CIENCIA diagnostic gen 69 31/5/05 16:53 Página 1 CIENCIA, TECNOLOGÍA Y MEDICINA Diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar M. Pocoví Mierasa y D. Tejedor Hernándezb a Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza. Zaragoza. España. b Progenika Biopharma S.A. Vizcaya. España. L a hipercolesterolemia familiar (HF) es una hiperlipemia de herencia autosómica dominante causada por defectos en el receptor celular de superficie de membrana que reconoce e internaliza a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) del plasma1. Esta alteración en la función del receptor LDL (rLDL) conduce a una acumulación de las partículas LDL en plasma. La concentración elevada de colesterol LDL (cLDL) en sangre favorece los depósitos patológicos de colesterol en diversos tejidos, que se manifiestan clínicamente por la presencia de xantomas tendinosos, arco corneal y enfermedad vascular aterosclerótica generalizada, muy especialmente en las arterias coronarias, por lo que la HF suele presentarse clínicamente con enfermedad coronaria prematura2. Figura 1 Estructura del gen del rLDL. EGF: factor de crecimiento endotelial. EL GEN DEL rLDL El gen del rLDL está localizado en el brazo corto del cromosoma 19 (región p13.1-p13.3) y consta de 18 exones y 17 intrones (fig. 1). Las mutaciones del gen del rLDL pueden producir defectos en la transcripción, en los procesos postranscripción, en la traducción y en los procesos postraducción del rLDL. Las mutaciones del gen del rLDL que cursan con HF se dividen en 5 clases en función del comportamiento fenotípico de la proteína mutante (fig. 2). Mutaciones de clase 1 (alelos nulos) El defecto consiste en que no se produce ninguna proteína inmunoprecipitable. Se pueden producir alelos nulos por deleciones que eliminan el promotor del rLDL, de modo que no se sintetiza ARN mensajero (ARNm). También se originan por mutaciones que afectan al ajuste o por grandes deleciones que producen un ARNm de tamaño anormal. Algunas mutaciones que originan un codón de parada o un cambio en la pauta de lectura producen un ARNm anormal y se encuentra a una concentración reducida. Esta clase de mutaciones son consideradas las más graves. Mutaciones de clase 2 (alelos defectuosos para el transporte) Estos alelos codifican proteínas que no adoptan su estructura tridimensional adecuadamente una vez sintetizadas y quedan bloqueadas, completa o parcialmente (2A y 2B, respectivamente), en el proceso de transporte entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. Estos alelos tienen mutaciones con cambio de aminoácido o pequeñas deleciones que mantienen la pauta de lectura que impiden parcial o completamente el plegamiento del receptor. Aproximadamente 2 tercios de las mutaciones de clase 2 se localizan en los exones que codifican el dominio de unión al ligando, y la La investigación presentada en este artículo ha sido parcialmente financiada por el Fondo de Investigaciones Sanitarias (RT/C03-01 y RT/G03-181), el Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF 2001-2466-C05), Lácer S.A. y Fundación Hipercolesterolemia Familiar, y ha contado con el apoyo tecnológico de Progenika Biopharma, S.A. (151) Figura 2 Clases de mutaciones del rLDL. mayoría de las restantes están en el dominio homólogo al precursor del factor de crecimiento endotelial (EGF). Mutaciones de clase 3 (alelos defectuosos para la unión) Codifican proteínas que son sintetizadas y transportadas a la superficie celular de forma normal, pero carecen de la capacidad de unir a las partículas LDL. Es un grupo heterogéneo, ya que la actividad de unión de LDL varía desde el 2 al 30% de la normal. La mayoría de las mutaciones de esta clase consisten en reordenamientos que mantienen la pauta de lectura en las repeticiones ricas en cisteína del dominio de unión al ligando. También la deleción de las repeticiones del dominio homólogo al precursor del EGF da lugar a esta clase de alelos. Mutaciones de clase 4 (alelos defectuosos para la internalización) Codifican proteínas que se transportan a la superficie celular y normalmente unen LDL, pero son incapaces de agruparse en veJANO 10-16 JUNIO 2005. VOL. LXIX N.