Clonación molecular de antígenos excreto-secretorios de

Clonación molecular de antígenos excreto-secretorios de Trichinella spp.
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Clonación molecular de antígenos excretosecretorios de Trichinella spp.
Castaño Zubieta, R.; Martínez, M. y Morici, G.
Area de Parasitología del Instituto de Patobiología, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. INTA Castelar
Introducción
La clonación molecular es una herramienta utilizada para la construcción de bibliotecas de ácido
desoxiribonucleico complementario (ADNc) y para la producción de proteínas de fusión.
La aplicación de antígenos excreto-secretorios (ES) en lugar de antígenos crudos de larvas musculares en los ensayos de inmunoabsorbancia ligado a enzimas (ELISA) para el diagnóstico de la trichinellosis, mejoró la especificidad y sensibilidad de la prueba (Gamble y col,1983).
La purificación de productos ES provenientes de cultivos de larvas musculares de Trichinella spp.
no permite obtener cantidades suficientes de proteínas para su utilización en pruebas inmunoenzimáticas. Con el objetivo de mejorar esta contingencia se aplicaron las técnicas de clonación molecular. Vassiilatis y col. en 1996 clonaron y expresaron ADNc codificante para una glicoproteína secretoria de 43 kDa de T. spiralis. Yao y col. en 1997 obtubieron ADNc codificantes para ES con peso
molecular de 46, 49/43 y 53 KDa de T. spiralis y proteínas de fusión provenientes de los mismos
Las posibles aplicaciones de ES recombinantes y su caracterización molecular son:
1- Desarrollo de técnicas inmunoenzimáticas para el diagnóstico serológico de Trichinellosis.
Yao y col. en 1997 desarrollaron un ELISA utilizando antígenos recombinantes de 45-50 kDa de
T. spiralis y Trichinella T5, detectando elevados niveles de anticuerpos en cerdos infectados con T. spiralis al comienzo de las 2 semanas post inoculación (PI) y continuando hasta las 8 semanas PI. En animales infectados con Trichinella T5 no se detectaron niveles de anticuerpos hasta las 5 semanas PI.
2- Investigación de candidatos vacunales.
El gen (TspE1) que codifica para un antígeno de T. spiralis de 31 kDa se clonó dentro de un plásmido para expresión en células eucariotas con el fin de desarrollar una vacuna ADN, la habilidad de
expresar antígeno en células ováricas de hamster (CHO) se confirmó por ensayos de inmunoblot e
inmunofluorescencia indirecta. Se comprobó la inmunogenicidad protectiva de la misma en ratones
BALB/c. (Wang y col. 2006)
3- Generación de anticuerpos anti proteínas de fusión en estudios inmunohistoquímicos con la
finalidad de esclarecer el lugar y momento del estadío evolutivo del parásito en que se secretan los
ES. Ensayos de inmunocitolocalización demostraron que un suero anti proteína de fusión solo reconoció epitopes en esticocitos de T. pseudospiralis y no de T. spiralis. (Chung y Ko, 1999)
4- Generación de anticuerpos para su utilización en la identificación de clones recombinantes.
En el presente capítulo se describe la metodología para la obtención de proteínas recombinantes
mediante la clonación de antígenos ES de Trichinella spp. (Figura 1)
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Figura 1. Clonación molecular
1) Aislamiento de ARN. 2) RT-PCR. 3) Ligación al vector. 4) Transformación del sistema de
expresión. 5) Detección de clones recombinantes. 6) Inducción y expresión. 7) Purificación.
Elección de antígenos
Para la elección de la proteína que se quiere expresar es importante saber si la secuencia de
ADNc se conoce o no. En caso de poder acceder a la secuencia se pueden diseñar cebadores específicos para amplificar el sector de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si
por el contrario no se tiene la información de la secuencia de ADNc, pueden diseñarse cebadores
degenerados teniendo en cuenta las regiones conservadas con otras proteínas relacionadas de otras
especies.
En este paso es necesario apelar al empleo de herramientas bioinformáticas en la búsqueda de
homologías entre especies para el diseño de cebadores. También contamos con el auxilio de programas informáticos que nos permiten predecir los sectores de la proteína en el cual se encuentran los
posibles epitopes. De esta manera podemos seleccionar estos sectores para proceder a su clonación.
A los cebadores diseñados se les deben incorporar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, lo cual permitirá la correcta introducción del inserto dentro del vector elegido.
