Lelli, Sandra Marcela. 2013 02 26 - Biblioteca Digital de la Facultad

Cómo se altera el metabolismo y transporte de
glucosa en porfiria experimental crónica y aguda.
Una aproximación mecanística
Lelli, Sandra Marcela
2013 02 26
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
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Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Cómo se altera el metabolismo y transporte de glucosa en porfiria
experimental crónica y aguda. Una aproximación mecanística.
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
en el área de Química Biológica.
LIC. SANDRA MARCELA LELLI
Director de Tesis:
Dra. Leonor Carmen San Martín de Viale.
Director Asistente:
Dra. Marta Blanca Mazzetti.
Consejero de Estudios:
Dra. Elba Vazquez.
Laboratorio de Disturbios Metabólicos por Xenobióticos, Salud Humana y Medio Ambiente.
(DIMXSA- QB66). Departamento de Química Biológica, FCEyN- UBA.
Buenos Aires, 2012
CÓMO SE ALTERA EL METABOLISMO Y TRANSPORTE DE GLUCOSA EN PORFIRIA
EXPERIMENTAL CRÓNICA Y AGUDA. UNA APROXIMACIÓN MECANÍSTICA.
Este trabajo de Tesis fue realizado utilizando ratas Wistar como animales de
experimentación y drogas tales como el hexaclorobenceno para inducir una porfiria
crónica, y la 2-alil-2-isopropilacetamida junto con el 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4dihidrocolidina, para modelar una porfiria aguda. Se logró así relacionar ambas
patologías modeladas con importantes alteraciones en diversos aspectos del
metabolismo de los hidratos de carbono (rutas anabólicas y catabólicas del glucógeno,
de la glucosa y su transporte), del metabolismo oxidativo (que lleva a la producción de
especies reactivas de oxígeno, ROS), del triptófano (TRP) y de los glucocorticoides
(GC) (niveles, síntesis y receptores), todos ellos campos que han sido muy poco
estudiados en las porfirias. Se establecen además inter-relaciones e inter-regulaciones
metabólicas y hormonales entre el metabolismo del hemo (que es donde las fallas
generan la porfiria), los metabolismos recién mencionados, el de los GC y la insulina,
con particular atención en la actividad de la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK),
enzima regulatoria clave de la gluconeogénesis.
Así los disturbios hormonales y metabólicos encontrados en los modelos tanto
de porfiria crónica como aguda, confluyen y dan cuenta de un descenso en la
disponibilidad de glucosa en el hepatocito que modularía la porfiria, exacerbando la
enzima regulatoria del camino del hemo, ALA-sintetasa. Por otro lado sustentarían el
porqué del efecto benéfico de la administración de glucosa en la terapia de las porfirias,
especialmente de la porfiria aguda, que es la más crítica y provoca un riesgo de vida.
Asimismo, es de destacar el efecto benéfico de la melatonina, reportado en el
presente trabajo, en los tres metabolismos investigados para la porfiria aguda. Así como
la importante disrupción hormonal que se reporta a nivel de los GC tanto a nivel
plasmático como en su síntesis adrenal y receptores hepáticos en el modelo crónico de
porfiria cutanea tarda. También es mencionable la contribución de las ROS, TRP y GC
al descenso de la PEPCK. Los resultados de esta Tesis tienen implicancias en el campo
de la toxicología, medicina y de la química biológica.
Palabras claves: porfiria, glucosa, glucocorticoides, triptófano, ROS, PEPCK.
ii
HOW METABOLISM AND TRANSPORT OF GLUCOSE ARE ALTERED IN CHRONIC AND
ACUTE EXPERIMENTAL PORPHYRIA. A MECHANISTIC APPROACH.
This Thesis work was performed using Wistar rats as experimental animals and
drugs such as hexachlorobenzene to induce chronic porphyria, and 2-allyl-2isopropylacetamide combined with 3',5'-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine to
model acute porphyria. Thus, both modeled pathologies were related with significant
alterations in several aspects of carbohydrates metabolism (catabolic and anabolic
pathways of glycogen, glucose and its transport), of oxidative metabolism (which leads
to production of reactive oxygen species, ROS), of tryptophan (TRP) and
glucocorticoids (GC) (levels, synthesis and receptor), all fields that have been very
poorly studied in porphyrias. In addition, metabolic and hormonal inter-relations and
inter-regulations were established between heme metabolism (where defects generate
porphyria), the metabolisms above mentioned, that of GC and insulin, with particular
attention on phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) activity, key regulatory
enzyme of gluconeogenesis.
Thus, hormonal and metabolic disturbances found in experimental models of both
chronic and acute porphyria, converge and account for a decrease in the availability of
glucose in the hepatocyte that would modulate the porphyria, exacerbating the
regulatory enzyme of heme pathway, ALA-synthase. Furthermore they could explain
why the beneficial effect of the glucose administration in the therapy of porphyrias,
especially of acute porphyria, which is the most dangerous since it is a life-threatening
disease.
It is also noteworthy the beneficial effect of melatonin, observed in three
metabolisms investigated in acute porphyria, here reported. Just as the important
hormonal disruption found at the level of GC, both in plasma as well as in the adrenal
synthesis and hepatic receptors in chronic model of porphyria cutanea tarda. Also worth
of mentioning is the contribution of ROS, TRP and GC to the PEPCK decrease. The
results of this Thesis have implications in fields of toxicology, medicine and biological
chemistry.
Keywords: porphyries, glucose, glucocorticoids, tryptophan, ROS, PEPCK.
iii
Agradecimientos
Una etapa muy ardua de mi vida hoy está concluyendo. Estuve rodeada de gente que hizo más
fácil el camino, que me acompañó, aconsejó y empujó hacia el frente. Gente a la que no quiero dejar de
agradecerle con todo mi corazón por haber estado tan cerca durante estos años de trabajo y vida...
... A la Dra. San Martín de Viale, por brindarme la posibilidad de trabajar en su laboratorio, por su
dirección y supervisión en la labor de Tesis y en particular, por sus consejos dados desde el corazón
que fueron y siguen siendo, de gran valor para mí.
... A la Dra. Mazzetti, por permitirme trabajar con ella y desarrollar parte importante de mi trabajo
de Tesis a su lado; y sobre todo por darme un sincero apoyo moral en los momentos difíciles.
... A la UBA, por el otorgamiento de las becas que me permitieron desarrollar este trabajo de Tesis.
... A la gente del Dpto. de Química Biológica, por darme el lugar físico y el tiempo necesario para
realizar mi trabajo. A Martín y Ayelén, por su enorme colaboración respecto a temas académicos y
administrativos.
... A mis queridísimas Doctoras y amigas: Adriana, Silvia, Nora y María del Carmen, por brindarme
todos sus conocimientos, para que a lo largo de estos años, pudiera adquirir importante aprendizaje y
criterio para “comprender” el trabajo de laboratorio e investigación.
... A la memoria de la Dra. M. Cristina Taira, que estará por siempre en mi corazón.
... A Carmen A. Aldonatti, por las innumerables tareas como Técnica en las que ha colaborado en mi
trabajo, por ser mi mejor compañía en el laboratorio, pero sobre todo, por el cariño que me dio y sigue
dándome como amiga.
... A mis chiquis, amiga/os y compañera/os que conocí trabajando en las largas jornadas del Labo:
Moni, Juli, Gise y Fede… a los que quiero muchísimo!
... A todas las que de una u otra manera ayudaron en este trabajo siendo mis compañeras de pasillo,
las Doctoras Silvina Gazzaniga, Claudita Martini, Gaby Chaufan, Mary Tomio y M. del Carmen
Vila, por aportar siempre su mejor consejo cuando les fue requerido de mi parte.
...en lo personal, al apoyo incondicional de mi entrañable familia: Papá y Mamá ante todo, hermanos,
sobrinos, suegros, cuñados y a los más gloriosos amigos: Tere, Ri, Ale, Fred, Gabita y Adrián!
Pero sé que nunca hubiese logrado terminar sola con esta enorme tarea, sin la pasión y el esfuerzo
que juntos y a la par pusieron por mí, estos dos amores inconmensurables: Marcelo y Damián ♥
A todos, ¡Muchas Gracias!
iv
No te rindas, Aún estás a tiempo,
De alcanzar y comenzar de nuevo,
Aceptar tus sombras, Enterrar tus miedos,
Liberar el lastre, Retomar el vuelo.
No te rindas, Que la vida es eso,
Continuar el viaje,
Perseguir tus sueños,
Destrabar el tiempo,
Correr los escombros, Y destapar el cielo...
Fragmento de “No te Rindas”, de M. Benedetti.
Dedicada a mi Papá y a toda mi gente amada.
v
Las siguientes publicaciones son parte de los resultados presentados en esta Tesis:
Lelli SM., Mazzetti MB., San Martín de Viale LC. (2001) Melatonin,
carbohydrates and experimental acute porphyria. Biocell; Supl. II, 25: 100.
Mazzetti MB., Taira MC., Lelli SM., San Martín de Viale LC. (2004)
Hexachlorobenzene impairs glucose metabolism in a rat model of porphyria
cutanea tarda: a mechanistic approach. Archives of Toxicology; 78: 25-33.
Taira MC., Mazzetti MB., Lelli SM., San Martín de Viale LC. (2004) Glycogen
metabolism and glucose transport in experimental porphyria. Toxicology; 197:
165-175.
Lelli SM., San Martín de Viale LC., Mazzetti MB. (2005) Response of glucose
metabolism enzymes in an acute porphyria model. Role of reactive oxygen
species. Toxicology; 216: 48-58.
Lelli SM., Ceballos NR., Aldonatti CA., Mazzetti MB., San Martín de Viale LC.
(2007)
Hexachlorobenzene
as
hormonal
disruptor-
Studies
about
glucocorticoids: their hepatic receptors, adrenal synthesis and plasma levels in
relation to impaired gluconeogenesis. Biochemical Pharmacology; 73: 873-879.
Lelli SM., Mazzetti MB., San Martín de Viale LC. (2008) Hepatic alteration of
tryptophan metabolism in an acute porphyria model. Its relation with
gluconeogenic blockage. Biochemical Pharmacology; 75: 704-712.
vi
INDICE DE CONTENIDOS
I-
ABREVIATURAS ............................................................................................................. xii
1-
INTRODUCCIÓN GENERAL ....................................................................................... 17
1.1. METABOLISMO DEL HEMO - PORFIRIAS HUMANAS Y EXPERIMENTALES ...... 17
1.1.1. Metabolismo del hemo – Su regulación y alteraciones................................................. 17
1.1.2. Alteraciones en el camino del hemo. Porfirias crónicas y agudas ................................ 22
1.1.3. Porfirias experimentales inducidas por compuestos porfirinogénicos. ......................... 28
1.1.4. HCB -Mecanismo porfirinogénico. Efectos sobre CYP y su metabolismo. ................. 31
1.1.5. AIA. Mecanismo porfirinogénico: sus efectos sobre CYP y sobre el ALA-S .............. 38
1.1.6. DDC. Mecanismo porfirinogénico: sus efectos sobre CYP y sobre la FQ ................... 41
1.2. METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO, SU REGULACIÓN ................ 42
Generalidades.......................................................................................................................... 42
1.2.1 Metabolismo de la glucosa ........................................................................................ 44
1.2.2 Gluconeogénesis: Las enzimas claves. ...................................................................... 46
1.2.3 Glucólisis: descripción de los pasos de la vía. ........................................................... 53
1.2.3.1. Paso final de la Glucólisis. Regulación de la piruvato quinasa (PK) ................... 55
1.2.4. Glucogenogénesis y glucógenolisis: GS y GP como enzimas claves ........................ 58
1.2.5. Glucocorticoides: Regulación sobre el metabolismo de hidratos de carbono............ 61
1.2.6. Porfirias y su relación con el metabolismo de los hidratos de carbono. ...................... 63
1.3. ESTRÉS OXIDATIVO ........................................................................................................ 64
1.3.1. Radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS)............................................... 64
1.3.2. Toxicidad de xenobióticos mediada por especies reactivas .......................................... 69
1.3.3. Toxicidad sobre las macromoléculas mediadas por ROS. ............................................ 70
1.3.2.1. Reacciones sobre proteínas, DNA, glúcidos y lípidos. .......................................... 70
1.3.4. Sistemas de defensas antioxidantes .............................................................................. 71
1.3.5. La melatonina como atrapante. ..................................................................................... 73
1.4. TRIPTÓFANO ..................................................................................................................... 75
1.4.1. Sus metabolitos. Caminos de degradación. ................................................................... 75
1.4.2. Importancia de los metabolitos del TRP ....................................................................... 78
1.4.3. Acción del TRP sobre el metabolismo de los hidratos de carbono ............................... 82
2-
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 85
2.1. OBJETIVOS GENERALES ................................................................................................ 85
2.2. OBJETIVOS PARTICULARES .......................................................................................... 85
2.2.1 Objetivos particulares: Modelo de porfiria crónica por intoxicación con HCB ............ 85
2.2.2 Objetivos particulares: Modelo de porfiria aguda generada con AIA/DDC .................. 85
3-
MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 90
3.1. ANIMALES ......................................................................................................................... 90
3.2. DROGAS Y REACTIVOS. ................................................................................................. 90
3.2.1- Equipos ......................................................................................................................... 92
vii
3.3. TÉCNICAS Y TRATAMIENTOS SOBRE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ...... 93
3.3.1. Drogado de animales - Modelo de Porfiria Crónica por HCB. ..................................... 93
3.3.2. Drogado de animales - Modelo de Porfiria Aguda por AIA/DDC ............................... 93
3.3.3. Tratamiento con Melatonina, como antioxidante preventivo. ...................................... 94
3.4 DETERMINACIONES HEPÁTICAS- PREPARACIÓN DEL TEJIDO. ............................ 96
3.4.1. Determinación de actividades enzimáticas del camino del hemo. .............................. 100
3.4.1.1. Actividad hepática de la 5-aminolevulínico-sintetasa (ALA-S)........................... 100
3.4.1.2. Actividad Uroporfirinógeno-decarboxilasa (URO-D) ........................................ 100
3.4.1.3 Actividad ferroquelatasa (FQ) ............................................................................. 102
3.4.2. Contenido de intermediarios hepáticos del camino del hemo. .................................... 103
3.4.2.1. Contenido hepático de ALA y PBG ..................................................................... 103
3.4.2.2. Contenido de porfirinas hepáticas ...................................................................... 103
3.4.3. Determinación de actividades enzimáticas hepáticas-Gluconeogénesis y Glucólisis. 104
3.4.3.1. Actividad fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) ....................................... 104
3.4.3.2. Actividad piruvato carboxilasa (PC) .................................................................. 104
3.4.3.3. Actividad glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa) ............................................................. 105
3.4.3.4. Actividad piruvato quinasa (PK) ......................................................................... 106
3.4.4. Contenido de glucógeno hepático ............................................................................... 106
3.4.5. Transporte de glucosa por tejido hepático- Captación por el hepatocito .................... 107
3.4.6. Determinación de actividades enzimáticas del metababolismo del glucógeno........... 108
3.4.6.1. Actividad de la Glucógeno Sintetasa (GS) .......................................................... 108
3.4.6.2. Actividad de la Glucógeno Fosforilasa (GP) ...................................................... 108
3.4.7. Determinación de parámetros de estrés oxidativo. ..................................................... 109
3.4.7.1. Determinación de la peroxidación lipídica por TBARS ..................................... 109
3.4.7.2. Concentración de proteínas carboniladas........................................................... 110
3.4.8. Actividades de las defensas antioxidantes .................................................................. 110
3.4.8.1. Actividad superóxido dismutasa (SOD) .............................................................. 110
3.4.8.2 Actividad Catalasa (CAT) .................................................................................... 111
3.4.9. Determinación de receptores de glucocorticoides (GR) ............................................. 112
3.4.10. Determinación de metabolitos hepáticos del TRP por HPLC................................... 113
3.3.11- Enzimas del camino quinurenérgico: actividad de la TRP pirrolasa. ....................... 113
3.5 DETERMINACIONES URINARIAS ................................................................................ 114
3.5.1. Contenido de intermediarios del camino del hemo- ALA, PBG y porfirinas ............. 114
3.5.1.1. ALA y PBG en orina ............................................................................................ 114
3.5.1.2. Porfirinas urinarias de ratas ............................................................................... 115
3.5.2. Determinación de parámetros de estrés oxidativo (QL) ............................................. 115
3.6 DETERMINACIONES PLASMÁTICAS .......................................................................... 116
3.6.1. Contenido de glucosa plasmática ................................................................................ 116
3.6.2. Determinación de insulina plasmática ........................................................................ 116
3.6.3. Determinación de corticosterona plasmática. ............................................................. 116
3.7 DETERMINACIONES EN OTROS TEJIDOS .................................................................. 117
3.7.1. Determinación de la captación de glucosa en grasa parda, timo y bazo .................... 117
3.7.2. Determinación de insulina pancreática en islotes de Langerhans ............................... 118
3.7.3. Determinación de corticosterona en glándulas adrenales. .......................................... 119
3.7.4. Determinación de proteínas ........................................................................................ 120
3.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ............................................................................................. 120
4-
RESULTADOS ............................................................................................................... 122
viii
4.1. MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA CRÓNICA POR HCB ................................. 122
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO
EXPERIMENTAL? .................................................................................................................. 122
4.1.1. Parámetros hepáticos y actividad enzimática clave del camino del hemo. ................. 122
4.1.2. Intermediarios del camino del hemo en orina. Determinación de porfirinas. ............. 123
EN BUSCA DE ALTERACIONES PROVOCADAS SOBRE EL METABOLISMO DE
LA GLUCOSA EN ESTA PCT EXPERIMENTAL ................................................................ 125
4.1.3. Niveles plasmáticos de glucosa y contenido de glucógeno hepático. ........................ 125
4.1.4. Actividades enzimáticas del metabolismo de la glucosa ............................................ 127
¿EXISTIRÁ VARIACIÓN EN LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA DE RATAS
TRATADAS CON HCB, EN LOS DIVERSOS TEJIDOS ESTUDIADOS? .......................... 131
4.1.5. Perturbaciones del transporte de glucosa en órganos y tejidos. .................................. 131
4.1.5.1. Captación de glucosa por el tejido hepático ....................................................... 132
4.1.5.2. Captación de glucosa por otros tejidos: grasa parda, timo y bazo..................... 132
¿HAY CAMBIOS EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO DEBIDOS A LA
ACCIÓN DEL HCB? ................................................................................................................ 136
4.1.6. Metabolismo del glucógeno. Niveles y actividades enzimáticas .............................. 136
4.1.6.1. Contenido hepático de glucógeno ....................................................................... 136
4.1.6.2. GS - Síntesis del glucógeno ................................................................................ 137
4.1.6.3. GP - Degradación del glucógeno ........................................................................ 138
EN BUSCA DE LAS CAUSAS DEL DESCENSO DE LA PEPCK Y LA GP:
¿SE DEBERÁ A INTERFERENCIAS EN EL SISTEMA REDOX? ..................................... 140
4.1.7. Parámetros de estrés oxidativo- Producción de ROS.................................................. 140
4.1.7.1. Peroxidación lipídica en tejido hepático ............................................................. 141
4.1.7.2. Quimioluminiscencia urinaria (QL) .................................................................... 143
¿EXISTEN ALTERACIONES DEL ESTADO HORMONAL QUE REGULA EL
METABOLISMO DE LA GLUCOSA? ESTUDIOS SOBRE GC E INSULINA. ................. 143
4.1.8. Determinación del nivel de insulina en plasma y secreción pancreática .................... 143
4.1.9. Glucocorticoides plasmáticos (CORT), receptores (GR) y síntesis adrenal ............... 145
4.1.9.1 Concentración de CORT vs. Porfirinas. .............................................................. 145
4.1.9.2 Análisis del número y afinidad de los GR hepáticos. ........................................... 146
ESTUDIANDO LA RAZÓN DE LA CAÍDA EN LA CONCENTRACIÓN DE CORT POR
EFECTO DEL HCB. ¿SERÁ DEBIDO A DEFECTOS EN SU SÍNTESIS ADRENAL? ...... 148
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO EN ESTE
MODELO DE PCT EXPERIMENTAL POR HCB.................................................................. 149
4.1.10. Contenido hepático de triptófano .............................................................................. 149
4.1.11. Metabolitos hepáticos del TRP medidos por HPLC. ................................................ 149
4.1.11.1. Cromatogramas de elución. .............................................................................. 149
4.2. MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA POR AIA/DDC ............................. 151
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO
EXPERIMENTAL DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA? ..................................................... 151
4.2.1. Actividades enzimáticas y precursores del camino del hemo. .................................... 151
4.2.1.1 La actividad ALA-S es dosis dependiente ............................................................ 151
4.2.1.2 Actividad Ferroquelatasa (FQ) ........................................................................... 152
ix
4.2.1.3 Contenidos hepáticos de ALA y PBG dosis dependiente ...................................... 153
ALTERACIONES PROVOCADAS EN EL METABOLISMO DE LA GLUCOSA:
GLUCONEOGÉNESIS, GLUCÓLISIS. ................................................................................. 155
4.2.2. Actividades enzimáticas de la gluconeogénesis.......................................................... 155
4.2.2.1. Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK)..................................................... 156
4.2.2.2. Glucosa 6 fosfatasa (G6Pasa) ............................................................................ 157
4.2.3. Glucólisis- Piruvato Quinasa (PK).............................................................................. 158
DAÑOS PROMOVIDOS EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO ............................. 159
4.2.4. Niveles de glucógeno y actividades enzimáticas de su metabolismo ......................... 159
4.2.4.1. Glucógeno hepático total..................................................................................... 159
4.2.4.2. Glucógeno Sintetasa (GS) ................................................................................... 160
4.2.4.3. Glucógeno fosforilasa (GP) - Degradación del glucógeno ................................. 161
4.2.5. Transporte de glucosa en tejido hepático .................................................................... 162
EN BUSCA DE LAS CAUSAS DEL DESCENSO DE PEPCK Y GP- INTERFERENCIAS
EN EL SISTEMA REDOX ....................................................................................................... 163
4.2.6. Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)- Estrés oxidativo. ..................... 163
4.2.6.1. Peroxidación lipídica en tejido hepático ............................................................ 163
4.2.6.2. Carbonilación de proteínas en tejido hepático ................................................... 165
4.2.6.3- Quimioluminiscencia urinaria (QL).................................................................... 166
4.2.7. Actividades de las defensas antioxidantes .................................................................. 167
4.2.7.1. Actividad superóxido dismutasa (SOD) .............................................................. 167
4.2.7.2. Actividad catalasa (CAT) .................................................................................... 168
MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE PREVENTIVO A LA INTOXICACIÓN. ......... 169
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRP EN ESTE MODELO DE
PORFIRIA AGUDA ................................................................................................................. 171
4.2.8 Camino serotoninérgico ............................................................................................... 172
4.2.9. Enzimas del camino quinurenérgico. Actividad de la TRPp. ..................................... 172
5-
DISCUSIÓN .................................................................................................................... 175
5.1. MODELO DE PORFIRIA CRÓNICA POR HCB. ...................................................... 175
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO DE
PORFIRIA CRÓNICA EXPERIMENTAL POR HCB? .......................................................... 175
ALTERACIONES PROVOCADAS SOBRE EL METABOLISMO DE LA GLUCOSA
EN ESTE MODELO DE PCT EXPERIMENTAL ................................................................... 177
VARIACIÓN EN LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA POR DIVERSOS TEJIDOS DE
RATAS TRATADAS CON HCB ............................................................................................. 180
CAMBIOS EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO DEBIDOS A LA ACCIÓN
DEL HCB .................................................................................................................................. 181
LAS CAUSAS DEL DESCENSO DE LA PEPCK Y LA GP: INTERFERENCIAS EN EL
SISTEMA REDOX ................................................................................................................... 183
ALTERACIONES DEL ESTADO HORMONAL. ESTUDIOS SOBRE
GLUCOCORTICOIDES E INSULINA ................................................................................... 186
x
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO EN ESTE MODELO
DE PCT EXPERIMENTAL POR HCB.................................................................................... 192
CONCLUSIÓN PARA EL MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA CRÓNICA POR HCB .. 193
5.2. MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA POR AIA/DDC ............................. 196
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO
EXPERIMENTAL DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA? ..................................................... 196
ALTERACIONES EN LAS ENZIMAS CLAVES DEL METABOLISMO DE LA
GLUCOSA. ............................................................................................................................... 198
DAÑOS SOBRE EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO. ............................................... 199
OTRA POSIBLE CAUSA DEL DESCENSO DE PEPCK y GP - INTERFERENCIAS
EN EL SISTEMA REDOX ......................................................... . ........................................... 201
MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE PREVENTIVO EN LA INTOXICACIÓN
AGUDA POR AIA/DDC. ......................................................................................................... 205
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRP EN ESTE MODELO DE
PORFIRIA AGUDA ................................................................................................................. 207
6- CITAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 213
xi
i-
ABREVIATURAS
1,3 diPGA
2-AAF
5-COOH´gen
5-HIAA
5-HT
5-HTRP
6-COOH´gen
7-COOH´gen
7-COOH
8-COOH
8-OH-dG
AAD
AAT
ACTH
AD-P
ADP
AIA
ALA
ALA-D
ALA-S
ALAS-1
ALAS-2
AMP
AMPc
ANOVA
ATP
Bapp
BSA
CAT
CoA
COPRO
COPROgen III
CORT
CPH
CPK
CPM
CPO
CRH
CS
CYP
DDC
DEX
1,3 Difosfoglicerato
2-Acetilaminofluoreno
Penta-Carboxiporfirinógeno
5-Hidroxindolacético
Serotonina o 5-Hidroxitriptamina
5-Hidroxitriptófano
Hexa-Carboxiporfirinógeno
Hepta-Carboxiporfirinógeno
Firiaporfirina
Uroporfirina
8-Hidroxi-2´-Desoxiguanosina
Aminoácidos Aromáticos Decarboxilasa
Alanina Aminotransferasa
Hormona Adrenocorticotropina
Porfiria por Deficiencia de ALA-D
Adenosina Difosfato
2-Alil-2-Isopropil-Acetamida
Ácido -Aminolevulínico
-Aminolevulínato-Dehidrasa
-Aminolevulínato-Sintetasa
Gen Ubicuo de -Aminolevulínato-Sintetasa
Gen Eritrocitario de -Aminolevulínato-Sintetasa
Adenosina Monofosfato
Adenosina Monofosfato Cíclica
Análisis de Varianza de una Vía
Adenosina Trifosfato
Número Aparente de Sitios de Unión
Albumina de Suero Bovina
Catalasa
Coenzima A
Coproporfirina
Coproporfirinógeno III
Corticosterona
Coproporfiria Hereditaria
Creatina Fosfoquinasa
Cuentas por Minuto
Coproporfirinógeno Oxidasa
Hormona Liberadora de Corticotropina
Citrato Sintasa
Citocromo P450
3´,5´-Dietoxicarbonil-1,4-Dihidrocolina
Dexametasona
xii
DHAP
pDMAB
DMEM
DMSO
DNA
DNPH
DRE
DTT
EDTA
ENO1
E.S.