º 1.569 41 CIENCIA diagnostic gen 69 31/5/05 16:53 Página 2 Diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar M. Pocoví Mieras y D. Tejedor Hernández CIENCIA, TECNOLOGÍA Y MEDICINA TABLA I Puntos de corte utilizados en el diagnóstico de hipercolesterolemia familiar (HF) en el programa MEDPED estadounidense para colesterol total y colesterol LDL (entre paréntesis), expresados en mg/dla Grado de parentesco con el familiar HF General “100%” Edad Primer Segundo Tercer Población Probabilidad < 20 20-29 30-39 ≥ 40 220 (155) 240 (170) 270 (190) 290 (205) 230 (165) 250 (180) 280 (200) 300 (215) 240 (170) 260 (185) 290 (210) 310 (225) 270 (200) 290 (220) 340 (240) 360 (260) (240) (260) (280) (300) Esperado para diagnóstico de HF con una especificidad del 98%. Primer grado: padres, hijos y hermanos. Segundo grado: tíos, abuelos y nietos. Tercer grado: primos hermanos. a Para pasar a mmol/l, dividir los valores por 38,7. DIAGNÓSTICO CLÍNICO TABLA II Diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar (HF) (MEDPED holandés) Historia familiar I Familiar en primer grado con antecedentes de enfermedad coronaria o vascular prematura II Familiar en primer grado con cLDL > percentil 95 I Familiar en primer grado con xantomas y/o arco corneal II Niños menores de 18 años con cLDL > percentil 95 1 2 2 2 Historia personal I Evidencia de enfermedad coronaria prematura II Evidencia de enfermedad vascular cerebral o periférica prematura 1 Examen físico I Xantomas II Arco corneal < 45 años 6 4 Analítica I cLDL > 330 mg/dl (> 8,5 mmol/l) II cLDL 250-329 mg/dl (6,5-8,4 mmol/l) III cLDL 190-249 mg/dl (5,0-6,4 mmol/l) IVc LDL 150-189 mg/dl (4,0-4,9 mmol/l) 8 5 3 1 Diagnóstico clínico de HF Seguro Probable Posible 2 ≥ 8 puntos 5-7 puntos 3-4 puntos cLDL: colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad. sículas recubiertas de clatrina y, por tanto, no internalizan las LDL unidas. Mutaciones de clase 5 (alelos defectuosos para el reciclado) Estos alelos codifican receptores que unen e internalizan el ligando en vesículas recubiertas de clatrina, pero no liberan el ligando en el endosoma y, por lo tanto, no se reciclan a la superficie celular. Los defectos que originan esta clase de alelos suelen ser mutaciones en el dominio homólogo al precursor del EGF. DIVERSIDAD DE MUTACIONES EN EL GEN DEL rLDL Se han descrito más de 900 mutaciones diferentes en el gen del rLDL, pero su número aumenta rápidamente y se calcula que pueden existir más de 1.000 mutaciones diferentes en población caucasiana. Dentro de una población aislada geográfica o culturalmente, o cuando una gran proporción de individuos están relacionados porque descienden de antecesores comunes a causa de la migración, puede haber una o pocas mutaciones que causen HF en muchos de los pacientes. Esto sucede en los canadienses franceses, libaneses cristianos, drusos, finlandeses, sudafricanos y judíos asquenazí de origen lituano. Sin embargo, en la mayoría de los países donde las poblaciones son genéticamente más heterogéneas, como ocurre en España, existe un amplio número de mutaciones entre los pacientes con HF, y éstas se encuentran distribuidas a lo largo de todo el gen del rLDL. 42 JANO 10-16 JUNIO 2005. VOL. LXIX N.