Manual de Procedimientos 2008

Manual de Procedimientos
Sensibilidad a los antimicrobianos
en Salmonella, Shigella y E. coli
2008
AUTORES
Bioq. Fernando Pasterán
Bioq. Marcelo Galas
Dto. Bacteriología
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”
Centro Regional de Referencia WHO-Global Salm Surv para
América del Sur.
Sensibilidad a los antimicrobianos
Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a infecciones cuando
su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificación. La determinación de la sensibilidad
está indicada en los casos en que el microorganismo causal de la infección pertenezca a una especie
2
capaz de exhibir resistencia a los antibióticos de uso clínico. Los mecanismos de resistencia a los
agentes antimicrobianos incluyen: producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de
acción y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas. Para los microorganismos que posean
sensibilidad antibiótica predecible se recomienda la aplicación de la terapia empírica adecuada. Las
pruebas de sensibilidad también son importantes en estudios de epidemiología de la resistencia y de
nuevos agentes antimicrobianos. Para realizar pruebas de sensibilidad e identificación se debe partir
de un cultivo primario en medio sólido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de
microorganismo que pueda tener rol patógeno. No se deben realizar pruebas de sensibilidad sobre
mezclas de diferentes tipos de microorganismos, ni sobre el material clínico sin procesar, excepto
para emergencias clínicas donde la coloración de Gram sugiera la presencia de un sólo patógeno.
Cuando la prueba de sensibilidad haya sido realizada a partir del material clínico, se debe informar
como resultado preliminar y se debe repetir utilizando la metodología estandarizada. No es
aconsejable la realización de pruebas de sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infección
y la muestra contiene flora normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados
probablemente tengan poca relación con el proceso infeccioso. En estos casos los resultados
obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento.
1. Difusión por discos
INTRODUCCION
La metodología empleada en la actualidad para la determinación de la sensibilidad a los
antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales que, desde hace más de
tres décadas, están enfocados a estandarizar la técnica.
Un comité de expertos de la OMS y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y
Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los países europeos.
Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretación de estas
pruebas continúa siendo un tema de discusión a nivel internacional. Europa está dividida en varias
regiones de influencia con diferentes recomendaciones para la determinación de sensibilidad
antimicrobiana: Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los países
bajos, la Sociedad Británica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiología y el Comité
de Estandarización de Laboratorios Clínicos (ex NCCLS, hoy denominado CLSI).
En la mayoría de los países de Latinoamérica se siguen las pautas del CLSI, en algunos casos, con
pocas modificaciones.
El siguiente es un resumen de la metodología referida habitualmente como "Método de la OMS", que
no difiere substancialmente del conocido "Kirby-Bauer". El documento que se ha tomado como base
es el M2 – A9 del Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, del año 2006 y las Tablas de
interpretación corresponden al suplemento M100 – S17 del año 2007.
El método recomendado por el Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing del CLSI se basa
en los estudios de Bauer y colaboradores (1). Esta metodología está descrita detalladamente y
cuenta con Tablas de interpretación que están respaldadas por una gran cantidad de datos clínicos y
de laboratorio. La modificación de doble capa de Barry, García y Thrupp (2) es un método alternativo
que demostró datos comparables de los diámetros de las zonas de inhibición, con precisión similar al
del CLSI y con una correlación satisfactoria con la CIM. Este método es una alternativa aceptable
para la estandarización del inóculo en las pruebas de sensibilidad de bacterias de rápido crecimiento,
como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa. El método de doble capa en agar no es aplicable a
las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos de microorganismos con requerimientos
nutricionales especiales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc.
Las Tablas para la interpretación de los diámetros de inhibición recomendadas por el CLSI (M100S17) se pueden utilizar para cualquiera de las dos metodologías descritas.
La difusión con discos es una metodología muy sencilla pero requiere un estricto control de calidad
interno de cada uno de los pasos y los insumos que intervienen en su realización. El control de
calidad interno de las pruebas de sensibilidad por difusión es un requisito indispensable para validar
los resultados de los aislamientos clínicos. En muchos casos, variaciones pequeñas en la calidad de
los reactivos o en algunos detalles metodológicos, se traducen en resultados totalmente distintos a
los reales. El American Type Culture Collection (ATCC, USA) dispone de todas las cepas patrones
necesarias para llevar a cabo este proceso.
Indicaciones para la realizacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
3
Las pruebas de sensibilidad contribuyen a orientar el tratamiento antimicrobiano de los procesos
infecciosos. No es necesario realizar pruebas de sensibilidad en aquellos casos en los que la
identificación del microorganismo es suficiente para predecir la sensibilidad a los antimicrobianos (por
ejemplo S. pyogenes vs penicilina).
Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando, a pesar de conocerse la sensibilidad del
germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicación.
El antibiograma también puede ser indicado con fines epidemiológicos y en el estudio de nuevos
antibióticos.
Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. No se debería realizar el
antibiograma en forma directa a partir del material clínico, excepto en las emergencias clínicas donde
la coloración directa de Gram sugiere cultivo monobacteriano. En este caso, debe repetirse luego
usando la metodología estandarizada.
En el caso particular de Salmonella sp., Shigella spp y Escherichia coli aisladas de materia fecal se
ha descrito resistencia a todos los antibióticos útiles para su tratamiento. Este hecho determina la
necesidad de realizar pruebas de sensibilidad en todos los casos. Estos patogenos producen
fundamentalmente diarreas pero su capacidad invasiva le confiere la posibilidad de hacer infecciones
sistémicas. El tratamiento antimicrobiano en cada una de estas situaciones clínicas es muy distinto y
por lo tanto también lo es la elección de los antibióticos a ensayar en el antibiograma.
Principios del método
El principio del método involucra la aplicación de una cantidad determinada de antimicrobiano en un
reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino, etc.) en la superficie del agar
sobre la cual se ha distribuido un inóculo del microorganismo en cuestión; se formará así, por
difusión, un gradiente de concentración de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad
del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano.
El diámetro obtenido dependerá no sólo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco,
sino también del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composición, de la capacidad de
difusión de la droga en ese medio, de la temperatura y atmósfera de incubación, de la velocidad de
duplicación bacteriana, del tamaño del inóculo y la fase de crecimiento de la bacteria, etc. Todas
estas son las variables más importantes que afectan el resultado del antibiograma.
Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusión del antibiótico que contiene comienza
instantáneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de concentraciones alrededor del
reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a las 6 hs. El tamaño de la zona de inhibición
dependerá del equilibrio entre la difusión del antibiótico y la velocidad de crecimiento del
microorganismo. Las recomendaciones del CLSI son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de
inoculada la placa y proceder a la incubación de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la
colocación de los discos. Cualquier variación en estos tiempos ocasionará un desplazamiento del
equilibrio antes mencionado que se traduce en errores en el tamaño de la zona de inhibición. Como la
difusión del disco comienza instantáneamente después de apoyado sobre el agar, estos nunca deben
levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque seguramente ya no tendrán la carga
de antibiótico original.
Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados cuidadosamente
y las Tablas de interpretación tendrán validez únicamente cuando la metodología utilizada en el
laboratorio sea estrictamente comparable con la aplicada en la elaboración de dichas Tablas.
Fundamentos para la interpretacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por
el metodo de difusion
Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones críticas" o "puntos de corte" que permiten
separar a los microorganismos en tres categorías, sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia.
Estas categorías se establecen para cada bacteria frente a cada antibiótico comparando la CIM en
cada caso con los puntos de corte establecidos.
*Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibiótico cuando se puede esperar que
una infección causada por el mismo responda al tratamiento con dicho fármaco a la dosis
recomendada.
*Resistente: este término indica que no es probable que la infección causada por el microorganismo
responda al antibiótico en cuestión, cualesquiera que sean la dosis y la localización de la infección.
4
*La categoría sensibilidad intermedia se aplica a dos situaciones. Por un lado, se incluyen en ella las
cepas con sensibilidad disminuida a un antibiótico que puede utilizarse con éxito, para el tratamiento
en dosis más altas, por ser poco tóxico o porque se concentra en el foco de infección (por ejemplo,
antibióticos ß-lactámicos o quinolonas en la orina).
En esta categoría se incluyen asimismo las cepas de "sensibilidad intermedia" a antibióticos que, por
ser más tóxicos, no puede usarse en dosis más altas. En este caso, la categoría intermedia sirve
como una zona de transición entre las cepas sensibles y las resistentes y previene pequeños errores
causados por factores técnicos. Muchas veces un resultado intermedio requiere la definición de la
sensibilidad mediante el uso de un método cuantitativo como la CIM.
La decisión definitiva sobre el uso de un determinado antibiótico y sobre la dosificación del mismo no
sólo depende de los resultados de las pruebas de sensibilidad sino también de la interpretación de
las mismas por el equipo de salud. También habrá que tener en cuenta otros factores como el rol
patogénico del microorganismo, los efectos secundarios y las propiedades farmacocinéticas del
medicamento, su penetración a los diferentes sitios de infección y el estado inmunitario del huésped,
etc.
Seleccion de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad
La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de difusión, es una decisión
de cada laboratorio clínico en consulta con el cuerpo médico, el comité de farmacia y el comité de
enfermedades infecciosas.
Para la selección de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se deben tener en
cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clínica, prevalencia de resistencia, costo, indicaciones
del FDA, recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos.
Se pueden obtener resultados incorrectos (sensibilidad in vitro, falla terapéutica in vivo) cuando se
ensayan determinados agentes antimicrobianos con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de
estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de 1ra. y 2da. generación y aminoglucósidos frente a
Salmonella spp. y Shigella spp. Por ello se resume las drogas con actividad frente a Salmonella y
Shigella spp.:
• Aminopenicilinas (Ampicilina)
• Trimetoprima/sulfametoxazol
• Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)
• Fosfomicina
• Tetraciclinas (Tetraciclina)
• Cloranfenicol (sólo para aislamientos de infección sistémica de Salmonella)
• Nitrofuranos (solo para aislamientos de Shigella)
• Cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima/ceftriaxona solo para aislamientos de
infección sistémica)
Otras drogas inapropiadas para tratamiento de diarreas pueden ser probadas para proveer datos
taxonómicos o información epidemiológica (como es el caso de la gentamicina). Sin embargo, tales
resultados deberán estar disponibles sólo para el laboratorio o para el comité de control de
infecciones. El ensayo de algunas drogas es muy útil como indicador de la presencia de mecanismos
de resistencia de difícil detección. Son ejemplos de estos casos: ácido nalidixico para detectar
sensibilidad disminuida a las fluorquinolonas y ceftacidima o el disco de amoxicilina/ ac. clavulánico a
30 mm del disco de una cefalosporina de tercera generación o disco de cefpodoxima como
detectores de ß-lactamasas de espectro extendido (Famiglietti A, et al. Consensus for antimicrobial
susceptibility testing for Enterobacteriaceae. Subcommittee on Antimicrobials, SADEBAC (Argentinian
Society of Clinical Bacteriology), Argentinian Association of Microbiology. Rev Argent Microbiol. 2005
Jan-Mar;37(1):57-66.). Una ventaja adicional del disco de cefpodoxima es su alta sensibilidad para
detectar cepas de Salmonella y/o Shigella productoras de ampC plasmidicos (Rapoport etr al, CMY-2
type ß-lactamase finally emerging in Argentina, aceptado para publicacion en Int. J. Antimicrob.
Agents)
Para la realización de una adecuada prueba de sensibilidad, el número de agentes probados debe
ser limitado. En general, deberá incluir sólo un representante de cada grupo de drogas relacionadas
que tengan muy similar actividad y para las cuales la interpretación podría ser la misma.
5
MATERIALES
Equipos
•
•
•
•
•
Ansas para inocular tipo loop (1-10 µl)
Pinzas
Mechero tipo Bunsen
Regla o calibre
Pipetas Pasteur plásticas descartables
Soluciones, reactivos y medios de cultivo
•
•
•
•
•
Solución fisiológica estéril, 3 ml en tubos
Caldo apropiado (tripteina soja (soya) u otro) esteril ,4 ó 5 ml en tubos
Placas con agar Mueller Hinton (profundidad del agar de 4 mm )
Discos de antibióticos
Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
6
Preparación del Agar Mueller Hinton
Comentarios teóricos
(1) Prepar el agar M. Hinton a partir de la base
deshidratada de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante.