ETC
FB
FGI
FQ
F1,6BP
F2,6BP
F6P
FBPasa1
FFA
G1P
G6P
G6Pasa
G6PDH
GAP
GAPD
GC
dGDP
GDP
GK
GlnIII
GP
GR
Gris
GS
GSH
GTP
H2O2
HCB
HEP
HEPES
HEPTA
HK
HMB
HO
HPA
HPLC
Dihidroxiacetona Fosfato
para-Dimetilamino Benzaldehído
Medio Dubelco-Eagle Modificado
Dimetilsulfóxido
Ácido Desoxiribonucleico
2,4-Dinitro Fenilhidrazina
Elementos de Respuesta a Dioxina
Ditiotreitol
Acido Etilendiamino-Tetracético
Enolasa1
Error Estandar
Cadena de Transporte de Electrones
Fenobarbital
Fosfoglucoisomerasa
Ferroquelatasa
Fructosa-1,6-Bifosfato
Fructosa-2,6-Bifosfato
Fructosa-6-Fosfato
Fructosa-1,6-Bifosfatasa
Ácidos Grasos Libres
Glucosa-1-Fosfato
Glucosa-6-Fosfato
Glucosa-6-Fosfatasa
Glucosa-6-Fosfato-Deshidrogenasa
Gliceraldehído-3-Fosfato
Gliceraldehído-3-Fosfato-Deshidrogenasa
Glucocorticoides
2´Deoxiguanosina 5´Difosfato
Guanosina-Difosfato
Glucoquinasa
Glucógeno Tipo III de Hígado
Glucógeno Fosforilasa
Receptores de GC
Griseofulvina
Glucógeno Sintetasa
Glutation Reducido o γ-Glutamil-Cisteinil-Glicina
Guanosina Trifosfato
Peróxido de Hidrógeno
Hexaclorobenceno
Porfiria Hepato Eritropoyética
Ácido Hidroxietil Piperazina Etano Sulfónico
Heptacarboxiporfirina
Hexoquinasa
Hidroximetilbilano
Hemo Oxigenasa
Eje Hipotalamo-Pituitario-Adrenal
Cromatografía Líquida de Alta Resolución
xiii
IDH
IDO
i.p.
α-KDH
Kdapp
LDH
LOOHLPL
MAO
MDBs
MDA
MDH
Mel
mRNA
NAD
NADH
NADP(H)
n.d.
1
O2
O2• O3
OH•
PAHs
PAI
PBG
PBGasa
PBG-D
PC
PCE
PCT
PDH
PEP
PEPCK
PFK
PGI
PGK
PGM
Pi
PK
PKA
PKL
PKM
PKR
PLC
PMSF
PPE
PPO
Isocitrato Deshidrogenasa
Indolamina extrahepática 2,3-Dioxigenasa
Intraperitoneal
α-Cetoglutarato Deshidrogenasa
Constante Aparente de Disociación
Lactato Deshidrogenasa
Hidroperóxido
Lipoproteína Lipasa
Mono Amino Oxidasa
Cuerpos de Mallory-Denk
Malondialdehído
Malato Deshidrogenasa
Melatonina
Ácido Ribonucleico Mensajero
Nicotinamida Adenina Dinucleótido
Nicotinamida Adenina Dinucleótido (reducido)
Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (reducido)
No Determinado
Oxígeno Singulete
Radical Superóxido
Ozono
Radical Hidroxilo
Hidrocarburos Aromáticos Polihalogenados
Porfiria Aguda Intermitente
Porfobilinógeno
Porfobilinogenasa
Porfobilinógeno-Deaminasa
Piruvato Carboxilasa
Porfiria Congénita Eritropoyética
Porfiria Cutánea Tarda
Piruvato Deshidrogenasa
Fosfoenolpiruvato
Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa
Fosfofructoquinasa
Fosfo Gluco (-hexosa) Isomerasa
Fosfoglicerato-Quinasa
Fosfoglicerato-Mutasa
Fosfato Inorgánico
Piruvato Quinasa
Proteínquinasa A
Piruvato Quinasa, isoforma Hepática
Piruvato Quinasa, isoforma Muscular
Piruvato Quinasa, isoforma Eritrocitaria
Fosfolipasa C
Fluoruro de Fenilmetilsulfonilo (Inhibidor de Proteasas)
Protoporfiria Eritropoyética
Protoporfirinógeno-IX-Oxidasa
xiv
PROTO IX
PROTOgen IX
PV
QL
RE
RIA
RNS
RO•
ROO•
ROS
RXR
SA
s.c.
SDH
SNC
SOD
SPB
TBA
TBARS
TCA
TCDD
TDO
TG
TPI
TPD
TRIS
TRP
TRPp
UDP-GA
UDP-Glu
UGT
URO
URO-D
UROgen I
UROgen III
URO–S
UTP
UTPG
Vf
VHC
VIH
Protoporfirina-IX
Protoporfirinógeno-IX
Porfiria Variegata
Quimioluminiscencia Urinaria
Retículo Endoplásmico
Radioinmunoensayo
Especies Reactivas de Nitrógeno
Radical Alcoxilo
Radical Peroxilo
Especies Reactivas de Oxígeno
Receptor de Ácido Retinoico – Xenobióticos
Succinil Acetona
Subcutáneo
Succinato Deshidrogenasa
Sistema Nervioso Central
Superóxido Dismutasa
Proteína Específica de Pegado a la Serotonina
Ácido Tiobarbitúrico
Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico
Ácido Tricloroacético
2,3,7,8-Tetracloro-Dibenzo-p-Dioxina
L-triptófano 2,3-dioxigenasa (TRPp)
Triglicéridos
Triosafosfato Isomerasa
Triosafosfato Deshidrogenasa
Tris-Hidroximetil-Aminometano
Triptófano
Triptófano Pirrolasa
Uridina Dinucleótido Fosfato -Ácido Glucurónico
Uridina Dinucleótido Fosfato –Glucosa
UDP Glucuronosil Transferasa
Uroporfirina
Uroporfirinógeno Decarboxilasa
Uroporfirinógeno I
Uroporfirinógeno III
Uroporfirinógeno-Sintetasa
Uridina Trifosfato
UTP-Glucosa
Volumen Final
Virus de Hepatitis tipo C
Virus de Inmunodeficiencia Humana
xv
Introducción
1 - INTRODUCCIÓN GENERAL
A continuación y previo al desarrollo del trabajo experimental, se definen
conceptos necesarios para introducir al lector de manera teórica, en aquellos temas que
se relacionan con este estudio. Se señala una descripción de los metabolismos del hemo,
hidratos de carbono y triptófano; estrés oxidativo, sistemas de defensas antioxidantes y
atrapantes; las porfirias que se generan por las diferentes fallas metabólicas; además de
los modelos de intoxicación en ratas utilizados para generar las porfirias experimentales,
que serán la base para el desarrollo de esta Tesis.
1.1. METABOLISMO DEL HEMO - PORFIRIAS HUMANAS Y EXPERIMENTALES
1.1.1. Metabolismo del hemo – Su regulación y alteraciones
El hemo es una molécula esencial para los organismos aeróbicos, que tiene un
rol fundamental en varias reacciones biológicas tales como transporte de oxígeno,
respiración, detoxificación de drogas y señales de transducción (Ponka, 1999). La
función de la molécula de hemo está determinada por las propiedades de las proteínas a
las cuales se une. Interacciona con varias apo-proteínas inactivas, proporcionando la
funcionalidad a las hemoproteínas resultantes.
En la hemoglobina y mioglobina el hemo transporta y almacena oxígeno
respectivamente, mientras que en los citocromos, está involucrado en el transporte de
electrones, generación de energía y diversas transformaciones químicas. En catalasas y
peroxidasas, el hemo interviene en la degradación de peróxidos y por ende en las
diferentes reacciones biológicas en las que participa el peróxido de hidrógeno (Adak el
al., 1998). Además, el hemo es indispensable para otros sistemas enzimáticos, tales
como la ciclooxigenasa y la óxido nítrico sintetasa (Seed & Willoughby, 1997).
Controla la expresión de numerosas proteínas tales como globina, citocromos,
mieloperoxidasa, hemooxigenasa (HO), receptores de transferrina y las enzimas del
camino de su síntesis (Gidari & Levere, 1977).
17
Introducción
Figura 1.1: Molécula del hemo, donde se ve la estructura
tetrapirrólica, con un átomo de hierro coordinado en el centro
de la misma.
El hemo es un tetrapirrol con un hierro coordinado (Figura 1.1). El ochenta a
noventa por ciento de hemo total en mamíferos, se sintetiza en las células eritroides para
incorporarse en la hemoglobina, luego que éstas se diferencian. La regulación de la
biosíntesis del hemo en estas células involucra el gen de la δ-aminolevulinato sintetasa
(ALA-S) eritrocitaria o ALAS-2. En ausencia de hierro, el mRNA de ALAS-2 es
bloqueado y el transporte de la enzima hacia la matriz mitocondrial inhibido (Ponka,
1999). Cuando los eritrocitos maduran, tanto la síntesis de hemo como de hemoglobina
cesa.
En contraste, el gen ALAS-1, está ubicuamente expresado, dado que todas las
células nucleadas tienen la necesidad de sintetizar hemo para los citocromos
respiratorios. El grueso del hemo no eritrocitario, se produce en el hígado para generar
diferentes hemoproteínas, en especial el citocromo P450 (CYP). Cualquier deficiencia o
exceso de hemo es tóxico para la célula hepática, por tanto la producción tiene que ser
controlada finamente, sobre todo por su paso limitante, el de la enzima ALA-S. Por
consiguiente, el gen ALAS-1 hepático se regula de diversas maneras para asegurarse
niveles adecuados de hemo intracelular (May et al., 1995). En el tejido hepático, la
actividad de ALA-S está reprimida por el producto final hemo (Srivastava et al., 1988;
Meguro et al., 1995), camino regulado por retroalimentación negativa, por lo que ésta es
considerada como una enzima reguladora del metabolismo.
Por el contrario, en células eritroides, la actividad es refractaria o se ve
incrementada por el hemo (Hoffman et al., 1980). Por tanto, los mecanismos de
regulación son diferentes según el tejido. Así, se muestran diferencias en la regulación
transcripcional y su transporte. También hay diferencias en los pesos moleculares
18
Introducción
(Watanabe et al., 1983) y en las propiedades catalíticas (Bishop et al., 1990) e
inmunológicas (Yamamoto et al., 1986) entre las isoenzimas de ALA-S en los tejidos
eritroide y hepático. Se han identificado tres potenciales puntos de regulación del hemo
sobre el ALA-S hepática: (a) nivel transcripcional; (b) por desestabilización del mRNA
de ALA-S; y (c) en la modulación de su entrada a la mitocondria (May et al., 1995).
En su síntesis están involucradas ocho enzimas, de las cuales la primera y las
tres últimas son mitocondriales, mientras las restantes son citosólicas (Figura 1.2). Se
han descripto mutaciones en todos los genes que codifican para las enzimas
biosintéticas del hemo, excepto para ALAS-1, y a las enfermedades resultantes se las
conoce como porfirias (Elder, 1998a). Dependiendo del defecto enzimático específico,
se puede observar el desarrollo de diversas patologías, con patrones de superproducción,
acumulación, y excreción de intermediarios de la síntesis del hemo. Las enzimas del
camino han sido estudiadas intensivamente, y en los últimos años se determinaron las
estructuras cristalinas de cada una ellas y se clonaron todos los genes involucrados,
como se describe a continuación.
El primer paso del camino metabólico del hemo, es la condensación de la glicina
y el succinil-CoA para formar la molécula de ALA (Figura 1.2). Esta reacción es la
etapa limitante en la velocidad de síntesis de la vía. Está catalizada por la enzima
ALA-S (EC.2.3.1.37) ubicada en la matriz mitocondrial, cuya actividad es regulada por
el pool de hemo libre intracelular (Astner et al., 2005).
El ALA formado es transportado activamente al citoplasma y mediante una
reacción catalizada por la ALA-Dehidrasa (ALA-D; EC.4.2.1.24), dos moléculas de
ALA se condensan para forman el monopirrol porfobilinógeno (PBG) (Batlle & Stella,
1978; Sassa 1982, 1998). Según su estructura cristalina, la enzima ALA-D es un
tetrámero de homodímeros, con ocho subunidades y un sitio activo por dímero
(Frankenberg et al., 1999) que requiere ocho átomos de zinc, uno por subunidad, cuatro
esenciales para la catálisis, mientras que los otros cuatro estabilizan la estructura
terciaria (Batlle et al., 1967; Batlle & Stella, 1978; Fukuda et al., 1988). En todos los
tejidos la actividad del ALA-D es mucho mayor que la del ALA-S y en humanos está
codificada por un solo gen, localizado en el cromosoma 9 (Potluri et al., 1987).
19
Introducción
Figura 1.2: Camino biosintético del Hemo, con sus enzimas e intermediarios. A: acetilo, M: metilo, P:
propilo, V: vinilo; Las flechas indican el orden en que cada grupo acetilo se convierte a metilo en cada
paso de decarboxilación por acción de la Uroporfirinógeno-Decarboxilasa (URO-D). ALA: ácido δaminolevulínico; PBG: porfobilinógeno; 7-COOH´gen: hepta-carboxiporfirinógeno; 6-COOH´gen:
hexa-carboxiporfirinógeno y 5-COOH´gen: penta-carboxiporfirinógeno.
Cuatro moléculas de PBG luego se condensan en forma repetitiva cabeza-cola,
con eliminación de amonio, para formar un tetrapirrol lineal inestable denominado
hidroximetilbilano (HMB). Esta reacción es catalizada por la enzima PorfobilinógenoDeaminasa (PBG-D; EC.4.3.1.8). El gen que la codifica contiene 15 exones, y mapea en
el cromosoma 11 (Wang et al., 1981; Gill et al., 2009).
20
Introducción
El HMB sirve como sustrato para la Uroporfirinógeno III-Sintetasa (URO-S;
EC.4.2.1.75) o Isomerasa, que cataliza la conversión del tetrapirrol a Uroporfirinógeno
III (UROgen III) por inversión del anillo D del HMB, seguido por el cierre del
macrociclo en forma asimétrica (Stella et al., 1971). También puede ocurrir la ciclación
simétrica espontánea del HMB pero su producto, el UROgen I, es fisiológicamente
inactivo y sólo se acumula en el organismo en condiciones patológicas. La URO-S
humana, según su estructura cristalina es un homodímero, codificado por un único gen
con 10 exones localizado en el cromosoma 10 (Aizencang et al., 2000; Mathews et al.,
2001). El complejo de ambas enzimas, Deaminasa e Isomerasa, se conoce con el
nombre de Porfobilinogenasa (PBGasa) (Llambías & Batlle, 1971; Mazzetti & Tomio,
1988, 1990, 1993, 1997).
El UROgen III se convierte en coproporfirinógeno III (COPROgen III) por la
decarboxilación secuencial de cuatro grupos acetilos. La decarboxilación del UROgen
III comienza en el anillo asimétrico D y procede en el sentido de las agujas del reloj
formando intermediarios de siete, seis, cinco y cuatro carboxilos (Batlle & Grinstein,
1962; San Martín de Viale & Grinstein, 1968a; Jackson et al., 1976). Esta reacción es
catalizada por la enzima Uroporfirinógeno-Decarboxilasa (URO-D; EC.4.1.1.37) cuya
estructura es un homodímero, con un sitio activo en cada monómero (San Martín de
Viale, 1969; Straka & Kushner, 1983; Whitby et al., 1998; Chaufan et al., 2005). En
humanos la codifica un único gen en el cromosoma 1 (Dubart et al., 1986). El UROgen
I también puede ser decarboxilado a COPROgen I en etapas, como la serie isomérica
III, pero a menor velocidad así como también lo hace el UROgen II y IV (San Martín
de Viale et al., 1976). La serie isomérica I se acumula en ciertas porfirias (San Martín
de Viale & Grinstein., 1968b). Sólo el isómero COPROgen III puede continuar en el
camino de la síntesis del hemo.
El COPROgen III es transportado a la mitocondria, y allí la enzima
Coproporfirinógeno-Oxidasa (CPO; EC.1.3.3.3) decarboxila oxidativamente dos grupos
propiónicos en las posiciones 2 y 4 de los anillos A y B para dar dos grupos vinilo,
produciendo el Protoporfirinógeno IX (PROTOgen IX) (Batlle et al., 1965; Jackson et
al., 1980). La enzima está localizada en el espacio intermembrana de la mitocondria, y
existen formas oxígeno dependiente y oxígeno independiente que catalizan la misma
21
Introducción
reacción (Sorianello & Mazzetti, 2000a; 2000b). Los mamíferos y otros eucariotas
superiores utilizan solamente la forma oxígeno dependiente. La enzima es un
homodímero (Martasek et al., 1997) y el gen que la codifica está localizado en el
cromosoma 3 (Cacheux et al., 1994)
El PROTOgen IX se oxida a protoporfirina IX (PROTO IX) por la acción de la
enzima Protoporfirinógeno IX-Oxidasa (PPO; EC.1.3.3.34). La eliminación de los seis
hidrógenos requiere oxígeno como aceptor de electrones terminal. La enzima se
sintetiza en el citosol y luego es transportada a la superficie exterior de la membrana
mitocondrial interna. Funciona como un homodímero y el gen humano de la PPO se
localiza también en el cromosoma 1 (Roberts et al., 1995).
La última etapa de este camino ocurre en la superficie interna de la membrana
mitocondrial, donde la enzima Ferroquelatasa (FQ; EC.4.99.1.1), cataliza la inserción de
un ión ferroso en el anillo porfirínico de la PROTO IX (Ríos de Molina et al., 1989). La
FQ humana es un homodímero oligomérico, sulfhidrílica y está asociada a la membrana
mitocondrial interna (Harbin & Dayley, 1985). El gen humano de FQ fue clonado y
mapeado en el cromosoma 18 (Whitcombe et al., 1991).
Una vez formada la molécula de hemo su destino será, como ya fue señalado,
formar parte de las diferentes hemoproteínas, como la hemoglobina, mioglobina, grupo
prostético de los citocromos y enzimas tales como peroxidasas, catalasa, triptófano
pirrolasa, etc.
1.1.2. Alteraciones en el camino del hemo. Porfirias crónicas y agudas
Las porfirias son fallas comúnmente hereditarias del metabolismo del hemo,
conforman un conjunto heterogéneo de enfermedades metabólicas con expresión clínica
variada y se originan como consecuencia de la hipoactividad congénita o adquirida de
alguna de las enzimas que participan de este camino metabólico. Según cual sea la
enzima del camino dañada, es el tipo de porfiria que se origina. Bioquímicamente, las
porfirias se caracterizan por la producción excesiva de porfirinas o sus precursores.
Existen dos tipos de manifestaciones clínicas que pueden presentarse separada o
22
Introducción
conjuntamente: ataques neuro-viscerales agudos, asociados con el incremento de ALA y
PBG; y/o signos cutáneos que resultan de la fotosensibilización de las porfirinas
acumuladas, en circulación o depositadas en la piel. Se han descripto mutaciones en
todos los genes que codifican para las enzimas biosintéticas del hemo menos para el de
ALAS-1, y las enfermedades que resultan de estas mutaciones se las conoce en general
como porfirias (Elder, 1998a). En la forma eritroide-específica del gen ALAS-2, se han
encontrado mutaciones, generando en algunos casos anemia sideroblástica ligada al
cromosoma X. Las porfirias y otros trastornos afines, están asociados con deficiencias
de las otras siete enzimas y se ha caracterizado detalladamente la patología para cada
una de ellas (Batlle, 1997; Schüller & Enriquez de Salamanca, 2000)
1. Porfiria por Deficiencia de ALA-D (AD-P o Porfiria de Doss). Es una porfiria
hepática rara, producida por la deficiencia autosómica recesiva de la enzima ALA-D.
Las manifestaciones clínicas de estos pacientes son variadas. En unos casos, el cuadro
clínico reproduce al de la porfiria aguda intermitente y en otros, se expresa en forma de
una poli-neuropatía motora. En esta variedad de porfiria no existen lesiones hepáticas.
La excreción urinaria de ALA está elevada pero la de la PBG es normal (Gross et al.,
1998).
2. Porfiria Aguda Intermitente (PAI). Es una enfermedad hepática originada por
la deficiencia congénita de la PBG-D. Se transmite de forma autosómica dominante con
penetrancia variable y se caracteriza clínicamente por originar crisis agudas
intermitentes de síntomas abdominales y neuro-psíquicos y por la excreción urinaria
elevada de ALA y PBG. Es una de las porfirias más graves que puede llevar al coma y a
la muerte. Tampoco en esta forma de porfiria existen lesiones hepáticas (Song et al.,
2009). En nuestro país la PAI es la porfiria hepática aguda más frecuente, con una
prevalencia de 1/125.000 (Parera et al., 2003).
3. Porfiria Congénita Eritropoyética (PCE o Porfiria de Günther). Es una porfiria
por deficiencia muy profunda de la actividad de la URO-S. Se caracteriza
bioquímicamente por una elevadísima excreción urinaria de porfirinas de la serie
isomérica I (San Martín de Viale & Grinstein, 1968b). Se la considera extremadamente
rara. Es la menos frecuente (300 casos en todo el mundo). La herencia es de carácter
23
Introducción
autosómico recesivo. Los síntomas se presentan en los primeros meses de vida. Las
lesiones son intensas, con dolorosas erosiones y cicatrizaciones reiteradas que pueden
terminar en atrofia epidérmica, esclerodermia, destrucciones óseas y cartilaginosas, por
lo que se la conoce también como porfiria mutilante. Otro signo característico es la
eritrodoncia (coloración marrón oscuro de los dientes de leche, por el acúmulo de
porfirinas). En ocasiones coexiste con una anemia hemolítica (Madan et al., 2007). En
general se practica esplenectomía durante el tratamiento.