º 1.569 Los criterios clínicos utilizados para identificar pacientes con HF incluyen: concentraciones altas de cLDL, historia familiar de hipercolesterolemia (en especial en niños), depósitos en tejidos extravasculares de colesterol tales como xantomas y arco corneal, e historia personal y familiar de enfermedad coronaria prematura. Los pacientes hipercolesterolémicos familiares heterocigotos tienen una concentración de cLDL de aproximadamente el doble que los individuos normales de la población, con un rango de cLDL desde 190 a 400 mg/dl (4,9 a 10,3 mmol/l). Los triglicéridos plasmáticos se encuentran por regla general en el rango de normalidad. Sin embargo, algunos pacientes pueden tener los triglicéridos elevados como consecuencia de interacción con otros genes (p. ej., genotipo apo E: E2/2) o con factores ambientales (p. ej., alcohol, sobrepeso y diabetes mellitus). Los xantomas tendinosos son patognomónicos de la HF, pero su identificación no es fácil. Recientemente se ha publicado que el 29% de los pacientes diagnosticados genéticamente de HF por ecografía presentan xantomas en el tendón de Aquiles. Probablemente la variabilidad de la frecuencia de xantomas en la HF publicada en diferentes estudios depende en parte del criterio clínico utilizado en la selección de la HF (algunos estudios incluyen la presencia de xantomas en los criterios de diagnóstico) y de los métodos utilizados para la identificación de xantomas. No hay ningún criterio clínico predictor para el diagnóstico de HF y, por tanto, deben utilizarse criterios arbitrarios. El programa MEDPED (Make Early Diagnosis-Prevent Early Deaths in MEDical PEDigrees) de Estados Unidos utiliza un criterio de diagnóstico centrado fundamentalmente en las cifras de cLDL del individuo y la historia familiar de hipercolesterolemia con evidencia de transmisión dominante. La presencia de niños con hipercolesterolemia aumenta la probabilidad de diagnóstico. Utilizando el criterio de diagnóstico propuesto por el MEDPED estadounidense, la sensibilidad es del 91%, y la especificidad, del 98% (tabla I). Otro criterio de diagnóstico clínico de HF es el sistema de puntuación que utiliza el grupo MEDPED holandés. Este criterio tiene en cuenta los datos personales y familiares de cLDL, la historia de enfermedad cardiovascular, la presencia de arco corneal antes de los 45 años y los xantomas. Al registrar estas características clínicas, se ha diseñado en los Países Bajos una tabla de puntuación (tabla II). Estos criterios tienen la ventaja de ser fáciles de utilizar en la práctica clínica para el diagnóstico de HF. Sin embargo, tienen el inconveniente de que no efectúan un diagnóstico inequívoco. DIAGNÓSTICO GENÉTICO Los métodos de diagnóstico basados en el análisis del ácido desoxirribonucleico (ADN) del gen del rLDL por técnicas de biología molecular son criterios basados en negativo/positivo y, por lo tanto, altamente específicos. Son los métodos recomendados por la Or(152) CIENCIA diagnostic gen 69 31/5/05 16:53 Página 3 CIENCIA, TECNOLOGÍA Y MEDICINA Diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar M. Pocoví Mieras y D. Tejedor Hernández ganización Mundial de la Salud (OMS) en el programa MEDPED. Sin embargo, en poblaciones donde existe un gran número de mutaciones en el gen del rLDL causantes de HF y éstas se encuentran distribuidas a lo largo de todo el gen, el diagnóstico genético resulta complejo y laborioso. El panel de expertos International Panel of Management of Familial Hipercolesterolemia recomienda proceder al diagnóstico genético en los casos siguientes3: 1. Poblaciones donde sólo unas pocas mutaciones del rLDL son responsables de la mayoría de casos de HF. 2. Poblaciones donde se conocen la mayoría de mutaciones causantes de HF y se dispone de herramientas genéticas diagnósticas rápidas. 