejemplo: TPP = 30 % TPN = 100% TP teórico calculado = 65 % Si el TPM obtenido es mayor o igual a 65% significa que la prueba corrige (déficit de factores), mientras que si el valor obtenido es menor de 65% significa que no corrige (presencia de un inhibidor). 17 ESTANDARIZACIÓN DEL CONTROL DE LA TERAPÉUTICA CON ANTICOAGULANTES ORALES CALIBRACIÓN DE LAS TROMBOPLASTINAS Introducción El tratamiento y la profilaxis de los trastornos trombóticos se realiza mediante la administración oral de medicamentos anticoagulantes a base de cumarinas. Estos interfieren en la producción hepática de los factores de coagulación vitamina K dependientes. La dosis adecuada de estos medicamentos se ajusta según el resultado del TP, en la cual se usa como reactivo la tromboplastina. Las diversas tromboplastinas preparadas varían en su reacción (sensibilidad) al efecto anticoagulante de las cumarinas. El uso de tromboplastinas calibradas permite relacionar, en una escala común, los TP obtenidos con diferentes tromboplastinas, y por lo tanto comparar el efecto anticoagulante independientemente de la tromboplastina utilizada. De esta manera se puede normalizar el control del tratamiento con anticoagulantes orales. Cada lote de tromboplastina debe ser calibrado contra una preparación estable de referencia, la que debe ser similar y del mismo origen (especie) que el lote a calibrar. Existen preparaciones de referencia de origen humano, bovino y de conejo Tromboplastinas de origen humano Primera preparación de referencia primaria de tromboplastina humana combinada (67/40). Segunda preparación internacional de referencia primaria de tromboplastina simple (BCT 253). Primer reactivo nacional argentino de referencia de tromboplastina de cerebro humano (RNAT). Primer reactivo nacional argentino de trabajo de tromboplastina de cerebro humano. En 1983 el Comité de expertos de la OMS modificó el tratamiento estadístico del modelo de calibración propuesto por Biggs y Denson. La sensibilidad de un lote de tromboplastina en relación a la referencia internacional, se expresa mediante el Indice de Sensibilidad Internacional (ISI) y los resultados del control de anticoagulación, en Razón Internacional Normatizada (RIN). CÁLCULO DEL ÍNDICE INTERNACIONAL DE SENSIBILIDAD (ISI) 1. Se determina el TP a 20 dadores normales y a 60 pacientes bajo tratamiento anticoagulante por vía oral, con más de 3 meses de tratamiento y sin otro trastorno de la hemostasia, utilizando la tromboplastina a calibrar y la de referencia . 2. Graficar en escala doble logarítmica los TP obtenidos con la preparación de referencia en función de los TP obtenidos con el lote a calibrar. Establecer la recta de ajuste por el método de regresión ortogonal. La pendiente de la recta se denomina índice de sensibilidad del lote (b) en relación a la referencia empleada. Conociendo el ISI de la referencia (ISI r) se calcula el ISI del lote : 18 ISI = b x ISIr El ISI de la tromboplastina de referencia es = 1 No deben utilizarse tromboplastinas que tengan ISI superior a 1,2 Resultados Expresión del control de la terapéutica anticoagulante oral en Razón Internacional Normatizada (RIN) Primero se calcula el cociente r: r = TP del plasma del paciente anticoagulado TP promedio de los plasmas normales Luego, conociendo el ISI de la tromboplastina usada en la determinación, se calcula el RIN mediante la fórmula: RIN = rISI TIEMPO DE TROMBINA Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulación del plasma citratado en presencia de una cantidad fija de trombina. Permite evaluar la transformación del fibrinógeno en fibrina, excluyendo la participación del Factor XIII. Concentraciones de PDF/pdf mayores a 40 µg/mL prolongan el Tiempo de Trombina (TT), la prueba es alterada por trazas de heparina pero con valores mayores de 60 segundos no se correlaciona con la heparinemia. Reactivos y Procedimiento 19 Solución de trombina de origen humano o bovino (100 U/mL). Se diluye en el momento de ser utilizada de modo tal que la prueba realizada con plasma normal dé un valor de 18 a 20 segundos (aproximadamente 5 U/mL). En un tubo de vidrio previamente incubado durante 1 minuto en un baño de agua a 37 °C colocar: - 200 µL de PPP (normal o problema) Incubar durante 30 segundos. - 100 µL de la solución de trombina diluída. A los 5 seg aproximadamente comenzar a investigar la formación de la red de fibrina y registrar el tiempo de coagulación. Realizar la prueba por duplicado. Resultados Valores de referencia: entre 15-20 segundos. Se informa el tiempo de coagulación de