4. Porfiria Cutánea Tarda (PCT) es una enfermedad de etiología heterogénea,
originada por una baja actividad de la enzima URO-D. Esta enzima es la responsable de
que el uroporfirinógeno (UROgen) III y también de las series I, II y IV (Aragonés et al.,
1972), pierdan sucesivamente un carboxilo de cada uno de sus cuatro radicales acetilos
de sus anillos pirrólicos, comenzando por el D y siguiendo el movimiento de las agujas
del reloj (Figura 1.2). Consecuentemente se acumulan porfirinas, preferentemente
uroporfirina (URO), hepta-carboxiporfirina (HEPTA) y COPRO en hígado y piel, lo
que a su vez se traduce clínicamente en una hipersensibilidad del órgano a la luz y a los
microtraumatismos (Anderson, 2007). Es la forma de porfiria más frecuente, aunque su
prevalencia varía mucho de un país a otro. En varios países europeos se sitúa alrededor
de 1/5.000 habitantes, mientras que en los Estados Unidos es de 1/25.000. Su incidencia
en Inglaterra es de 2 a 5/1.000.000/año. Dentro de las porfirias cutáneas, la PCT es la
porfiria más frecuente en la Argentina (1/37.000) (Méndez et al., 2005). La enfermedad
es más usual en los hombres que en las mujeres. Cuando ocurre en ellas, es común que
estén sometidas a tratamiento con estrógenos. Otros factores desencadenantes y/o
exacerbantes, aparte de los estrógenos son: el alcohol, la sobrecarga de hierro, los
compuestos clorados (San Martín de Viale, 1979; Smith & De Matteis, 1990). Se han
diferenciado tres formas etiopatogénicas principales de PCT:
Tipo I o esporádico. Representa el 70 al 80% de todos los casos. Es de
aparición tardía, no existen antecedentes familiares y la actividad de la enzima
está disminuida sólo en el hígado. En esta forma de porfiria no se han
identificado mutaciones genéticas que justifiquen la baja actividad enzimática.
La causa del defecto enzimático en este tipo de PCT es oscura. Se supone que la
siderosis, la toma de estrógenos, el alcohol, el tabaco, la infección por el virus de
24
Introducción
la hepatitis C (VHC) y el de la inmunodeficiencia humana (VIH) o la existencia
de una hepatopatía crónica, son factores implicados en este defecto (Egger et al.,
2002). En la mayoría de los pacientes con PCT, existen indicios de un
metabolismo anormal del hierro. Se supone que el hierro puede determinar la
formación del radical hidroxilo (OH•) y que éste contribuye a la oxidación del
UROgen a URO y determina la formación de inhibidores, aún no caracterizados
de la URO-D. Los hidrocarburos aromáticos polihalogenados (PAHs) actuarían
como inductores de la isoforma CYPIA2, la cual oxidaría el UROgen a URO y
daría lugar también a la formación de inhibidores de la URO-D. El alcohol
podría contribuir favoreciendo el depósito de hierro, induciendo la formación de
especies reactivas de O2 (ROS) de los CYP o como causante de hepatopatía. El
mecanismo de esta relación con el descenso de la actividad de la URO-D es
incierto. En raras ocasiones, varios pacientes de la misma familia presentan una
porfiria con estas mismas características. En estos casos se habla de PCT del tipo
III. Se desconoce la naturaleza del defecto hereditario responsable de este tipo de
PCT.
Tipo II o familiar. Enfermedad autosómica dominante. Representa el 2030% de todos los casos. En estos pacientes la actividad URO-D está disminuida
al 50% de su actividad normal, no sólo en el hígado sino también en el resto de
los tejidos, incluídos los hematíes. Afecta a varios miembros de una misma
familia, aunque su penetrancia es baja, por lo que su expresión clínica ocurre
sólo en el 10% de los casos. El descenso de actividad de la URO-D en la PCT
del tipo II se justifica por la existencia de mutaciones en el gen de esta enzima,
que determinan que su cantidad en tejidos esté muy disminuida. Entre estos
enfermos, se han identificado al menos 115 mutaciones diferentes en el gen de
URO-D (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php) localizado en el cromosoma
1p34. La mayoría de esas mutaciones son puntuales, aunque también hay
algunas deleciones e inserciones. La presencia de siderosis, abuso alcohólico,
tabaco, estrógenos, etc, contribuye también a favorecer la expresión clínica de
esta enfermedad (Medina et al., 2000). La Porfiria Hepato-Eritropoyética (HEP)
de Piñol-Aguadé representa la variedad homocigótica o doble heterocigótica, de
la PCT del tipo II. En ella, la actividad de la URO-D es extremadamente baja
25
Introducción
(con un remanente del 3-27%), no sólo en el hígado sino también en la médula
ósea (Lim & Poh-Fitzpatrick, 1984).
Tipo tóxica. En el hombre se han descripto casos, a veces con carácter
epidémico, de PCT en sujetos expuestos a diferentes agentes químicos como
hidrocarburos aromáticos polihalogenados (hexaclorobenceno, HCB; 2,3,7,8tetraclorodibenzo-p-dioxina: TCDD; di- y tri-clorofenol). Estas sustancias
pueden inhibir la URO-D y son capaces de reproducir la enfermedad en
animales de experimentación (De Matteis, 1998; Billi et al., 2000b; Rozman et
al., 2001; Cochón et al., 2005; San Martín de Viale, 2007)
5. Coproporfiria hereditaria (CPH). Es una porfiria poco frecuente determinada
genéticamente, heredada con carácter autosómico dominante, originada por la
deficiencia de la CPO mitocondrial. Clínicamente se expresa por cuadros agudos
similares a los que aparecen en la PAI y en algunas ocasiones, por lesiones cutáneas
parecidas a las de la PCT. Es característico que la COPRO en heces esté muy elevada
(Lee et al., 2005).
6. Porfiria Variegata (PV). La PV es una enfermedad autosómica dominante
originada por un descenso de la actividad de la PPO, que se expresa clínicamente por
fotosensibilidad de la piel, crisis agudas neuroviscerales y por excreción fecal elevada
de PROTO IX, COPRO III y porfirina-X (Qin et al., 2011). En estos enfermos, no suele
haber lesiones hepáticas. Es una enfermedad frecuente en la población blanca de
Sudáfrica y en el norte de Europa. En Argentina, está entre las dos porfirias agudas más
frecuentes, luego de la PAI, y su frecuencia es de 1/600.000 (Parera et al., 2003).
7. Protoporfiria Eritropoyética (PPE). La PPE es una porfiria hereditaria
producida por una actividad deficiente de la ferroquelatasa (FQ), última enzima de la
biosíntesis del hemo. Como consecuencia se produce la acumulación de PROTO IX en
piel, médula ósea, eritrocitos, plasma, hígado y heces (Kappas et al., 1989). Las dos
manifestaciones clínicas más importantes son la fotosensibilidad y la enfermedad
hepatobiliar, ambas asociadas a las anormalidades bioquímicas.
26
Introducción
Las porfirias denominadas agudas (AD-P, PAI, CPH, PV) son las más riesgosas,
pues pueden llevar a desenlaces fatales y son las más susceptibles al desencadenamiento
y exacerbación por drogas y factores metabólicos. Estos pueden disparar
manifestaciones clínicas, como resultado de un desbalance por la enzima deficiente en
la vía (San Martín de Viale, 2007). Todas son hepáticas, inducibles y se caracterizan por
síndromes neuro-psiquiátricos con manifestaciones desde depresión hasta franca
psicosis, acompañadas por severos dolores abdominales, disturbios motores, parálisis
respiratoria y colapso cardiovascular (Kappas et al., 1995). El síndrome neuropsiquiátrico ocurre solamente en porfirias en las cuales hay inducción del ALA-S
hepático y consiguiente aumento del ALA y PBG. Los ataques característicos se
precipitan por drogas tales como barbitúricos, ayuno y hormonas (Elder, 1998a;
Thadani et al., 2000; Thunell, 2000).
Los ataques de porfiria hepática aguda inducible se tratan generalmente
discontinuando la exposición a los agentes de precipitación, con infusiones de hemo, y/o
sobrecarga de carbohidratos. El hemo reprime directamente su propia biosíntesis en un
proceso de retroalimentación negativa (May et al., 1995). Los carbohidratos se dan
típicamente como infusión de glucosa concentrada, y los mecanismos subyacentes de su
efecto benéfico, aun no se han comprendido.
Dentro de las porfirias hepáticas crónicas, la PCT es el tipo más difundido y se
caracteriza por excreción urinaria aumentada de porfirinas altamente carboxiladas:
uroporfirinas (8-COOH) y firiaporfirinas o hepta-carboxiporfirinas (7-COOH),
fotosensibilidad en las áreas expuestas de la piel, hiperpigmentación e hipertricosis entre
otras (Kappas et al, 1995).
Aunque no está definitivamente probado, personalidades históricas parecen
haber sufrido de porfiria, incluyendo al Rey George III (Macalpine & Hunter, 1966),
Friedrich Wilhelm I de Prussia (Pierach & Jennewein, 1999), y Vincent van Gogh
(Loftus & Arnold, 1991).
En la Figura 1.3 pueden verse distintos tipos de porfirias con sus respectivos
bloqueos enzimáticos, tanto en porfirias hereditarias como en adquiridas por inducción
con diferentes drogas. Dependiendo específicamente del defecto enzimático, se pueden
27
Introducción
observar diversos patrones de superproducción, acumulación, y excreción de
intermediarios de la biosíntesis del hemo.
1.1.3. Porfirias experimentales inducidas por compuestos porfirinogénicos.
La capacidad de una droga para precipitar una porfiria depende de su capacidad
para iniciar la transcripción de ALA-S y para inhibir su control fisiológico por
retroalimentación negativa, que se realiza mediante el pool de hemo regulatorio (San
Martín de Viale, 2007). Desde hace más de medio siglo es sabido que ciertas drogas
pueden alterar la regulación de la biosíntesis del hemo en el hígado de animales de
laboratorio y humanos (Nielsen, 1953) causando una condición de porfiria hepática que
se caracteriza por la acumulación de metabolitos de dicho camino, como son las
porfirinas y los precursores ALA y PBG.
Como resultado de la acción de algunos de estos compuestos, se produce una
disminución de los depósitos de hemo hepático, por aumento en su degradación o
represión de su síntesis, lo que causa acumulación y excreción en exceso de algunos
intermedios del camino. Por tanto, se genera una deficiencia aguda de hemo, marcada
de-represión de la enzima ALA-S y exacerbación de la producción de precursores del
camino en el hígado, generando ataques de porfiria (Tschudy & Bonkowsky, 1972).
Juegan un papel central las enzimas dependientes del CYP. Más de la mitad de
las drogas prescriptas, son metabolizadas por oxidación en el hígado a través de un
sistema de oxidasas de función mixta, entre las cuales las enzimas CYP son miembros
importantes. Xenobióticos tóxicos son también metabolizados por este sistema esencial
para la supervivencia de todos los organismos. Dentro de la familia de los CYP existen
entre 30 y 100 diversos subtipos, todas con diferentes afinidades por su sustrato. Las
isoenzimas encargadas de metabolizar xenobióticos, pertenecen a las familias de los
CYP 1, 2, 3 y 4, varios de los cuales responden a la asociación de un ligando con el
incremento de sus velocidades de transcripción (Dickins, 2004). Otras sustancias actúan
como sustratos suicidas dando origen a la destrucción de la enzima CYP y de su
componente hemo (Marks, et al., 1988, Ortiz de Montellano & Correia, 1995). Hay así
28
Introducción
drogas que tienen capacidad para inducir y otras de destruir los CYP, en base a ello se
las clasifica. Otro factor importante es la lipofilicidad de la droga, para atravesar las
membranas lipídicas y alcanzar el retículo endoplásmico y así los CYP.
Figura 1.3: Mecanismo porfirinogénico de drogas a través de su interacción con el CYP y bloqueos
enzimáticos en porfirias humanas. AD-P: Porfiria por deficiencia de ALA-D; AIA: 2-alil-2isopropilacetamida; ALA-S: ácido δ-aminolevulínico (ALA)-sintetasa, ALA-D: ALA-dehidrasa; CAR:
Receptor Constitutivo de Androstano; CPH: Coproporfiria Hereditaria; DDC: 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4dihidrocolidina; FB: fenobarbital; FQ: ferroquelatasa; HCB: hexaclorobenceno; HPE: Porfiria Hepato
Eritropoyética; PAI: Porfiria Aguda Intermitente; PBG-D: porfobilinógeno-deaminasa; PCE: Porfiria
Congénita Eritropoyética; PCT: Porfiria Cutánea Tarda; PPE: Protoporfiria Eritropoyética; PV:
Porfiria Variegata; PXR: Receptor de Pregnano-Xenobióticos; RXR: Receptor de ácido RetinoicoXenobióticos; URO-D: uroporfirinógeno-decarboxilasa.
Desde hace más de cien años se sabe que ciertas drogas precipitan ataques de
esta enfermedad. Se trata, no sólo de drogas terapéuticas, sino también de drogas de uso
industrial o doméstico. El concepto de inducción química de la porfiria se originó a
partir de 1889, cuando se comenzaron a utilizar el sulfonal, trional y tetronal como
sedantes, lo que provocó un brote masivo de porfiria aguda, enfermedad hasta entonces
desconocida (With, 1971). Más tarde se desencadenaron casos semejantes, y aún fatales
29
Introducción
de dicha enfermedad, con la administración de barbitúricos y altas dosis de Sedormid
(Schmid & Schwartz, 1952), pasando luego por los episodios masivos de Turquía
ocurridos durante 1956, en los que el HCB indujo cuatro mil casos de PCT por
ingestión de pan contaminado (San Martín de Viale, 1979; Gocmen et al., 1989).
Un logro muy importante en la elucidación del mecanismo de inducción de
porfirias por drogas, fue el hallazgo de Granick & Urata (1963) que encontraron la
actividad hepática de la enzima ALA-S francamente aumentada en una porfiria
experimental causada por 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC), hallazgo que
luego se extendió a la porfiria experimental causada por 2-alil-2-isopropilacetamida
(AIA) (Marver et al., 1966) y por otras drogas (Nakao et al., 1967; De Matteis & Gibbs,
1972). La enzima ALA-S es el paso limitante del camino y también el sitio donde el
hemo ejerce su control por un mecanismo de retroalimentación negativa (Sassa &
Granick, 1970).
El mecanismo por el cual cada una de las diferentes drogas estimula la actividad
del ALA-S hepático no es completamente claro. Hay que hacer una especial distinción
entre drogas que aumentan marcadamente la actividad de esta enzima e inducen porfiria
y otras que causan poca estimulación de su actividad, sin un acúmulo importante de
porfirinas en hígado (De Matteis, 1971). Ejemplos de drogas del primer grupo, son los
compuestos porfirinogénicos AIA, DDC y griseofulvina (Gris). En la fracción
microsomal del hígado se observa una caída transitoria en la concentración del CYP y
del hemo luego de la administración de alguna de estas drogas en animales de
experimentación, que coincide con el aumento de la actividad de la enzima ALA-S.
Esto sugiere que dichas drogas porfirinogénicas pueden estimular marcadamente la
actividad de la enzima por disminución de la concentración del hemo hepático, de tal
modo que reducirían el normal control por retroalimentación.
Con el compuesto porfirinogénico AIA, se sabe que la pérdida del hemo es
debida por un lado, al aumento de su destrucción y por el otro, a la conversión del
mismo en pigmentos verdes (De Matteis, 1971; Meyer & Marver, 1971). El grupo alilo
de la molécula de esta droga parece ser importante tanto en la destrucción del hemo
hepático como en la inducción de la actividad de ALA-S, posiblemente luego de su
metabolización, en un derivado reactivo (Abbritti & De Matteis, 1972). Aunque en la
30
Introducción
fracción microsomal es donde se da la mayor destrucción del hemo, también ha sido
observada su desaparición en la fracción citosólica y mitocondrial, lo que concuerda con
el hallazgo de inducción de la actividad de ALA-S por AIA en ambos sitios (Hayashi et
al., 1969).
1.1.4. HCB -Mecanismo porfirinogénico. Efectos sobre CYP y su metabolismo.
Figura 1.4: Estructura química del HCB
Químicamente
la
sigla
HCB,
corresponde
a
la
denominación
del
hexaclorobenceno (C6Cl6) como se ve en la Figura 1.4. Es un hidrocarburo aromático
policlorado, altamente lipofílico, producido como un sub-producto o impureza en la
fabricación de compuestos clorados y de varios pesticidas registrados (ATSDR, 2002).
El HCB se halla entre los más persistentes contaminantes ambientales que pueden viajar
miles de millas (Fisher, 1999), y se bioacumula en el ambiente, en animales y en
humanos (Courtney, 1979).
Tanto en humanos (intoxicaciones accidentales), como en animales (modelos
experimentales de PCT), se ha visto que este compuesto clorado genera una importante
inhibición de la enzima URO-D (San Martín de Viale et al., 1975, 1977), lo que
conlleva a un bloqueo del camino del hemo, con inducción de la actividad ALA-S y
acúmulo de precursores, especialmente de porfirinas altamente carboxiladas (8-y 7COOH) de la serie isomérica III (San Martín de Viale et al., 1970; Elder et al., 1976,
Wainstok de Calmanovici et al., 1984). Nuestro laboratorio fue el primero en demostrar
dicho bloqueo, punto clave de la desregulación del camino del hemo, en este tipo de
porfirias inducidas.
31
Introducción
Una llamativa evidencia epidemiológica fue encontrada en estudios hechos sobre
una población expuesta vía oral, al HCB en Turquía. En los años cercanos a 1950, la
ingestión de pan hecho de granos que habían sido tratados con HCB, causó una
epidemia en esta región. La dosis ingerida de HCB fue estimada en el un rango de 0,05–
0,2 g/día, equivalente a 0,7–2,9 mg/kg/día para una persona de mediana edad. Un índice
extremadamente alto de mortalidad (del 95%) ocurrió en infantes por debajo de los 2
años de edad, que habían sido amamantados con leche de las madres que habían
ingerido el pan contaminado. Los infantes envenenados exhibieron una condición
conocida como pembe yara o "daño rosa" debido a las lesiones de piel. Las muertes
infantiles fueron asociadas sobre todo a fallas cardio-respiratorias.
HCB ha demostrado ser causa de muerte, y puede generar perturbaciones a
diversos niveles (Ezendam et al., 2004). Se registraron efectos inmunotóxicos no solo
en
las
víctimas
del
envenenamiento
turco,
sino
también
en
trabajadores
ocupacionalmente expuestos en Brasil. Niveles elevados de IgM e IgG fueron
observados, así como deterioro de la función granulocítica (Queiroz et al., 1998). Un
número limitado de estudios ocupacionales ha asociado la inhalación del HCB con
efectos en el hígado, específicamente con porfirinas aumentadas y en mayor grado con
carcinoma hepatocelular (Sunyer et al., 2002), efectos inmunológicos (actividad
disminuida de neutrófilos, inmunoglobulinas aumentadas y susceptibilidad a infección),
efectos renales, como la microproteinuria (Queiroz et al., 1997; Seldén et al., 1999) y
efectos en tiroides (niveles disminuidos de tiroxina con hipotiroidismo, bocio y cáncer
de la tiroides) y desarrollo deteriorado de habilidades locomotoras en infantes.
En ratas, el HCB induce porfiria hepática y efectos neurotóxicos (Courtney,
1979), además de efectos sobre el sistema reproductivo (Jarrell et al., 1998), la función
tiroidea (Kleiman de Pisarev et al., 1990), y el sistema inmune (Vos, 1986; Michielsen
et al 1999). Los órganos blancos más sensibles son el hígado, ovario y el sistema
nervioso central.
Estudios con animales de investigación indican que la absorción de HCB por
ingestión a través de la vía gastrointestinal es variable, dependiendo del solvente
utilizado como vehículo para su administración. En vehículos acuosos la absorción es
de alrededor de un 6 %, mientras que con vehículos aceitosos la absorción puede llegar
32
Introducción
hasta un 82 %. El HCB es particularmente tóxico para el feto y posteriormente para el
neonato, a través de la ingestión de leche materna (ATSDR, 1996).
Una vez absorbido, el HCB se distribuye en órganos y tejidos con alto contenido
lipídico, aumentando su concentración con el correr de los años por bioacumulación. Es
lentamente metabolizado a pentaclorofenol por el sistema hepático del CYP en sus
isoformas 3A1, A2 y A4 (den Besten et al., 1993), conjugado con glutation (GSH) para
dar pentaclorotiofenol, o declorinado reductivamente para formar pentaclorobenceno. El
pentaclorofenol se convierte posteriormente en tetraclorohidroquinina (Mehmood et al.,
1996). La eliminación del HCB del organismo, se produce por vía urinaria,
mayoritariamente como metabolitos del mismo, siendo el pentaclorofenol (en un 50%) y
el pentaclorobenceno (en un 25%) los predominantes. En menor medida se encuentran
metabolitos como el tetraclorobenceno, tetraclorofenoles, tetraclorohidroxiquinonas, y
triclorofenol, entre otros (ATSDR, 1996).
Estudios en seres humanos y en animales sostienen claramente que el HCB
causa porfiria. En mujeres embarazadas que habían sido expuestas al igual que en niños,
se evidenció sugestiva pero no concluyentemente, altas incidencias de abortos y de
bebes muertos durante el parto. De igual manera se ha estimado en estudios animales
que las ratas en desarrollo expuestas de forma crónica exhibieron una respuesta
aumentada similar a los animales adultos; y que las ratas expuestas de manera aguda
exhibieron porfiria aún hasta 500 días después de la exposición. No se encuentra
descripto ningún estudio respecto a efectos sobre la salud en seres humanos o en
animales expuestos por la piel al HCB.
Varios estudios realizados en animales han demostrado la capacidad del HCB,
como del TCDD y otros bifenilos policlorados, para inducir una porfiria que se asemeja
a la PCT humana (De Matteis et al, 1961; San Martín de Viale et al., 1970; San Martín
de Viale et al., 1977; Smith & De Matteis, 1980; Elder, 1998b). El hígado es el órgano
blanco de la acción porfirinogénica del HCB, y es sobre todo en este órgano donde el
HCB induce la acumulación de porfirinas altamente carboxiladas, debido a la una
marcada reducción en la actividad de la enzima URO-D (San Martín de Viale et al.,
1970; Elder et al., 1976; San Martín de Viale et al., 1976a, 1976b, 1977). Al respecto,
cabe mencionar que las ratas hembras son mucho más sensibles que los machos a los
33
Introducción
efectos porfirinogénicos del HCB (San Martín de Viale et al., 1970; Smith et al., 1979;
Wainstok de Calmanovici et al., 1991). En relación a ello, nuestro laboratorio fue el
primero en demostrar la dependencia de sexo para la inducción de porfiria por HCB.
Sobre el tema, se ha informado que el 17-β-estradiol y las drogas que contienen
estrógenos, juegan un papel relevante en el desarrollo de la porfiria inducida por HCB
en ratas (San Martín de Viale et al., 1968, 1976a; Grant et al., 1975; Smith & Francis,
1981). El grupo de investigación de Legault et al. (1997), demostró que el dimorfismo
sexual en la porfiria inducida por HCB en ratas, está relacionado con la presencia de
17-β-estradiol y que ambos sexos tienen la capacidad para responder cuando está
presente el estado hormonal adecuado. Los autores sugieren que la hormona actúa
exacerbando la inhibición URO-D. Además, se ha informado que hembras
pertenecientes a diferentes cepas de ratas, no son igualmente susceptibles para adquirir
porfiria inducida por HCB (Wainstok de Calmanovici et al., 1989; Legault et al., 1997).
Como ya es conocido, el hierro juega un rol en el desarrollo de la porfiria
inducida por HCB (De Matteis & Stonard, 1977; Smith et al., 1979). Así, el contenido
de hierro hepático se incrementa en el tratamiento de ratas con HCB (Hanstein et al.,
1981; Wainstok de Calmanovici et al., 1985). La sobrecarga de hierro acelera y
exacerba la porfiria inducida por HCB (Taljaard et al., 1971; Smith & Francis, 1983).
Además el más alto contenido de hierro no hémico, ha sido señalado como la causa de
la susceptibilidad diferente entre dos cepas de ratas para adquirir porfiria por HCB
(Smith et al, 1979).
Otro rasgo característico de esta porfiria experimental es el gran retraso en su
desarrollo (Courtney, 1979; Stonard et al., 1998). Además, el HCB es un inductor de
las isoenzimas del CYP (Wainstok de Calmanovici et al., 1984), que participan en el
sistema de metabolización de drogas (ATSDR, 2002) y ha sido demostrado que después
de un largo plazo de exposición, el HCB produce hepatomas, hemangio-hepatomas y
carcinoma hepatocelular en varios especies de roedores (Smith & Cabral, 1980; Smith
et al., 1985; Ertürk et al., 1986). Se ha obtenido una gran cantidad de información sobre
los efectos del HCB en el metabolismo del hemo (Mylchreest & Charbonneau, 1977;
Gocmen et al., 1986; Billi de Cattabi et al., 2000a) y si bien el mecanismo de acción de
este fungicida en la inducción de la porfiria no es totalmente claro, se conoce bastante
34
Introducción
del mismo. Para que el HCB ejerza su acción porfirinogénica, es decir produzca
porfiria, es necesario que se metabolice a través del CYP (Wainstok de Calmanovici et
al., 1984). Y como ya se ha mencionado, la enzima blanco del HCB en la biosíntesis del
hemo, es la URO-D.