3. Personas en las que el diagnóstico clínico no es concluyente y proceden de familias con mutación conocida. Como ya hemos comentado, España es un país en el que, a pesar de que existe un gran número y heterogeneidad de mutaciones del rLDL, se conocen la mayoría de ellas y se dispone de una plataforma de diagnóstico rápida basada en un DNA-array, por lo que el diagnóstico genético es el recomendable. Para ello es conveniente conocer previamente si el caso índice o probando cumple con los criterios clínicos del MEDPED holandés de “seguro” o “probable” y, en caso afirmativo, realizar el diagnóstico definitivo con un DNA-array o con otro procedimiento de diagnóstico genético si no se dispone de este tipo de herramienta. EL PROYECTO GENOMA HUMANO, EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR Y LOS DNA-ARRAYS En el año 2001, el Consorcio para el Proyecto Genoma Humano y la empresa privada Celera presentaron el primer borrador completo del genoma humano. Este primer borrador permitió estimar que el genoma humano contiene aproximadamente 30.000 genes y que las diferencias interindividuales se limitan a un 0,1% de los 3.000 millones de nucleótidos que constituyen el material genético humano. En la mayoría de los casos estas variaciones, conocidas como mutaciones o polimorfimos (en función de la frecuencia de aparición de la variante rara), se corresponden con un solo nucleótido y, por tanto, reciben el nombre de SNP (single nucleotide polymorphisms). La alteración directa de la funcionalidad de determinados genes como causa de enfermedad o la asociación con los genes responsables de la misma hacen necesaria la búsqueda de los polimorfismos relevantes desde un punto de vista clínico. En este objetivo se centran numerosos proyectos públicos y privados, como, por ejemplo, The HapMap Project. En paralelo al avance de esta búsqueda, las nuevas herramientas del diagnóstico molecular deben permitir la aplicación clínica de estos conocimientos a la medicina diaria. En el año 1953, la revista Nature publicó el descubrimiento de Watson y Crick acerca de la estructura molecular del ADN. Se trata de una doble hélice compuesta por 2 cadenas alargadas, o filamentos, totalmente complementarias. La capacidad de las cadenas de ADN para unirse de forma específica a otras cadenas totalmente complementarias fue descrita en 1975 por Southern. La miniaturización en portas de vidrio de este principio básico de la biología molecular es el origen de los DNA-arrays, microarrays o biochips (fig. 3). El perfeccionamiento paulatino de esta metodología la sitúa en un puesto privilegiado para confirmar la aplicación práctica de los conocimientos adquiridos al descifrar la secuencia del genoma humano. (153) Figura 3 Imagen de los DNA-arrays sobre los que se han depositado las cadenas de ADN. LA PLATAFORMA LIPOCHIP Y EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LA HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR EN ESPAÑA El análisis mutacional de las muestras de ADN de pacientes con sospecha clínica de HF constató la presencia de 180 mutaciones en el gen del rLDL y 1 mutación en el gen de la apolipoproteína B (apo B)4. La extensión de esta búsqueda en la población hipercolesterolémica española, cifrada en unos 80.000 individuos, requiere el desarrollo de un sistema de diagnóstico rápido y eficaz para la detección de estas mutaciones. De esta forma surge la plataforma Lipochip, que consta de 3 partes: 1. DNA-array5. Se trata de una superficie de cristal en la que están depositadas un gran número de cadenas de ADN entre las que se pueden distinguir las complementarias al alelo normal y las que lo son al alelo mutado de cada una de las 181 mutaciones. Estas secuencias se van a unir al ADN del paciente de una forma diferencial en función de la presencia o no del alelo mutante, en un proceso que recibe el nombre de hibridación. Al iluminar el DNA-array con un rayo láser se puede identificar a qué secuencias se ha unido la muestra problema, ya que el ADN del paciente se ha marcado, previamente a la hibridación, con una molécula fluorescente (fig. 4). 