Varios investigadores han aislado antígenos específicos de productos excreto-secretorios de T. spiralis. Los genes que codifican para los antígenos inmunodominantes de 43, 46, 49 y 53 KDa de T. spiralis han sido caracterizados (Su y col,1991; Sugane y Matsura,1990; Zarlenga y Gamble,1990; Vassilatis y col, 1992)
Aislamiento de acido ribonucleico (ARN)
Este paso se lleva a cabo a partir de larvas infectivas recuperadas de muestras congeladas de músculos de animales de laboratorio mediante el proceso de digestión artificial (Chung y col, 1999).
Las larvas se almacenan a –70°C o inmediatamente después de la digestión artificial, se someten
al proceso de extracción de ARN exponiéndolas inicialmente a la acción de una solución desnaturalizante a base de tiocianato de guanidinio. (Zarlenga y col. 2002).
Algunos investigadores prefieren utilizar para este fin soluciones comerciales disponibles en el
mercado. (Zarlenga y col. 2002, Wu y col 2002, Connolly y col.1995)
El ARN finalmente obtenido en pureza, puede conservarse a –70°C o utilizarse para la síntesis de
ADNc mediante la reacción de Transcripción Reversa seguida de PCR (RT-PCR)
La calidad del ARN puede ser monitoreada por electroforesis en gel con formaldehído (Chung y
col 1999)
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RT-PCR
Esta reacción utiliza como templado ARN y se realiza con el objetivo de obtener ADNc que codifica para el sector de la proteína de interés.
Para la construcción de la primera cadena de ADNc, es necesario emplear la enzima transcriptasa reversa, que reconoce como sustrato al ARN. La misma, incubada conjuntamente con un cebador
poli-timina (oligoDT) que se anilla con la cola poli-adenina del ARN mensajero, incorpora por complementariedad de bases los dideoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) correspondientes. Una vez obtenido el ADNc, se procede a realizar la PCR usando cebadores específicos con un sitio de reconocimiento a enzimas de restricción, resultando de este proceso la amplificación del sector que codifica
para la proteína que se desea clonar. Este ADNc constituye el sector que se inserta en el plásmido o
vector.
Para realizar la transcripción reversa, se emplearon aislamientos de ARN de larvas musculares de
T. pseudospiralis utilizando el cebador oligoDT y seguidamente el ADNc codificante para el antígeno tpJ5, utilizando pares de cebadores específicos. (Kuratli y col. 2001)
Reacción de ligación al vector
El criterio de selección del vector dependerá del sistema en el cual se pretende expresar la proteína (bacterias, levaduras, células de insecto, células de mamífero o plantas); del sitio en el que se desea
expresarla (intra o extracelular); del metódo de purificación que se empleará, etc.
En general, las construcciones que se usan actualmente como vectores, son productos comerciales
disponibles en el mercado. (Kuratli y col. 2001, Connoly y col.1996, Zarlenga y col. 2002, Chung y
col.1999, Yao y col. 1997)
Algunas de las características principales que deben presentar los vectores plasmídicos para transformación de bacterias son:
a) Poseer un promotor.
b) Una región de reconocimiento al ribosoma (RBS).
c) Un sitio de reconocimiento múltiple a varias enzimas de restricción (este va a ser el lugar de
introducción dirigida del ADNc en forma orientada en el marco correcto de lectura de codones).
d) Una región tag (permite la purificación de la proteína de fusión en un solo paso)
e) Un gen de resistencia a antibióticos (para permitir la selección de clones recombinantes), etc.
Para la reacción de ligación en primer lugar se somete el vector a la acción de las mismas enzimas
de restricción, en concordancia a los sitios agregados a los productos de PCR por la acción de los
cebadores. De esta manera el vector abierto se incuba en presencia de una enzima ligasa (T4) con la
proporción adecuada de ADNc productos de la PCR.
Para la expresión del péptido amino terminal 183 de la glicoproteína de 43 kDa un fragmento de
ADNc se subclonó en los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción Sal I y HindIII dentro de un vector de expresión para transformar bacterias Escherichia coli de la cepa JM109.(Vassilatis y col. 1996)
Transformación del sistema de expresión
La transformación es el proceso mediante el cual se introduce la construcción vector + inserto
dentro del sistema de expresión elegido.