El bloqueo de la URO-D es debido a la acción de un inhibidor de esta enzima.
Ríos de Molina et al., (1980) fueron los primeros en informar su presencia. Deriva del
UROgen por oxidación de las ROS. El hierro y la isoforma CYP1A2 están involucrados
en este proceso. El inhibidor tiene bajo peso molecular (PM < 2.000), no tiene espectro ni
fluorescencia de porfirinas (Billi de Catabbi, Fuentes, San Martín de Viale, no publicado).
Es más polar que las porfirinas, ya que tiene cargas negativas. Su estructura no está
definida. Ha habido varias propuestas para este: oligopirrol poli-carboxilado, di-o tetrahidroporfirinas, uroporfirina peroxilada y/o hidroxilada (Cochón et al., 2005). El inhibidor
se une a las argininas que están relacionadas con la actividad de la URO-D, a través de sus
cargas negativas, alterando la adecuada orientación para la decarboxilación (Ríos de
Molina et al., 1980; Billi de Catabbi, 1999). Así, bloquea el acceso de los sustratos a las
histidinas del sitio activo de la URO-D, enmascarando la carga positiva que es necesaria
para que el UROgen se una a la enzima.
Sobre esta base, el mecanismo de la porfiria inducida por HCB sería el siguiente:
HCB dispararía un proceso de oxidación centrado en el hierro celular hepático junto con la
inducción de CYP1A (Smith & De Matteis, 1980), que oxidarían al UROgen
transformándolo en uroporfirina y en el inhibidor de URO-D (Fig.1.5). En este sentido, se
informó que el CYP1A2 es esencial en el proceso que conduce a la porfiria inducida por
HCB y que la contribución de otras formas del CYP (2B y 3A) inducidas por esta droga,
parece ser mínima (Sinclair et al., 2000).
Se han propuesto dos fases en este mecanismo de inducción de esta porfiria
experimental (Stonard et al., 1998): (a) una etapa temprana relacionada con la oxidación
de UROgen a uroporfirina (CYP-dependiente); (b) una etapa posterior relacionada con
la oxidación del UROgen a inhibidor de la URO-D, CYP-dependiente (asistida por
hierro). Además, se ha propuesto que el HCB puede actuar como una droga soluble en
lípidos que se une a citocromos y no se metaboliza rápidamente, por lo tanto produce
desacoplamiento en la cadena de transporte de electrones (ETC) de la actividad
35
Introducción
monooxigenasa, favoreciendo consecuentemente la producción de ROS (Ferioli et al.,
1984). Al respecto, Billi de Catabbi et al., (1997) detectaron aumentos en los niveles de
las ROS en fases tempranas de la intoxicación por HCB. Estas ROS atacan al UROgen
dando el inhibidor, que causa la inhibición de la actividad URO-D y produce
peroxidación sobre los lípidos. Estas ROS podrían también contribuir al descenso de
URO-D por el ataque a su estructura proteica, oxidando las histidinas del sitio activo,
distorsionando así el centro activo de la enzima (Chaufan et al., 2005). Todo esto
produciría la acumulación de UROgen que es secundaria y es consecuencia de la
inhibición de URO-D, incrementando la oxidación del UROgen y la generación del
inhibidor, logrando finalmente una inhibición de URO-D auto-perpetúante (Elder,
1998b).
De este modo, en etapas posteriores se produce un incremento en los niveles de
porfirinas, ya que la ruta metabólica del hemo se desregula, debido a que el descenso en
la actividad de URO-D supera el 50%, produciendo así una inducción de la enzima
ALA-S, enzima regulatoria y limitante del camino del hemo (Wainstok de Calmanovici
et al., 1984). Esta situación da lugar a una fuerte acumulación de UROgen que no es
metabolizada, sino que es fácilmente oxidada en el ambiente oxidativo creado por el
HCB (Figura 1.5).
El tiempo necesario para llegar a este proceso auto-perpetuante estaría
relacionado y explicaría el retraso en el establecimiento y aparición de la porfiria
inducida por HCB (Billi de Catabbi et al., 2000a). Este retraso es un rasgo característico
de dicha porfiria experimental. El ambiente oxidativo provocado por HCB no sólo ataca
al UROgen sino también a otros blancos celulares como lípidos, produciendo
peroxidación; al DNA, dando lugar a derivados como la 8-OH-desoxiguanosina
(Horváth et al., 2001); y proteínas, produciendo su carbonilación (Berlett & Stadtman,
1997).
36
Introducción
Sustratos endógenos
(Uro´ gen ?)
(CYP 1A2 + Fe3+)
Figura 1.5: Esquema del mecanismo porfirinogénico propuesto para el HCB (modificado a partir de
Billi et al., 1997) CYP: citocromo P-450; ROS: especies reactivas de oxígeno; s: semanas desde el
tratamiento con HCB; (-) regulación negativa; Flechas hacia arriba: incrementos inducidos por HCB;
Flechas hacia abajo: disminuciones inducidas por HCB en niveles o actividades.
En cuanto a los daños irreversibles producidos por HCB, se ha informado que la
inactivación de URO-D es auto-perpetuante a menos que la formación de ROS sea
prevenida por la remoción del hierro (Elder, 1998b). En este sentido, cabe mencionar
37
Introducción
que el tratamiento con desferrioxamina, un quelante de hierro, mejora notablemente el
cuadro bioquímico de la porfiria inducida por HCB (Wainstok de Calmanovici et al.,
1986).
El metabolismo del hemo y en especial la enzima URO-D, están implicados en
la génesis de la manifestación clínica de este tipo de porfiria. Las alteraciones causadas
por el fungicida en el metabolismo de otros compuestos tales como lípidos han sido
también investigadas en un modelo experimental de PCT (Billi de Catabbi et al., 1997)
afectando a fosfolípidos y eicosanoides (Billi de Catabbi et al., 2000a, 2005; Cochon et
al., 2001, 2005). El HCB afecta también a proteínas unidas a membrana y produce
cambios en la fosforilación de las mismas (Randi et al., 1998). Por otra parte Kleiman
de Pisarev et al., (1990) informan que el tratamiento con HCB afecta la función tiroidea
y el metabolismo de la tiroxina. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto que el HCB
tiene en metabolismo de los hidratos de carbono.
Si consideramos todo lo antedicho, el efecto de esta droga porfirinogénica en
diversos metabolismos y dado que el HCB genera una porfiria experimental similar a la
causada por TCDD, otros bifenilos policlorados y a la PCT humana, parece importante
analizar la relación entre la porfiria y las alteraciones causadas por esta droga en
diversas etapas del metabolismo glucídico.
1.1.5. AIA. Mecanismo porfirinogénico: sus efectos sobre CYP y sobre el ALA-S.
Figura 1.6: Estructura química
de la 2-alil-2-isopropilacetamida.
La 2-alil-2-isopropilacetamida (AIA; C8H15NO, PM: 141,21) es una acetamida
que contiene un grupo alilo (Figura 1.6) y causa una importante destrucción del hemo
hepático, particularmente del hemo del CYP (De Matteis, 1971; Smith & De Matteis,
38
Introducción
1980) por N-alquilación de su grupo prostético (hemo), convirtiéndolo en pigmentos
verdes anormales llamados N-alquil-porfirinas.
Se sabe que el AIA en roedores induce una patología química que modela una
porfiria aguda humana (Granick, 1966; Marver et al., 1966). Este desarreglo en el
metabolismo de las porfirinas se produce por el agotamiento del hemo y como
consecuencia de este agotamiento, el aumento de la actividad ALA-S por su derepresión (Moses et al., 1970; Meyer & Marver, 1971; Whiting & Granick, 1976). Esto
lleva a la acumulación de los precursores ALA y PBG en el hígado y excreta en exceso
de los mismos en orina, generándose así un modelo de porfiria aguda en animales
(Smith & De Matteis, 1980; Marks et al., 1988).
El ALA-S se considera que es la principal enzima regulatoria de la biosíntesis
de porfirinas (Tschudy et al., 1972), y su inducción eleva la concentración de ALA muy
por encima de los valores normales. La siguiente enzima en la secuencia metabólica, el
ALA-D, transforma el exceso de ALA en PBG, con el resultado neto de un aumento en
la concentración de los dos precursores porfirínicos, parte de los cuales se excreta en la
orina.
En 1973, Tomaro & Frydman describen por primera vez a la enzima PBG
oxigenasa y su inducción por AIA. Este novedoso tipo de oxidasa aislada a partir de
fuentes vegetales y animales, oxida el PBG a 5-oxo-2-hidroxi-PBG, un metabolito que
no sigue el camino de las porfirinas. La PBG-oxigenasa aislada de hígado de rata o bien
de germen de trigo, se describió como una proteína catiónica, dependiente de hierroazufre que presenta una cinética alostérica y una estructura multimérica. La
administración de AIA por tanto, no sólo induce el ALA-S en ratas, sino que también
induce la PBG-oxigenasa. La máxima inducción de esta última, es coincidente en el
tiempo con el pico de excreción del PBG, y tiene una separación temporal de la
máxima actividad del ALA-S. Los datos sugieren que la inducción secuencial de ALAS y PBG-oxigenasa podría implicar una respuesta metabólica para el problema de la
formación excesiva de PBG en inducción experimental por AIA.
Otros investigadores han demostrado en tratamientos realizados sobre embriones
de pollo, que el AIA, el DDC y el fenobarbital (FB) promueven niveles extremadamente
39
Introducción
elevados de ALA-S, acumulación de porfirinas y marcada elevación en el nivel del
CYP, (Brooker et al., 1983). El mismo trabajo muestra, que por criterios físicos e
inmunológicos, la isoforma CYP inducida por dichos fármacos es idéntica. Datos de
hibridación demostraron que el mRNA inducido es idéntico a la sonda de cDNA
clonada para realizar el estudio. Los 3 fármacos, aunque estructuralmente diferentes,
inducen las misma isoforma de CYP, llamada 2H10. El 2-acetilaminofluoreno (2-AAF),
que es un potente hepatocarcinógeno, induce la actividad de la CYP monoxigenasa y en
gran medida es similar a la inducida por el tratamiento con las drogas antedichas (Gupta
& Abou-Donia, 1998). Esto es de particular importancia en estudios donde se observa
cómo las drogas precipitan ataques de porfiria hepática aguda y se está trabajando en
avanzar sobre la investigación del mecanismo molecular del efecto de diversas drogas
de uso farmacéutico en dichas inducciones.
También Schoenfeld et al., (1985) realizaron un estudio en células hepáticas de
embriones de pollo, y observaron que existía una reducción en presencia de glucosa, de
la inducción del ALA-S por AIA. Asimismo, Rose et al., (1961) encontraron que altas
dosis de glucosa prevenían el desarrollo de la porfiria experimental inducida por AIA,
mientras que la grasa no tenía efecto alguno.
Polo et al., (1988) publicaron un modelo de porfiria aguda con inhibición de la
enzima PBG-D por AIA y glicerina, pero los animales morían en el transcurso de una
hora. Luego se desarrolló un modelo de porfiria a largo plazo, mediante la
administración de los mismos fármacos que utilizó Polo (AIA y glicerina) pero en dosis
más bajas para evitar la precoz mortalidad de los animales. Se encontró que la
administración del compuesto porfirinogénico AIA a ratas macho Wistar (1 dosis/7
días/4 semanas) no constituía un modelo experimental aceptable de porfiria aguda
intermitente (PAI) ya que no conseguía provocar hipoactividad de la enzima PBG-D.
En otros aspectos, Lafta et al., (2008) indagaron acerca del efecto de la
acetamida, en la absorción de hierro en ratones. Se investigó que tanto el AIA como la
succinil acetona (SA), tienen efectos característicos sobre el metabolismo del hemo. La
SA, es un metabolito anormal de la vía metabólica de la tirosina, y se produce en exceso
en pacientes con tirosinemia hereditaria tipo-1. Se comprobó que la inhibición de la
síntesis del grupo hemo con SA, se asocia con un aumento de la absorción de hierro,
40
Introducción
mientras que la estimulación de la síntesis del hemo con AIA se asocia con una
disminución de la absorción del mismo. Los cambios en los niveles de ALA parecen
funcionar como moduladores en la absorción de hierro, pero el mecanismo de este
efecto queda aún sin esclarecerse.
1.1.6. DDC. Mecanismo porfirinogénico: sus efectos sobre CYP y sobre la FQ
Figura 1.7: Estructura química del DDC
El 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC, C14H21NO4; PM 267,32), es
un compuesto que contiene grupos metílicos (Figura 1.7) y produce una disminución
significativa en el pool de hemo y un aumento de la actividad ALA-S, que conduce
también a la acumulación del precursor de la vía, ALA. Posee la propiedad combinada
de destruir selectivamente al CYP por N-alquilación de su grupo prostético hemo,
convirtiéndolo a N-metil protoporfirina, y de impedir la síntesis de hemo causando la
acumulación de PROTO IX. En efecto, esa misma N-metil-PROTO es la que actúa
como poderoso inhibidor a nivel de la actividad FQ, enzima terminal de la síntesis
(Marks et al., 1988). Se ha comprobado que el que metila, es el grupo 4-Me del DDC.
Como consecuencia, hay inducción de ALA-S, acumulación y excreción en
exceso de PROTO, así como también de precursores, por lo que su uso estaría
modelando una porfiria aguda del tipo PV (Smith & De Matteis, 1980; Marks et al.,
1988). Comparte el mismo mecanismo porfirinogénico y modela el mismo tipo de
porfiria que la griseofulvina (Gris), ya que se ha sugerido que uno de los grupos metilos
de la molécula de Gris cumpliría también la misma función anteriormente indicada
(Navone et al., 1991). Estos tóxicos actúan como sustratos suicidas del CYP porque son
sustratos y producen un inhibidor para la misma enzima que las metaboliza (Ortiz de
Montellano & Correia, 1983).
41
Introducción
Embriones de pollo, ratas, ratones y conejos, han sido usados para ensayar la
capacidad porfirinogénica de diferentes drogas. El embrión de pollo in ovo ha sido muy
usado para este fin, ya que se ha sugerido que refleja mejor la susceptibilidad humana a
la exacerbación de la porfiria clínica por drogas, que las especies mamíferas (Cochón et
al., 1997). La administración a embriones de pollo, ratas o ratones de pequeñas dosis de
DDC junto con el compuesto a ser examinado, ha sido usada por ciertos investigadores
como un modelo muy sensible para estudiar la capacidad porfirinogénica de diversas
drogas (Cochón et al., 1997).
Los inactivadores irreversibles del CYP actúan por unión covalente del
inhibidor, o del fragmento derivado de él, al nitrógeno pirrólico del grupo prostético
hemo de la enzima. Esta N-alquilación del hemo autocatalizada, es el resultado del
metabolismo oxidativo de los CYP por olefinas terminales como AIA, secobarbital y los
compuestos con grupos alilos, como dialilsulfuro y dialilsulfona que dan origen a los
históricos pigmentos verdes que fluorescen rojo, y también del metabolismo de los
acetilenos terminales, dihidropiridinas como (DDC) y dihidroquinolinas, alquil y aril
hidracinas e hidrazonas (San Martín de Viale, 2007).
Además, la intoxicación con DDC imita las alteraciones hepatocelulares
asociadas al alcoholismo y se caracteriza por la aparición de agregados citoplásmicos de
distintos tamaños (cuerpos de Mallory-Denk, o MDBs) que contienen proteínas del
citoesqueleto (Denk et al, 2000; Zatloukal et al., 2007; Cochón et al., 2010).
Alteraciones del citoesqueleto muy similares a las observadas en la hepatitis alcohólica
humana, también puede ser inducida en ratones por intoxicación crónica con Gris, la
otra droga porfirinogénica recién nombrada (Denk et al, 1975; Katsuma et al, 1987).
1.2. METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO, SU REGULACIÓN
Generalidades
Las cuatro clases principales de moléculas orgánicas en sistemas vivos son las
proteínas, los lípidos, los ácidos nucleicos y los carbohidratos. Estos últimos forman el
grupo de compuestos orgánicos más abundantes de la naturaleza, y casi todos los
42
Introducción
organismos los sintetizan y metabolizan (Wade, 2005). El término carbohidrato se debe
a que los azúcares más simples tienen la fórmula empírica CnH2nOn, (con n ≥ 3), lo que
sugiere que los átomos de carbono están de alguna manera combinados con el agua. Así,
los químicos se refieren a estos compuestos como hidratos de carbono o carbohidratos.
Las plantas verdes y las bacterias los producen en el proceso de fotosíntesis, durante el
cual absorben el CO2 del aire y por acción de la energía solar generan principalmente
glucosa, necesaria para producir energía en forma de ATP. En las plantas, la celulosa es
el principal polisacárido estructural. En los animales invertebrados, la quitina es el
principal componente del exoesqueleto. Y en los vertebrados, las capas celulares de los
tejidos conectivos también contienen hidratos de carbono.
De los glúcidos más sencillos (monosacáridos), el más importante es la glucosa
(Figura 1.8). De fórmula C6H12O6, la glucosa es un sólido cristalino de color blanco que
se caracteriza por tener una función hidroxilo (-OH) típica de los alcoholes, en cada uno
de los carbonos excepto en el primero, donde aparece una función aldehído (Ghazarian
et al., 2011). La glucosa, se oxida para formar CO2 y agua, suministrando energía para
todos los procesos celulares (síntesis, movimiento celular, transporte, etc.).
Figura 1.8: Estructuras en cadena recta y en anillo del la
α-D y β-D glucosa.
La glucosa es el principal combustible de los músculos y otras partes del
organismo y se metaboliza para obtener energía a través de la respiración celular. Está
presente en todas las células, desde los microorganismos hasta los vertebrados
superiores. La regulación de su concentración y distribución constituye uno de los
procesos más importantes que hace posible la vida.
Tanto las plantas como los animales, pueden unir numerosas moléculas de
glucosa para formar moléculas de almacenamiento de energía más grandes. Sin
embargo, las moléculas de glucosa pueden estar enlazadas también para formar una
43
Introducción
variedad de otras macromoléculas. La celulosa, por ejemplo, se compone de moléculas
de glucosa unidas entre sí a través de enlaces β-1,4-glucosídicos. También, como en el
caso del almidón, las glucosas pueden estar unidas a través de enlaces α-1,4; mientras
que los enlaces glucosídicos de glucógeno son del tipo α-1,4 y α-1,6.
El glucógeno es la principal forma en que se almacena la glucosa en vertebrados
tanto en el hígado como en el tejido muscular esquelético. Se encuentra en mayor
proporción en el primero (hasta 6% de su peso) y en el músculo, que rara vez excede el
1%. Sin embargo, debido a su mayor masa, el músculo almacena tres a cuatro veces más
cantidad de glucógeno como reserva que el hígado. Su estructura es muy semejante a la
amilopectina, salvo que es mucho más ramificado (una ramificación cada 8 o 12
unidades de glucosa (Figura 1.9).
Figura 1.9: Estructura básica del
glucógeno, un polímero ramificado de
α-glucosas con uniones α-1,4 donde
las cadenas laterales se encuentran
cada 8-12 moléculas de la cadena
lineal, unidas en forma α- 1,6.
Cuando existe una disminución significativa de glucosa en sangre, el glucógeno
es degradado por medio de una serie de enzimas, para cubrir las necesidades energéticas
del organismo. El metabolismo hepático y en menor grado el renal de grasas y ciertas
proteínas, generan energía para el desarrollo de la gluconeogénesis, proceso por el cual
se sintetizan moléculas de glucosa partiendo de precursores no glucídicos en animales
en estado de ayuno, sin más reservas de glucógeno por degradar.
1.2.1 Metabolismo de la glucosa
La homeostasis de la glucosa está finamente regulada para satisfacer las demandas
energéticas durante los ciclos de ayuno/alimentación en los animales. Aunque la grasa y
las proteínas se pueden movilizar desde el tejido adiposo y el músculo para suministrar
energía a diversos órganos durante ayunos prolongados, las células rojas de la sangre y
el cerebro necesitan de la glucosa como fuente de combustible. Durante condiciones de
44
Introducción
alimentación, la insulina se secreta desde las células β-pancreática en respuesta al
elevado nivel de glucosa en plasma. Las células β-pancreática poseen una maquinaria
que sensa rápidamente el aumento de glucosa en plasma durante el período posprandial.
Esta maquinaria incluye canales de potasio sensibles al ATP que proporcionan factores
de acoplamiento, para gatillar la exocitosis de insulina (Maechler & Wollheim, 2001).
El pegado de la insulina al receptor en la membrana plasmática de las células
blanco, es decir, del músculo, tejido adiposo e hígado, resulta en la rápida absorción de
glucosa en estas células (Saltiel & Kahn, 2001). En el músculo esquelético, la glucosa
se almacena en forma de glucógeno a través de la glucogenogénesis, mientras que en el
tejido adiposo, la glucosa se convierten en triglicéridos a través de la síntesis de ácidos
grasos de novo. En el hígado, la insulina inhibe la glucógenolisis y la gluconeogénesis
mientras que estimula la glucólisis y la síntesis de glucógeno y triglicéridos (Saltiel &
Kahn, 2001). Por lo tanto, el resultado de la acción de la insulina es la reducción de los
niveles plasmáticos de glucosa en el cuerpo. Durante la inanición, cuando el nivel de
glucosa es bajo, las células α-pancreáticas secretan el glucagón que estimula la
movilización de la grasa del tejido adiposo hacia el músculo esquelético para la βoxidación. En el hígado, el glucagón y los glucocorticoides (GC) estimulan la
glucogenólisis para suministrar glucosa a las células rojas de la sangre y el cerebro,
mientras que el efecto a largo plazo de estas hormonas, es la estimulación de la
gluconeogénesis hepática (Jiang & Zhang, 2003).
Varios grupos de investigación han demostrado que el hígado, además de ser un
órgano que genera glucosa, también es un órgano que la capta, en respuesta a un
aumento de la concentración de azúcar en sangre por sobre los niveles fisiológicos. Al
consumir glucosa, y luego de la absorción de la misma por diferentes tejidos,
aproximadamente el 60% quedará almacenada en el hígado para su posterior utilización
(Ferrannini et al., 1980).
Una vez que la glucosa es incorporada en el hígado o tejido muscular, lo hace
como glucosa 6-fosfato (G6P), este es el paso inicial en el metabolismo de la glucosa.
La fosforilación para formar G6P está catalizada por la enzima hexoquinasa (HK;
EC.2.7.1.1).
45
Introducción
1.2.2 Gluconeogénesis: Las enzimas claves.
La gluconeogénesis es la formación de glucosa a partir de precursores no
glucosídicos como el piruvato, lactato, glicerol y aminoácidos glucogénicos, excepto la
leucina y la lisina (Fig. 1.10). Esta vía bioquímica se produce principalmente en el
hígado y es esencial para la supervivencia durante el ayuno, tratando de mantener con
ello, las concentraciones de glucosa en sangre dentro de los límites fisiológicos para el
funcionamiento óptimo de todo el organismo. También juega un papel importante en la
eliminación de lactato y el mantenimiento de la disponibilidad de glucosa durante el
ejercicio (Corssmit et al., 2001).
El principal punto de entrada a esta vía es el piruvato, que en la mitocondria se
carboxila a oxalacetato. En el citosol, el oxalacetato se descarboxila y fosforila para
formar fosfoenolpiruvato (PEP). Cualquiera de los intermediarios del ciclo de Krebs se
puede utilizar como fuente de carbono para esta vía metabólica. Los ácidos grasos de
cadena impar proporcionan un esqueleto de carbonos que derivarán en acetil-CoA y
succinil-CoA (este último es sustrato gluconeogénico, por ser intermediario del ciclo de
Krebs).
Algunos tejidos, requieren un aporte continuo de glucosa. Esta se obtiene a partir
del glucógeno proveniente del hígado, el cual solo puede satisfacer dichas necesidades
durante el tiempo que tarda en agotarse dicho polisacárido alli almacenado
(aproximadamente entre 8-10hs). Posteriormente, comienza la formación de glucosa por
neosíntesis, a partir de sustratos diferentes al glucógeno.
