Enzimas Sesión 01

Enzimas
Sesión 01
Cinética de lar reacciones químicas
Una reacción química tiene dos características de importancia: la posición de equilibrio
(estabilidad de la concentración de productos y reactivos) y la velocidad de reacción (las
reacciones tienen por objeto determinar el mecanismo y la velocidad con que
interaccionan las moléculas bajo determinadas condiciones).
La velocidad de una reacción química puede medirse como la velocidad de formación
de uno o más de su productos o bien la velocidad de utilización de sus reactivos.
Intuitivamente podemos suponer que al aumentar la concentración de los reactivos la
probabilidad de interacción de los mismos aumenta conjuntamente con la velocidad que
procede tal reacción. Ambas variables (velocidad de reacción y concentración de los
reactivos) son directamente proporcionales, así que matemáticamente debe existir un
valor constante, de esta manera podemos escribir:
vr = k. [reactivos]n.
(velocidad de reacción) = (constante). (concentración de reactivos)n
El valor del exponente n es el orden de la reacción. Así si n = 1, estamos en presencia de
una reacción de primer orden donde la velocidad es proporcional a la reacción de un
solo reactivo. vr = k. [A]
Análogamente, cuando n = 2, la velocidad es proporcional al producto de las
concentraciones de dos reactivos o al cuadrado de la concentración de uno solo. Este
tipo de reacciones reciben el nombre de segundo orden. vr = k. [A] [B] = k [A] 2
La importancia de determinar el orden de una reacción química radica en que a partir de
ese parámetro puede obtenerse información sobre el mecanismo molecular en que
opera.
Velocidad de reacción y equilibrio
En un estado de equilibrio químico las velocidades de reacciones directa e inversa son
exactamente iguales. Considerando una reacción de primer orden:
k1 [A] = k – 1 [B]
Este principio nos permite llegar fácilmente a una reacción entre las constantes de
velocidad y de equilibrio:
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción: Energía de activación
La clave llevó al descubrimiento del criterio más importante para las reacciones
químicas, las velocidades de reacción son generalmente sensibles a la temperatura. En el
caso de las reacciones biomoleculares, un aumento de 10º C incrementa su velocidad
entre 1,5 y 5 veces. Para explicar este hecho se postuló que al acrecentar la temperatura
aumenta la fracción de moléculas capaces de tener una energía suficiente para alcanzar
un "estado activado" que luego se transforme en producto de la reacción por formación
o ruptura de enlaces químicos.
Se admite que las únicas moléculas que reaccionan son aquellas que al chocar llevan
consigo una energía mayor que un cierto valor mínimo. A este valor de energía
necesaria se lo denomina energía de activación y es un factor de suma importancia para
determinar la magnitud de la velocidad de reacción.
Catalizadores
Para que una reacción química tenga lugar se debe superar el valor de la energía de
activación. Una vez vencida esa barrera el sistema evoluciona de forma tal que llegará
al estado final de la reacción. La velocidad de reacción podría incrementarse de dos
maneras: aumentando la concentración del "complejo activado" o eventualmente
disminuyendo la energía de activación. Este último mecanismo es el que se pone de
manifiesto cuando se emplea determinadas sustancias llamadas catalizadores. Estas
sustancias aceleran las reacciones químicas disminuyendo la energía libre de activación,
se combinan con los reactivos para producir un estrato de transición de menor energía
que el estado de transición de la reacción no catalizada. Cuando los productos de la
reacción se forman, se regenera el catalizador al estado libre.
Enzimas: catalizadores biológicos
Las reacciones químicas en sistemas biológicos raramente ocurren en ausencia de un
catalizador. Estos catalizadores se denominan enzimas y son en su totalidad moléculas
de naturaleza proteica (aunque ha habido estudios acerca de enzimas de naturaleza
glucosídica).
Es razonable pensar en la necesidad que tienen los seres vivos de poseer estos
catalizadores, ya que las funciones vitales de cualquier célula serían imposibles de
mantener si las reacciones que ocurren en ella fueran extremadamente lentas.
Además de incrementar la velocidad las enzimas exhiben una elevada especificidad y en
algunos casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, aumentando y otras
veces disminuyendo, de acuerdo a las necesidades del momento, su actividad.