De los medios disponibles se considera al agar MHinton como el mejor para las pruebas de
sensibilidad de rutina dado que:
• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en
las pruebas de sensibilidad.
• Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría
de las bacterias patógenas.
• Existen suficientes datos recopilados que
avalan la experiencia de las pruebas de
sensibilidad realizadas en este medio.
(2) Inmediatamente después de esterilizar dejar
enfriar en baño de agua hasta 45-50ºC.
Aunque el agar M. Hinton es generalmente
confiable para las pruebas de sensibilidad, los
resultados obtenidos con algunos lotes pueden, en
ocasiones, variar significativamente. Si un lote de
medio no sustenta el adecuado crecimiento de los
microorganismos probados, los halos obtenidos en
las pruebas por difusión podrían ser mayores
quedando fuera de los límites de control de
calidad, conduciendo a resultados erróneos.
(3) Dispensar el medio en las placas de Petri de
fondo plano hasta un nivel aproximado de 4 mm.
Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio para
placas de 150 mm. de diámetro y 25 a 30 ml. para
las de 100 mm. de diámetro interno.
Se ha demostrado que con volúmenes mayores o
menores de agar, la prueba pierde reproducibilidad
ya que pequeñas variaciones tienen efectos
significativos. Placas de espesores menores a los
4 mm producirán zonas de inhibición más grandes
a las esperadas pudiendo ocasionar falsa
sensibilidad al momento de interpretar los halos
obtenidos. El fenómeno opuesto se obtendrá con
espesores mayores a los 4 mm.
Controle la profundidad de entre 2 a 5 placas del
total del lote preparado. Para medir la profundidad
introduzca dentro del agar un elemento fino, estéril,
marcado en 3 y 5 mm de uno de sus extremos. El
rango de profundidad aceptado para la prueba de
difusión es de 3 a 5 mm.
Antes de colocar el medio en la placa de petri debe
asegurarse que la mesada donde está trabajando
esté perfectamente nivelada. De no ser así, el agar
en las placas quedará inclinado conduciendo a
errores por la heterogeneidad del espesor del
mismo.
(4) Las placas que no se usan en el día pueden
mantenerse en refrigerador (2-8 ºC.).
Las placas almacenadas en bolsas de plástico
tienen un período de uso de hasta 70 días.
(5) Las placas con más de 7 días de preparación
no son adecuadas para las pruebas de sensibilidad
salvo que sean envueltas en bolsas de plástico
para evitar la desecación, de lo contrario deberán
controlarse con los microorganismos de referencia
(6) Debe controlarse la esterilidad de una muestra
representativa de cada lote incubando 24 horas o
7
más a 30-35 ºC. Luego descar esas muestras.
No deberá observarse crecimiento de colonias
bacterianas o micóticas. Para verificar la esterilidad
del medio, tome una muestra equivalente al 5-10%
del total del lote producido. Ignorar cualquier
contaminación esporádica; ej. una fracción de
medio. Descartar el lote completo, si el nivel de
contaminación es significativo (>10% del medio
controlado).
pH: El agar Mueller Hinton debe tener un pH 7,2 7,4 a temperatura ambiente y debe determinarse
después de su solidificación.
El pH para cada lote debe ser controlado cuando
se prepara cada lote de medio. Si el pH está por
debajo de 7,2, ciertas drogas (por ej.
aminoglucósidos,
quinolonas
y
macrólidos)
parecerán menos activas; mientras otras (p ej.
tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el
pH es demasiado alto se observarán los efectos
opuestos. Ver Tabla 1
Si el pH está muy alejado del rango aceptable
debe controlarse el procedimiento de la
preparación del medio.
Es ideal el uso de electrodos de superficie, pero
también resulta satisfactoria la determinación del
pH del macerado de una alícuota solidificada de
agar, suficiente para que el bulbo del electrodo
quede totalmente sumergido.
El método a utilizar dependerá del tipo de equipo
disponible en cada laboratorio
Debe asegurarse que el electrodo de superficie
esté adecuadamente calibrado.
Las correcciones necesarias se deben realizar por
el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
El agregado de grandes volúmenes de estas
soluciones para correccion del pH puede alterar el
contenido de sales del medio.
Humedad: Si justo al momento de usar las placas
hay exceso de humedad en la superficie, éstas se
deben colocar a 35ºC durante 10 - 30 min hasta
que desaparezcan las gotas de humedad
superficiales.
Las placas deberán estar húmedas pero no
mostrar gotas sobre la superficie del medio ya que
distorsionarán las zonas de inhibición.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de
Timidina se debe ensayar el Enterococcus faecalis
ATCC® 29212 o ATCC® 33186 frente al disco de
trimetoprima / sulfametoxazol.
Los medios que contienen excesiva cantidad de
timina o timidina pueden revertir los efectos
inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima,
produciendo así zonas más pequeñas, menos
nítidas o sin halo lo cual puede dar como resultado
un informe de falsa resistencia.
Un medio satisfactorio mostrará un halo de
inhibición claro y definido de 20 mm o más.
En caso que se observe una zona de inhibición <
20 mm podrá procederse al agregado de timidina
fosforilasa o sangre lisada de caballo.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura
(aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo
eliminará los excesos de timidina presentes en el
medio. Este procedimiento mejorará la nitidez de
los halos y la confiabilidad de las pruebas de
sensibilidad para sulfonamidas y trimetoprima
frente a patógenos comunes.
8
Un agar Mueller Hinton con elevado contenido de
timina o timidina no podrá ser utilizado para el
ensayo de trimetoprima, sulfonamidas o la
combinación de ambas drogas pero podrá
utilizarse para ensayar la actividad de cualquier
otro antimicrobiano.
Efectos por variación en la composición de
cationes divalentes. Las pruebas de control de
cadidad interno realizadas con cada lote de agar M.
Hinton deben estar de acuerdo con los rangos de
diámetros sugeridos para las correspondientes
cepas ATCC (ver Control de Calidad). Los
resultados de las pruebas con las cepas patrones
deben ser cuidadosamente observados para
detectar cualquier valor aberrante debido a la
composición de cationes del medio de cultivo.
La variación en cationes divalentes principalmente
Ca++ y
Mg++ afectarán los resultados con
tetraciclina, colistín y aminoglucósidos sobre todo
frente a P. aeruginosa. Un excesivo contenido de
cationes reducirá la zona de inhibición, mientras
que bajas concentraciones de cationes resultarán
en zonas de inhibición mayores que las esperadas.
Un exceso de zinc podría reducir las zonas de
inhibición de los carbapenems
Los rangos aceptables son los siguientes (Método
de absorción atómica o equivalente):
Ca++ = 20 -25 mg/L; Mg++ = 10 -12.5 mg/L.
Aspecto:
Antes de su utilización, se debe controlar que los
medios de cultivo no presenten evidencia de:
- Decoloración
- Deshidratación
- Rotura del agar
- Volumen insuficiente
- Heterogeneidad del espesor de la capa de agar
- Otros signos de deterioro
Descartar los medios que presenten alguna de
estas características
Tabla1
Variación de la actividad de diferentes antimicrobianos con el cambio del pH
Se incluyen también antibióticos sin actividad frente a Salmonella y Shiegella spp.
AUMENTO DE LA ACTIVIDAD
pH ácido
pH alcalino
Amoxicilina
Amplicilina
Carbenicilina
Cloxacilina
Piperacilina
Tetraciclina
Doxiciclina
Minociclina
Nitrofurantoina
Amicacina
Netilmicina
Estreptomicina
Tobramicina
Claritromicina
Eritromicina
Ac. Nalidixico
Quinolonas Fluoradas
DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD
pH ácido
Azitromicina
Claritromicina
9
Clindamicina
Metronidazol
CAMBIOS EN LA ACTIVIDAD
CON EL AUMENTO O DISMINUCION DEL pH
Penicilina
Cefalotina
Cefalexina
Cefoperazona
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cloranfenicol
Polimixina B
Sulfonamidas
Trimetoprima
Conservación de los discos
Comentarios teóricos
Los discos deben mantenerse refrigerados a 2 8ºC (si van a ser utilizados en los siguientes 7 días)
o en congelador (freezer) a -14 ºC o menos (para
conservación a largo plazo).
Para mantener su potencia, todos los discos deben
mantenerse en congelador (freezer) especialmente
los que contienen drogas de la familia de los ßlactámicos. Sólo los discos que se estén usando
diariamente pueden permanecer en el refrigerador
Los discos deben guardarse en contenedores
herméticos con desecante y ser sacados del
refrigerador o congelador (freezer) 1 ó 2 horas
antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la
temperatura antes de ser abiertos los frascos o
contenedores
Este proceso evita la condensación que podría
ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los
frascos fríos. La mayoría de las drogas
antibacterianas son más sensibles a la exposición
a un ambiente húmedo que a temperaturas
templadas. Los antimicrobianos más afectados por
los problemas de conservación son, en general, los
ß-lactámicos y dentro de esta familia, los
carbapenemes
(meropenem
e
imipenem),
oxacilina, cefaclor, las combinaciones de ßlactámicos con inhibidores de ß-lactamasas
(amoxicilina/ac. clavulánico, ampicilina/sulbactam,
ticarcilina/ac. clavulánico, cefoperazona/sulbactam
y piperacilina/tazobactam) son los más lábiles.
Cuando el indicador del desecante usado (por ej.
gel de sílice) cambia de color debe interpretarse
como un exceso de humedad y reemplazarse.
Patrón de turbidez
Comentarios teóricos
Para estandarizar la densidad del inóculo se usa
una suspensión de sulfato de bario como estándar
Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
representa aproximadamente 108 UFC/ml para
10
de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).
bacterias de rápido crecimiento. La estandarización
de inóculo es esencial ya que el tamaño de la zona
de inhibición es muy dependiente de la densidad
del inóculo utilizado.
Preparar dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2
0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de
H2SO4, 0,18 M (0,36 N) (1% V/V). Verificar la
densidad correcta del estándar usando un
espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debe
ser 0,08 a 0,10, para el estándar 0,5 de Mc
Farland. (Ver Tabla 2)
Distribuir en 4-6 ml dentro de tubos similares a los
usados para la preparación de los inóculos de las
cepas clínicas y mantener guardados a
temperatura ambiente y al abrigo de la luz.
Inmediatamente después de su preparación, los
tubos se deben sellar herméticamente para evitar
la evaporación y concentración de la suspensión.
Agitar vigorosamente con vortex o manualmente el
estándar antes de su uso para lograr una turbidez
homogénea.
Reemplazar o verificar la confiabilidad de los
estándares
mensualmente.
Descartar
los
estándares, que presenten alguna evidencia de
evaporación. Esto pude controlarse marcando los
tubos en el momento de la preparación con una
marca a la altura del menisco. Si la evaporación es
evidente, descartar los tubos.
Recordar que los patrones de turbidez de SO4Ba
tienen una vida útil de aproximadamente un año.
Luego de transcurrido este tiempo deben ser
reemplazados por un nuevo lote.
Tabla 2 Preparación de los estándares de Mc Farland
Estándar
No
0.5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Volumen (ml)
BaCl2 (1,175 %)
H2SO4 (1 %)
0.5
99.5
1.0
99.0
2.0
98.0
3.0
97.0
4.0
96.0
5.0
95.0
6.0
94.0
7.0
93.0
8.0
92.0
9.0
91.0
10.0
90.0
Equivalente en No de
bacterias/ml (x108)
1.5
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
PROCEDIMIENTO
11
Día 1
Comentarios teóricos
a) Preparación del inoculo
A partir de 4 ó 5 colonias bien aisladas y de igual
morfología en un medio de aislamiento primario
preparar una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo
apropiado (tripteina soja (soya) u otro) tocando la
parte superior de cada colonia.
Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a
partir de una cepa aislada. Se debería evitar
realizar el antibiograma en forma directa a partir
del material clínico, excepto en las emergencias
clínicas donde la coloración directa de Gram
sugiere naturaleza monobacteriana. En este caso,
debe repetirse luego usando la metodología
estandarizada.