46
Introducción
Figura 1.10. Vías gluconeogénica/glucolítica y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). El lactato y
la alanina, productos de la glucólisis anaeróbica y la degradación de proteínas, se convierten a piruvato
que luego es carboxilado por la piruvato carboxilasa (PC) a oxalacetato. El oxalacetato se convierte en
malato por la malato deshidrogenasa mitocondrial (MDH) en el ciclo de los TCA. El malato
mitocondrial pasa al citoplasma donde se oxida a oxalacetato por la MDH citosólica dependiente de
NAD. El malato se convierte finalmente en fosfoenolpiruvato (PEP) por la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa (PEPCK). La conversión de múltiples pasos desde el PEP al producto final glucosa, a
través de la inversión de las reacciones de la glucólisis, requiere de las enzimas gluconeogénicas,
fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa1) y glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa), para evitar las reacciones
glucolítica catalizadas por la fosfofructoquinasa (PFK) y hexoquinasa (HK). El glicerol obtenido a partir
de la hidrólisis de los triglicéridos (TG) también puede entrar en la vía de la gluconeogénesis a través de
la conversión a dihidroxiacetatofosfato (DHAP). ALT, alanina-aminotransferasa; CS, citrato sintasa; G3P (o GAP), gliceraldehído-3-fosfato; IDH, isocitrato deshidrogenasa; α-KDH, α-cetoglutarato
deshidrogenasa; LDH, lactato deshidrogenasa; PDH, complejo piruvato deshidrogenasa; PK, piruvato
quinasa; SDH, succinato deshidrogenasa; FFA, ácidos grasos libres. Se destacan algunas de las enzimas
de la gluconeogénesis en violeta y de las glucolíticas en rojo (Adaptado de Jitrapakdee, 2012).
47
Introducción
La gluconeogénesis requiere cuatro enzimas adicionales que evitan las tres
reacciones irreversibles catalizadas por las enzimas glucolíticas: piruvato quinasa (PK;
EC.2.7.1.40);
fosfofructoquinasa-1
(PFK1;
EC.2.7.1.11)
y
hexoquinasa
(HK;
EC.2.7.1.1). Estas cuatro enzimas gluconeogénicas son la piruvato carboxilasa (PC;
EC.4.6.1.1); la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK; EC. 4.1.1.32); la fructosa1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1; EC.3.1.3.11), y la glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa; EC.3.1.3.9).
La gluconeogénesis y la glucólisis están normalmente reguladas en forma
recíproca, de modo que una de las vías está detenida cuando la otra está muy activa. La
actividad de esta vía va a depender principalmente de la concentración de glucagon
circulante. Esta hormona posee la capacidad de estimular su actividad mediante el
despliegue de 3 reacciones:
i- Cambios en los efectores alostéricos: en presencia del glucagon se disminuye
la concentración de la fructosa-2,6-bisfosfato (F2,6-BP), por lo que se inhibe la PFK1 y
se activa la FBPasa1, esto se debe a la fosforilación ejercida por parte de la proteinquinasa A (PKA) sobre la enzima PFK-2 (EC.2.7.1.105). En cambio, cuando la glucosa
abunda, el nivel elevado de F2,6-BP inhibe la gluconeogénesis y activa la glucólisis.
ii- Modificaciones covalentes de la actividad enzimática: el glucagon
desencadena el aumento de la concentración de AMPc; por lo que se impulsa la
actividad quinasa de las proteínas dependientes de AMPc. Así, se fosforila la PK
inactivandola, permitiendo de esta forma dirigir el PEP hacia la síntesis de glucosa.
iii- Inducción de la síntesis de enzimas: El glucagon estimula la actividad de la
PEPCK gracias a que favorece el incremento de la trascripción del gen que codifica para
dicha enzima.
De igual forma cobra gran importancia en la regulación de la gluconeogénesis, la
disponibilidad de sustratos específicos de este proceso:
i- Disponibilidad de sustrato: ante la concentración disminuida de insulina, se
produce la movilización de aminoácidos que provienen de las proteínas musculares que
van serán utilizados como precursores de la gluconeogénesis.
48
Introducción
ii- Activación alostérica por acetil–CoA: la acetil-CoA en el período de ayuno
favorece la activación alostérica de la PC, debido a que en el hígado se acumulan ácidos
grasos como resultado de la lipólisis excesiva en tejido adiposo. Así, se aumenta la
formación de acetil-CoA por la acción de la beta oxidación de estos ácidos.
iii- Inhibición alostérica por el AMP: activa la PFK1 e inhibe a la F1,6-BPasa.
Elevadas concentraciones de AMP estimulan así la ruta de la glucólisis.
Algunas enzimas que participan en la vía glucolítica, también lo hacen en la
gluconeogénesis, pero ambas rutas se diferencian por tres reacciones irreversibles que
utilizan enzimas específicas en cada proceso. En la gluconeogénesis, estas reacciones
son las que catalizan la: i) conversión de piruvato a PEP (a través de PC y PEPCK); ii)
la conversión de G6P a glucosa (por la G6Pasa); y iii) la de F1,6BP a F6P (por la acción
de la FBPasa 1).
i-Conversión de piruvato a PEP (a través de las enzimas PC y PEPCK)
El oxalacetato es intermediario en la producción del PEP en la gluconeogénesis.
La conversión de piruvato a PEP se lleva a cabo en dos pasos (Fig 1.11). La enzima que
cataliza esta primera reacción es la PC, una enzima alostérica que se encuentra en la
mitocondria. Esta, cataliza la reacción de piruvato (derivado de la alanina, vía AAT, o
del lactato, mediante la LDH y CO2), para dar oxalacetato (Utter & Keech, 1960). Este
paso requiere energía, la cual queda disponible por hidrólisis de un ATP.
La PC de diversos orígenes, como ya fue explicado es activada alostéricamente
por acetil-CoA (Scrutton et al., 1965). Cuando hay más acetil-CoA del necesario para
mantener el ciclo del ácido cítrico, el piruvato se dirige hacia la gluconeogénesis. El ion
magnesio y la biotina son necesarios para una catálisis eficaz. La biotina, enlazada
covalentemente con la enzima, reacciona con el CO2, que se une de manera covalente.
Después el CO2 se incorpora al piruvato, formando así el oxalacetato.
49
Introducción
Fig 1.11. Las dos etapas en la conversión del piruvato a PEP; la primera implica la carboxilación del
piruvato a oxalacetato consumiendo ATP y realizada por la enzima PC; luego la decarboxilación y
fosforilación del oxalacetato hacia PEP, consumiendo GTP, por la enzima PEPCK.
Esta enzima también juega funciones no gluconeogénicas, tal como la
lipogénesis y la gliceroneogénesis en tejido adiposo blanco (Reshef et al., 2003); la
síntesis de glutamato en astrocitos (Hertz et al., 1999) y la secreción de insulina en
células β-pancreáticas inducidas por glucosa (Jitrapakdee et al., 2006, 2008; Hasan et
al., 2008). En la rata y el ratón, el gen de la PC está regulado por dos promotores
alternativos (Jitrapakdee et al., 1997, 2001), mientras que en humanos (Wang et al.,
2008) el gen está regulado por tres promotores. El uso de promotores alternativos
resulta en la producción de transcriptos alternativos con diferentes regiones 5´ no
codificantes (Jitrapakdee et al., 1997, 2001). En las ratas, el promotor proximal se activa
bajo condiciones gluconeogénicas y lipogénicas (en hígado y tejido adiposo,
respectivamente), mientras que el promotor distal se activa durante la secreción de
insulina inducida por glucosa en células β-pancreáticas (Jitrapakdee et al., 1998).
La enzima PEPCK, realiza el segundo paso, catalizando la conversión de
oxalacetato a PEP (Hanson & Reshef, 1997). Esta reacción también incluye la hidrólisis
de un nucleósido-trifosfato, en este caso el GTP en vez del ATP.
Hay dos formas de PEPCK, la citosólica y la mitocondrial, que son codificadas
por dos genes nucleares diferentes (Hanson & Reshef, 1997). La PEPCK mitocondrial
convierte fácilmente el oxalacetato formado en la mitocondria a PEP. Con el fin que el
oxalacetato entre en el citosol, donde es sustrato para la PEPCK citosólica, éste es
50
Introducción
convertido primero en malato por la malato deshidrogenasa (MDH; EC.1.1.1.37)
mitocondrial. El malato es exportado al citosol, donde se convierte de nuevo a
oxalacetato por la MDH citosólica. Se propone que la PEPCK mitocondrial sostiene la
gluconeogénesis a partir del lactato, mientras que la PEPCK citosólica lo haría a partir
de los aminoácidos glucogénicos (Hanson & Reshef, 1997).
A diferencia de la mayoría de las enzimas metabólicas, PEPCK no está sujeta a
regulación alostérica u otra del tipo postraduccional, sino que es controlada de forma
multi-hormonal a nivel transcripcional, como se evidencia por la presencia de elementos
de respuesta en su promotor a insulina, que inhibe la síntesis proteica; y a
glucocorticoides, cAMP y hormona tiroidea que la activan (Hanson & Reshef, 1997;
Yang et al, 2009a, 2009b). En contraste con la PEPCK citosólica, la regulación de la
transcripción en la PEPCK mitocondrial es casi desconocida.
ii-Conversión de G6P a glucosa (a través de la enzima G6Pasa)
El sistema enzimático de la glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa) comprende: la
actividad fosfatasa con su sitio activo sobre el lado citosólico; el transportador de la
G6P (T1); el transportador de la glucosa (T2) y el transportador del fosfato inorgánico
(T3), los cuales están unidos al retículo endoplásmico (RE) (Mithieux, 1997). La
importancia de su localización microsomal está dada por la función característica del
hígado y riñón, que es sintetizar glucosa para exportarla a los tejidos a través de la
circulación sanguínea. El transportador T1, funciona trasladando G6P del citosol al RE.
La G6Pasa cataliza la hidrólisis dependiente de Mg2+, partiendo de G6P para dar
glucosa y Pi, en lo que es la etapa final de la gluconeogénesis. La glucosa es luego
transportada por el RE y la membrana plasmática, a través del transportador T2,
liberando desde éste la glucosa a circulación.
La G6Pasa se expresa predominantemente en el hígado y el riñón, pero también
puede expresarse a menor nivel en los intestinos. Al igual que PEPCK, la G6Pasa está
regulada a nivel transcripcional, pero no post-traduccional. El promotor de la G6Pasa
contiene múltiples sitios de unión a factores/co-activadores de transcripción sensibles a
hormonas (Hutton & O'Brien, 2009).
51
Introducción
La regulación de la gluconeogénesis hepática se puede controlar a través de
mecanismos pre- y post-traduccionales. Los controles post-traduccionales incluyen la
regulación del suministro de sustrato y la regulación alostérica de la actividad
enzimática, mientras que el control pre-traduccional se consigue a través de factores de
transcripción que median la activación y la represión de genes que codifican a las
enzimas gluconeogénicas (Corssmit et al, 2001)
La expresión de los mRNA que codifican estos diversos factores de
transcripción y sus actividades, está controlada por insulina y glucagón, lo que explica
por qué la gluconeogénesis en si, esté hormonalmente regulada. Han sido identificados
sitios de unión para múltiples factores de transcripción en regiones promotoras de genes
que codifican para las enzimas gluconeogénicas, lo que sugiere la interacción
cooperativa de los factores de transcripción durante el ayuno, induciendo el aumento de
la expresión génica de la gluconeogénesis (Klover & Mooney, 2004).
iii-Conversión de F1,6BP a F6P (a través de la enzima FBPasa 1)
La reacción en la glucólisis llevada a cabo por la fosfofructoquinasa 1 (PFK1;
EC. 2.7.1.11) es esencialmente irreversible, debido a que está impulsada por la
transferencia de un fosfato del ATP. La reacción que tiene lugar en la gluconeogénesis
para evitar este paso, consiste en una simple reacción hidrolítica, catalizada por la
fructosa-1,6 bisfosfatasa (FBPasa 1) que permite la conversión de F1,6BP a F6P. La
enzima tiene múltiples subunidades y requiere de la presencia de Mg2+ para su
actividad, constituyendo uno de los lugares de control donde se regula la ruta de la
gluconeogénesis.
La FBPasa-1 se expresa principalmente en la hígado y es inhibida
alostéricamente por fructosa-2,6-bisfosfato, que es producida por el complejo
enzimático
bifuncional
fosfofructoquinasa2/fructose-2,6-bisfosfatasa
(PFK-2;
EC.2.7.1.105/ FBPasa-2; EC. 3.1.3.46) (O'Brien & Granner, 1996). Aunque las regiones
promotoras del gen de la FBPasa-1 han sido clonadas, la información disponible es
limitada con respecto a los elementos que actúan en cis, y que median la regulación
transcripcional de esta enzima bajo diversas condiciones fisiológicas (El-Maghrabi et al,
52
Introducción
1991; Herzog et al, 2000). La F6P formada en la reacción experimenta posteriormente
la isomerización a G6P por la acción de la fosfoglucoisomerasa (PGI; EC.5.3.1.9).
Entonces, las hormonas que regulan esta ruta metabólica son: el glucagón, la
insulina y las catecolaminas, y lo hacen controlando la expresión génica de algunas
enzimas claves. El glucagón durante el ayuno, estimula esta vía aumentando la
expresión de la PEPCK y de la FBPasa1, e inhibiendo la expresión de la PFK1, PK y la
PFK2, mientras que la insulina, inhibe a estas últimas ante el aumento en la ingesta de
alimentos. El efecto de las catecolaminas depende del estado nutricional del organismo.
La inanición aumenta la acetil-CoA que estimula la PC y por lo tanto la
gluconeogénesis; la elevación de alanina y glutamina estimulan también esta vía. El
cortisol aumenta la disponibilidad de sustrato y la F2,6BP inhibe a la FBPasa1.
1.2.3 Glucólisis: descripción de los pasos de la vía.
La glucólisis es el primer paso de la respiración celular y consiste en una serie
de reacciones que ocurren en el citoplasma de la célula y por las cuales, a partir de una
molécula de glucosa, se producen dos moléculas de piruvato. Todos los organismos
llevan a cabo este proceso. La glucólisis se divide en dos partes; en la primera la
molécula de glucosa se divide en dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato (GAP) y en
la segunda estas dos moléculas se convierten en dos moléculas de piruvato (Figura
1.12). Durante la glucólisis se producen dos moléculas de ATP. A esta vía también se la
conoce como ciclo de Embden-Meyerhof. Está catalizada por 11 enzimas, todas de
localización citoplasmática. En los primeros pasos se requiere del aporte de energía,
abastecido por el acoplamiento con el sistema ATP/ADP.
El ATP reacciona con la glucosa desprendiéndose un grupo fosfato que se
ensambla para producir G6P + ADP. Esta reacción es catalizada por la enzima,
hexoquinasa (HK-GK, EC.2.7.1.1). La molécula se reorganiza en un anillo pentagonal,
con ayuda de la enzima fosfoglucoisomerasa (PGI, EC.5.3.1.9), obteniéndose F6P.
La
reacción
puede
seguir
ambas
direcciones,
dependiendo
de
las
concentraciones de los intermediarios. La siguiente acción es catalizada por una
53
Introducción
enzima alostérica fosfofructoquinasa (PFK1), para dar la F1,6BP. El ATP actúa como
efector alostérico, inhibiéndo la actividad enzimática.
Figura 1.12 Camino de la glucólisis: La glucólisis es una via metabólica en la que un mol de glucosa es
catabolizado a dos moles de piruvato, NADH y ATP: Glucosa + 2ATP + 2NAD++ 2Pi -> 2 Piruvatos +
4ATP + 2NADH + 2H+. En condiciones aerobicas, el piruvato se oxida adicionalmente por enzimas
mitocondriales a CO2 y H2O. La glucólisis puede ser separada generalmente en dos fases, la de
generación de precursores y la de producción de energía. La primera fase utiliza dos moles de ATP para
convertir la glucosa en fructosa-1,6-bisfosfato. En la segunda fase, la fructosa-1,6-bifosfato es convertida
adicionalmente por etapas en piruvato con la producción de cuatro moles de ATP y dos moles de NADH.
ENO1, enolasa1; GAPD, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa; GPI, glucosa-6- fosfato isomerasa;
HK, hexoquinasa; LDH, lactato dehidrogenasa; PFK, fosfofructoquinasa; PGK, fosfoglicerato quinasa;
PGM, fosfoglicerato mutasa; PK, piruvato quinasa; TPI, triosa fosfo isomerasa.
54
Introducción
La interacción entre la PFK1 y la F6P es el principal mecanismo regulador de
la glucólisis. Si existe ATP en cantidades adecuadas para la vida normal de la célula,
este inhibe la actividad de la enzima cesando la producción de ATP y se conserva la
glucosa. Si la concentración de ATP es baja, la enzima se desinhibe y continúa la
degradación de la glucosa. Luego la F1,6-BP se escinde en dos moléculas de tres
carbonos cada una: la dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y el gliceraldehído 3-fosfato
(GAP). Ambas son isómeros que pueden transformarse una en otra por acción de una
enzima fosfogluco-(hexosa)-isomerasa (PGI; EC.5.3.1.9).
Toda la DHAP se convierte eventualmente en GAP. A partir de este punto en
las reacciones, debemos multiplicar por dos los productos obtenidos para tener en
cuenta el destino de una molécula de glucosa. Cada GAP se oxida, con ayuda de la
enzima gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPD, EC.1.2.1.9), la cual reduce el
NAD+ en NADH. Esta es la primera reacción en la que la célula obtiene energía
conservándose parte de ella en la unión de un grupo fostafo con GAP, el que se
transforma en 1,3-difosfoglicerato (1,3diPGA). La enzima fosfoglicerato quinasa
(PGK, EC.2.7.2.3) libera un fosfato del 1,3diPGA, generando una molécula de ATP.
Como esta reacción es muy exergónica, impulsa a todas las reacciones previas para
que avancen. El grupo fosfato remanente se transfiere de la posición 3 a la 2 mediante
la acción enzimática de la fosfogliceromutasa (PGM, EC.5.4.2.1). Se pierde una
molécula de agua del compuesto y mediante este reordenamiento interno, la molécula
con ayuda de la enzima enolasa (ENO1; EC.4.2.1.11) concentra energía en la vecindad
del grupo fosfato. El fosfato se transfiere a una molécula de ADP, obteniéndose una
molécula de ATP y un piruvato. Esta reacción, catalizada por la piruvato quinasa (PK),
impulsa a las dos reacciones precedentes.
Así, de una molécula de glucosa se obtiene de forma neta, dos moléculas de
ácido pirúvico, dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH.
1.2.3.1. Paso final de la Glucólisis. Regulación de la piruvato quinasa (PK)
Las reacciones catalizadas por la HK, PFK1 y PK suceden con pérdida de
energía libre. Estos pasos exergónicos de la glucólisis, son los candidatos ideales en la
regulación de la vía. De hecho, estudios in vitro han demostrado que las tres enzimas
55
Introducción
están alostéricamente controladas (Pinilla et al., 1982). Sin embargo la regulación de la
HK, no es un punto de control tan importante para la glucólisis. Esto es debido al hecho
de que grandes cantidades de G6P derivan directamente de la degradación del
glucógeno (el mecanismo predominante de entrada de carbohidratos a la glucólisis
desde el músculo esquelético) y por lo tanto, la reacción de dicha enzima es
prácticamente redundante.
Como fue explicado precedentemente, la piruvato quinasa (PK; EC. 2.7.1.40),
cataliza la transformación de PEP y ADP, en piruvato y ATP (Kayne, 1973). La enzima,
que aparece en todas las células vivas, es clave en esta ruta primordial del metabolismo
de carbohidratos. La regulación de la PK es muy importante para frenar la glucólisis,
cuando el ATP se encuentra en suficiente concentración para abastecer las necesidades
celulares, con el fin de poder activar la gluconeogénesis (Valentini et al., 2000).
Existen cuatro isoformas distintas de PK en los tejidos humanos (Hall & Cottam
1978; Consler et al., 1989) codificados por dos genes diferentes. Uno se encuentra en el
cromosoma 1, identificado como el gen PKLR (Tani et al., 1987) y expresado en el
hígado como proteína PKL y en eritrocitos como PKR. La expresión de ambas proteínas
es dependiente de elementos promotores tejido-específicos, sobre dicho gen (Kahn,
1998).
El otro gen de la PK está localizado en el cromosoma 15 y codifica dos proteínas
identificadas como PKM1 y PKM2. La designación PKM refleja el hecho de que a la
enzima se la pensó originalmente como una expresión específica de músculo. Las dos
isoformas PKM, son el resultado del splicing alternativo del gen PKM (Noguchi et al.,
1986). Ahora se sabe que la mayoría de los tejidos expresan tanto la isoforma PKM1
como PKM2. PKM1 se encuentran en numerosos tejidos diferenciados normales,
mientras que PKM2 se expresa en la mayoría de las células proliferativas. Todos los
tipos de cáncer que han sido examinados para la expresión PK, muestran el patrón de
expresión de la isoforma PKM2. En efecto, la expresión de PKM2 genera una vía
diferenciada de oxidación de la glucosa a lactato en células cancerosas (Zwerschke et
al., 1999; Oehler et al., 2000).
El isoforma PKL hepática ha sido la más estudiada in vitro. Esta enzima es
inhibida por ATP y acetil-CoA y es activada por F1,6BP (Kawaguchi et al., 2001). La
56
Introducción
inhibición de la PK por ATP es similar al efecto del ATP en la PFK1. La unión del ATP
al sitio de regulación, reduce su afinidad por el PEP (Mattevi et al., 1996). La enzima
hepática también es controlada a nivel de síntesis. El aumento de la ingestión de
hidratos de carbono induce a la síntesis de PKL que produce elevados niveles de la
misma en las celulas (Bizeau et al., 2001). Con dietas ricas en carbohidratos, se puede
inducir hasta 10 veces la concentración de PK, en comparación con dietas pobres en
carbohidratos.
La regulación de PKL es característica de un tejido gluconeogénico, y se regula
a través de la fosforilación por la PKA o fosfoquinasa A. Sin embargo las isoenzimas
tipo M, no se ven afectadas por ese mecanismo. Como consecuencia de estas
diferencias, los niveles de glucosa en sangre y las hormonas asociadas pueden regular el
balance de la gluconeogénesis y de la glucólisis hepática, mientras que el metabolismo
muscular no se vería afectado.
La deficiencia de PK, debida a una mutación genética, origina alteraciones,
únicamente en el metabolismo de los eritrocitos, porque estas células no son capaces de
compensar el defecto enzimático aumentando la síntesis de enzima mutada ni utilizar
otras rutas degradativas (Demina et al., 1999). Los eritrocitos de los individuos
afectados tienen una capacidad reducida para producir ATP y por lo tanto no tiene
suficiente ATP para realizar actividades tales como bombeo de iones o mantener el
equilibrio osmótico. Estos eritrocitos tienen una vida media corta, debido a la fácil lisis.
La deficiencia de PK es la causa más común de anemia hemolítica hereditaria
esferocítica (Barociani & Beutler, 1993)
La isoenzima PK hepática está regulada por fosforilación, efectores alostéricos,
y modulación de la expresión génica (Muñoz & Ponce, 2003). Los efectores alostéricos
más importantes son la F1,6BP, que estimula la actividad PK disminuyendo su Km para
PEP y para el efector negativo ATP. La PK hepática se fosforila y se inhibe por la PKA,
y por lo tanto está bajo control hormonal similar a la PFK2. Condiciones extracelulares
que conducen a la fosforilación e inhibición de PK hepática, tales como la baja glucosa
sanguínea y los altos niveles de glucagón circulante no inhiben la enzima muscular
(Hall & Cottam, 1978). El resultado de esta regulación diferencial es que las hormonas
como el glucagón y la epinefrina favorecen la gluconeogénesis por inhibición de la
57
Introducción
glucólisis hepática, mientras que a la vez, la glucólisis muscular puede proceder de
acuerdo con las necesidades en sus condiciones intracelulares.
1.2.4. Glucogenogénesis y glucógenolisis: GS y GP como enzimas claves.
La acumulación de glucógeno, es la respuesta fisiológica en mamíferos al
aumento de la concentración de glucosa en sangre, que se produce después de cada
comida. Este se almacena principalmente en el hígado y el músculo esquelético (Roach,
2002). De acuerdo al contenido de carbohidratos ingeridos, la gluconeogénesis se
suprime, y el exceso de glucosa se metaboliza o almacena (Cahill, 1970).
La glucogenogénesis es la ruta por la cual se sintetiza el glucógeno. Es la vía
bioquímica que permite la incorporación de nuevas unidades de glucosa provenientes de
la dieta a la molécula creciente de glucógeno, es bien conocida e implica la acción de
variadas y sucesivas enzimas. Este proceso se lleva a cabo en el citosol, siendo su
principal sustrato la G6P, requiere de la energía aportada por el ATP y la uridina trifosfato
(UTP). Se inicia con la conversión de la G6P en G1P, consumiendo una molecula de ATP,
acción catalizada por la enzima PGM. Posteriormente se sintetiza la UDP-glucosa (UDPG)
a partir de G1P y UTP, por acción de la UDP-glucosa fosforilasa. La glucógeno sintasa
(GS; EC.2.4.1.11), cataliza la adición de residuos de glucosa al extremo no reductor de
una cadena de glucógeno naciente, a través de enlaces α-1,4-glucosídicos, utilizando la
UDPG como sustrato. La elucidación de este mecanismo le valió al Dr. Luis F. Leloir el
premio Nobel de 1970 (Leloir et al., 1959; Leloir & Goldberg, 1960).Tradicionalmente,
esta enzima, que cataliza el paso clave de la síntesis, se ha considerado como la que
ejerce el máximo control de la vía metabólica. De hecho, la actividad GS está altamente
regulada a través de fosforilaciones en múltiples sitios y efectores alostéricos (Bollen,
1998) principalmente por la G6P (Villar-Palasi & Guinovart,
1997). La reacción
catalizada por la GS además, es la limitante de velocidad para la síntesis de glucógeno
en todos los órganos (Roach et al., 1998). Sin embargo, algunos investigadores han
demostrado que el control de almacenamiento del glucógeno no reside exclusivamente
en la GS y que otros factores también deben ser considerados (Ferrer et al., 2003).