la muestra expresado en segundos, junto con el tiempo de trombina del plasma normal (control). Esta prueba se ve alterada por anomalías cualitativas (el fibrinógeno fetal presenta prolongación de esta prueba por su contenido en ácido siálico) y cuantitativas del fibrinógeno; inhibidores adquiridos del tipo antitrombina, productos de degradación de la fibrina y/o fibrinógeno; presencia de paraproteínas. Si bien esta prueba se prolonga por la presencia de heparina, no se utiliza para monitorear el tratamiento con este anticoagulante por su gran sensibilidad. Los pacientes con tratamientos crónicos con dicumarínicos presentan un TT 4 a 6 segundos mayor que el de referencia. TIEMPO DE REPTILASA Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulación del plasma citratado por acción de una enzima derivada del veneno de víbora Bothrops atrox, la reptilasa. La enzima promueve la transformación del fibrinógeno en fibrina, por su acción proteolítica semejante a la de la trombina. La reptilasa escinde el fibrinopéptido A de la molécula del fibrinógeno y no es inhibida por la antitrombina, por lo que el tratamiento con heparina no interfiere o afecta su actividad. Procedimiento En un tubo de vidrio, incubado durante 1 minuto en un baño de agua a 37ºC, colocar: - 150 µL de PPP (normal o problema) Incubar durante 1 minuto. - 50 µL de reactivo (extracto purificado del veneno de Bothrops atrox) Registrar el tiempo de coagulación. La prueba debe realizarse por duplicado. Resultados Valores de referencia: 15-22 segundos Se informan los tiempos de coagulación expresados en segundos del plasma problema y del plasma normal. Se considerará prolongado cuando la diferencia con el control resulte mayor de 5 segundos. Esta prueba es de utilidad para el estudio de las disfibrinogenemias congénitas y adquiridas (hepatopatías, macroglobulinemias). El Tiempo de reptilasa no se altera por la presencia de heparina ni de hirudina, pero sí por niveles elevados de PDF/pdf. 20 TIEMPO DE STYPVEN Fundamento: El reactivo de Stypven (veneno de víbora de Rusell) contiene un complejo enzimático con actividad sobre los factores de la coagulación. Ha sido demostrado que los componentes del veneno activan directamente el FX a FXa sin la participación de otros factores de la coagulación. Esta propiedad es empleada para diferenciar una deficiencia del FVII de una deficiencia de FX. El tiempo de coagulación del plasma, desencadenado por el agregado del reactivo de Stypven, es independiente de la concentración del Factor VII en la muestra. Procedimiento Colocar en baño de agua a 37° C un tubo de vidrio y agregar los siguientes reactivos: - 100 µL de PPP (normal o problema) - 100 µL de Stypven-cefalina. Incubar 30 segundos exactamente y adicionar - 100 µL de CaCl2 Registrar el tiempo de coagulación de la muestra. Resultados Valores de referencia: 10-17 segundos Se informan los tiempos de coagulación expresados en segundos del plasma problema y del plasma normal. DETERMINACIÓN DE LOS FACTORES DE COAGULACIÓN El estudio de los factores de coagulación comprende: 1. La determinación funcional. 2. La determinación inmunológica. La determinación funcional se puede realizar dosando la actividad coagulante de los factores empleando para ello un sistema coagulable. Además, se puede determinar la actividad amidolítica, mediante la utilización de péptidos sintéticos (sustratos cromogénicos), cuya secuencia de aminoácidos es semejante a los sustratos naturales. En general, existe correlación entre la actividad coagulante y la actividad amidolítica, excepto en ciertas alteraciones moleculares. Cuando este defecto implica cambios estructurales que alteran la interacción con el sustrato natural, aunque no afecten el sitio activo, ello disminuye la actividad coagulante y, en cambio, no afectan la interacción con el sustrato sintético, manteniéndose la actividad amidolítica. En la determinación inmunológica de la concentración de proteína plasmática completa, se pueden usar diversas técnicas: radioinmunoensayo, enzimoinmunoensayo, inmunodifusión radial, electroinmunodifusión, inmunoturbidimetría, inmunonefelometría, etc. El empleo de estas técnicas ha demostrado que factores con niveles antigénicos normales (cantidad de proteína) pueden tener alteraciones moleculares de causa congénita o adquirida, que disminuyen su actividad biológica en los sistemas de coagulación o sustratos cromogénicos. Estas modificaciones cualitativas de los factores pueden ser evidenciadas por: inmunoelectroforesis cruzada, técnicas cromatográficas, análisis de secuencia de aminoácidos, y otras. 