Para esta operación se puede utilizar ansa o
hisopo.
Incubar el tubo de cultivo a 35-37 ºC hasta que se
alcance o exceda la turbidez del estándar
equivalente al 0,5 de Mc Farland (2 - 4 h).
Alternativamente el inóculo puede ser obtenido
directamente a partir de colonias seleccionadas de
una placa de cultivo no selectivo, de no más de 18
a 24 horas de incubación. Proceder a ajustar
directamente el inoculo (paso siguiente) sin
incubación previa.
Cuando se prueban discos de trimetoprimasulfametoxazol con este método de preparación
del inoculo de colonia aislada sin incubacion previa
en medio liquido, pueden arrastrarse sustancias
antagónicas que producen un crecimiento con
aspecto de niebla dentro de la zona del halo de
inhibición.
b) Estandarización del inóculo
Ajustar la densidad de los cultivos que se
encuentran en fase logarítmica, con solución salina
o caldo, por comparación visual hasta turbidez
equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland.
Para facilitar este procedimiento, mire los tubos
contra un fondo blanco con una línea negra como
contraste.
Importante: agitar muy bien el estándar de
turbidez antes de proceder a la comparación
Utilizar para esta operación las pipetas Pasteur
descartables y transferir unas gotas a un tubo con
solución fisiológica estéril.
Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
representa aproximadamente 108 UFC/ml para
bacterias de rápido crecimiento.
La estandarización de inóculo es esencial ya que el
tamaño de la zona de inhibición depende de la
densidad del inóculo. Para la interpretación de las
pruebas de sensibilidad con las tablas
recomendadas por el CLSI se requiere un inóculo
confluente.
Nunca utilice inóculos no estandarizados para el
hisopado de las placas. Evitar extremos en la
densidad del inóculo. Los excesos o defectos en la
densidad del inóculo producen cambios muy
grandes en los resultados finales del ensayo
c) Siembra de las placas
Dentro de los 15 minutos después de ajustado el
inóculo, inocular las placas de Mueller Hinton con
un hisopo estéril.
Para evitar el sobrecrecimiento del inóculo
bacteriano no excederse de los 15 minutos
Presionar el hisopo contra las paredes del tubo a
fin de escurrir el exceso de inóculo.
Sembrar la superficie seca del Mueller Hinton por
hisopado en tres direcciones para asegurar una
Resultados reproducibles y confiables requieren
una distribución homogénea del inóculo en las
12
completa y homogénea distribución del inóculo.
placas.
Esperar de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min.
antes de aplicar los discos para que el exceso de
humedad superficial producido por la inoculación
sea completamente absorbido
d) Colocación de los discos
Colocar los discos sobre la superficie del agar con
pinza estéril aplicando una ligera presión a una
distancia no menor a 24 mm desde un centro al
otro. La distancia al borde de la placa al disco no
debe ser menor de 14 mm
Debido a que todas las drogas difunden casi
instantáneamente, un disco no debe ser removido
una vez que tomó contacto con la superficie del
agar. Si el disco es desplazado del lugar donde
tomó contacto con el agar, la carga de antibiótico
del mismo será menor que la estandarizada, por lo
que se observara una tendencia a la falsa
resistencia.
No deben colocarse más de 5 discos por placa de
90 mm o 12 en placa de 150 mm.
La colocación de los discos se realizará según
figura 1
e) Incubación de las placas
Llevar las placas a la estufa dentro de los 15
minutos posteriores a la colocación de los discos.
Estas se deben incubar invertidas, a 35oC±2 por 16
a 18 horas y en ambiente aeróbico.
Figura 1
Esquema sugerido para la colocación de los discos
CIP
NIT
TET
CTX
GEN
Placa 1
FOS
AMP
CHL
TMS
NAL
Placa 2
CIP: ciprofloxacina; NIT: nitrofurantoína; CTX: cefotaxima; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina; FOS:
fosfomicina; AMP: ampicilina; TMS: trimetoprima/sulfametoxazol; NAL: ácido nalidíxico,
CHL: cloranfenicol. Este esquema tiene en cuenta el tamaño de las zonas de inhibición usuales que
producen los distintos antibióticos frente a Salmonella y Shigella spp. y está diseñado de manera de
evitar la superposición de las zonas de inhibición producidas.
13
Día 2
f) Lectura de las placas e interpretación de
resultados
Examinar y verificar la pureza del inóculo
Comentarios teóricos
Las pruebas de sensibilidad deben ser realizadas
de cultivos puros. Si se produjera contaminación
durante la realización del ensayo puede ser
fácilmente detectado examinando la placa del
antibiograma.
Examinar y verificar que el crecimiento sea
confluente.
Las
zonas
de
inhibición
deberán
ser
uniformemente
circulares
y
el
desarrollo
confluente. La presencia de colonias aisladas
indica un inóculo bacteriano de densidad inferior al
estandarizado. Se deberá repetir la prueba. Lo
mismo si el inóculo bacteriano fuere más denso
que el recomendado.
Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y
el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición
serán uniformemente circulares
En algunas oportunidades en el antibiograma,
entre discos ubicados cercanos unos de otros
puede producirse alguna distorsión de las zonas de
inhibición (por ejemplo antagonismo, sinergia,
inducción y/o inhibición) y estas zonas de inhibición
no se presentarán por ende uniformemente
circulares. Esta valiosa información adicional no
deberá considerarse en la lectura de la zona de
inhibición pero provee importante información
adicional sobre posible identidad bacteriana,
mecanismos de resistencia, etc.
Medir los diámetros de las zonas de inhibición.
Para la lectura de los halos se deberá tener en
cuenta el área que no muestre desarrollo obvio a
ojo desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o
colonias muy pequeñas que puedan ser detectadas
sólo con mucha dificultad en el borde de la zona de
inhibición.
Cuando
se
prueban
discos
de
trimetoprima/sulfametoxazol no considerar en la
lectura un crecimiento del 20% o menos del
desarrollo total.
Los tamaños de las zonas de inhibición serán
interpretados con las Tabla 2A. Los organismos se
informarán sensibles, intermedios o resistentes al
antimicrobiano ensayado según corresponda.
Colonias mayores creciendo dentro de la zona de
inhibición deberán ser subcultivadas, identificadas
nuevamente y reevaluadas en cuanto a su
sensibilidad a los antimicrobianos.
Este fenómeno ocurre por que pueden arrastrarse
sustancias antagónicas de la actividad de esta
combinación de drogas que determinan un
crecimiento con aspecto de niebla dentro de la
zona de inhibición real.
Las interpretaciones de los diámetros de las zonas
de inhibición son provistas por CLSI. Estas tablas
de interpretación fueron obtenidas utilizando un
inóculo estandarizado que da como resultado un
crecimiento confluente. Los puntos de corte para la
interpretación de cada droga se deducen del
análisis de regresión lineal resultante de múltiples
determinaciones de un amplio número de
aislamientos mediante el método de referencia
(CIM) y la difusión por discos.
El documento del CLSI M100-S17 no incluye
puntos de corte para enterobacterias frente a
fosfomicina. En este caso los puntos de corte se
pueden obtener de otras normas (por ej. Sociedad
Francesa de Microbiología). Del mismo modo, el
uso de pruebas de tamizaje para la presencia de
BLEE surge de la epidemiologia de Argentina con
14
reportes de presencia de estas enzimas en estos
patogenos (Andres P. et al. Int J Antimicrob
Agents. 2005 Jun;25(6):501-7. Extended-spectrum
ß-lactamases in Shigella flexneri from Argentina:
first report of TOHO-1 outside Japan)
g) Informe de los resultados
Utilizar la planilla para el registro de los resultados
CONTROL DE CALIDAD
Propósito
El objetivo de un programa de control de calidad interno es el monitoreo de:
•
La exactitud y precisión de los procedimientos para realizar las pruebas de sensibilidad.
•
La calidad de los reactivos usados en las pruebas.
•
El desempeño de las personas que llevan a cabo los ensayos y la lectura de los resultados.
Estos objetivos son alcanzados principalmente por la utilización de cepas de referencia
seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad en los métodos a ser controlados.
Cepas Control
Para controlar la precisión y la exactitud de las pruebas de difusión, se deben obtener de una fuente
confiable las siguientes cepas patrones para control de calidad:
• E. coli ATCC® 25922
• P. aeruginosa ATCC® 27853
• S. aureus ATCC® 25923
• E. faecalis ATCC® 29212
• E. coli ATCC® 35218
• K. pneumoniae ATCC® 700603
E. coli ATCC® 35218 productor de ß-lactamasa se recomienda solamente para el control de calidad
de los discos que contengan la combinación "ß-lactámico/Inhibidor de ß-lactamasa", entre estos
inhibidores se encuentran: ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.
Cuando se prueben rutinariamente sulfonamidas, trimetoprima ó trimetoprima-sulfametoxazol, debe
controlarse, para cada lote nuevo de Mueller Hinton, los niveles de timina ó timidina. Para ello debe
utilizarse E. faecalis ATCC® 29212 ó 33186.
Las siguiente Tabla muestran algunas de las cepas utilizadas más comúnmente en el control de
calidad interno, los factores a evaluar y algunas de sus características.
Tabla 3. Microorganismos sugeridos para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos
Cepa
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
- Factores a evaluar: Propiedades
- Concentración de cationes: Aumento de resistencia a
aminoglucósidos cuando aumenta la concentración de calcio y
magnesio.
15
- pH: Aumento de resistencia a aminoglucósidos cuando el pH del
medio disminuye.
• No subcultivar, se seleccionan mutantes resistentes a las
penicilinas activas frente a Pseudomonas spp
• Frente a un doble halo alrededor del disco de imipenem,
cambiar el lote de Mueller Hinton.
Escherichia coli
ATCC 25922
- Calidad de la prueba de sensibilidad
Escherichia coli
ATCC 35218
- Mide la carga de inhibidores de ß-lactamasas de los discos para
antibiograma. Probar sólo frente a combinaciones de antibióticos
ß-lactámicos e inhibidores de ß-lactamasas como
ampicilina/sulbactama, amoxicilina/ácido clavulánico, ticarcilina/
ácido clavulánico, etc.
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
- Calidad de la prueba de sensibilidad
- Concentración de timidina: Este compuesto interfiere con la
actividad de trimetoprima y de sulfametoxazol.
Las cepas patrones para el control de calidad se deben probar y mantener de la siguiente
manera:
• Las cepas de control de calidad se deben probar por la técnica estandarizada de difusión en agar
descrita anteriormente. Los antibióticos a ensayar deben ser los mismos que se utilizan para los
aislamientos clínicos.
• Las cepas de control de calidad de trabajo se deben conservar a 4 - 8ºC en agar tripticasa de soja
(soya) (no exigentes o fastidiosas) y se deben subcultivar semanalmente. Si las quiere almacenar por
tiempo prolongado, puede hacerlo de la siguiente manera: mantenga los cultivos a -20 ºC ó menos (p
ej.: Nitrógeno líquido) en medios adecuados (p ej.: 10-15 % de glicerol en caldo Tripticasa - Soja
(Soya), caldo al 50 % de Suero fetal bovino, en sangre de oveja defibrinada ó en leche descremada)
o en estado liofilizado minimizando de esta manera el riesgo de alterar su sensibilidad a los
antibióticos.
• Los cultivos de trabajo deben ser reemplazados por lo menos una vez al mes a partir de cultivos
congelados, liofilizados o comerciales.
• Antes de su utilización, las cepas patrones se deben sembrar sobre una placa de agar con el fin de
obtener colonias aisladas.
• Los inóculos para realizar los ensayos de sensibilidad con las cepas de referencia se deben
preparar siguiendo las mismas indicaciones que se utilizan para los aislamientos clínicos ya sea
permitiendo que el cultivo alcance fase logarítmica o bien resuspender colonias provenientes de una
placa de 18-24 h de incubación.