Luego, la enzima ramificante genera enlaces α1-6 sobre la cadena principal. Estas
ramificaciones permiten la formación de nuevos extremos no reductores, que aceleran la
58
Introducción
síntesis de glucógeno debido a que hay una mayor cantidad de aceptores de residuos
glucósidos. Por otra parte, una mayor cantidad de terminaciones no reductoras también
contribuye a una degradación de glucógeno más rápida, puesto que existe una mayor
cantidad de terminaciones por las cuales iniciar la degradación.
Figura 1.13 -Glucogenogénesis: Se inicia con la conversión de la G6P en G1P, acción catalizada por la
enzima fosfoglucomutasa (PGM). Posteriormente se sintetiza la UDP-glucosa (UDPG) a partir de G1P y
UTP, por acción de la UDP-glucosa pirofosforilasa. La glucógeno sintasa (GS), cataliza la adición de
residuos de glucosa al extremo no reductor de una cadena de glucógeno naciente, a través de enlaces α1,4-glucosídicos, utilizando la UDP-glu como sustrato.
La glucógenolisis es la vía de degradación del glucógeno. La glucógeno
fosforilasa (GP; EC 2.4.1.1) cataliza el primer paso del camino y se encarga de atacar
enlaces exoglucosídicos. Por degradación del mismo se genera glucosa-1-fosfato (G1P)
desde la unión terminal α-1,4 glucosídica (Livanova et al, 2002) y esta reacción se
expresa como:
59
Introducción
(α-1,4 glucosido)n + Pi ↔ (α-1,4 glucosido)n-1 + G1P
La GP no es capaz de romper más allá de los puntos de ramificación α1-6. Para
ello el proceso des-ramificador requiere la actividad catalítica de la glucotransferasa que
elimina tres residuos de glucosa y transfiere este trisacárido intacto al extremo de alguna
otra ramificación externa. El residuo de glucosa queda unido a la cadena por un enlace
α1-6; este enlace se rompe por la actividad α1-6 glucosidasa.
La síntesis y degradación del glucógeno están controladas coordinadamente por
una cascada amplificadora disparada por hormonas, de modo que la GS es inactiva
cuando la GP es activa, y viceversa. Ambas enzimas están controladas por fosforilación
y por interacciones alostéricas no covalentes. En un estado de buena alimentación, la
GS es activada alostéricamente por la G6P, la que provoca un reordenamiento
conformacional exponiendo simultáneamente los residuos fosforilados de la proteína
GS. La desfosforilación de estos residuos produce una enzima activa, que ya no necesita
la presencia de G6P para mantener su conformación funcional. (Ferrer et al., 2003).
La GP hepática se activa por transfosforilación debida a la PKA, en presencia de
magnesio. Esta activación es acelerada varias veces por el monofosfato cíclico de
adenosina (AMPc). El glucágon y la adrenalina triplican la formación de AMPc, por lo
tanto activan la GP hepática, lo que explica los potentes efectos glucógenoliticos de
dichas hormonas. La epinefrina (adrenalina), insulina y glucagón también regulan la GP
mediante sistemas de amplificación por segundos mensajeros que están ligados a la
proteína-G. La adrenalina activa la adenilato ciclasa a través de receptores
transmembrana acoplados a Gs, los cuales activan la enzima para aumentar la
concentracion intracelular de AMPc. El AMPc se une y libera una forma activa de la
PKA. Luego, la PKA fosforila una fosforilasa- b-quinasa (dando la forma fosforilasa-aquinasa, activa), que a su vez, fosforila a la GP-b (inactiva), transformándola en la GP-a
(activa). Esta fosforilación se realiza sobre la serina 14 de la GP. La desactivación se
produce mediante una fosforilasa-fosfatasa específica.
En el hígado, el glucagón también activa otro receptor asociado a la proteína G,
que desencadena una cascada diferente, dando lugar a la activación de la fosfolipasa C
(PLC). La PLC indirectamente provoca la liberación de calcio del retículo endoplásmico
de los hepatocitos hacia el citosol. La mayor disponibilidad de calcio, pega la subunidad
60
Introducción
de calmodulina para activar también la fosforilasa b-quinasa. La fosforilasa-a-quinasa,
activa así a la GP, en la misma forma que se mencionó anteriormente.
1.2.5. Glucocorticoides: Regulación sobre el metabolismo de hidratos de carbono.
La secreción de glucocorticoides (GC) por la corteza suprarrenal está bajo el
control de un sistema de retroalimentación neuroendocrino, el eje hipotalamo-pituitarioadrenal (HPA). La activación del eje HPA comienza con la secreción hipotalámica de la
hormona liberadora de corticotropina (CRH); la activación de la transcripción génica en
la pituitaria en respuesta a CRH; la secreción de la hormona adrenocorticotropina
(ACTH) y la estimulación de la síntesis adrenal de los GC por inducción con ACTH.
Los GC, a su vez, inhiben la expresión génica y la secreción de CRH a nivel
hipotalámico, e interfieren con la transcripción y secreción de ACTH en la hipófisis
anterior (Drouin et al., 1989; Cole et al., 1995; Raber, 1998; Malkoski & Dorin, 1999)
estableciendo de ese modo un bucle de retroalimentación reguladora.
Los niveles bajos de glucosa en plasma durante el ayuno y el ejercicio
desencadenan una serie de señales hormonales que promueven un cambio en el uso de
energía de todo el cuerpo. Junto a una caída en los niveles de insulina, las hormonas
contra-reguladoras ganan el control metabólico. Estas son principalmente la hormona
peptidica glucagón, liberada de las células α de los islotes pancreáticos; y los GC
suprarrenales liberados a la circulación (Unger & Orci, 1981; Andrews &Walker, 1999)
que antagonizan las acciones de la insulina (Saltiel, 2001).
Una de las características destacadas del metabolismo hepático es la capacidad
para la neosíntesis de glucosa, la gluconeogénesis durante el ayuno, a fin de
proporcionar la glucosa a los tejidos extrahepáticos, tales como eritrocitos, médula
renal, y cerebro (Consoli, 1992). Durante el ayuno, los ácidos grasos libres (FFA) y los
precursores de aminoácidos se canalizan en la vía gluconeogénica que comprende,
como ya fue descripto, varios pasos bioquímicos en la conversión de piruvato a glucosa.
Las principales enzimas reguladoras son la PC, que convierte el piruvato en oxalacetato,
la PEPCK que promueve la descarboxilación de oxalacetato a PEP, y, finalmente la
61
Introducción
G6Pasa, que hidroliza la G6P en glucosa libre y fosfato inorgánico (Pilkis & Granner,
1992; Hanson & Reshef, 1997; Nordlie et al., 1999; Saltiel, 2001).
En condiciones normales, la expresión de la forma citosólica de PEPCK es
inducida en respuesta al ayuno a través del glucagón y los GC, mientras que una ingesta
de carbohidratos genera un aumento concomitante de los niveles de insulina en plasma,
disminuyendo fuertemente la velocidad de neosíntesis. La regulación hormonal de la
transcripción del gen PEPCK por el glucagón, actua a través del cAMP, mientras que
los GC y la insulina por otro lado, son el eje principal regulador de la actividad PEPCK
en respuesta a la transición entre el ayuno y la alimentación (Loose et al., 1985; Hanson
& Reshef, 1997).
Por otra parte la G6Pasa, que cataliza la conversión de G6P a la glucosa libre,
representa el paso final en la vía gluconeogénica y al mismo tiempo, controla la
liberación hepática de glucosa proveniente de la glucógenolisis (Barthel & Schmoll,
2003). Consistentemente con su función, la interrupción de la actividad G6Pasa conduce
a una hipoglucemia grave (Lei et al., 1996). Durante décadas fue conocido, que la
expresión del gen de la subunidad catalítica de esta enzima es inducida por GC, ya que
una adrenalectomía interrumpe la expresion del gen (Oishi et al, 2005). En el
tratamiento de hepatocitos aislados, los GC conducen a la inducción del mRNA de la
G6Pasa, efecto generado en las proximidades de la región 5´ de su gen (Garland, 1988;
Schmoll et al., 1999; Vander Kooi et al., 2005)
Son variadas por lo tanto, las funciones que los GC ejercen sobre la
gluconeogénesis. Básicamente son funciones de estimulación, como se ha visto en
humanos, donde en el cortisol de hepatocitos se aumenta la actividad de las enzimas que
convierten aminoácidos en glucosa (la activación es a nivel transcripcional), y además
provoca la movilización de aminoácidos desde los tejidos extrahepáticos, lo que
aumenta la cantidad de material para llevar a cabo la gluconeogénesis. Por otra parte, la
glucólisis celular se ve inhibida, ya que los GC deprimen la oxidación de NADH, que es
necesario para permitir que esta vía se lleve a cabo con más facilidad y rapidez.
Sobre el metabolismo de proteínas los GC también generan su efecto a través de:
1) la disminución de la reserva proteica de casi todas las células del cuerpo,
62
Introducción
exceptuando las del hígado, por una disminución en la síntesis y un aumento del
catabolismo de las proteínas celulares; 2) la estimulación del transporte de aminoácidos
hacia las células hepáticas y el aumento de enzimas para el anabolismo proteico. Las
proteínas del plasma que se sintetizan en el hígado y luego pasan a la sangre, aumentan
al igual que las proteínas hepáticas (Heszele & Price, 2004; Glass, 2005); 3) la
disminución del transporte de aminoácidos hacia las células musculares y otras células
extrahepáticas (disminuye la concentración de aminoácidos y la síntesis de proteínas).
Otros efectos de los GC también se dan sobre el metabolismo de lípidos
hepáticos y son: 1) aumento de la síntesis de triglicéridos, 2) disminución de la
oxidación de los ácidos grasos, 3) acumulación de lípidos en el hígado (Cole et al.,
1982). La acumulación intra-citoplasmática de triglicéridos también se puede observar
en hepatocitos aislados cuando se los expone a GC (Mendoza-Figueroa et al., 1988;
Giudetti & Gnoni, 1998). Consistentemente, la adrenalectomía en ratas inhibe
sustancialmente la acumulación hepática de triglicéridos, en particular en respuesta a
una dieta alta en grasas, y el efecto puede ser fácilmente invertido por terapia de
reemplezo de GC (Mantha et al., 1999). Mientras que los GC aumentan la lipólisis
mediante la inducción de lipasa sensible a GC (Slavin et al., 1994) y reducen la
lipoproteína-lipasa (LPL) en los depósitos de grasa periférica, promueven la
diferenciación de pre-adipocitos, y por tanto la hipertrofia celular en la grasa central
(Samra et al., 1998; Seckl et al., 2004)
1.2.6. Porfirias y su relación con el metabolismo de los hidratos de carbono.
Como ya fue explicado en el capítulo anterior, las porfirias son un grupo
heterogéneo de enfermedades metabólicas con manifestaciones principales tales como:
ataques agudos, dolores neuro-viscerales y/o alteraciones o daños dermatológicos.
En la experiencia de trabajo de Bonkovsky & Barnard (2000), la mayoría de los
pacientes remitidos con diagnóstico presuntivo de "porfiria" no tenían porfiria, sino
síndromes de otras etiologías asociados con aumentos leves, no específicos de la
excreción urinaria de porfirinas (porfirinurias secundaria). El manejo de las porfirias
agudas o inducibles, depende de la prevención o el rápido tratamiento ante los ataques
63
Introducción
agudos. En este último, se incluye la administración de analgesia; hematina intravenosa
y por lo menos de 300 g/día de carbohidratos.
En PCT activa, la tarea consiste en lograr la reducción del hierro por flebotomía
terapéutica; dieta alta en carbohidratos y la inmediata supresión de factores que
precipitan o exacerban el cuadro, especialmente alcohol y estrógenos. Como se puede
observar, en los diferentes tipos de porfirias, el manejo nutricional es parte esencial en
la rehabilitación del cuadro. Esto da idea del efecto benéfico que la ingesta de
carbohidratos tiene, y por lo tanto la presunción de la existencia de alguna alteración de
su metabolismo en diversos casos de porfirias.
En relación al trabajo de Schoenfeld et al., (1985) realizado en células hepáticas
de embriones de pollo, se observó que existía una reducción en la inducción del ALA-S
por el AIA en presencia de glucosa. La fructosa y diversas sustancias gluconeogénicas,
incluyendo aminoácidos gluconeogénicos, tuvieron un efecto similar. La leucina, que es
puramente cetogénica, no apaciguó la inducción del ALA-S. Los autores concluyeron
que los efectos benéficos de las proteínas en los ataques agudos de porfiria hepática,
probablemente son debidos a sus propiedades gluconeogénicas y que la G6P, es el
agente activo que lleva a este efecto benéfico, al igual que el descripto como “efecto
glucosa”.
1.3. ESTRÉS OXIDATIVO
1.3.1. Radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS).
Se consideran radicales libres a todas aquellas moléculas que en su estructura
atómica presentan uno o más electrones desapareados o impares en el orbital externo.
Es una entidad química que, contrariamente a la tendencia espontánea de los electrones
localizados en los átomos y moléculas para formar pares, tiene electrones desapareados.
Esta configuración espacial los hace muy inestables, extraordinariamente reactivos y de
vida efímera. Poseen una enorme capacidad para combinarse inespecíficamente con la
diversidad de moléculas integrantes de estructura celular: carbohidratos, lípidos,
64
Introducción
proteínas, ácidos nucleicos y derivados de cada uno de ellos (Halliwell & Gutteridge,
1999, Valko et al. 2004).
Los radicales libres se generan continuamente como productos del metabolismo
normal de la célula, y son inactivados por un conjunto de mecanismos enzimáticos o de
atrapamiento. En las células de mamíferos, bajo condiciones aeróbicas, la participación
del oxígeno en reacciones de óxido-reducción (redox) es inevitable. El oxígeno
molecular es fundamentalmente birradical, ya que tiene 2 electrones no apareados en su
orbital externo, ambos con el mismo spin (giro paralelo), impidiendo así que capte 2
electrones simultáneamente en las reacciones en las que interviene. El oxígeno solo
puede participar en reacciones univalentes y aceptar los electrones de uno en uno
(Halliwell & Gutteridge, 1999). La mayor parte del oxígeno utilizado por el organismo
humano es reducido a agua por acción del complejo citocromo-oxidasa de la cadena
respiratoria mitocondrial. La reacción involucra 4 pasos univalentes desde los cuales
pueden escapar sus intermediarios: radical superóxido (O2• -), peróxido de hidrógeno
(H2O2) y radical hidroxilo (OH•), (Reilly & Bulkley, 1990). Estos intermediarios, en
condiciones normales, quedan unidos al sitio activo de la citocromo-oxidasa y no
difunden al resto de la célula.
El término especies reactivas de oxígeno (ROS) usualmente se refiere a los
radicales O2• -, OH•, peroxilo (ROO•), alcoxilo (RO•) pero también incluye especies no
radicales como ácido hipocloroso (HClO), cloraminas, oxígeno singulete (1O2), ozono
(O3) y H2O2. Este último no es estrictamente un radical libre, pero por su capacidad de
generar al OH• en presencia de metales como el hierro, se lo incluye como tal.
Las especies reactivas de nitrógeno (RNS) están implicadas en modificaciones
oxidativas de proteínas y lipoproteínas de bajo peso molecular, a través de procesos que
pueden ser independientes de la peroxidación lipídica producida por ROS (Alderton et
al., 2001; Poli et al., 2004). Las ROS y RNS son generadas intracelularmente y
extracelularmente. Intracelularmente como consecuencia de la actividad metabólica de
mitocondrias, microsomas y peroxisomas que involucran varios sistemas enzimáticos.
Extracelularmente son liberadas por células inflamatorias y macrófagos presentes en los
tejidos.
65
Introducción
La sangre, cumple entre otras funciones la de transportar oxígeno desde los
pulmones hasta los tejidos, y es aquí donde el O2 actúa como sustrato en diversas
reacciones bioquímicas intracelulares desencadenando una gran producción de H2O2 y
O2• -, entre otras ROS. La mitocondria constituye la fuente principal de radicales libres.
Este fenómeno se efectúa a nivel de la cadena de transporte de electrones, que es la
última etapa de producción de protones de alta energía, y cuyo pasaje a través de la
membrana interna mitocondrial genera un gradiente eléctrico que aporta la energía
necesaria para formar el ATP. En este proceso de fosforilación oxidativa, el oxígeno
actúa como aceptor final de electrones. Una consecuencia directa de este proceso es que
entre los nutrientes iniciales y la generación de energía final, se forman varias moléculas
con diferente grado de oxidación. Algunas de ellas pueden entregar 1 ó 2 electrones al
oxígeno y producir intermediarios parcialmente reducidos (Turrens, 1994). Los
peroxisomas son organelas del citosol muy ricas en oxidasas que generan H2O2, la cual
es depurada por enzimas específicas como la catalasa (CAT).
Los leucocitos polimorfonucleares poseen en sus membranas la enzima
NADPH-oxidasa generadora de O2, que en presencia de hierro se transforma en la
especie altamente tóxica, el OH•. Esta situación se da particularmente en los procesos
inflamatorios (Markert et al., 1984).
Los radicales libres se forman, en condiciones fisiológicas, en proporciones
controlables por los mecanismos de defensa celulares. En situación patológica, esta
producción se incrementa sustancialmente, ingresándose al estado de “estrés oxidativo”.
Los factores que llevan a esta situación pueden ser químicos, como el aumento de
metales pesados, xenobióticos, drogas y componentes del tabaco; físicos: radiaciones
UV, hiperoxia; y orgánicos o metabólicos: dieta hipercalórica, dieta insuficiente en
antioxidantes, diabetes, procesos inflamatorios, fenómenos de isquemia-reperfusión,
traumatismos y ejercicios extenuantes.
Radical superóxido
El radical superóxido (O2• -) se forma por adición de un electrón a una molécula
de oxígeno. Las fuentes más importantes son la cadena de transporte de electrones
66
Introducción
(ETC) en la mitocondria, el retículo endoplasmático y el cloroplasto (Halliwell &
Gutteridge, 1999; Inoue et al., 2003). En la mitocondria, se produce por la fuga de
electrones en reacciones mediadas por la ubiquinona (Q10) y sus complejos
enzimáticos.
También es generado por numerosas enzimas oxidativas como la
NADPH-oxidasa, xantina-oxidasa, aldehído-oxidasa, las flavín-deshidrogenasas y las
peroxidasas (Li & Jackson, 2002; Inoue et al., 2003).
Su amplia capacidad oxidante lo hace capaz de oxidar polifenoles,
catecolaminas, lactato deshidrogenasa unida a NADH, etc. (Bielski & Chan, 1973;
Fridovich, 1989) Además, puede inactivar algunas enzimas como la CPK o la CAT
(Pigeolet et al., 1990).
En solución acuosa el radical superóxido es capaz de reaccionar consigo mismo,
dando una reacción de dismutación:
O2• - + O2• - + 2H+
H2O2 + O2
La enzima superóxido dismutasa (SOD), presente en muchos organismos,
elimina el O2• -, catalizando la reacción anterior. Es esta transformación la que potencia
su toxicidad, ya que el O2• - reacciona con el H2O2 en presencia de hierro o cobre dando
lugar al radical hidroxilo (OH•), muy reactivo en la llamada reacción de Haber-Weiss
(Liochev & Fridovich, 2002)
(Fe/Cu)
H2O2 + O2•
-
O2 + OH• + OH
-
Peróxido de hidrógeno
El peróxido de hidrógeno (H2O2) se produce en todos los sistemas que generan
-
O2• pero existen también enzimas que llevan a cabo la reducción divalente del oxígeno
sin mediación de este radical, como la acil-CoA-oxidasa, la NADH oxidasa, la glutation
oxidasa y el sistema xantina/xantina-oxidasa entre otras (Moldovan & Moldovan, 2004;
Jezek & Hlavatá, 2005).
67
Introducción
El H2O2 puede inactivar enzimas, como la GAPD, oxidando grupos tiólicos
llevando a la célula a una deficiencia de ATP por inhibición de la glucólisis (Brodie &
Reed, 1987; Hyslop et al., 1988). Puede además, oxidar piruvato, glioxilato o 2oxoglutarato (Andrae et al., 1985). En presencia de trazas metálicas (Cu, Fe, Co) se
produce la reacción de Fenton (Stohs & Bagchi, 1995), dando lugar al radical HO• a
partir de H2O2.
(Cu/Fe/Co)
2+
Fe + H2O2
Fe3+ +OH + OH•
-
Por ser una molécula pequeña y relativamente estable posee una gran capacidad
de difundir y atravesar membranas celulares (Halliwell, 1990). La disponibilidad de
trazas de metales, una vez dentro de la célula, potencia los efectos deletéreos del H 2O2
mediados por la producción de OH•, causando daño aún en lugares alejados de donde se
originó.
Radical hidroxilo
El radical hidroxilo (OH•) es el radical libre más reactivo que se conoce y es
capaz de dañar a la mayoría de las moléculas que se encuentran en las células (Pastor et
al., 2000). Es tan reactivo que solamente existe como tal durante pocos microsegundos
(10-9s). Tiene una distancia de difusión pequeña y se combina rápidamente con
moléculas vecinas, comenzando una serie de reacciones en cadena que pueden atacar a
todas las moléculas presentes en la célula incluyendo al DNA y generando mutaciones.
El daño biológico causado por el radical mejor caracterizado, es la peroxidación
lipídica (Aruoma et al., 1989). Se acepta que la mayor parte del daño celular causado
por el radical O2•
-
y el H2O2 deriva de la conversión de éstos al OH• mediante la
reacción de Harber Weiss (Halliwell & Gutteridge, 1999).
La reacción de Fenton, requiere cantidades submicromolares de hierro. La
reacción puede ser catalizada por otros metales divalentes como el cobre, aunque el
agente más importante en la producción del radical OH• in vivo es el Fe2+ (Liochev &
Fridovich, 2002).
68
Introducción
Oxígeno singulete
El oxígeno singulete (1O2) posee una configuración electrónica de alta energía.
Por ello la vida media de esta especie es corta, sobre todo en solución acuosa, pues
pierde rápidamente su energía. Sin embargo en medios hidrofóbicos, como membranas
celulares, este tiempo se prolonga, pudiendo reaccionar con ácidos grasos
poliinsaturados, formando peróxidos lipídicos.
1.3.2. Toxicidad de xenobióticos mediada por especies reactivas.
La mayoría de los xenobióticos que ingresan a un organismo, se transforman en
metabolitos más polares y estables por medio de las enzimas que los metabolizan y
luego se excretan del mismo. Sin embargo, algunos xenobióticos sufren una activación
metabólica generando especies reactivas capaces de unirse covalentemente a proteínas,
DNA y otras biomoléculas (Kumar & Surapaneni, 2001; O’Brien et al., 2005; Rousu et
al., 2009). Aunque la relación mecanística entre dichos metabolitos reactivos y la
toxicidad de algunos xenobióticos es aun muy difusa, existen evidencias que sugieren la
asociación entre ambas (Rousu et al., 2009; Wen & Flitch, 2009).
En general, los metabolitos reactivos se clasifican en fuertes y débiles. Las
especies reactivas débiles más comunes incluyen a los epóxidos, α y β-carbonilos
insaturados, quinonas, quinona-iminas, metiluros de quinona-imina, isotiocinatos,
episulfonio y otros (Ma & Subramanian, 2006; Tang & Lu, 2010). Los aldehídos e iones
de imino pertenecen al grupo de las especies reactivas fuertes. Los metabolitos más
reactivos son tan inestables que no pueden ser detectados directamente. El GSH y sus
análogos se utilizan comúnmente como atrapantes de especies débiles (Evans et al,
2004; Gan et al., 2005; Soglia et al., 2006; Leblanc et al., 2010). Las especies fuertes
pueden ser atrapadas por semicarbazidas, metoxilamina e iones cianuro (Kalgutkar et
al., 2002; Argoti et al., 2005). La reacción de algunos atrapantes con los metabolitos
reactivos forman aductos muy estables.