Todas estas propiedades pueden ser cumplidas por moléculas altamente complejas, que
al ser moléculas orgánicas (macromoléculas) comparten características con las proteínas
no enzimáticas y difieren de los catalizadores inorgánicos:
a) Son termolábiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del medio.
b) El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (denominado sustrato) es
altamente específico.
c) Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran número de moléculas de
sustrato por unidad de tiempo.
d) Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y alostéricos .
Como todos los catalizadores las enzimas aceleran notablemente la velocidad de una
reacción química y cumplen con las siguientes características:
1) Son efectivas en pequeñas cantidades
2) No sufren modificaciones químicas irreversibles durante la catálisis. Es decir que
luego de la reacción enzimática, las moléculas de enzimas que reaccionaron son
indistinguibles de las que no lo han hecho, (la estructura de la molécula se mantiene, al
principio y final de la reacción, exactamente igual).
3) No afectan la posición de equilibrio de la reacción que catalizan. El estado inicial y
final de la reacción es el mismo, solo que se llega al equilibrio mucho más rápidamente.
Nomenclatura y clasificación
Una forma general de denominar a las enzimas es añadir el sufijo "asa" al nombre del
sustrato. Así, la ureasa es la enzima que cataliza la hidrólisis de la urea formando
amoníaco y dióxido de carbono.
Sin embargo con el descubrimiento de nuevas enzimas esta nomenclatura resulta a
veces confusa. Actualmente se ha adoptado ciertas recomendaciones de la Internacional
Enzime Comission, que pretende sistemetizar la nomenclatura y clasificación de las
diferentes enzimas conocidas. Este sistema divide a las enzimas en seis clases que a su
vez pueden tener diferentes subclases.
Clasificación Internacional de las Enzimas
Óxido – Reductasas (reacciones de oxido- reducción)
Actúan sobre ": CH – OH "
Actúan sobre ": C = O "
Actúan sobre ": C = CH – "
Actúan sobre ": CH – NH2 "
Actúan sobre ": CH – NH – "
Hidrolasas (reacciones de hidrólisis)
Esteres
Enlaces glucosídico
Enlaces pepsídicos
Otros enlaces C – N
Anhídridos de ácido
Transferasas (transferencia de grupos funcionales)
Grupos de un átomo de C
Grupos aldehídos o cetónicos
Grupos acilos
Grupos glucosilos
Grupos fosfatos
Grupos que contienen azufre
Liasas (Adición a los dobles enlaces)
:C=C:
:C=O
:C=N–
Isomerasas (reacción de isomerización)
Racemasas
Ligasas (Formación de enlaces con escisión de ATP)
:C–O
:C–N
:C–S
:C–C
Los nombres propuestos en este sistema son los que se emplean cuando es necesaria una
identificación exacta de las enzimas, (por ejemplo en revistas científicas). Sin embargo,
cotidianamente pueden emplearse los nombres triviales por ser mucho más conocidos.
Cofactores
Algunas enzimas dependen para su actividad catalítica además de la estructura proteica,
de otras moléculas de naturaleza no proteica. Estas estructuras reciben el nombre de
cofactores. Estos son resistentes al calor mientras que las proteínas generalmente no lo
son.
El complejo enzima – cofactor recibe el nombre de holoenzima. A la fracción proteica
aislada del cofactor que es inactiva se la denomina apoenzima. Los cofactores pueden
ser simplemente iones metálicos o en algunos casos moléculas orgánicas complejas.
Estas últimas el nombre de coenzimas.
Holoenzima = Apoenzima + Coenzima
Activadores Metálicos
Elemento
Enzima Activada
Zn++
Deshidrogenasas, anhidrasa carbónica, ARN y ADN polimerasas.
Mg++
Fosfohidrolasas, fosfotransferasas, fosfatasas.
Mn++
Arginasas, peptidasas, quinasas.
Mo
Nitratoreductasa, nitrogenasa.
Fe2+, Fe3+
Citocromos, catalasas, ferredoxina, peroxidasas, nitritoreductasa.