• Las cepas de control de calidad pueden ser utilizadas para ensayar la precisión y la exactitud de las
pruebas de sensibilidad hasta tanto no presenten un cambio significativo en los diámetros de las
zonas de inhibición que no puedan ser atribuidos a fallas metodológicas o de calidad de los reactivos.
Si aparecen resultados inexplicables que sugieran un cambio en la sensibilidad propia del
microorganismo, se debe obtener un nuevo cultivo a partir de las cepas almacenadas.
Parámetros que se evaluan con las
cepas de referencia para el control de
calidad
A) Potencia de los antimicrobianos
B) Medios de cultivo
Parámetros que NO se evaluan
eficientemente con las cepas de referencia
para el control de calidad
A) Problemas concernientes al antimicrobiano en
las pruebas de sensibilidad (por ej. discos, pocillos
o tubos: vacíos, secos, sobre o subcargados).
16
1. pH
2. Cationes Ca++ y Mg++
3. Contenido de timidina
4. Factores de crecimiento, composición del medio
5. Profundidad del agar para la prueba de difusión
por discos
B) Contaminación esporádica de los medios de
cultivo.
C)
Mal
funcionamiento
instrumental.
momentáneo
del
C) Condiciones de incubación (temperatura y
atmósfera)
D) Presencia de NaCl en los caldos para la prueba
de oxacilina para Staphylococcus spp.
D) Inóculo y técnica de inoculación.
E) Lectura subjetiva de puntos finales poco
definidos (pej. halos de inhibición difusos).
E) Contaminación de los medios de cultivo.
F) Funcionamiento del instrumental.
F) Interpretación de resultados, uso de criterios
apropiados de interpretación.
G) Medida del punto final
G) Errores de transcripción.
H) Errores técnicos individuales.
Son numerosos los factores que pueden dar como resultado una alteración en el tamaño final de las
zonas de inhibición. Las causas probables de algunas de ellas se indican a continuación.
Efecto observado
con las cepas de referencia
Causas probables
Agrandamiento general de las zonas de inhibición
Bajo inóculo
Volumen insuficiente del medio de cultivo
Sobrecarga de los discos
Disminución general de las zonas de inhibición
Alto inóculo
Volumen excesivo del medio de cultivo
Inactivación de la droga de los discos
Discos vencidos
Trimetoprima-Sulfametoxasol, disminución del
tamaño de la zona y/o aparición de colonias
internas
Exceso de timidina en el medio de cultivo. Se
corrige con el agregado (5%V/V) de sangre lisada
de caballo, rica en timidina fosforilasa.
Tetraciclinas, quinolonas fluoradas, colistina o
aminoglucósidos
- Disminución de las zonas, especialmente
frente a Pseudomonas aeruginosa
-Exceso del contenido de cationes divalentes:
Ca++ y Mg++
- Aumento de las zonas
- Escaso contenido de cationes divalentes
Aminoglucósidos, macrólidos
- Disminución de las zonas
pH menor a 7,2
Penicilinas y tetraciclinas
- Aumento de las zonas
pH menor a 7,2
17
Frecuencia de Realización de las pruebas de control de calidad con las cepas de referencia
Frecuencia de las pruebas
Comentario
Cada vez que se introduce un nuevo lote de discos
de antimicrobianos a la rutina, este se debe
ensayar con las cepas patrón de control de calidad
apropiadas.
En general se acepta que en una serie de pruebas
uno de cada veinte ensayos consecutivos de
control de calidad esté fuera de los rangos
establecidos. Si aparece más de un resultado fuera
de dichos rangos, se deben tomar medidas
correctivas.
Las cepas patrón de control de calidad se deben
probar semanalmente y cada vez que se cambie
cualquier reactivo que intervenga en la realización
de las pruebas de sensibilidad; los discos de
antibiótico a ensayar deben ser los mismos que se
utilizan de rutina para los aislamientos clínicos
Cuando un ensayo dé como resultado halos de
inhibición que estén fuera del rango aceptable, se
deben tomar medidas correctivas. Si la desviación
se puede atribuir a un error obvio, como por
ejemplo discos o cepas de control anómalos,
contaminación de la cepa control o atmósfera de
incubación incorrecta, se debe repetir la prueba de
control de calidad.
Si dicha desviación no se puede atribuir a un error
obvio, se debe continuar con los controles de
calidad diariamente hasta detectar la fuente de
error y documentar la solución del problema.
La obtención de resultados aceptables con las cepas de control de calidad no garantiza que
los resultados obtenidos con los aislamientos clínicos sean correctos.
Cuando se obtienen resultados de sensibilidad atípicos en un aislamiento clínico se debe
repetir la prueba y/o confirmar la tipificación del mismo.
En la Tabla 4 se presentan las resistencias naturales de las enterobacterias más comunes en la
clínica diaria. Estas resistencias muchas veces puede ayudar al bacteriólogo a confirmar o no la
identificación bacteriana. Cabe destacar que todos estos microorganismos pueden tener además
resistencias adquiridas a varios de los antimicrobianos para los cuales las cepas salvajes son
sensibles.
Resistencias inusuales
Por otra parte se debe tener en cuenta que la resistencia a algunos antibióticos en determinados
microorganismos es sumamente inusual y debe, por lo tanto, repetirse. Si dicha resistencia se
confirma, el aislamiento debe derivarse a un centro de referencia para su confirmación y
caracterización del mecanismo involucrado. Algunos ejemplos de estas combinaciones
microorganismo-droga incluyen resistencia a:
•
•
•
•
carbapenemes en cualquier enterobacteria.
cefalosporinas de tercera generación en Shigella spp.
cefpodoxima en Salmonella o Shigella spp.
quinolonas fluoradas en Shigella spp. o Salmonella spp.
La detección temprana de este tipo de cepas permitirá dar la voz de alarma y de esa manera elaborar
estrategias para evitar su diseminación.
Cada laboratorio debería desarrollar sus propias reglas para detectar las posibles fallas en las
pruebas de sensibilidad y proceder así a su corrección.
18
Tabla 4
Resistencias naturales en el género enterobacterias
Organismo
Citrobacter
koserib
Citrobacter
freundii
Enterobacter
aerogenes
y E. cloacae
Enterobacter
agglomerans
AMP
GEN
AMP/ CAR MEZ
CPG FOX CTG CFP IMP TOB AKN CHL
SUL TIC PIP
NET
TE
T
SXT CIP NAL NTI POL
Rc
S-R
R
S
S-R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
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S
Rc
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S-R
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S
S
S
E. coli
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Klebsiella spp.
Rc
S-R
Rc
S-R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Morganella
morganii
Proteus
mirabilis
Proteus
vulgaris y P.
penneri
Providencia
spp.
Salmonella
spp.
Rc
S-R
S
S
Rc
S-R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Rc
Rc
S
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S
R
c
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Serratia spp.
R
R
S
S
R
S-R
S
S
S
S
S
S
R
S
Shigella spp.
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
c
c
c
R
R
c
R
S
S
S
S
S
R
R
S
S
S
S
c
a Abreviaturas: S, sensible; R, resistente; S-R, sensible o resistente; AMP, ampicilina; AMP/SUL, ampicilina/sulbactam; CAR,
carbenicilina; TIC, ticarcilina; MEZ, mezlocilina; PIP, piperacilina; CPG, cefalosporinas de primera generación; FOX, cefoxitina;
CTG, cefalosporinas de tercera generación; CFP, cefoperazona; IMP, imipenem; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina; NET,
netilmicina; AKN, amicacina; CHL, cloranfenicol; TET, tetraciclina; SXT, trimetoprima/sulfametoxazol; CIP, ciprofloxacina; NAL,
ácido nalidíxico; NTI, nitrofurnatoina; POL, polimixina.
b Ex C. diversus
c Muy inusual encontrar aislamientos sensibles a esta droga.
LIMITACIONES DEL METODO DE DIFUSION POR DISCOS
Grupos de microorganismos donde se puede aplicar la prueba de difusión por discos
El método de difusión descripto en este documento ha sido estandarizado para patógenos de rápido
desarrollo.
Resultados incorrectos
Se pueden obtener resultados incorrectos cuando se ensayan determinados agentes antimicrobianos
con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de
1ra. y 2da. generación y aminoglucósidos con Salmonella spp y Shigella spp. En estos casos si se
ensaya alguna de las drogas enumeradas el resultado de éstas no deberá incluirse en el informe al
médico. Esto se debe a que pueden inducir a errores en la elección del tratamiento (falsa
sensibilidad)
Emergencia de resistencia
Algunos agentes antimicrobianos están asociados con la emergencia de resistencia durante terapias
prolongadas. Más aún, aislamientos inicialmente sensibles podrían transformarse en resistentes
dentro de los tres a cuatro días de haberse iniciado la terapia antimicrobiana
19
c
c
c
Planilla - Registro de Resultados: Prueba de Difusión por discos
Antimicrobiano
Cepa
Cepa
Cepa
Cepa
E. coli ATCC®
25922
Diámetro S,I, Diámetro S,I, Diámetro S,I, Diámetro S,I, Diámetro Rang
mm
R
mm
R
mm
R
Mm
R
mm
o
Ampicilina
16-22
Trimtoprimasulfametoxazol
24-32
Acido
nalidixico*
22-28
Cloranfenicol
21-27
Fosfomicina
-
Nitrofurantoina
20-25
Cefotaxima**
29-35
Gentamicina
19-26
Tetraciclina
18-25
Ciprofloxacina*
30-40
* Resistencia a Acido nlidixico indica generalmente sensibilidad disminuida a ciprofloxacina. Es importante que
esta sensibilidad disminuida sea informada al equipo medico ya que se han descrito fallas de tratamiento en
infecciones por Salmonella spp. con estas características (CLSI). Si se detectara un aislamiento de Salmonella
spp. o Shigella spp. con sensibilidad disminuida o resistencia, confirmar el hallazgo y enviarlo a un centro de
referenci para su estudio.
** Las cefalosporinas de tercera generación se deben informar únicamente frente a aislamientos causantes de
infecciones sistémicas. Descartar previamente presencia de BLEE: Cefpodoxima se puede incorporar como
prueba de tamizaje de ß-lactamasas de espectro extendido y resistencia a cefalosporinas de tercera generación.
En caso de presentarse resistencia a esta droga (halos < 17mm) se debe confirmar la presencia de BLEE
mediante el ensayo de CTX y CAZ con el disco de AMC entre ambos o en paralelo con los discos de
cefotaxima/ac. clav (CTC) y ceftazidima/ac. clav (CAC). Para la sospecha de BLEE en Salmonella spp y
Shigella spp., utilizar los puntos de corte especiales recomendados por CLSI para E. coli, Klebsiella spp. y P.
mirabilis frente a CTX y CAZ. Evaluar en un segundo paso también la sensibilidad a cefoxitina con el objetivo
de diferenciar la resistencia a cefpodoxima mediada por BLEE de la mediada por enzimas tipo AMP-C
plasmídico.
20
2. Métodos de Dilución
INTRODUCCION
Las técnicas de dilución en caldo o agar, se pueden utilizar para medir cuantitativamente la actividad
"in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos métodos se basan en la
preparación de una serie de tubos o placas con caldo o agar, respectivamente, a los cuales se les
agrega el antibiótico (ATB) en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o
placas con una suspensión estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se examinan
después de incubar 18 a 24 hs. a 35ºC y se determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) del
antimicrobiano frente al microorganismo ensayado. El resultado final no ende significativamente de la
metodología empleada. Por ello, para obtener valores reproducibles intra e interlaboratorios, cada
detalle técnico debe ser cuidadosamente controlado.
Las bases para la realización de estas metodologías derivan, en gran parte, de la información
generada por un estudio colaborativo internacional (1). Aunque estos métodos son referenciales,
algunos son lo suficientemente prácticos para ser desarrollados tanto en los laboratorios clínicos
como en los de investigación. Existen también sistemas comerciales que se basan, al menos en
parte, en los mismos conceptos y dan resultados equivalentes a los obtenidos con las técnicas
descriptas en este documento...
El documento que se ha tomado como base es el M7 – A7 del Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI) del año 2006. Las Tablas de interpretación corresponden al suplemento M100 – S17 del año
2007.