2. Detección de grandes reordenamientos. El 14% de las mutaciones del rLDL causantes de HF se corresponden con la deleción o duplicación de una amplia zona del gen y no con cambios que incluyen a un solo nucleótido. Por tanto, el análisis de la presencia de este tipo de mutaciones es necesario en los pacientes que resultan negativos en el DNA-array. 3. Secuenciación de muestras negativas. La lectura completa de los nucleótidos del gen del rLDL susceptibles de experimentar un cambio con consecuencias fenotípicas permite completar el DNAarray con nuevas mutaciones que hasta el momento no contempla la herramienta. Al completarse el DNA-array, la necesidad de recurrir a la secuenciación, una metodología lenta en comparación con el DNA-array, es cada vez menor. ESTADO ACTUAL DE LA PLATAFORMA LIPOCHIP En la actualidad, la plataforma recibe muestras de sangre de pacientes con sospecha clínica de padecer HF. En un plazo de aproximadamente 15 días el facultativo que ha solicitado la prueba recibe el dictamen genético. Si hay que proceder a la secuenciación de la muestra de ADN, los resultados se pueden demorar 2 meses. JANO 10-16 JUNIO 2005. VOL. LXIX N.º 1.569 43 CIENCIA diagnostic gen 69 31/5/05 16:53 Página 4 CIENCIA, TECNOLOGÍA Y MEDICINA Figura 4 Imagen del DNA-array al iluminar con láser. Se pueden observar los puntos donde se representan cada una de las secuencias de ADN que se quieren analizar. La señal indica la intensidad de la hibridación. La tasa de detección de una mutación en el gen del rLDL se encuentra en torno al 75% en el caso de los individuos con una sospecha clínica de “seguridad o certeza” según los criterios clínicos del MEDPED holandés2. A pesar de la elevada sospecha clínica, como se ha comentado antes, el diagnóstico genético está indicado en estos pacientes, puesto que: a) Sólo el diagnóstico genético asegura una certeza del 100% en el diagnóstico3. b) Los pacientes con un diagnóstico genético positivo muestran una mayor adherencia al tratamiento6. c) El tipo de mutación que presenta el paciente podría implicar un mayor o menor riesgo de enfermedad cardiovascular a igualdad de niveles de cLDL5. Los dictámenes genéticos positivos en pacientes con una sintomatología clínica consistente con un diagnóstico clínico “probable o posible” (MEDPED holandés) se elevan al 40%. Por tanto, el diagnóstico clínico presenta un 40% de falsos negativos entre estos pacientes que reciben un diagnóstico definitivo proveniente del diagnóstico genético. 䊏 Bibliografía 1. Goldstein JL, Hobbs HH, Brown MS. Familial hypercholesterolemia. En: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors. The metabolic and molecular basis of inherited disease. Vol. II, cap. 120. New York: McGraw-Hill; 2001. p. 2863-913. 2. WHO. Human Genetics Program. Familial Hypercholesterolaemia, a global perspective. Ginebra: WHO; 1999. 3. International Panel of Management of Familial Hypercholesterolemia. Guidelines for the management of heterozygous familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis. 2004;173:55-68. 4. Mozas P, Castillo S, Tejedor D, Reyes G, Alonso R, Franco M, et al. Molecular characterization of familial hypercholesterolemia in Spain: identification of 39 novel and 77 recurrent mutations in LDLR. Hum Mutat. 2004;24:187. 5. Tejedor D, Castillo S, Mozas P, Jiménez E, López M, Tejedor MT, et al. A reliable low density DNA-array based on allele-specific probes for detection of 118 mutations causing familial hypercholesterolemia. Clin Chem. En prensa. 6. Umans-Eckenhausen MAW, Defesche JC, Van Dam MJ, Kastelein JJ. Longterm compliance with lipid-lowering medication after genetic screening for familial hypercholesterolemia. Arch Intern Med. 2003;163:65-8. 44 JANO 10-16 JUNIO 2005. VOL. LXIX N.º 1.569