Cu2+
Citocromo oxidasa, tirosinasa, ácido ascórbico oxidasa, plastocianina
Ca2+
1,3 β glucansintetasa, calmodulina.
K+
Piruvato fosfoquinasa, ATPasa.
Co
Vitamina B12 hallada en microorganismos y animales, pero no en plantas. Importante en
la fijación simbiótica de nitrógeno.
Ni
Ureasa.
En ciertos casos las coenzimas están estrechamente unidas a la molécula de la enzima y
reciben el nombre del grupo prostético. Un ejemplo clásico lo constituye el grupo hemo
del citocromo C, unido covalentemente a la proteína. Entre los cofactores que requieren
las enzimas para su funcionamiento están las coenzimas: NADPH + H (nicotinamida
adenina dinucleótido fosfato reducido), NAD (nicotinamida adenina dinucleotido), FAD
(flavina adenina dinucleótido), piridoxal, biotina, tiamina, ácido tetra hidrofólico,
cobalamina.
Cinética de las Reacciones Enzimáticas
En principio, las consideraciones generales de la cinética química pueden aplicarse a las
reacciones catalizadas enzimáticamente, aunque estas últimas tienen la particularidad de
mostrar el fenómeno de saturación por el sustrato.
A una concentración constante de enzima, si vemos el gráfico de la velocidad de la
reacción catalizada enzimáticamente en función de la concentración del sustrato, es
evidente que a bajas concentraciones del mismo la velocidad de formación de producto
es proporcional a la concentración del sustrato. A medida que se aumenta la
concentración de sustrato se aprecia una pérdida de la proporcionalidad, en esta zona la
reacción es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la
reacción es independiente de esta.
Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una región determinada del mismo
llamada sitio activo. El fenómeno de saturación junto con otras evidencias llevaron a
postular la existencia de un complejo enzima – sustrato (E – S) como etapa previa a la
formación de productos.
En 1913 Lenor Michelis dedujo la relación entre la velocidad máxima (vm) de una
reacción catalizada enzimáticamente en términos de la formación del complejo E – S.
En base a estas consideraciones es lógico suponer que a altas concentraciones de
sustrato, todos los sitios activos de la enzima están ocupados y por lo tanto la velocidad
alcanza un máximo. El modelo propuesto sirve de base para explicar las propiedades de
la mayoría de las enzimas y como se dijo antes asume la existencia de un complejo E –
S como intermediario en la catálisis.
Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo E – S, con una
constante de velocidad k1. Este complejo E – S puede seguir dos caminos: a) puede
proceder para formar el producto con una constante de velocidad k3; b) el camino
alternativo es disociándose, generando nuevamente E y S con una constante de
velocidad k2.
En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será :
v = k3 [E – S]
El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión
equivalente con valores conocidos. Mediante desarrollo matemático se ha desarrollado
la siguiente ecuación:
Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente. Obtención del km. y la vmax.
Resumiendo, si se mantiene la concentración de la enzima constante y variamos la
concentración de substrato se obtiene una curva hiperbólica como la de la figura (arriba
izquierda). Al principio un aumento de la concentración de substrato produce un
aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si se sigue aumentando la
concentración de substrato, la velocidad de reacción comienza a disminuir; vemos que a
muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de
reacción, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La
velocidad de reacción que se obtiene a esa alta concentración de substrato se define
como la velocidad máxima (vm) de la reacción enzimática bajo las condiciones
especificadas. La concentración de substrato [S], a la semivelocidad máxima de
reacción (½ v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o
km, la cual es una característica para cada enzima. La inversa de km, o 1/ km, mide
aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras más pequeño sea el
valor de km, mayor será la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas
compiten en el metabolismo por el mismo substrato, éste será transformado
preferentemente por la enzima con mayor afinidad.
Así tendremos:
(simplificando)
Si reordenamos la ecuación tendremos que: [S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]
Esto significa que la concentración del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la
velocidad es el valor de km de la enzima.
La expresión de Michelis – Menten puede ser transformada algebraicamente en otras
formas, que son más útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de esas
formas consiste en tomar los recíprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuación.
Esta expresión conocida con el nombre de ecuación Lineweaver – Burk, corresponde a
una recta de ecuación :
y = a.m + b
Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando
gráficamente (al lado) obtendremos una gráfica del tipo lineal.