Las técnicas que se describen en este documento fueron diseñadas para ensayar bacterias de fácil
desarrollo después de 18 - 20 hs. de incubación en medio M. Hinton sin suplementos.
Indicaciones para realizar la prueba sensibilidad a los antimicrobianos por el metodo de CIM
La realización de una CIM esta justificada en las siguientes situaciones
1. Ausencia de metodología más sencilla por ejemplo, método de difusión
2. Falta de estandarización
3. Uso de nuevos antibióticos
4. Falla inesperada de tratamiento
5. Perfiles inusuales (confirmación)
6. Para vigilancia cuantitativa de la resistencia a los antimicrobianos
7. Infecciones severas que requieran la realización de pruebas bactericidas tales como poder
bactericida del suero, velocidad bactericida del suero, curva de muerte (endocarditis no
respondedoras a la terapia, uso de esquemas no convencionales, bacteriemias y meningitis en
inmunocomprometidos, osteomielitis crónicas, búsqueda de actividad sinérgica)
El valor de CIM obtenido por el método de dilución, orienta al medico tratante sobre que
concentración de antibiótico necesita alcanzarse en el sitio de infección para inhibir el desarrollo del
microorganismo infectante. La CIM, sin embargo, no representa un valor absoluto. La CIM real puede
estar entre la menor concentración de antibiótico que inhibe al microorganismo y la siguiente dilución
inmediatamente inferior donde se observa desarrollo del mismo. Si por ejemplo, fueran probadas
diluciones al medio y se determina una CIM de 16 µg/ml, el verdadero valor podría estar entre 16 y 8
µg/ml. Debe tenerse en cuenta que a pesar de realizar las pruebas de dilución bajo condiciones
cuidadosamente controladas, no siempre se obtienen los mismos resultados. Generalmente, la
reproducibilidad de esta prueba es de +/- 1 dilución.
La metodología más común para la determinación de La CIM es la que utiliza diluciones seriadas al
medio (por ej. 1, 2, 4, 8,16 µg/ml, etc.). También existen otros esquemas de dilución, que utilizan
unas pocas concentraciones (hasta dos), concentraciones "Breakpoint" o que agregan
concentraciones entre las que se ensayan normalmente (por ej. 4, 6, 8, 12, 16 µg/ml) Los resultados
de estos métodos alternativos pueden ser igualmente útiles; sin embargo, a veces son más difíciles
de controlar. Cuando se produce inhibición del crecimiento con la menor concentración utilizada, el
verdadero valor de la CIM no se puede determinar exactamente y debe informarse como igual o
menor que dicha concentración. Cuando se ensayan concentraciones adicionales entre las usuales y
la CIM es una de esas concentraciones intermedias, la interpretación de la prueba se debe hacer
después de redondear el valor a la próxima superior dilución al medio del esquema normal (por ej.
Una CIM de 6 µg/ml se debe redondear a 8 µg/ml y luego proceder a interpretar).
21
Cuando se informa al médico el resultado de la CIM, el valor debe ser acompañado por su
correspondiente interpretación (por ej. SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE) que se obtiene
aplicando los criterios enumerados en las Tablas del CLSI. Cuando las CIMs se realizan con 4 o
menos concentraciones consecutivas, o con concentraciones no consecutivas, se debe informar la
correspondiente interpretación. Si se desea se puede informar además el rango de CIM ensayado
Eleccion del numero de concentraciones a ensayar
Las concentraciones a ensayar para un determinado antibiótico, en general, deberían determinarse
de acuerdo a los puntos de corte que se enumeran en la Tabla 2A del documento M100-S17del CLSI,
pero el número final de concentraciones deberá ser elegido por quien realiza la prueba. Se
recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya el rango de CIM de al
menos una cepa patrón de control de calidad. La elección del rango deberá considerar los siguientes
puntos:
1. CIM usual de la combinación germen/droga (CIM50 y 90),
2. “Break point” de sensibilidad y resistencia y
3. Rango aceptable de al menos una de las cepas ATCC ensayadas en paralelo con la/s cepa/s
incógnita/s (Tabla 3A del documento M100-S17 del CLSI)
2.1 Dilución en agar
La dilución en agar es un método bien establecido para la determinación de la sensibilidad a los
antimicrobianos (3,4). El agente antimicrobiano se incorpora dentro del medio con agar, de manera tal
que cada placa contenga una concentración de antibiótico diferente. Los inóculos estandarizados de
los distintos microorganismos se pueden aplicar rápida y simultáneamente sobre la superficie del
agar utilizando un replicador de Steers (5). La mayoría de los replicadores existentes transfieren de
25 a 36 inóculos a la vez por cada placa.
La preparación, propiedades y control del agar M. Hinton y los estándares de turbidez se describen
en detalle para el método de difusión. Para la dilución en agar valen los mismos considerandos
descripto ut supra
MATERIALES
Equipos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
Ansas para inocular tipo loop (1-10 µl)
Mechero tipo Bunsen
Placas de Petri (9 cm de diámetro)
Pipetas Pasteur plásticas descartables
Pipetas de 0.1 ml (podrán utilizarse pipetas automáticas)
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 5 ml
Micropipetas hasta 1000µl
Baño termostatizado (50-55 oC)
Replicador tipo Stern
Soluciones, reactivos y medios de cultivo
•
•
•
•
•
•
•
•
Solución fisiológica estéril, 3 ml en tubos 13X100 mm (para la preparación del inóculo
estandarizado)
Tubos con 0.9 ml de caldo o solución fisiológica estéril (para la dilución 1/10 del inóculo)
Placas de agar nutritivo (9 cm de diámetro)
Gradilla de 11 tubos 13x100mm con 3 ml de agua destilada (para la dilución del ATB)
19 tubos con 19 ml de agar Mueller Hinton
Placas de Petri con Agar Mueller Hinton que contengan diluciones del ATB
Patrón de turbidez equivalente al 0.5 Mc Farland
Antimicrobianos de potencia conocida
22
PROCEDIMIENTO
Día 1
Comentarios teóricos
a) Preparación de las diluciones del antibiótico
Las figuras 2 a 9 muestran los pasos secuenciales
para la preparación de las diluciones de los
antibioticos comúnmente utilizados para Salmonella
y Shigella
Los antibióticos estándar o de referencia se
pueden obtener directamente del laboratorio
productor o de otras fuentes comerciales. No se
recomienda la utilización de las preparaciones para
aplicación parenteral.
A modo de ejemplo se indican en la Tabla 5
columna 2 los rangos sugeridos para distintos atb
con actividad frente a Samonella
La elección de la rangos deberá tener en
consideración la epidemiología local
Para las pruebas de sensibilidad se debe conocer
el lote, la potencia (generalmente expresada en
µg/ml, % ó UI/mg de polvo) y la fecha de
vencimiento de los antimicrobianos de referencia
El almacenamiento de la droga debe hacerse
según las recomendaciones del laboratorio
productor, o a una temperatura igual o menor a 20ºC en un desecador (preferiblemente con vacío)
provisto de algún material desecante como gel de
sílice o cloruro de calcio. Cuando se saca el
desecador del freezer se debe esperar que tome
temperatura ambiente antes de abrirlo para evitar
que el agua de condensación humedezca las
drogas. Las tertraciclinas deberán protegerse al
abrigo de la luz.
b) Preparación de la Solución de Antibiótico de
trabajo (SAT)
Para preparar la solución de antibiótico de trabajo
se debe tener presente el peso de droga activa y la
concentración más alta del rango deseado
corregido según el volumen final requerido para el
ensayo (ver Tabla 5).
Se debe tener en cuenta que para la dilución en
agar cada solución de atb preparada debe ser 20
veces más concentrada que la deseada en la
placa.
En general los antimicrobianos se obtienen como
sales. Esto significa que no todo el peso de la
droga en polvo será activo. El dato de potencia
expresa la proporción de droga activa en el total
del polvo
Ello es por que la solución del antibiótico se diluirá
1/20 al ser incorporada al agar (1 ml de la solución
de ATB + 19 ml del agar)
Por ello para considerar la pesada a efectuar
deberá tenerse presente en primer lugar que la
solución de antibiótico a preparar deberá ser de
una concentración 20 veces superior a la del
rango superior deseado (20X). (Tabla 5, columna
3)
Para el caso particular de trimeptroprima/
sulfametoxazol (TMS) la solución de antibiótico a
preparar deberá ser de una concentración 40
veces superior a la del rango superior deseado de
cada uno de los componentes individuales (40X).
(Tabla 5, columna 3)
Puesto que para obtener la solucion de antibiotico
de trabajo (SAT) de TMS se mezclaran volúmenes
iguales de las soluciones de trimetoprima (TMP) y
sulfametozaxol (SMZ). De esta manera ambas
soluciones se diluirán 1:2, obteniéndose la SAT de
TMS
El volumen final de SAT requerido dependerá del
esquema de dilución a seguir
En el caso propuesto en el ejemplo de la Tabla 5
las diluciones seriadas al ½ involucran la
transferencia de 3 ml de la SAT para obtener la
dilución al ½ correspondiente (figuras 2-9) Puesto
Esquemas alternativos de dilución de las
soluciones de ATB se encuentran en la Tabla 5 del
documento M100-S17 del CLSI (2002). El volumen
final de SAT a preparar deberá contemplar el
esquema de diluciones a realizar
23
que 1 ml de la SAT también será necesario para
preparar la primera placa del rango, se requiere un
volumen de SAT superior a los 4 ml. (Tabla 5,
columna 4)
El peso de droga activa de cada antibiótico (Tabla
5 columna 5) (deberá posteriormente corregirse
con el dato de potencia) resulta de multiplicar el
volumen final necesario (Tabla 5 Columna 4) por
20 veces la concentración superior del rango de
SAT (Tabla 5 Columna 3) por 20 veces el valor de
la concentración superior del rango
Tabla 5 Ejemplo de rango sugeridos y cálculo de las pesadas
Antibiótico
Rango de
diluciones
(µg/ml)
Concentración
de solución a
preparar
(rango superior
x 20)
(µg/ml)
Volumen
final
necesario
de solución
de ATB
(ml)
Peso del
antibiótico activo
(deberá
posteriormente
corregirse con el
dato de potencia)
(mg)
Peso del
antibiótico
total corregido
por el dato de
potencia
(mg)
Solvente
Fig.
Ampicilina
(AMP)
0.12-256
5120*
(256X20)
5
25,6 (5 x5120)
Ver formula 1
Agua
2
c
Cefotaxima
(CTX)
0.008-16
320
(16X20)
5a
1.6 (5 x640)
Pesar 10 veces
mas
Ver formula 1
Agua
3
Cloranfenicol
(CHL)
0.25-512
10240*
(512X20)
5
51,2 (5 x10240)
Ver formula 1
Metanol
4
Ver formula 1
Agua
5
c
Ciprofloxacina
(CIP)
Trimetoprima/
sulfametoxazol
(TMS)
Tetraciclina
(TET)
Gentamicina
(GEN)
0.002-4
0.03/5764/1216
0.25-512
0.06-128
80
(4X20)
5a
TMP: 2560
(64X40)
3
b
4,0 (5 x800)
Pesar 10 veces
mas
TMP:
metanol
7,680 (3 x2560)
6
Ver formula 1
SMZ: 48640
(1216X40)
10240*
(512X20)
2560*
(128X20)
b
SMZ:
agua
3
145,38 (3 x48640)
5
51,2 (5 x10240)
Ver formula 1
Metanol
7
5
12,8 (5 x2560)
Ver formula 1
Agua
8
Estos rangos se establecieron en base a la epidemiología de la resistencia de Argentina
* Estas soluciones representan las soluciones de antibiótico de trabajo (SAT).
a: Estas soluciones requieren un paso previo (dilución o mezcla) para convertirse en la SAT por lo
que se podría prepara un volumen final menor a 5 ml (ver mas adelante).
b: De esta manera ambas soluciones se diluirán 1:2, obteniéndose la SAT de TMS con un volumen
final superior a los 5 ml requeridos para el ensayo del ejemplo
c) Cálculo de la cantidad de droga activa.