69
Introducción
1.3.3. Toxicidad sobre las macromoléculas mediadas por especies reactivas.
1.3.2.1. Reacciones sobre proteínas, DNA, glúcidos y lípidos.
En 1954 se propuso por primera vez, que los radicales libres eran agentes
tóxicos y generadores de enfermedades (Gerschman et al., 1954). Por la alta
inestabilidad atómica, los radicales libres colisionan con una biomolécula y le sustraen
un electrón, oxidándola, perdiendo de esta manera su función específica celular. Las
especies reactivas se unen a proteínas, rompen las cadenas de DNA, reaccionan con
componentes vitales de la célula y atacan los dobles enlaces de los ácidos grasos
polinsaturados enclavados en la estructura de los fosfolípidos de membranas.
Las proteínas pueden ser críticamente modificadas por metabolitos reactivos, lo
que lleva a alterar procesos biológicos, resultando en toxicidad directa, hecho
demostrado por necrosis de tejidos y/o apoptosis (Evans et al., 2004).
Por acción de las ROS, en las proteínas se oxidan preferentemente los
aminoácidos fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina y metionina. Como consecuencia
de ello se forman entrecruzamientos de cadenas peptídicas, fragmentación de proteínas
y formación de grupos carbonilos que impiden el normal desarrollo de sus funciones
específicas. Entre los aminoácidos que se oxidan dando lugar a grupos carbonilos se
encuentran lisina, prolina y arginina; el contenido en carbonilos de las proteínas se
puede emplear como un indicador de daño oxidativo a las mismas (Grimsrud, 2008).
La unión de especies reactivas a los ácidos nucleicos tiene el potencial de producir
genotoxicidad (Koc & Swenberg, 2002; Farmer et al., 2005). El daño al DNA produce
bases modificadas, con serias consecuencias en el desarrollo de mutaciones y
carcinogénesis, o la pérdida de expresión por daño al gen específico. El oxígeno es
capaz de adicionarse a las bases o al azúcar del DNA formando el radical peroxilo, que
genera un gran número de productos por las posteriores reacciones de estas especies
radicales del DNA. También se forman puentes cruzados DNA-proteína. La
modificación oxidativa más frecuente suele darse a nivel de la guanosina, dando lugar a
la 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina (8-OH-dG). Su importancia reside en su poder
mutagénico, ya que durante la replicación producirá transversiones G-T (Kasai &
Nishimura, 1984; Shibutani et al., 1992). El daño al DNA ha sido observado en un gran
70
Introducción
número de líneas celulares procedentes de mamíferos, expuestas a estrés oxidativo. Este
daño incluye roturas de doble y simple cadena, deleciones, cambio de bases, daño
oxidativo, e incluso aberraciones en los cromosomas (Halliwell & Auroma 1991).
Los hidratos de carbono reaccionan fácilmente con los radicales OH•. La glucosa
constituye un secuestrante del radical superóxido, al retenerlo e impedir su acción sobre
otras moléculas. La manosa y el manitol son secuestrantes del radical hidroxilo. Por
ello, se ha observado que diversos polisacáridos pueden actuar como agentes protectores
celulares. El daño oxidativo a los glúcidos tiene importancia cuando se trata de
polisacáridos de función estructural, ya que los polisacáridos son despolimerizados por
los radicales libres (Borel et al., 1988) dando lugar a procesos degenerativos.
La oxidación de lípidos (ácidos grasos polinsaturados) por los radicales libres
produce una reacción en cadena en la que el ácido graso al oxidarse, se convierte en
radical de ácido graso, con capacidad de oxidar a otra molécula vecina. En este proceso,
conocido como peroxidación lipídica, se dañan las estructuras ricas en lípidos como las
membranas celulares y las lipoproteínas. El hierro libre (Fe2+) acelera la
descomposición de lípidos a hidroperóxidos (LOOH-) en compuestos tales como
radicales alcoxilos (RO•) y peroxilos (ROO•) y malondialdehído (MDA). Estos
compuestos son los productos finales de la descomposición peroxidativa de ácidos
grasos poliénicos (Halliwell & Chirico, 1998); son muy reactivos, y pueden oxidar
grupos tioles de la célula a distancia de donde se produjo la injuria inicial. La
peroxidación lipídica por tanto, puede propagarse a través de la célula, resultando en
una disrupción de la membrana lipídica, a veces lejos del sitio en donde se originó la
formación de dichas especies.
1.3.4. Sistemas de defensas antioxidantes
La aparición de ROS y RNS es una característica de la vida aeróbica. La
existencia y desarrollo de células en un ambiente oxidante no sería posible sin
poderosos mecanismos de defensa frente a dichas especies. Halliwell & Gutteridge
(1999) definen como antioxidante a toda sustancia que hallándose presente en bajas
concentraciones con respecto a las biomoléculas oxidables, retarda o previene la
71
Introducción
oxidación de dichos sustratos. La función primaria de los antioxidantes es asegurar que
las concentraciones de radicales libres en la célula se mantengan bajas. Los mecanismos
antioxidantes se pueden dividir en dos categorías: no enzimáticos y enzimáticos.
Los mecanismos enzimáticos catalizan o aceleran reacciones químicas que
utilizan sustratos que a su vez reaccionan con radicales libres o que actúan
específicamente sobre determinadas especies reactivas.
La enzima CAT, está presente en células de plantas, animales y en bacterias
aeróbicas (Mates et al., 1999). En animales se encuentra especialmente concentrada en
eritrocitos y en hígado, localizada principalmente en los peroxisomas. Cataliza la
reacción de descomposición del H2O2 para dar H2O y O2. Es de gran importancia en el
metabolismo de las ROS y se puede considerar como secuestrante de radicales libres,
aunque el H2O2 no sea estrictamente un radical. La cinética de esta enzima no obedece a
un patrón normal, es una enzima no saturable por sustrato, y existe una rápida
inactivación a concentraciones de H2O2 mayores que 0,1 M (Aebi, 1984).
Por otra parte, la superóxido dismutasa (SOD) es una metaloenzima que cataliza
muy eficientemente la dismutación del radical O2• - a O2 y H2O2. Se han descripto tres
tipos de SOD (Landis & Toser, 2005). Todas ellas catalizan la misma reacción con un
mecanismo idéntico, pero se diferencian en el metal presente en su centro activo. Esta
enzima destruye el O2•
-
con una elevada velocidad de reacción, por sucesivas
oxidaciones y reducciones del ion del metal de transición presente en su sitio activo
(Mates et al., 1999).
La Cu/Zn-SOD se encuentra en el citoplasma de todas las células eucariotas.
Tiene un peso molecular de 32 kD con dos subunidades, que poseen un sitio activo con
un átomo de cobre, la de actividad catalítica, y otro de zinc, que estabiliza la estructura
(Halliwell & Gutteridge, 1999, Mates et al., 1999). Es una enzima muy estable, lo que
facilita su aislamiento pero es fuertemente inhibida por cianuro, lo que la diferencia del
resto de las SOD.
La Mn-SOD es una proteína cuyo peso molecular es de 40 kD. En organismos
bacterianos suele tener 2 subunidades. También se ha aislado en organismos superiores
pero tan sólo de matriz mitocondrial (Wolin, 2000). En estos organismos posee 4
subunidades, es mucho más lábil que la Cu/Zn-SOD y no se inhibe por cianuro. La Mn72
Introducción
SOD es una de las enzimas antioxidantes más efectiva que tiene acción antitumoral
(Behrend et al., 2003).
La SOD extracelular (EC-SOD) es una glicoproteína secretoria, tetramérica que
contiene cobre y zinc, tiene elevada afinidad por ciertos glucosaminoglicanos como la
heparina (Mates et al., 1999). En tejido de mamíferos esta regulación ocurre
primariamente de manera coordinada por citoquinas, antes que como una respuesta
individual de la célula ante los oxidantes (Valko et al., 2006). Otras clases de SOD
incluyen: la Fe-SOD que es similar a la Mn-SOD pero se encuentra casi exclusivamente
en procariotas y algas, y la Ni-SOD descubierta en Streptomyces y cianobacterias
(Barondeau et al., 2004).
Los mecanismos no enzimáticos involucran moléculas de bajo peso molecular
(como GSH, ácido úrico, ácido dihidro-lipoico, metalotioneína, ubiquinol y melatonina)
con un gran poder reductor, por lo tanto con propiedades antioxidantes. Estos
compuestos al colisionar con las ROS y/o RNS les ceden un electrón oxidándose a su
vez, y transformándose en un radical débil no tóxico. Estos tipos de antioxidantes
actúan como verdaderos “atrapantes” de radicales libres. Se los puede clasificar como
endógenos, sintetizados por la misma célula, o exógenos a los que ingresan a través de
la cadena alimentaria.
1.3.5. La melatonina como atrapante.
La N-acetil-5-metoxitriptamina, comúnmente conocida como melatonina (Mel)
es un producto de síntesis de la glándula pineal de los vertebrados. La vía de síntesis de
la Mel ha sido bien descripta, como así también los mecanismos neurales que rigen la
producción pineal de la misma (Reiter, 1991). La Mel tiene un gran número de
funciones fisiológicas, incluyendo la regulación de los ritmos circadianos (Kennaway &
Wright, 2002), efectos oncostáticos (Blask et al., 2002), de estimulación del sistema
inmune (Guerrero & Reiter, 2002) y funciones anti-inflamatorias (Cuzzocrea & Reiter,
2002).
Incluso más tarde, y algo inesperadamente, la Mel fue identificada como un
potente atrapante directo de radicales libres (Tan et al., 2002) y antioxidante indirecto
73
Introducción
(Rodríguez et al., 2004). Lo que parece particularmente inusual es la alta eficacia que
posee la Mel como protectora contra las especies reactivas del oxígeno (ROS) y del
nitrógeno (RNS). En contraste a muchos otros antioxidantes, cruza todas las barreras
fisiológicas-morfológicas, es decir la hemato-encefálica y la placenta, y se distribuye a
lo largo de todas las células (Rodríguez et al., 2004). Tras la oxidación, la melatonina se
convierte a su vez en otros compuestos antioxidantes tales como la 3hidroximelatonina cíclica, la N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina y la N1-acetil5-metoxiquinuramina (Reiter et al., 2007). Por lo tanto, la Mel se considera como un
antioxidante de amplio espectro aún más potente que el GSH en la neutralización de los
radicales libres, que puede proteger las membranas celulares contra el daño oxidativo de
manera muy eficaz (Reiter et al., 1997). Con las numerosas investigaciones realizadas
en los últimos años, ya no cabe duda acerca de su capacidad para reducir el daño
molecular resultante por las especies reactivas tóxicas, ROS y RNS (Hardeland et al.,
1995; Acuña-Castroviejo et al., 2002; Tan et al., 2002).
La reducción de los niveles circulantes de Mel también exacerba el daño
oxidativo a los tejidos que están sometidos a un aumento del estrés oxidativo (Reiter et
al., 1999). También ha demostrado eficacia para reducir la toxicidad de ciertas drogas y
en algunos casos mejorar su actividad (Reiter et al., 2002), para reducir la severidad y el
grado de daño de los tejidos después de isquemia/reperfusión en el cerebro y otros
órganos (Cheung, 2003), para prevenir cambios degenerativos en el SNC en los
modelos de la enfermedad de Alzheimer (Pappolla et al., 2000) y en el Parkinson
(Antolín et al., 2002), para reducir el daño de radicales al DNA que puede llevar al
cáncer (Reiter et al., 1998), y en muchas otras situaciones.
Diversas funciones de la Mel accionan en la reducción del estrés oxidativo. En
este punto, se desconoce cuál de las múltiples acciones de la misma, es decir, si
captación de radicales libres, la estimulación de las enzimas antioxidantes, el aumento
de la eficacia de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, la reducción de la
fuga de electrones, o la mejora de la eficiencia de otros antioxidantes, son más
importante en la contribución a su alta eficacia (Reiter et al., 2003).
74
Introducción
1.4. TRIPTÓFANO (TRP).
El triptófano (TRP) es un aminoácido esencial en los mamíferos, que debe ser
adquirido a través de la dieta, ya que su síntesis no puede ser realizada por animales.
El TRP es el cuarto aminoácido menos abundante de los necesarios para la
síntesis proteica. Esto significa que cuando el suministro de triptófano es bajo en
comparación con otros aminoácidos esenciales, esto limita la síntesis de proteínas y,
finalmente, la tasa de crecimiento. Es precursor de sustancias biológicamente
importantes, como la serotonina (5-HT), un neurotransmisor producido principalmente
en el intestino y también en las plaquetas y en el cerebro. También se generan a partir de
él, la hormona pineal melatonina (Mel), el ácido nicotínico, las coenzimas NAD, las
melaninas, alcaloides indólicos y la fitohormona ácido 3-indolacético (Musajo & Bena,
1964; Price et al., 1965; Wolf, 1974; Peters, 1991).
1.4.1. Sus metabolitos. Caminos de degradación.
El TRP en mamíferos puede ser metabolizado (Figura 1.11) por tres diferentes
rutas:
a) por la vía de la transaminación o ruta indólica, convirtiendo el TRP a indol,
que luego se puede excretar en orina como indoxilsulfato (Diesbach & Wiederkehr,
1945);
b) por la ruta serotoninérgica que conduce a la formación de serotonina (5-HT)
a través del 5-hidroxitriptófano (5-HTRP; Rimington et al., 1948). En esta ruta, el 5HTRP se forma en un primer paso por la acción de la L-triptófano hidroxilasa [Ltriptófano tetrahidrobiopterina oxígeno oxidorreductasa (ó 5-hidroxilasa), EC 1.14.16.4]
y después la decarboxilasa de aminoácidos aromáticos (AAD), la convierte en 5-HT. Se
ha sugerido que menos del 1% de triptófano ingerido se utiliza en la conversión a
serotonina (Wolf, 1974). Un dato importante a tener en cuenta, es el publicado por
Llambías et al. (2003) que muestra un aumento significativo en la excreción urinaria de
5-HT y del ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA), el principal metabolito de
75
Introducción
degradación de la serotonina, en ratas porfíricas intoxicadas con el xenobiótico HCB y
que este incremento solo sucede bajo condiciones de luz (Llambías et al., 2007).
c) por la vía quinurenérgica, para la formación de formilquinurenina, por acción
de la triptófano pirrolasa o L-triptófano 2,3-dioxigenasa, [TRPp o TDO; EC.1.13.11.11]
(Bearcroft et al., 1995) y por la indolamina extrahepática 2,3-dioxigenasa (IDO,
también llamada indol 2,3-dioxigenasa). Ambas enzimas catalizan la misma reacción de
escisión del anillo de pirrol y de inserción del oxígeno molecular en L-triptófano, pero
por diferentes mecanismos. La TDO se expresa solo en el hígado de mamíferos y es
sustrato específica, mientras que IDO se expresa ubicuamente en todo el cuerpo,
excepto el hígado, y tiene una mayor variedad de sustratos (Thackray et al. 2008).
La TDO o TRPp hepática requiere oxígeno molecular para su actividad, y es
inducida por su propio sustrato (TRP), los GC y su cofactor, el grupo hemo (Knox &
Auerback, 1955; Badawy & Evans, 1975). Esta enzima que tiene un rápido recambio
(Feigelson & Greengard, 1961; Schimke et al., 1965; Badawy & Evans, 1975), es la
enzima de velocidad limitante en la degradación del TRP (Knox, 1951¸ 1966) y está
fuertemente regulada por el pool de hemo (Bissell & Hammaker, 1977; Badawy, 1978;
Correia & Burk, 1978). Es muy activa en ratas, por lo que parece ser un buen modelo
animal para el estudio del metabolismo del TRP a lo largo de la vía de la quinurenina,
tanto en condiciones fisiológicas como patológicas (Allegri et al., 2003).
Se encontraron también que ciertas drogas porfirinogénicas alteran la actividad
de TRPp, tales como las dibenzo dioxinas policloradas (Fan & Rozman, 1994; Weber et
al., 1994), griseofulvina, colidinas y acetamidas alquil-sustituídas, además de drogas
que exacerban la porfiria, como el fenobarbital y la carbamazepina (Badawy, 1978;
Morgan & Badawy, 1992)
76
Introducción
Figura 1.11: Caminos de degradación del triptófano (TRP). a) vía de la transaminación o ruta indólica,
b) ruta serotoninérgica que da la formación de serotonina (5-HT), por la acción de la L-triptófano
hidroxilasa, y la amino ácido decarboxilasa (AAD), c) vía quinurenérgica hepática, para la formación de
formilquinurenina por acción de TRPp o TDO (triptófano pirrolasa o L-triptófano 2,3-dioxigenasa).PLP:
fosfato de piridoxal.
77
Introducción
1.4.2. Importancia de los metabolitos del TRP
Serotonina
La serotonina (5-HT) es un potente vasoconstrictor encontrado principalmente
en cerebro, tejido intestinal, plaquetas sanguíneas y mastocitos. Cuando ocurre una
herida y hay sangrado, al agregarse las plaquetas liberan varias sustancias
fisiológicamente activas incluyendo la serotonina y el tromboxano-A2 que estimulan la
vasoconstricción. Luego las plaquetas agregadas y el tejido dañado inician el proceso de
coagulación sanguínea (Voet & Voet, 1995a). La serotonina es un vasoconstrictor que
estimula también la contracción uterina.
En el metabolismo del cerebro, la serotonina es un neurotransmisor. Juega un
importante papel regulatorio en el sistema nervioso. En cerebro, se encuentra
mayormente unida a una proteína adherente específica (SBP o Serotonin Binding
Protein). Ciertas drogas que producen marcada alteración en la actividad del sistema
nervioso central, son potentes antagonistas de la serotonina in vitro. Así la
administración de reserpina, droga que disminuye la actividad del sistema nervioso
central en el hombre, aumenta la excreción urinaria de serotonina y de su principal
producto metabólico 5-hidroxindolacético (5-HIAA) (White et al. 1964a)
La 5-HT es una amina aromática, pertenece a la familia de las indolaminas,
aislada del suero (serum; de aquí el nombre serotonina) que tiene un importante efecto
hipertensor. Se distribuye ampliamente entre animales, plantas y en el hombre. Se
sintetiza a partir del TRP, y dado que la indolamina es una sustancia hidrofílica, como
tal no puede cruzar la barrera hematoencefálica por lo tanto, toda la serotonina neuronal
del sistema nervioso central es sintetizada localmente. La biodegradación de la 5-HT, se
lleva a cabo tanto a nivel intracelular como en la hendidura sináptica, dando origen a su
principal metabolito inactivo, el ácido 5-hidroxindolacético, por la acción enzimática de
la monoaminooxidasa (MAO). Una vía alternativa que cobra gran importancia en la
fisiopatología de las psicosis, es la síntesis de quinureínas a partir de la serotonina y sus
derivados. Otro metabolito de importancia es el acido 5-OH-3-metilindol, producto de
la metilación del ácido 5-hidroxindolacético, cuya aparición en niveles significativos
podría correlacionarse con sintomatología de base epiléptica. La síntesis puede
78
Introducción
aumentar de forma marcada, bajo condiciones que requieren un continuo suministro del
neurotransmisor por un incremento de la actividad neuronal. El aumento de la síntesis
tiene una absoluta dependencia del Ca+2 extracelular.
Como con otros transmisores amino biogénicos, la 5-HT es almacenada
primariamente en vesículas y es liberada por un mecanismo exocitótico. Esto es
necesario para proteger la indolalquilamina de degradación intraneuronal por la MAO.
También, las vesículas sinápticas serotoninérgicas, contienen una proteína específica
que se adhiere a la 5-HT con gran afinidad (SPB). La SPB está contenida en neuronas
serotoninérgicas. La serotonina es liberada de la SPB por un proceso dependiente del
Ca+2.
No existe un receptor único para serotonina, sino más bien ha sido descrita toda
una superfamilia de receptores (siete) con funciones específicas en las áreas pre- y postsinápticas. Entre ellos, el 5-HT 1A en las neuronas presinápticas y el 5-HT 2A en las
postninápticas, están asociados a la apertura de los canales K+, a la inhibición de
adenilciclasa y a la hidrólisis de fosfoinositol a través de una proteína G.
La 5-HT puede actuar como un neuromodulador. La actividad de 5-HT en la
sinapsis se termina, primariamente, por su captación en terminales serotoninérgicos,
mediante la unión de estas moléculas a proteínas específicas de transporte.
En cuanto a las implicaciones funcionales de la serotonina, los receptores 5HT1A están presenten en alta densidad en áreas del cerebro que son componentes del
sistema límbico, implicado en la modulación de la emoción. Participa en el control
hipotalámico de la secreción pituitaria, particularmente en la regulación de prolactina,
ACTH, y hormona del crecimiento. Se ha implicado a la serotonina en el sueño. Se ha
propuesto que el papel de las neuronas centrales serotoninérgicas es coordinar la
actividad del sistema nervioso, fijar el tono de actividad en conjunción con el nivel de
activación del organismo. También parece estar implicada en la regulación de ritmos
circadianos. Se ha visto que la serotonina inhibe la toma de comida, tiene efectos
anoréxicos. Estos efectos hipofágicos son más pronunciados en ratas hembras, un efecto
de potencial relevancia para los trastornos de la alimentación en humanos.
79
Introducción
El control de entrada del dolor parece depender de la liberación de serotonina,
que facilita la producción de endomorfinas medulares. Su disminución sería responsable
de la sintomatología depresiva. En pacientes con depresión se constata disminución del
triptófano libre plasmático. La disminución de la transmisión serotoninérgica en estados
depresivos es avalada por la disminución del ácido 5-HIAA en líquido cefalorraquídeo.
En estados depresivos la recaptura de serotonina está disminuida. Se ha involucrado
también la neurotransmisión serotoninérgica en la regulación de la ansiedad. De este
modo regula la timia, el sueño, actividad sexual, apetito, ritmos circadianos, funciones
neuroendocrinas, temperatura corporal, dolor, actividad motora y funciones cognitivas.
La disminución del 5-HIAA en líquido cefalorraquídeo es un marcador de
hostilidad. En los mecanismos fisiológicos de la alimentación se hallan involucrados los
receptores de la serotonina: 5HT1a (en la hiperfagia) y 5HT1c/2 (en la anorexia).
Además, es la responsable de la modulación inhibitoria del consumo de hidratos de
carbono. Por lo tanto el TRP, y los inhibidores selectivos de la recaptura de serotonina
son útiles en el tratamiento de la bulimia y otros trastornos de la alimentación. En las
toxicomanías y el alcoholismo están involucrados los receptores 5-HT2. El alcohol y la
cocaína son agonistas del mismo. En la migraña se utiliza terapéuticamente un agonista
del receptor de serotonina, 5HT1d.
Serotonina e indolacético dan cuenta de una fracción significativa del
triptófano degradado. Un segundo e importante camino metabólico es el quinurenérgico,
iniciado por la TRPp o TDO que resulta en una serie de sub-productos, uno de los
cuales es el glutaril-CoA, que aparece en orina en cantidades variables y la suma de
todos ellos da cuenta del total del metabolismo del triptófano. De los muchos productos
formados, los fisiológicamente usados son: el neurotransmisor serotonina, el glutarilCoA que es metabolizado a acetil-CoA, la vitamina ácido-nicotínico, usada para la
biosíntesis del NAD, en menor cantidad la alanina que se forma como sub-producto de
estas reacciones y la hormona melatonina (White et al., 1964c).
Melatonina
Como ya fue dicho, la melatonina es una neurohormona con propiedades
antioxidantes (Reiter, 2005) que regula el reloj biológico del organismo, con eficacia en
80
Introducción
el combate contra el insomnio, el cáncer, el envejecimiento, la hipertrofia de próstata, la
depresión, el colesterol, la hipertensión, la osteosporosis, las cataratas y la epilepsia. Se
ha manifestado como un poderoso impulsor del sistema inmunológico, como
antioxidante y como regenerador de la actividad sexual (Reiter, 1988; Pierpaoli &
Regelson, 1995; Stevens, 1996).
Es producida principalmente en la glándula pineal, pero otros órganos como
hígado, riñón, retina, adrenal, timo, tiroides, páncreas y ovario también la producen.