Centro activo de una enzima
Ya se había mencionado que la porción de la molécula en la enzima que se una al o a
los sustratos es una zona relativamente pequeña de la misma. Esta zona , responsable de
la actividad catalítica, que favorece la orientación de los grupos químicos (que
reaccionan para dar los productos de la reacción) recibe el nombre de centro activo.
Los grupos responsables de la actividad catalítica propiamente dicho se los denomina
sitios catalíticos. En algunos casos esos grupos pueden corresponder a los grupos
prostéticos de los cuales ya se ha hablado.
Expresión de la actividad enzimática
La cantidad de enzimas presentes en un fluido biológico es muy difícil de determinar en
valores absolutos, mg. o moles, una forma de resolver este problema es midiendo la
velocidad de reacción catalizada por la misma empleando un sustrato específico. La
velocidad de reacción puede expresarse como la cantidad de reactivo que se transforman
en producto por unidad de tiempo. De allí que la unidad internacional (UI) de cualquier
enzima se define como la cantidad de la misma que cataliza la transformación de un mol
de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas: pH, temperatura, concentración de
sustrato/s y cofactores, etc.
En base a lo que se acaba de explicar es posible expresar la cantidad de una enzima en
un fluido biológico en UI/cm3 o en UI/ mg. de proteína total. Esta última expresión
denominada actividad específica es la cantidad de moles de sustrato transformados por
minuto y por mg. de proteína, debiéndose indicar la temperatura, el pH, etc.
Es importante recordar que la actividad específica de una enzima es una medida
indirecta de la fracción de la proteína total en una preparación que contienen a la
enzima.
Factores que influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas
Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de
reacción hasta cierta temperatura óptima, ya que después de aproximadamente 450 C se
comienza a producir la desnaturalización térmica. Las enzimas de muchos mamíferos
tienen una temperatura óptima de 370 C, por encima de esa temperatura comienzan a
inactivarse y se destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan
en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias árticas tienen
temperaturas óptimas cercanas a 00 C.
Efecto Del pH Sobre La Actividad Enzimática: El pH no afecta la actividad enzimática
directamente sino que modifica la concentración de protones. Los protones además de
alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la reacción
como substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta
directamente la velocidad de la reacción.
Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar
el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando
así las propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la
desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación.
Enzimas:
Tripsina 7,7
Catalasa 7,6
Pepsina 1,5 (pH óptimo)
Arginasa 9,7
Fumarasa 7,8
Ribonucleasa 7,8
Inhibición Enzimática
La actividad enzimática puede ser disminuida o eliminada por la acción de ciertas
sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimáticos.
Mediante el uso de inhibidores enzimáticos se ha obtenido información muy valiosa
sobre la conformación del centro activo de algunas enzimas.
Las distintas formas de interacción se traducen en varios tipos de inhibición
perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos tipos más comunes son la
competitiva y la no competitiva. La primera es cuando el inhibidor compite con el
substrato por la unión con el centro activo de la enzima. Este tipo de inhibición puede
reducirse si se aumenta la concentración de substrato. Un ejemplo clásico lo constituye
la inhibición del malonato sobre la enzima succinato deshidrogenasa que cataliza la
eliminación de dos átomos de hidrógeno de los átomos de carbono metilénico del
succinato. En la segunda el inhibidor forma un enlace covalente con las enzimas cerca
del centro activo sin modificarla irreversiblemente. Un ejemplo son los gases nerviosos,
como el fluorofosfato de di isopropilo (DFP) que forma un complejo con la enzima
acetilcolinesterasa. Los animales envenenados con este gas quedan paralizados, debido
a la imposibilidad de transmitir adecuadamente los impulsos nerviosos.
Ciertos metales como el plomo, mercurio y arsénico inhiben enzimas que tienen en su
centro activo grupos – SH libres.
El proceso de inhibición enzimática es útil para comprender los mecanismos de acción
tóxica y farmacológica de algunos compuestos.
Isoenzimas
Son enzimas que difieren en su forma estructural pero que poseen la misma actividad
catalítica, catalizan la misma reacción.