Para saber cual es exactamente la cantidad de
droga activa hay que calcularla utilizando el dato de
potencia. (EJEMPLO: que un antibiótico tenga una
potencia de 930 µg/mg, implica que por cada
miligramo de polvo pesado sólo 930 µg serán
activos o tendrán actividad antimicrobiana)
(FORMULA 1)
En general los antimicrobianos se obtienen como
sales. Esto significa que no todo el peso de la
droga en polvo será activo.
El resultado de esta formula estima finalmente la
cantidad de droga a pesar
24
FORMULA 1
Peso del antibiótico total: _______(colunma 5 de Tabla 5)
Potencia: _________
Cálculo:
________ µg de droga activa (dato de potencia) --------------- 1mg droga
____ mg droga activa calculados (Tabla 5 columna 5) -------------- X= _____ µg de droga a pesar
(Tabla 5 columna 6)
Para pesar el antibiótico a ensayar se debe hacer
en balanza analítica bien calibrada, con una
precisión igual o superior al décimo de miligramo,
Se debe evitar pesar cantidades muy pequeñas de
droga ya que estas acarrean alto error
Se recomienda utilizar el método de doble arresto
para efectuar la pesada
Generalmente al realizar la pesada se obtiene un
exceso o defecto de la droga activa , en tal caso se
debe aplicar la fórmula 2 para conocer el exacto
volumen de solvente a agregar para obtener la
concentración deseada
FORMULA 2
Cálculo:
Cálculo del solvente necesario para obtener la concentración deseada:
______ µg de droga activa (Tabla 5 columna 3) ---------------- 1 ml
(Concentración del antibiótico en la primer placa 20X)
________ µg (cantidad de droga pesada) ---------------- X=_________ ml
(Dato experimental que surge de la pesada)
(vol. de solvente para disolver
la droga)
Agregar el volumen calculado del solvente apropiado (Tabla 5 columna 7)
** Asegúrese de tomar todos los recaudos necesarios para el manejo de solventes distintos del agua
según indicaciones del fabricante **
El solvente a utilizar dependerá del tipo de droga.
En algunos casos el límite de solubilidad del
antimicrobiano sólo permite preparar soluciones de
concentraciones bajas
Para las drogas que no son solubles en agua
(Tabla 5, columna 7), se debe proceder de la
siguiente manera:
1- Use solamente la cantidad mínima del solvente
(metanol, acetona, cloroformo, etc) necesaria para
solubilizar la droga.
2- Diluya hasta alcanzar el volumen final calculado,
con agua estéril o con el buffer estéril adecuado
como se indica en la formula 2 .
La mayoría de las soluciones preparadas en el
ejemplo serán directamente las SAT con excepción
En general cuando se preparan soluciones de
antibiótico, se busca obtener soluciones madres
25
de CTX, CIP, TMP, SMZ que deben realizar algún
paso previo antes de conseguir la SAT (ver a bajo).
stock concentradas que luego se deben diluir para
alcanzar la concentración necesaria para preparar
el rango deseado
En el caso de CTX y CIP la SAT se obtiene
diluyendo las soluciones preparadas (1/10 en el
ejemplo para CTX de la Tabla 5) y para
trimetoprima / sulfametoxazol se debe mezclar un
volumen de cada droga para obtener la mezcla de
la concentración deseada (3 ml de c/u en el
ejemplo de la Tabla 5)
En el ejemplo de la Tabla 5 se pesan diez veces
mas CTX y CIP para evitar pesar cantidades muy
pequeñas de droga ya que estas acarrean alto
error.
d) Preparación de las diluciones del antibiótico (ver
figuras 2 a 8 correspondientes a cada droga)
La SAT será en todos los casos la primera dilución
del rango (la más concentrada). El objetivo en este
paso es obtener 11 diluciones al ½ sucesivas de la
SAT.
Para determinar el número de concentraciones a
incluir en las pruebas de sensibilidad se
recomienda elegir el rango de concentraciones de
manera tal que incluya: los puntos de corte que se
enumeran en la Tabla 2 A de CLSI (M100-S17), el
rango de CIM de al menos una cepa patrón de
control de calidad (Tabla 3 de CLSI M100-S17) y
la CIM 50 y 90 para bacterias de características
similares a las cepas incógnitas (previamente
reportadas en la literatura o basadas en la
experiencia previa)
Para el ejemplo de la Tabla 5, tomar una gradilla
con 11 tubos conteniendo 3 ml de agua. Colocar 3
ml de la SAT en el primero de los 11 tubos y
homogeneizar correctamente. Tomar 3 ml de este
tubo y transferirlos al segundo tubo de la serie,
homogenizar y pasar 3 ml al tercero. Repetir este
procedimiento hasta el último tubo. De esta manera
se deben obtener, incluida la SAT, 12 diluciones
consecutivas al ½ del antibiótico
Un esquema alternativo de dilución del antibiótico
se puede obtener en la Tabla 5 de CLSI M100-S17
e) Colocación del antibiótico en el agar y
preparación de las placas para la CIM (ver figuras 2
a 8 correspondiente a cada droga)
Tomar 12 tubos con 19 ml de agar Mueller Hinton
fundido y enfriado a 50-55º C (mantenerlos en el
baño termostatizado hasta su utilización). De a una
a la vez y empezando por la más diluida, tomar las
diluciones preparadas en el punto 2.1.4 transferir
1ml de cada solución a un tubo con 19 ml de agar
(dilución 1/20)
Importante: no descartar el sobrante de las
soluciones de antibiótico antes de finalizar el
ensayo. En caso de error durante la preparación
de las placas (solidificación total o parcial en el
tubo, etc) podria llegar a utilizarlas nuevamente
Homogeneizar correctamente cada tubo por
inversión evitando la formación de burbujas y vierta
La mezcla agar-antibiótico debe ser colocada
rápidamente en las placas para evitar la
26
el contenido completo a una placa de Petri de 9 cm
de diámetro. Si se formaran burbujas en la placa,
pasar ligeramente la llama del mechero por la
superficie de la placa para eliminarlas.
solidificación total o parcial de la misma dentro del
recipiente de mezclado
Importante: rotular cada placa con el valor de la
concentración final resultante (Tabla 5 columna
2). Se debe marcar además cada placa de agar
para conocer la ubicación de los inóculos en la
misma
Si las placas no se usan de inmediato se pueden
guardar a 4 - 8ºC por no mas de 3 días El
almacenamiento de las placas se debe hacer en
bolsas de plástico para evitar su desecación. Las
placas
conteniendo
ácido
clavulanico
o
carbapenemes se deben preparar el dia de
realización de la CIM debido a la rápida
degradación (hidrólisis) de la droga. Otros
antimicrobianos particularmente lábiles son: ßlactámicos en general, y sulbactam y tazobactam
No se puede asegurar que todos los antibióticos
mantengan su actividad en estas condiciones, por
lo tanto siempre es necesario evaluar el estado de
los antibióticos mediante la prueba de cepas
patrones de control de calidad.
La placa de Petri debe alcanzar una profundidad de
3-4 mm con la mezcla agar-antibiótico
Este control (placa sin antibiótico) permitirá conocer
la viabilidad de los microorganismos a los cuales se
le evaluará la sensibilidad.
Preparar además una placa con 20 ml de agar sin
antibiótico Esta placa sin antibiótico servirá como
control de crecimiento. De esta manera se deben
obtener, por atb, 12 placas con las concentraciones
de antibiótico comprendidas en el rango de la
segunda columna de la Tabla 2 y una placa sin
antibiótico que se utilizará como control.
f) Secado de las placas
Antes de realizar la prueba, colocar las placas,
abiertas e invertidas, en una estufa de 35º C o en
un equipo de flujo laminar por al menos 30 minutos
para eliminar el exceso de humedad que pudieran
contener.
Evite la sobre desecación de las placas
g) Preparación de los inóculos (ver figura 9)
El inóculo estandarizado para el método de dilución
en agar, se puede preparar permitiendo el
crecimiento del microorganismo hasta la turbidez
0,5 de la escala de McFarland o bien
resuspendiendo colonias directamente hasta
alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusión por
discos
Para la inoculación de las placas para la dilución en
agar se puede utilizar un replicador tipo Stern (que
deposita simultáneamente múltiples inóculos) o
también puede realizarse con pipeta o ansa
calibrada. La siembra de los inóculos se realiza por
“spot” en la superficie del agar (aproximadamente 2
µl de suspensión). Cada “spot” debe contener una
cantidad neta de 104 bacterias.
La inoculación de las placas se realizará utilizando
un replicador de Stern
Control de calidad
Juntamente con las cepas incógnitas deberán
ensayarse las cepas de referencia que se
describen mas adelante para el control de calidad
del ensayo.
h) Ajuste del inoculo al patrón de 0.5 Mc Farland
27
A partir del tubo con crecimiento logarítmico de
cada aislamiento, transferir pequeños volúmenes
(gotas) a un tubo con 3 ml de solución fisiológica
hasta obtener una turbidez comparable al estándar
0.5 de Mc Farland. Utilice para esta operación
pipetas Pasteur descartables.
Las
suspensiones
bacterianas
contendrán 1 x 108 UFC/ml.
preparadas
IMPORTANTE: agitar muy bien el estándar antes
de proceder a la comparación.
i) Dilución 1/10 de la suspensión bacteriana (0.5 Mc
Farland)
Evitar extremos en la densidad del inóculo.
Transferir 0.1 ml de cada inóculo ajustado en el
punto h a un tubo con 0.9 ml de caldo o solución
fisiológica. De esta manera se realiza una dilución
1/10 del inóculo ajustado,
Se obtendrá así una suspensión de ~1 x 107
UFC/ml que será el inóculo de trabajo.
Una vez ajustado, el inóculo debe utilizarse dentro
de los 15 min.
Para evitar sobrecrecimiento bacteriano
j) Colocación de los inóculos (ver figura 9 y 10)
La colocación de los inóculos obtenidos en el punto
2.1 en el pocillo del replicador.8 se realizará con
pipeta automática, depositando con mucho cuidado
400 µl de cada uno de ellos en el pocillo
correspondiente.
IMPORTANTE: asegurarse de no salpicar y
contaminar los pocillos continuos al que se
está cargando. Y de anotar la posición del
pocillo en el que se deposita cada inoculo (ver
esquema en la Figura10)
Pocillo del
Replicador
Recuerde agitar muy bien el inóculo de trabajo
antes de proceder a colocarlo en el pocillo del
replicador
Se recomienda distribuir las cepas de referencia en
varias posiciones de los pocillos (preferentemente
distantes uno de otro) para monitorear toda la
extensión de la placa
Cepa Nro….
Figura 10.
Esquema de distribución de los inóculos
28
k) Siembra de las placas
IMPORTANTE: Se debe rotular cada placa de
agar antes de comenzar con la siembra para
conocer la ubicación de los inóculos en la
misma
Se debe comenzar con la placa control que sólo
contiene agar Mueller Hinton y luego se
continuará con la serie de placas con
antibiótico comenzando con aquella que posea
la menor concentración.
Verifique que todas las placas estén secan antes
de la siembra.
Sembrando desde la placa con menor
concentración de antibiótico se reduce la
posibilidad de efecto “carry over”. De todas
maneras se debe inocular una segunda placa
control de viabilidad al finalizar la serie
(corresponde a la placa sin antibiótico del la droga
siguiente), para confirmar que no hubo
contaminación ó un significativo efecto "carry over"
de antibiótico durante el procedimiento
IMPORTANTE: mirar periódicamente que todos
los clavos estén depositando la microgota de
inóculo.
Cada clavo del replicador de Stern deposita
aproximadamente 2 µl, como el inóculo utilizado
tiene 1 x 107 UFC/ml (ver punto 2.1.9), por cada
“spot” quedarán aproximadamente 2 x 104
bacterias que es el inóculo recomendado.