21 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE LOS FACTORES VIII, IX, XI Y XII, PRECALICREÍNA Y QAPM Introducción La prueba de elección para el análisis del mecanismo intrínseco, por su sensibilidad para detectar alteraciones de los factores de esta vía, es el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA). La cuantificación de la actividad coagulante de los factores que pertenecen exclusivamente a la vía intrínseca se realiza mediante técnicas en una etapa, en un sistema de coagulación similar a la prueba del TTPA utilizando como sustratos, plasmas carentes de la actividad procoagulante del factor a determinar. El tiempo de coagulación será inversamente proporcional a la concentración plasmática del factor limitante. Los factores VIII y IX también pueden ser determinados por técnicas en dos etapas, cuyo fundamento es la prueba de generación de tromboplastina. Ambas técnicas presentan ventajas y desventajas. Los métodos en una etapa son rápidos, sencillos y los resultados tienen buena correlación con la clínica y con la respuesta luego de la terapéutica sustitutiva. Como inconveniente está la necesidad de contar con plasma humano deficiente como sustrato. En la actualidad existen plasmas sustratos comerciales, los cuales fueron obtenidos por adsorción inmunológica del factor en cuestión a partir de plasmas normales. Estos métodos se ven afectados por la presencia de inhibidores. Los métodos en dos etapas no requieren el uso de plasmas deficientes, son más precisos a bajas concentraciones del factor a determinar y no son sensibles a la presencia de inhibidores. En cambio, son laboriosos y lentos. DETERMINACIÓN DE FACTOR VIII.c: MÉTODO EN UNA ETAPA Fundamento: El método usa un sistema de coagulación semejante al TTPA, que aporta todos los factores excepto el Factor VIII. El tiempo de coagulación de este sistema es inversamente proporcional a la actividad coagulante del FVIII del plasma del paciente. Reactivos Plasma humano deficiente en FVIII (plasma humano hemofílico A severo: FVIII menor de 1 U/dL, sin inhibidor) Reactivo cefalina-caolín CaCl2 0,025 M PPP Tampón de dilución: Tampón de Owren modificado pH 7,35 (Ver reactivos de uso general) Procedimiento - 100 µL de reactivo para FVIII diluído 1/2 en tampón de Owren modificado pH 7,35. - 100 µL de PPP diluído 1/2 en tampón de Owren modificado pH 7,35. - 100 µL de reactivo cefalina-caolín. Incubar 2 minutos a 37 C. - 100 µL 0,1 mL de CaCl2 0,025 M. Registrar el tiempo de coagulación. 22 Resultados: Los resultados se expresan en unidades por mililitro (U/mL) o en %, deducidos de una curva de valoración construída utilizando una mezcla de plasmas normales (estándar de trabajo) de actividad conocida (0.1 U/mL o 100%). Curva de calibración DILUCIÓN DEL PLASMA DE REFERENCIA 1/2 1/4 1/8 1/20 1/40 1/80 % 100 50 25 10 5 1 Con cada una de estas diluciones se realiza el procedimiento antes explicado, de tal manera que para cada concentración se obtendrá un tiempo en segundos. La curva se construye en papel doble logarítmico, anotando las concentraciones (U/mL) sobre la abscisa y los tiempos de coagulación (segundos) sobre la ordenada. De la recta resultante, se deduce la concentración de FVIII:c del plasma problema. Valores de referencia: 0.5-1.50 U/mL ó 50-150 % Observaciones. Inicialmente se usó plasma hemofílico sin diluír, pero la dilución 1/2 da resultados similares, por lo tanto se usa esta última para ahorrar plasma. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE LOS FACTORES II, V, VII Y X Introducción La prueba del tiempo de Quick permite evidenciar la actividad del mecanismo extrínseco de la coagulación. La cuantificación de la actividad coagulante de los factores II, V, VII y X por métodos en una etapa, se fundamenta en una modificación del tiempo de Quick, usando como sustrato un plasma deficiente en el factor a investigar. El tiempo de coagulación de este sistema es inversamente proporcional a la actividad funcional (coagulante) del factor presente en el plasma en estudio. DETERMINACIÓN DEL FACTOR V Método en una etapa Fundamento. El método para dosar el FV utiliza como sustrato un plasma artificialmente desprovisto de FV, que aporta los factores II, VII, X y fibrinógeno. El tiempo de coagulación de la mezcla del plasma problema (diluído), el reactivo para FV, la tromboplastina y el calcio, dependerá de la concentración del FV en el plasma incógnita. Reactivos Plasma deficiente en FV Tromboplastina de cerebro humano o de conejo Cloruro de calcio 