La selección de clones transformados puede realizarse de varias maneras. En el caso que se haya
empleado la bacteria E. coli como sistema de expresión, una de las formas de selección de transformantes es el cultivo de las mismas en presencia del antibiótico de selección (cuyo gen se encuentra
incluído en el vector). Aquellas colonias que sean capaces de crecer en presencia del medio más el
antibiótico son las que incorporaron exitosamente el vector durante el proceso de transformación.
Hasta el momento el sistema de expresión más utilizado por los investigadores para la expresión
de antígenos de Trichinella spp. es la bacteria E. coli. (Vassilatis y col. 1996, Nagano y col. 2003, Connolly y col 1996, Zarlenga y col 2002, Chung y col.1999, Yao y col.1997)
Detección de los clones recombinantes
Aquellas colonias transformadas pueden ser sometidas a una reacción de PCR para verificar la
presencia del inserto dentro del vector.
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Es importante realizar una secuenciación para confirmar el correcto marco de lectura de codones
y determinar que la secuencia insertada es la que se desea expresar. La secuenciación de nucleótidos
puede llevarse a cabo utilizando el método de terminación dideoxi de cadena, también denominado
método de Sanger.(Chung y col 1999)
Para la clonación molecular del antígeno tpJ15 se secuenciaron clones independientes, transformados con las construcciones correspondientes, con el objeto de verificar el ADNc insertado en el
vector. Para realizar el alineamiento de las secuencias, y para la identificación de posibles dominios
funcionales utilizando SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), se empleó el programa computacional de alineación de secuencias múltiples CLUSTAL (Kuratli y col 2001).
Multiplicación- inducción y expresión
Para la obtención de las proteínas recombinantes es preciso multiplicar la biomasa del sistema de
expresión y luego proceder a la inducción mediante el agregado de un agente inductor de la expresión de las proteínas. El proceso de inducción, debe ponerse a punto probando la concentración de
proteínas a diferentes tiempos del proceso.
La expresión de proteínas de fusión puede ser intracelular o extracelular. En caso que se exprese
dentro de la célula, es importante evaluar si lo hace en forma soluble o insoluble formando cuerpos
de inclusión. Esta información ayudará en la elección de los procesos de purificación.
Para inducir la expresión de transformantes Chung y col. en1999 adicionanron a cultivos en Luria
Broth (LB) el agente inductor isopropil-1-tio-b-D-galactopiranoside (IPTG). Las células se incubaron a 37°C durante 3 horas. El lisado de estas bacterias se separó mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) bajo condiciones reductoras.
Yao y col. (1997) obtubieron cerca de 20 mg totales de ES recombinantes de 45-50 kDa pertenecientes a T. spiralis y Trichinella T5 a partir de 250 ml de medio de cultivo.
Purificación de las proteínas recombinantes
La purificación puede realizarse con la proteína en forma nativa o desnaturalizada.
Aquellas proteínas que se encuentren en forma insoluble dentro de cuerpos de inclusión, pueden
recuperarse por solubilización con agentes caotrópicos (por ejemplo urea) y posteriormente ser renaturalizadas.
La proteínas de fusión pueden separarse por un SDS-PAGE preparativo, visualizarse por tinción
negativa y luego recuperarse por electroelución (Vassilatis y col. 1996).
Es necesario evaluar diferentes tipos de protocolos de purificación para determinar cual es el más
adecuado a las características de la proteína.
La metodología de purificación también va a depender de la proteína de fusión. La región tag presente en el vector utilizado, determina las características de la región fusionada a la proteína de interés. Si este tag codifica a una cola de histidinas, la proteína podrá purificarse al ser enfrentada a una
resina con níquel y luego eluída con imidazol, dada la afinidad del mismo por la histidina. Esta metodología se denomina cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados. Nagano y
col.(2004) expresaron ES recombinantes de T. pseudospiralis en E. coli en forma de cuerpos de inclusión, los cuales se solubilizaron completamente por tratamiento con urea 6M y luego fueron purificados por afinidad de la cola de histidina a los metales.
La técnica de clonación molecular aplicada para la obtención de proteínas de fusión mejorará la
disponibilidad de antígenos ES destinados al desarrollo de técnicas de diagnóstico serológico de Trichinellosis y a la investigación de posibles candidatos vacunales.
Los ensayos realizados hasta el presente proveen una base sólida y prometedora para continuación de las investigaciones
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