Las placas inoculadas se deben mantener a
temperatura ambiente hasta que el agar absorba el
líquido que acompaña al inóculo pero no más de 15
minutos
IMPORTANTE: no invertir ni inclinar las placas
hasta que la microgota de inóculo se haya
absorbido.
l) Incubación
Incubar las placas invertidas durante 16-18 hs a
35ºC en ambiente aeróbico
Día 2
Comentarios teóricos
m) Lectura e interpretación
Para determinar el punto final, las placas se deben
colocar sobre una superficie oscura y opaca. La
CIM se registrará como el valor de la menor
dilución que inhibe completamente el desarrollo
bacteriano
Si
persisten
dos
o
más
colonias
en
concentraciones superiores al aparente punto final,
o
si
se encuentra
desarrollo a
altas
concentraciones y no a bajas, se debe controlar la
pureza del cultivo y probablemente deba repetirse
la prueba.
No se debe considerar el desarrollo de una simple
colonia o una tenue película causada por el
depósito del inóculo.
29
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden
permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se
ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final
en estos casos corresponderá a la concentración
en la que haya más del 80 % de reducción del
crecimiento comparando con el control.
Este fenómeno ocurre por que pueden arrastrarse
sustancias antagónicas de la síntesis del ácido
fólico
Los resultados de CIM obtenidos serán
interpretados con la Tabla 2A, y los organismos se
informarán sensibles, intermedios o resistentes
frente al antimicrobiano ensayado
El documento de la CLSI M100-S17no incluye
puntos de corte para todos los antibióticos
ensayados. En estos casos los puntos de corte son
asignados de acuerdo a un análisis de la
distribución poblacional y según las propiedades
farmacocinéticas y farmacodinamia del antibiótico
n) Informe de los resultados
Utilizar la planilla para el registro de los resultados
30
Figuras
Figura 2
Dilución en Agar - AMPICILINA
(*) caldo, agua
1. Preparación de la dilución
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ml
de H20
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
160
µg/ml
80
µg/ml
40
µg/ml
20
µg/ml
10
µg/ml
5
µg/ml
19ml*
SAT
256
µg/ml
32
µg/ml
2
µg/ml
m
l
2.5
µg/ml
1
19ml*
19ml*
1
µg/ml
3 ml*
1
m
l
19ml*
19ml*
4
µg/ml
1
m
l
1
1
1
8
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
19ml*
19ml*
16
µg/ml
m
l
m
l
19ml*
19ml*
64
µg/ml
1
1
19ml*
128
µg/ml
1
m
l
m
l
19ml*
m
l
3 ml*
320
µg/ml
m
l
3 ml*
640
µg/ml
m
l
3 ml*
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
3 ml*
1280
µg/ml
1
1
m
l
AMP activa
___mg
3 ml*
2560
µg/ml
m
l
SAT
5120
µg/ml
0.5
µg/ml
0.25
µg/ml
19ml*
(*) agar MH
0.125
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
256
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
Figura 3
Dilución en Agar - CEFOTAXIMA
1. Preparación de la dilución
(*) caldo, agua
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ ml
de H20
3 ml*
3 ml*
3 ml*
2.5
µg/ml
1.25
µg/ml
0.625
µg/ml
0.31
µg/ml
19ml*
SAT
16
µg/ml
19ml*
8
µg/ml
19ml*
19ml*
19ml*
4.0
µg/ml
2.0
µg/ml
1.0
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
19ml*
0.5
µg/ml
0.25
µg/ml
19ml*
19ml*
0.12
µg/ml
0.06
µg/ml
19ml*
0.03
µg/ml
0.015
µg/ml
1
1
1
1
1
19ml*
1
m
l
m
l
1
1
1
m
l
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
3 ml*
m
l
3 ml*
5
µg/ml
m
l
3 ml*
10
µg/ml
m
l
3 ml*
20
µg/ml
m
l
3 ml*
40
µg/ml
m
l
3 ml*
80
µg/ml
m
l
3 ml*
160
µg/ml
m
l
3 ml*
m
l
Sol Interm.
Interm.
1920
µg/ml
3 ml*
SAT
320
µg/ml
m
l
CTX activa
___mg
Dil 1/10
19ml*
0.016
µg/ml
19ml*
(*) agar MH
0.008
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
16
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
31
Figura 4
Dilución en Agar - CLORANFENICOL
1. Preparación de la dilución
(*) caldo, agua
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ml
de Metanol
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
160
µg/ml
80
µg/ml
40
µg/ml
20
µg/ml
10
µg/ml
19ml*
SAT
512
µg/ml
256
µg/ml
19ml*
19ml*
19ml*
128
µg/ml
64
µg/ml
32
µg/ml
19ml*
16
µg/ml
8
µg/ml
19ml*
19ml*
4
µg/ml
2
µg/ml
5
µg/ml
1
1
m
l
1
m
l
1
1
1
19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
m
l
m
l
1
1
m
l
1
m
l
19ml*
3 ml*
m
l
3 ml*
320
µg/ml
m
l
3 ml*
640
µg/ml
m
l
3 ml*
1280
µg/ml
m
l
3 ml*
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
3 ml*
2560
µg/ml
1
m
l
CHL activo
___mg
3 ml*
5120
µg/ml
m
l
SAT
10240
µg/ml
19ml*
19ml*
1
µg/ml
0.5
µg/ml
19ml*
(*) agar MH
0.25
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
512
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
Figura 5
Dilución en Agar - CIPROFLOXACINA
1. Preparación de la dilución
(*) caldo, agua
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ ml
de H20
3 ml*
40
µg/ml
20
µg/ml
10
µg/ml
5
µg/ml
2.5
µg/ml
1.25
µg/ml
0.625
µg/ml
0.31
µg/ml
0.15
µg/ml
0.08
µg/ml
19ml*
SAT
4
µg/ml
19ml*
2
µg/ml
19ml*
19ml*
19ml*
1
µg/ml
0.5
µg/ml
0.25
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
19ml*
19ml*
0.12
µg/ml
0.06
µg/ml
19ml*
19ml*
0.03
µg/ml
0.015
µg/ml
19ml*
0.008
µg/ml
0.04
µg/ml
1
1
1
1
1
1
m
l
1
m
l
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
3 ml*
m
l
800
µg/ml
3 ml*
1
Sol. Intermedia
CIP activa
___mg
9 ml*
SAT
80
µg/ml
m
l
Dil 1/10
19ml*
0.004
µg/ml
19ml*
(*) agar MH
0.002
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
4
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
32
Dilución en Agar – TRIMETOPRIMA (TMP) / SULFAMETOXASOL (SUL) Fig. 6
1. Preparación de la dilución
____ ml
de Metanol
3 ml
3 ml
(*) caldo, agua
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
TMP act._____mg
Dil 1/2
3 ml*
3 ml*
____ ml
de H20
3 ml
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
SAT
640/12160
160/3040
40/760
1280/24320 µg/ml
µg/ml
µg/ml
µg/ml
320/6080
80/1520
µg/ml
µg/ml
3 ml*
3 ml*
10/190
µg/ml
20/380
µg/ml
3 ml*
3 ml*
2.5/47.5
µg/ml
5/95
µg/ml
0.625/11.875
µg/ml
1.25/23.75
µg/ml
19ml*
19ml*
SAT
64
µg/ml
32
µg/ml
19ml*
19ml*
19ml*
16
µg/ml
8
µg/ml
4
µg/ml
19ml*
2
µg/ml
1
µg/ml
19ml*
19ml*
0.5
µg/ml
0.25
µg/ml
m
l
m
l
1
1
m
l
1
m
l
1
1
19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
m
l
m
l
1
1
m
l
1
m
l
1
m
l
1
m
l
1
m
l
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
m
l
SUL act._____mg
19ml*
19ml*
____
µg/ml
____
µg/ml
19ml*
(*) agar
____MH
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
64
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
Figura 7
Dilución en Agar - TETRACICLINA
1. Preparación de la dilución
(*) caldo, agua
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ml
de Metanol
3 ml*
20
µg/ml
10
µg/ml
19ml*
SAT
512
µg/ml
256
µg/ml
19ml*
19ml*
19ml*
128
µg/ml
64
µg/ml
32
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
19ml*
16
µg/ml
8
µg/ml
19ml*
19ml*
4
µg/ml
2
µg/ml
19ml*
1
µg/ml
5
µg/ml
1
1
1
1
19ml*
1
m
l
1
1
m
l
1
1
m
l
19ml*
3 ml*
m
l
3 ml*
40
µg/ml
m
l
3 ml*
80
µg/ml
m
l
3 ml*
160
µg/ml
m
l
3 ml*
320
µg/ml
m
l
3 ml*
640
µg/ml
m
l
3 ml*
1280
µg/ml
m
l
3 ml*
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
3 ml*
2560
µg/ml
1
m
l
TET activa
___mg
3 ml*
5120
µg/ml
m
l
SAT
10240
µg/ml
19ml*
0.5
µg/ml
19ml*
(*) agar MH
0.25
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
512
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
33
Figura 8
Dilución en Agar - GENTAMICINA
1. Preparación de la dilución
(*) caldo, agua
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ml
de H20
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
20
µg/ml
10
µg/ml
5
µg/ml
2.5
µg/ml
1.25
µg/ml
19ml*
SAT
128
µg/ml
64
µg/ml
19ml*
19ml*
19ml*
32
µg/ml
16
µg/ml
8
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa
19ml*
4
µg/ml
2
µg/ml
19ml*
19ml*
1
µg/ml
0.5
µg/ml
m
l
19ml*
0.25
µg/ml
1
1
1
1
1
19ml*
m
l
m
l
1
1
m
l
1
1
m
l
19ml*
m
l
3 ml*
40
µg/ml
m
l
3 ml*
80
µg/ml
m
l
3 ml*
160
µg/ml
m
l
3 ml*
320
µg/ml
m
l
3 ml*
640
µg/ml
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
3 ml*
1
m
l
GEN activa
___mg
3 ml*
1280
µg/ml
m
l
SAT
2560
µg/ml
19ml*
0.12
µg/ml
19ml*
(*) agar MH
0.06
µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
128
µg/ml
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
Dilución en Agar
Figura 9
Preparación y colocación del inóculo
0.1 ml
Gotas
Dilucion 1/10
Bacteria
en fase
logarítmica
0.5 de
McFarland
Cc:1x108
UFC/ml
0.9 ml
de SF o caldo
Cc:1x107
400 µl
UFC/ml
Policubetas de inóculos
del Replicador de Stenr
© Servicio ANTIMICROBIANOS – INEI - Dr. Carlos G. Malbrán
34
Planilla - Registro de Resultados: Método de dilución en agar y microdilución (CIM)
AISLAMIENTOS
Antibiótico
Método
Cepa
mínima
CIM µg/ml Concentración inhibitoria
CIM
µg/ml
S,I,R
Cepa
CIM
µg/ml
S,I,R
Cepa
CIM
µg/ml
S,I,R
Cepa
CIM
µg/ml
S,I,R
E. coli ATCC®
25922
Rango
CIM
µg/ml
µg/ml
AMP
2-8
CTX
0.030.12
CHL
2-8
CIP
0.0040.016
TMS
<0.5
/9.5
TET
0.5-2
GEN
0.25-1
35
2.2 Microdilución en caldo
Este método se denomina microdilución porque se utilizan pequeños volúmenes de caldo. La prueba
se realiza en policubetas de plástico estériles de fondo cónico o redondo.
MATERIALES
Equipos
•
•
•
•
•
•
Mechero tipo Bunsen
Pipetas Pasteur plásticas descartables
1 Reservorio con 12 compartimientos
5 Reservorios sin compartimientos
Micropipeta multicanal para 12 y 8 puntas
Microplacas de 96 pocillos fondo redondo esteriles
Soluciones, reactivos y medios de cultivo
•
•
•
•
•
•
Solución fisiológica estéril, 3 ml en tubos 13X100
Placas de agar Mueller Hinton (9 cm de diámetro, profundidad del agar de 4 mm )
Placas de agar nutritivo (9 cm de diámetro)
12 Tubos 13x100mm con 4,5 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes
Tubo con 9,9 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes
Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
Preparación del caldo Mueller Hinton
Comentarios teóricos
(1) Preparar el caldo M. Hinton a partir de la base
deshidratada de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante. Esterilizar en autoclave.
De los medios disponibles se considera al caldo MHinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de
rutina dado que:
• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en
las pruebas de sensibilidad.
• Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría
de las bacterias patógenas.