0,025 M 23 Tampón de Michaelis pH 7,35 (ver reactivos) para realizar las diluciones PPP Procedimiento Colocar en un baño de agua a 37ºC un tubo de vidrio y agregar los siguientes reactivos: - 100 µL de plasma deficiente en FV - 100 µL de PPP diluído 1/10 en tampón de Michaelis - 100 µL de tromboplastina Incubar exactamente 20 segundos - 100 µL de CaCl2 0,025 M Registrar el tiempo de coagulación de la mezcla. Resultados Los resultados se expresan en unidades por decilitro (U/dl ó en %) y se deducen de una curva de calibración construida empleando como calibrador un plasma de referencia o un pool de plasmas normales. Cada nuevo lote de reactivos debe ser controlado, trazando la curva correspondiente. Curva de calibración DILUCIÓN DEL PLASMA CONTROL 1/10 1/20 1/40 1/80 % 100 50 25 12,5 Se grafica en papel doble logarítmico, colocando sobre la abscisa las concentraciones del factor (%) y los tiempos de coagulación (segundos) sobre la ordenada De la recta resultante, se deduce la concentración de FV en el plasma problema. Valores de referencia: 0.7-1.2 U/dL ó 70-120 % Observaciones Se usa el plasma del paciente diluído porque aumenta la sensibilidad de la técnica. DETERMINACIÓN DE FIBRINÓGENO: MÉTODO FUNCIONAL DE CLAUSS Fundamento: El tiempo de coagulación del plasma, por acción de un exceso de trombina, es inversamente proporcional a la concentración plasmática de fibrinógeno. Reactivos Tampón imidazol pH 7,5 (ver reactivos) Solución fisiológica. Solución de trombina 100 U/mL en solución fisiológica. PPP Estándar de fibrinógeno. Procedimiento Colocar un tubo de vidrio en baño de agua a 37°C y adicionar los siguientes reactivos: - 100 µL de PPP diluído 1/10 en tampón imidazol pH 7,5. Incubar durante 30 segundos. 24 - 100 µL de de la solución de trombina (100 U/mL). Mezclar suavemente y registrar el tiempo de coagulación de la mezcla. La prueba debe efectuarse por duplicado. Resultados Los resultados se expresan en gramos de fibrinógeno por 1itro de plasma La concentración se deduce de una curva, en escala logarítmica, del tiempo de coagulación (segundos) en función de la concentración de fibrinógeno (g/L). Para realizar la curva se preparan diluciones (1/5, 1/10, 1/20, 1/40) del estándar de fibrinógeno en tampón imidazol pH 7,5 y luego se determina el tiempo de coagulación por acción de la trombina para cada dilución. El tiempo de trombina de la muestra incógnita se interpola en la curva y se obtiene la concentración de fibrinógeno. Valores de referencia: 1,7-4,0 g/L Los siguientes algoritmos resultarán útiles en la interpretación de las pruebas de uso frecuente en el laboratorio de hemostasia. Paciente con: TP alterado, APTT normal Realizar TP en mezcla con plasma normal (1+1) No corrige Corrige Dosaje de los factores de la vía extrínseca Búsqueda de Inhibidor Paciente con: APTT alterado, TP normal, TT normal APTT con incubación Prolongada 20 min a 37°C Corrige No Corrige Realizar APTT en mezcla con plasma normal Dosaje de precalicreínas Corrige Dosaje de factores de la vía intrínseca No Corrige Búsqueda de inhibidor 25 Paciente con: TT alterado, TP normal, APTT normal Realizar TT en mezcla con plasma normal (1+1) Corrige No Corrige Dosaje de Fibrinógeno Tiempo de Reptilasa Alterado Normal Disminuido Hipo o afibrinogenemia Congénita o adquirida Disfrinogenemia Congénita o adquirida Inhibidor tipo heparina BIBLIOGRAFÍA Manual de Hematología de la Academia Nacional de Medicina. 1990. Manual de Hemostasia y Trombosis - Grupo Cooperativo de Hemostasia y Trombosis (Grupo CLAHT). 1990. Hemostasia y Trombosis Técnicas e interpretación. Dr. Edgardo Iglesias 1978. Guía de trabajos prácticos de Hemostasia. Universidad de Buenos Aires. Departamento de Análisis Clínicos – 1987. Wintrobe’s Clinical Hematology . 9ª Edición. 1993. Trombosis. Tomo 1. Raúl Altman y colaboradores. 2005. Fundamentos para el Manejo Práctico en el Laboratorio de Hemostasia. Grupo CAHT (Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis). 2003. Guías de Trabajo Práctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia 1999. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA. Monroe D.M., Hoffman M. What does it to make the perfect clot? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006; 26:41-48. Roberts H.R., Monroe D.M., Escobar M.A. Current concepts of Hemostasis. Anesthesiology V 100, N° 3, Mar 2004. Collection, transport and processing of blood specimens for testing plasma based coagulation assays and molecular hemostasis assays. Approved guideline- Fifth edition. NCCLS 2012; 28(5).