• Existen suficientes datos recopilados que
avalan la experiencia de las pruebas de
sensibilidad realizadas en este medio.
(2) El caldo que no se usa en el día puede
mantenerse en refrigerador (2-8 ºC.).
(3) Controlar la esterilidad de una muestra
representativa de cada lote incubando 24 horas o
mas a 30-35 ºC. Luego descar esas muestras.
No deberá observarse crecimiento bacterianas o
micótico. Para verificar la esterilidad del medio,
tome una muestra equivalente al 5-10% del total
del lote producido. Ignorar cualquier contaminación
esporádica; ej. una fracción de medio. Descartar el
lote completo, si el nivel de contaminación es
significativo (>10% del medio controlado).
pH: El caldo debe tener un pH 7,2 - 7,4 a
temperatura ambiente. Determinar el pH después
de su preparación.
El pH para cada lote debe ser controlado cuando
se prepara cada lote de medio. Si el pH es
demasiado
bajo,
ciertas
drogas
(p
ej.
Aminoglucósidos,
quinolonas
y macrólidos)
parecerán menos activas; mientras otras (p ej.
tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el
pH es demasiado alto se podrían esperar los
efectos opuestos. Ver Tabla 1
36
Si el pH está muy alejado del rango aceptable
debe controlarse el procedimiento de la
preparación del medio.
El método a utilizar dependerá del tipo de equipo
disponible en cada laboratorio
Las correcciones necesarias serán realizadas por
el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
El agregado de largos volumenes de estas
soluciones para correccion del pH puede alterar el
contenido de sales del medio.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de
Timidina se debe realizar la CIM de trimetoprima /
sulfametoxazol frente a Enterococcus faecalis
ATCC® 29212 o ATCC® 33186. El punto final en
estos casos corresponderá a la concentración en la
que haya más del 80 % de reducción del
crecimiento comparando con el control.
Los medios que contienen excesiva cantidad de
timina o timidina pueden revertir los efectos
inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima,
produciendo así CIMes mas altas, lo cual puede
dar como resultado un informe de falsa resistencia.
El medio se considera adecuado si el valor de la
CIM es < 0.5/9.5 µg/ml.
En caso que se observe una CIM > 0.5/9.5 µg/ml
podrá procederse al agregado de timidina
fosforilasa o sangre lisada de caballo.
Efectos por variación en la composición de
cationes divalentes. Las pruebas realizadas con
cada lote de caldo M. Hinton deben estar de
acuerdo con los límites de control para las
correspondientes cepas ATCC (ver Control de
Calidad). Los resultados de las pruebas con las
cepas patrones deben ser cuidadosamente
observados para detectar cualquier valor aberrante
debido a la composición de cationes del medio de
cultivo.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura
(aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo
inactivará los excesos de timidita presentes en el
medio y la confiabilidad de las pruebas para
sulfonamidas y trimetoprima frente a patógenos
comunes, excepto para enterococos
La variación en cationes divalentes principalmente
Ca++ y
Mg++ afectarán los resultados con
tetraciclina, colistín y aminoglucósidos frente a P.
aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes
aumentará las CIMes, mientras que bajas
concentraciones de cationes resultarán en CIMes
menores a las esperadas. Un exceso de zinc
podría aumentar las CIMes de los carbapenems
Los rangos aceptados son los siguientes (Método
de absorción atómica o equivalente):
Ca++ = 20 -25 mg/L; Mg++ = 10 -12.5 mg/L.
37
PROCEDIMIENTO
Día 1
Comentarios teóricos
a) Preparación de las soluciones de antibiótico
(figura 11)
Se debe tener en cuenta que para la microdilucion,
cada solución de antibiótico debe ser preparada 2
veces más concentrada que la deseada en el
pocillo
La solución de antibiótico se debe preparar de una
concentración tal que duplique la deseada (2X). De
esta forma, los pocillos serán cargados con 50 µl
de la solución del antibiótico y 50 µl del inoculo.
Para pesar las drogas podrán utilizarse los
conceptos y formulas descriptos para la dilución en
agar con la salvedad que la solución de
antibiótico a preparar deberá ser de una
concentración 2 veces superior a la del rango
superior deseado (2X). (Tabla 5)
Una vez preparada las diluciones del antibiótico,
homegeinicelas perfectamente y con la misma
pipeta llene el correspondiente compartimiento del
reservorio de la pipeta multicanal comenzando por
la solución mas diluida (Se deberán utilizar
reservorios con 12 divisiones). Proceda de la
misma manera para las otras 11 diluciones. (ver
figura 11)
IMPORTANTE: Rotular los reservorios con el
nombre del antibiótico que esta colocando y al
menos la ubicación de la menor y mayor
concentración del rango preparado.
Al finalizar todos los compartimientos (12) del
reservorio de la pipeta multicanal quedarán llenos.
Se utilizará un reservorio de 12 compartimientos
por cada antibiótico a ensayar
b) Llenado de las policubetas con las diluciones del
antibiótico (Figuras 11 y 12)
Este procedimiento se llevará a cabo mediante la
utilización de la pipeta multicanal de doce puntas y
el correspondiente reservorio.
De una vez se cargan las 12 diluciones del
antibiótico en la línea de la policubeta
correspondiente (ver figura 12). Rotular cada línea
de las policubetas con el nombre del antibiótico que
le colocó y las ubicaciones de la dilución menor y
mayor del rango.
Se deberá preparar una policubeta por cada cepa
a ensayar. Cada una será idéntica con respecto a
los antibióticos que contengan.
c) Preparación del inóculo (ver figura 13)
38
El inóculo estandarizado para el método de
microdilución, se puede preparar permitiendo el
crecimiento del microorganismo hasta la turbidez
0,5 de la escala de McFarland o bien
resuspendiendo colonias directamente hasta
alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusión por
discos
Importante: agitar muy bien el estándar de
turbidez antes de proceder a la comparación
Con pipeta de 0.1 o 0.2 ml, colocar 0.1 ml del
inóculo ajustado al 0.5 de Mc Farland (1 x 108
UFC/ml) en un tubo con 9.9 ml de caldo Mueller
Hinton ajustado en cationes.
Con esto se logra una dilución 1/100 del inóculo
6
ajustado (1 x 10 UFC/ml). Cuando se colocan 50
µl de esta suspensión a cada pocillo se obtendrá
una concentración final de bacterias de
aproximadamente 5 x 105 UFC/ml (inóculo
recomendado) al ser diluida al medio por el
agregado de igual volumen de la dilución del
antibiótico
Control de calidad
Juntamente con las cepas incógnitas deberán
ensayarse las cepas de referencia para el
control de calidad del ensayo.
d) Siembra de las policubetas de la microdilución
(ver figura 13)
Tomar reservorios para pipetas multicanal sin
compartimientos (o placas de petri) y volcar en
cada uno la dilución 1/100 de cada una de las
cepas preparadas en el punto 3.3
La aplicación del inóculo se debe realizar dentro de
los 15 minutos posteriores a su ajuste
Una vez cargados los reservorios, tomar de a uno
por vez y, con pipeta multicanal de 8 puntas,
colocar 50 µl del inóculo en todos los pocillos de
una de las policubetas preparadas
Importante: recordar que hay un pocillo control
de caldo que sólo lleva 100 µl del caldo utilizado
para preparar las diluciones del antibiótico
Repetir esta operación con todas las
ensayar en sus respectivas policubetas
Cada policubeta debe incluir un pocillo de control
de crecimiento (sin antibiótico), y un control
negativo (caldo sin inocular):
Control de caldo: contendrá 100 µl de caldo
Mueller Hinton ajustado con cationes.
Control de inòculo: contendrá 50 µl del inóculo de
trabajo preparado en el punto 2.2.3. y 50 µl de
caldo Mueller Hinton ajustado en cationes.
cepas a
Importante: rotular cada policubeta con el
nombre de la cepa que le colocó.
39
e) Incubación
Apilar las policubetas terminadas y colocar en la de
arriba un film plástico. Incubar 16-20 hs a 35º C en
ambiente aeróbico.
Al finalizar la prueba, se debe sellar cada
policubeta con tapa plástica, película plástica
autoadhesiva o bolsa plástica para evitar la
desecación. Esta cubierta plástica debe permitir el
intercambio de temperatura
Para mantener una temperatura de incubación
uniforme, se recomienda no apilar más de cuatro
policubetas.
f) Lectura e interpretación
La CIM es la menor concentración de antibiótico
capaz de inhibir completamente el desarrollo
bacteriano en el pocillo, el punto final queda
definido a simple vista por la falta de turbidez del
caldo.
Cuando en una prueba de microdilución se obtiene
un pocillo salteado, se debe leer la CIM más alta.
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden
permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se
ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final
en estos casos corresponderá a la concentración
en la que haya más del 80 % de reducción del
crecimiento comparando con el control.
Para determinar el punto final de desarrollo, debe
compararse cada pocillo de la CIM con el pocillo
control de crecimiento. El ensayo se considera
válido si en el pocillo control de crecimiento se
observa un botón de crecimiento o turbidez neta.
Si apareciera más de un pocillo salteado con
alguna droga, esta no se debería informar.
Este fenómeno ocurre por que pueden arrastrarse
sustancias antagónicas de la síntesis del ácido
fólico
Los resultados de CIM obtenidos serán
interpretados con la Tabla 2A y los organismos se
informarán sensibles, intermedios o resistentes
frente al antimicrobiano ensayado
g) Informe de los resultados
Utilizar la planilla para el registro de los resultados
40
Figuras
Figura 11
Microdilución:
Microdilución:
diluciones del ATB
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
____ml
SAT
____
µg/ml
Antibiótico:_________
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
3 ml*
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
____
µg/ml
2 ml
Reservorio para pipeta multicanal
(12 divisiones)
(*) Caldo
Mueller
Hinton
ajustado en
cationes
© Servicio ANTIMICROBIANOS – INEI - Dr. Carlos G. Malbrán
Microdilución: Colocación del ATB
Fig 12
AMP
256
128
64
32
16
8
CTX
16
8
4
2
1
0,5
CHL
512
256
128
64
32
16
CIP
4
2
1
0,5
TMS*
64
32
16
8
4
2
1
0,5
TET
512
256
128
64
32
16
8
4
2
GEN
128
64
32
16
8
4
2
1
0,5
Caldo
Inoc.
(-)
(+)
Controles
4
2
1
0,5
0,25 0,12
0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008
8
4
2
1
0,5
0,25
0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008 ,004 ,002
0,25 0,12 0,06 0,03
1
0,5
0,25
0,25 0,12 0,06
© Servicio ANTIMICROBIANOS – INEI - Dr. Carlos G. Malbrán
50 µl
(*) Se indica rango de TMP
Se deberá preparar una placa de microdilución por cada cepa a estudiar
41
Figura 13
Microdilución
Preparación y Colocación del
inóculo
Pipeta multicanal
5 ml
0,1 ml
1/100
Reservorio
0.5 de
McFarland
Cc:1x108 UFC/ml
9.9 ml
de Caldo Mueller
Hinton ajustado en
cationes
Cc final del
Inoculo
5x105 UFC/ml
50 µl
Cc:1x106 UFC/ml
Policubetas
Control de caldo
No agregar inóculo
© Servicio ANTIMICROBIANOS – INEI - Dr. Carlos G. Malbrán
42
Planilla - Registro de Resultados: Método de dilución en agar y microdilución (CIM)
AISLAMIENTOS
Antibiótico
Método
Cepa
mínima
CIM µg/ml Concentración inhibitoria
CIM
µg/ml
S,I,R
Cepa
CIM
µg/ml
S,I,R
Cepa
CIM
µg/ml
S,I,R
Cepa
CIM
µg/ml
S,I,R
E. coli ATCC®
25922
Rango
CIM
µg/ml
µg/ml
AMP
2-8
CTX
0.030.12
CHL
2-8
CIP
0.0040.016
TMS
<0.5
/9.5
TET
0.5-2
GEN
0.25-1
43
Referencias
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single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45:493-496
2. NCCLS. Evaluating production lots of dehydrated Mueller Hinton agar; Approved standard NCCLS
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