Tiene una función relevante en la fisiología circadiana, sus niveles fluctúan con los
ciclos del día y la noche, con mayores niveles durante ésta última. En el cerebro actúa
como inductor del sueño, ralentizando la actividad cerebral y determinando el ciclo
sueño-vigilia (Dawson & Encel, 1993). En el corazón y el sistema circulatorio reduce la
formación de coágulos, lo cual a su vez disminuye la posibilidad de infartos y trombosis
(Reiter et al., 2005). En el intestino facilita la absorción de minerales y nutrientes
contenidos en los alimentos. En el sistema reproductor regenera la actividad sexual,
regulando su funcionamiento (Tamarkin et al., 1985). En todo el cuerpo, la melatonina
actúa directamente sobre las células como un poderoso antioxidante, protegiéndolas de
los radicales libres (Reiter, 1993). La melatonina mejora la eficiencia del sistema
inmunitario aumentando las defensas naturales, preservándonos de las enfermedades en
general y en particular de aquellas típicas del envejecimiento como cáncer, patologías
cardiovasculares y en enfermedades auto-inmunes (Regelson & Pierpaoli, 1987; Lissoni
et al., 1991; Reiter et al., 1994, 2005). La melatonina juega un papel decisivo en la
asimilación del zinc por el organismo, aminora el proceso de calcificación y restaura la
actividad del timo (Stevens, 1996). El zinc es importante para el mantenimiento del
sistema inmune y hay relación entre los niveles de zinc y la producción de células-T por
el timo (Poon et al., 1994). El déficit de melatonina produce insomnio y depresión y
parece acelerar el envejecimiento.
Indolacético
El triptófano por transaminación produce el indol-3-pirúvico y éste, por
decarboxilación oxidativa, genera el indol 3-acético. El indolacético está presente en
pequeñas cantidades en la orina normal y en cantidades incrementadas en la orina de
pacientes con pelagra, enfermedad causada por la falta de niacina (Vitamina B3) o de
81
Introducción
triptófano en la alimentación. En plantas este compuesto funciona como auxina, una
hormona de crecimiento (White et al., 1964b).
5-Hidroxindolacético (5-HIAA)
Aproximadamente 7mg de 5-HIAA es excretado en orina normal por día. Se ha
estimado que 3% del triptófano dietario es metabolizado por esta vía. En pacientes con
cáncer, cerca de 400 mg de este compuesto son excretados por día; su excreción
también aumenta en alcaptonuria, una enfermedad congénita caracterizada por la
acumulacion de ácido homogentísico, que deriva de la tirosina o fenilalanina como
consecuencia de la falta de la enzima homogentísico-dioxigenasa (White et al., 1964b;
Voet & Voet, 1995b). En los primeros años de vida no hay síntomas más que la
excreción de este ácido, pero con los años (edad adulta) puede aparecer pigmentación
anormal en la piel, los cartílagos y otros tejidos conectivos ú ocronosis (White et al.,
1964c).
1.4.3. Acción del TRP sobre el metabolismo de los hidratos de carbono
En 1955, por primera vez se demostró que la administración de TRP a ratas
normales daba como resultado hipoglucemia (Gullino et al., 1955). Esto ha sido
confirmado en general en muchos otros estudios (Diengott et al., 1956; Gagliardino et
al., 1971; McDaniel et al., 1973), aunque hay considerables variaciones entre los
distintos informes, en particular en relación a los tiempos utilizados e intensidad de la
hipoglucemia, y sobre todo en las conclusiones sobre el mecanismo que da tal efecto.
Es poco probable que el TRP en sí mismo, sea la causa directa de la
hipoglucemia. Jinks et al., (1957) afirman que varios metabolitos indólicos también
podrían provocar disminuciones en las concentraciones de glucosa en sangre, y
atribuyen estas acciones a las variaciones en la disponibilidad de insulina en circulación.
En contraste, demostraciones hechas por otros grupos (Ray et al, 1966;
Veneziale et al., 1967) afirman que la síntesis de glucosa en hígado aislado y perfundido
se inhibe por el TRP y por metabolitos derivados de la vía quinurenérgica. Sugieren
además, que la hipoglucemia en un animal puede ser causada por alteraciones en la
82
Introducción
gluconeogénesis, deterioro a su vez derivado del aumento en la concentracion hepática
del quinolinato (Ray et al., 1966; McDaniel et al., 1973). Esta hipótesis se apoya en las
observaciones de que la administración in vivo de quinolinato, produce cambios en los
metabolitos hepáticos similares a los observados después de tratamiento con TRP
(Williamson et al., 1971; Spydervold et al., 1974) También hay informes donde se
describe que no solo altera la gluconeogénesis, sinó inclusive la formación de
glucógeno (Smith & Pogson 1977)
En un estudio del papel de las monoaminas intracelulares en la regulación de la
secreción de insulina, Lundquist et al., (1971) encontraron que la administración de
bajas dosis de 5-HT en ratones pretratados con un inhibidor de la MAO, provocaba una
hipoglucemia profunda en animales que habían sido previamente alimentados. Este
efecto es suprimido por los inhibidores de la descarboxilasa de aminoácidos aromáticos
(AAD) y por los antagonistas de la acción de la 5-hidroxitriptamina o serotonina
(Furman, 1974). Esto sugiere que la 5-HT intracelular puede ser el agente activo en la
promoción de la hipoglucemia en estas condiciones. El efecto del TRP, sin embargo, se
diferencia del de 5-HTRP en que sólo este último se encontró eficaz en animales
diabéticos (Furman, 1974). El metabolismo de los carbohidratos y sus procesos de
control varían de una especie a otra en mamíferos (Hanson, 1974; Elliott & Pogson,
1977) y se debe tener cuidado en la extrapolación de estudios en ratas, o cualquier otra
especie, con el hombre.
El descubrimiento de que el quinolinato, metabolito de la vía de la TRPp, inhibe
la enzima PEPCK de la gluconeogénesis, ha sido usado como una herramienta muy útil
para la inhibición selectiva de esta enzima. La especificidad de acción, ha llevado a
estudiar a través de dicha herramienta el papel de la PEPCK en la regulación de la
gluconeogénesis. Se sabe que el quinolinato inhibe la gluconeogénesis a partir del
lactato en mayor medida que desde el piruvato (Gabbay, 1985).
83
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVOS GENERALES
Se propone como objetivo general, investigar las alteraciones del
metabolismo de la glucosa y de su regulación, en dos modelos de porfiria
inducidos con drogas, uno crónico por administración de HCB (PCT) y otro
agudo por intoxicación con AIA/DDC, que den cuenta del efecto benéfico que
tiene la administración de glucosa en porfirias humanas y experimentales,
dada que es muy escasa la bibliografía científica al respecto. Este trabajo de
investigación implica el estudio del metabolismo de los glucocorticoides
(GC), de la insulina, del triptófano (TRP) y del estado oxidativo en general.
2.2. OBJETIVOS PARTICULARES
2.2.1 Objetivos para el modelo de porfiria crónica por hexaclorobenceno (HCB).
A continuación se describen los objetivos particulares para el modelo
de porfiria crónica por HCB, realizando un estudio comparativo entre
animales tratados con HCB vs animales controles, en función de las semanas
transcurridas desde la intoxicación.
1.- Confirmar el efecto porfirinogénico del HCB en el camino del hemo
en ratas Wistar hembras, a través de la evaluación de la URO-D y porfirinas
hepáticas y urinarias; es decir, validar el modelo propuesto para la Tesis.
2.- Investigar la existencia de disturbios en las rutas anabólicas y
catabólicas de la glucosa mediante el estudio de sus niveles plasmáticos, así
como en las actividades de enzimas hepáticas de la gluconeogénesis (PEPCK,
PC y G6Pasa) y de la glucólisis (PK).
85
OBJETIVOS
3.-Analizar si la intoxicación producida por HCB genera perturbaciones
del transporte de glucosa en hígado y otros tejidos, utilizando para ello un
análogo de glucosa marcada no metabolizable (3-O-metil d-3H-glu).
4.- Evaluar si el tratamiento con el xenobiótico promueve daños en los
procesos de síntesis y degradación del glucógeno, a través de la determinación
de sus niveles hepáticos, así como de sus enzimas claves: GS para
glucogenogénesis y GP para glucógenolisis.
Investigar alteraciones en factores regulatorios de la PEPCK y GP
5.- Investigar si hay interferencias en el sistema redox y en la
producción de ROS y relacionarlos con las producidas en el metabolismo
glucídico, midiendo peroxidación lipídica en hígados, quimioluminiscencia
espontánea en orinas (QL) en paralelo con las enzimas claves del metabolismo
de hidratos de carbono.
6.- Determinar si en este tipo de porfiria existen alteraciones del estado
hormonal que regula el metabolismo de la glucosa, estudiando nivel
plasmático de glucocorticoides (GC), el número y la afinidad de los receptores
hepáticos de GC (GR) y la biosíntesis de GC en tejido adrenal en presencia y
ausencia de ACTH. Todo ello en relación a las alteraciones del camino del
hemo y a la actividad de PEPCK, que está regulada positivamente por GC y
negativamente por insulina.
7.- Estudiar el efecto de la droga porfirinogénica HCB sobre los niveles
plasmáticos de insulina y sobre el patrón de secreción pancreática de esta
hormona estimulada por glucosa, en relación a biomarcadores del camino del
hemo y parámetros claves del metabolismo glucídico, atendiendo que la
insulina regula negativamente a PEPCK y GP.
86
OBJETIVOS
8.- Explorar algunos aspectos del metabolismo del triptófano (TRP) en
relación a esta porfiria y al metabolismo de la glucosa. Esto, teniendo en
cuenta que la administración de TRP resulta en hipoglucemia y que la
presencia de algunos de sus metabolitos de degradación daña la
gluconeogénesis y la formación de glucógeno.
2.2.2. Objetivos particulares: Modelo de porfiria aguda generada con AIA/DDC
Se describen aquí los objetivos particulares para el modelo de porfiria
hepática aguda, realizado a través del estudio comparativo de animales
tratados con 2-alil 2-isopropilacetamida (AIA) y 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4dihidrocolidina (AIA/DDC) vs controles, en función de dosis crecientes de la
droga porfirinogénica AIA.
1.- Investigar cómo se desregula el camino del hemo en este modelo
experimental de porfiria hepática aguda por la acción de dosis crecientes de
AIA y una dosis fija de DDC determinando las actividades de ALA-S (enzima
regulatoria del camino) y FQ (enzima particularmente afectada por acción del
DDC), y el contenido de los precursores ALA y PBG en el hígado.
2.- Indagar en esta porfiria inducida por AIA/DDC la existencia de
fallas en las rutas anabólicas y catabólicas de la glucosa, mediante el estudio
de las actividades de enzimas hepáticas de la gluconeogénesis (PEPCK y
G6Pasa) y de la glucólisis, PK.
3.- Determinar si el tratamiento con ambas drogas promueve daños en
los procesos de síntesis y degradación del glucógeno a través de sus enzimas
claves: GS para la glucogenogénesis y GP para la glucógenolisis, así como en
niveles hepáticos de glucógeno.
87
OBJETIVOS
4. Analizar si la intoxicación producida por el tratamiento con
AIA/DDC genera perturbaciones del transporte de glucosa en hígado, usando
un análogo de glucosa marcada no metabolizable (3-O-metil d-3H-glu).
5. En la búsqueda de interferencias en el sistema redox, evaluar el daño
a lípidos y proteínas en hígado, la presencia de quimiolumiscencia espontánea
en orina asociada a estrés oxidativo y las actividades hepáticas de enzimas
antioxidantes SOD y CAT. Todo ello en animales tratados con AIA/DDC, con
diferentes dosis de AIA y en relación a las actividades de PEPCK y de GP.
6. Investigar si la melatonina (Mel) administrada previamente a la
intoxicación de los animales, puede modular los efectos producidos por el
AIA/DDC sobre el ambiente oxidativo, la biosíntesis de la glucosa y el
camino del hemo; es decir, si puede modular o prevenir la porfiria aguda
inducida por estas drogas.
7. Explorar la existencia de perturbaciones en el metabolismo hepático
del TRP en este modelo de porfiria aguda, midiendo la concentración de
serotonina (5-HT); los niveles del TRP y además la actividad de la enzima
TRPp en sus tres formas: holo-enzima, apo-enzima y enzima total. Todo ello
en relación a biomarcadores de porfiria y al metabolismo de la glucosa, a los
fines de interrelacionar dichos disturbios.
88
Materiales y Métodos
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. ANIMALES
Para todas las experiencias de esta Tesis, se utilizaron ratas hembra de la cepa
Wistar. Sus pesos corporales al comienzo de cada experiencia rondaron entre los 190 y
210g.
Los animales fueron adquiridos aproximadamente a los dos meses de edad (150170g) en el Bioterio de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CONEA, EzeizaArgentina). Luego se mantuvieron hospedados hasta su utilización en el Bioterio
Central de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-UBA, bajo condiciones de
temperatura constante (22 °C) y ciclos de luz controlados (12 h luz-12h oscuridad, con
luz desde las 06:00 a las 18:00 h), en jaulas de acero inoxidable con acceso a comida
(Purina, dieta 3) y agua ad libitum.
Los procedimientos que involucraron animales, tanto cuidado como uso, fueron
llevados a cabo de acuerdo con las guías internacionales (Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals, National Research Council, USA, 1996; The Council of the
European Communities Directive, 86/609/ECC), como con las nacionales (Comité de
Uso de Animales de la Asociación Argentina de Especialistas en Animales de
Laboratorio, AADEALC).
3.2. DROGAS Y REACTIVOS.
El hexaclorobenceno de grado comercial (HCB) fue proporcionado gentilmente
por Compañía Química S.A. (BA, Argentina). El aceite de maíz Mazola con el que se
administró el HCB, se compró localmente. La 2-alil-2-isopropilacetamida (AIA) fue
donada por Roche Company (Basel, Suiza). El 3´,5´-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina
(DDC) fue comprado a Aldrich Chemical Company Inc. (Milwaukee, WI., USA).
La colagenasa se obtuvo a través de Serva Feinbiochemica (Heidelberg,
Alemania). La
125
I-insulina monoiodinada de cerdo, fue obtenida en CENEXA
(Facultad de Medicina, Universidad Nacional de la Plata, Argentina) y el antisuero de
coballo contra la insulina porcina fue donado por el Dr. R. Gutman, del Hospital
90
Materiales y Métodos
Italiano, (BA., Argentina). Este antisuero fue suficientemente no específico para
permitir ser desplazado por la insulina de rata. El estándar de insulina de rata fue
obtenido a través de Novo Research Laboratories (Bagsvaerd, Dinamarca).
El antisuero contra la corticosterona (CORT) fue proporcionado atentamente
por el Dr. Celso Gomez Sanchez, (University of Mississippi Medical Center MS., USA)
La 3-O-[metil-3H]-glucosa (1 mCi/ml, 60–90 Ci/mmol), [3H]-corticosterona
(76,5 Ci/mmol) y [3H]-DEX (35 Ci/mmol) fueron comprados a NEN Life Science
Products Inc. (Boston, MA., USA). El cocktail de centelleo OptiPhase Hi Safe 3 fue
provisto por Wallac Scintillation Products (Turku, Finlandia). El medio modificado
Eagle-Dulbecco en polvo (DMEM) fue comprado a GIBCO (NY, USA).
La Uroporfirina III se obtuvo a través de Porphyrin Products, Logan, (UT.,
USA).
El clohidrato de guanidina se compró a Invitrogen (CA., USA).
Se utilizó para la medición de glucosa en plasma el Kit Wiener Enzimático de
Glicemia, Laboratorios Wiener (Rosario, Argentina).
El ácido ascórbico, ácido delta-aminolevulínico (ALA), ácido tiobarbitúrico
(TBA), adenocorticotrofina (ACTH), 5’-adenosina monofosfato (AMP), citocalasina B,
citrato-liasa (CL), coenzima A (CoA), 2’-deoxiguanosina 5’-difosfato (dGDP),
dexametasona (DEX), epinefrina, fosfoenol-piruvato (PEP), fosfotransacetilasa,
glucógeno tipo III de hígado de conejo (GlnIII), glucosa-1-fosfato (G1P), heparina,
lactato deshidrogenasa (LDH), málico dehidrogenasa (MDH), malondialdehido (MDA),
Melatonina (Mel), NADH, piruvato, albumina de suero bovina (BSA), resinas de
intercambio Dowex 1 y Dowex 50W y otros reactivos, enzimas y sustratos, se
compraron a través de Sigma-Aldrich Chemical Co. (STL., USA).
El resto de las drogas utilizadas, fueron las de mayor grado de pureza
disponible en el mercado local.
91
Materiales y Métodos
3.2.1- Equipos
Todos los homogenatos se realizaron con un homogeneizador Potter-Elvehejm
(USA). Cuando hubo que sonicar muestras se utilizó un homogeneizador Ultrasónico
4710 Perkin Elmer 450 (Waltham, MA., USA).
Las centrifugaciones se efectuaron de acuerdo a las condiciones necesitadas y
la fracción a obtener, en una centrífuga de mesa Presvac (BA., Argentina), en una
microcentrífuga Sartorius modelo 1-14, en una centrífuga refrigerada Sorvall RC5C y/o
en una ultracentrífuga Beckman XL 90 (Brea, CA., USA).
Las
mediciones
espectrofotométricas
se
llevaron
a
cabo
en
un
espectrofotómetro SHIMADZU UV 160ª (Kyoto, Japón). Se llevaron a cabo diferentes
filtraciones en columnas de Dowex 1, Dowex 50W y Sephadex G25.
Para realizar las determinaciones por HPLC, las muestras se filtraron a través
de filtros Millipore SJHU013NS para luego ser inyectadas en una columna de HPLC
µBondapack C18 (300 x 3,9 mm) Waters (Milford, MA., USA) adosada a un
cromatógrafo Spectra SERIE Thermo Separation Products, (Waltham, MA., USA)
Modelo P200, con detector de fluorescencia FL 2000 (Waters Corp. Milford, MA.,
USA) e integrador Data Jet, de Thermo Separation Products.
Para cuantificar el transporte de 3H-Glu en los tejidos, para los ensayos por
RIA y para medir quimioluminiscencia urinaria (QL), se utilizó un contador líquido de
centelleo Beckman LS-3150P (Brea, CA., USA), que solo fue operado en modo out-offcoincidence, cuando se realizó la cuantificación de QL.
Para la obtención de agua destilada y desionizada (Milli-Q) se utilizaron un
destilador y desionizador marca Millipore (Billerica, MA., USA).
92
Materiales y Métodos
3.3. TÉCNICAS Y TRATAMIENTOS SOBRE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
3.3.1. Drogado de animales - Modelo de Porfiria Crónica por HCB.
Los animales utilizados en el modelo de intoxicación crónica por HCB fueron
aleatoriamente separados en cada experiencia en dos grupos: el grupo control (n = 30) y
el grupo tratado con HCB (n = 30).
En este esquema de drogado, las ratas del grupo HCB recibieron sólo 500 mg de
la droga/kg peso corporal en cinco dosis consecutivas diarias de 100 mg/kg peso
corporal, disuelto en aceite de maíz (1% p/v) por intubación gástrica (Legault et al.,
1997; Mylchreest & Charbonneau, 1997). Se ha demostrado que este protocolo induce
una porfiria totalmente desarrollada en un lapso de tiempo bien definido y predecible
(Mylchreest & Charbonneau, 1997). La principal ventaja de este modelo de intoxicación
respecto del continuo (Billi de Catabbi et al., 1997), es que involucra una exposición
mínima al HCB (menor tiempo y menor dosis). El tratamiento con HCB no causó
muertes, síndromes neurológicos detectables, ni sufrimiento en los animales.
Las ratas del grupo control recibieron sólo el aceite de maíz como vehículo (10
ml/kg peso corporal) durante esos mismos 5 días.
Todos los animales fueron privados de la comida 24 h antes de ser sacrificados,
pero se les permitió libre acceso al agua de los bebederos.
Se consideró como tiempo 0, el momento en que se administró la 5ta dosis
consecutiva de HCB en aceite por intubación gástrica y en las semanas sucesivas a
partir de ese tiempo inicial, seis ratas de cada grupo (tratadas con HCB y controles)
fueron utilizadas para las determinaciones, que en lo sucesivo se detallarán.
3.3.2. Drogado de animales - Modelo de Porfiria Aguda por AIA/DDC
Los animales utilizados en el modelo de intoxicación aguda, por
administración concomitante de AIA y DDC, fueron aleatoriamente separados para
cada experiencia en cuatro grupos.
93
Materiales y Métodos
Para este esquema de drogado, el AIA fue disuelto en solución salina (1,5-2%,
p/v) (De Matteis, 1970) y el DDC (utilizado en una dosis única de 50mg/kg peso
corporal) fue disuelto en aproximadamente 2,5 ml de aceite de maíz (De Matteis et al.,
1973). Ambas soluciones fueron preparadas justo antes de ser administradas a los
animales.
Las ratas fueron ayunadas 8 h antes de la intoxicación con ambas drogas. El
AIA fue inyectado subcutáneamente (s.c.) en tres dosis diferentes según los grupos,
mientras que concomitantemente, el DDC fue inyectado intraperitonealmente (i.p.) en
la dosis antedicha.
Así, los animales se dividieron en los siguientes grupos: L (100 mg AIA/kg
peso corporal + 50mg DDC/kg peso corporal), M (250 mg AIA/kg peso corporal +
50mg DDC/kg peso corporal), y H (500 mg AIA/kg peso corporal + 50mg DDC/kg
peso corporal).
El grupo Control (C) recibió solo los vehículos: solución salina vía s.c. y aceite
de maíz vía i.p. Estas dosis de AIA y DDC también fueron usadas por otros grupos de
investigación (De Matteis, 1970; De Matteis et al., 1973) para obtener modelos de
porfiria en ratas.
Las ratas tuvieron un ayuno total de 24h (8h antes del drogado y 16h después
del tratamiento) antes de ser sacrificadas, aunque con libre acceso a los bebederos de
agua.
En las determinaciones en las que se necesitó la orina total, se colectó durante
las 16 h posteriores a la intoxicación, utilizando jaulas metabólicas individuales para
cada animal.
3.3.3. Tratamiento con Melatonina, como antioxidante preventivo.
Otros animales también utilizados en el modelo de intoxicación aguda, por
administración concomitante de AIA y DDC, fueron aleatoriamente separados para
cada experiencia en cuatro grupos: C (grupo Control), Mel (grupo Melatonina), I+Mel
94
Materiales y Métodos
(grupo intoxicado con AIA/DDC junto al tratamiento con Melatonina) e I (grupo
intoxicado con AIA/DDC). La melatonina (Mel) fue inyectada en dos de los grupos de
animales con una concentración de 10 mg/kg de peso corporal, i.p. 3 veces al día (a las
8, 12 y 16hs) durante los 2 días previos a la intoxicación con AIA (300 mg/kg. pc, s.c.)
y DDC (50 mg/kg. pc, i.p.). El grupo Control (C) recibió solo los vehículos de las
drogas y del protector Mel.
Figura. 3.1. Esquema del protocolo de pre-tratamiento con Melatonina vía i.p. sobre ratas intoxicadas
con AIA/DDC y Controles.
C, ratas Control (inyectadas con vehículos de Mel i.p. y vehículos de AIA s.c. y DDC i.p.)
I, rata intoxicada con AIA/DDC 300/50 mg por kg peso (inyectada con vehículos de Mel i.p.)
Mel, rata pre-tratada con Mel. i.p. 48h (3 dosis cada 4 hs) y 24 horas (3 dosis cada 4 hs) antes
del sacrificio e inyectada con vehículos de AIA s.c. y DDC i.p.
I+Mel, rata intoxicada con AIA s.c. y DDC i.p. y pre-tratada con las 6 dosis de Mel. i.p. 48 y 24
horas antes del sacrificio.
Los vehículos de las diferentes drogas, se representan como líneas verticales negras; la intoxicación
con AIA/DDC como rectángulos rojos y las dosis del tratamiento con Mel, como rectángulos verdes.
Para este esquema de drogado, el AIA y DDC fueron disueltos y administrados
a los animales como se describe en el punto anterior. La melatonina fue disuelta en
solución salina justo antes de ser administrada i.p. a los animales de los grupos
correspondientes (Mel y I+Mel). A los grupos C e I se los inyectó i.p. en los mismos
horarios solo con el vehículo de Mel (1 ml de solución salina). Las dosis fueron basadas
95
Materiales y Métodos
en estudios sobre ratas tratadas con melatonina como protector y reductor de la
toxicidad producida por ciertas drogas (Reiter et al., 2000)
Las ratas fueron ayunadas durante 24h (8h antes del drogado y 16h después del
tratamiento) antes de ser sacrificadas, aunque con libre acceso a los bebederos de agua.
Las mediciones fueron hechas 16h post-intoxicación.
En las determinaciones en las que se necesitó la orina total, se colectó durante
las 16h posteriores a la intoxicación, utilizando jaulas metabólicas individuales para
cada animal, provistas de bebederos con agua.
3.4 DETERMINACIONES HEPÁTICAS- PREPARACIÓN DEL TEJIDO.
Las ratas se sacrifican por decapitación a los tiempos establecidos para cada
modelo. Todos los ensayos fueron llevados a cabo en ratas con un período total de
ayuno de 24h, salvo en los dos lotes de 5 animales cada uno, que se utilizaron para
determinar el efecto de la comida vs el ayuno en las determinaciones enzimáticas
hepáticas de PEPCK, PK, PC y G6Pasa.
Los hígados de los animales recién sacrificados, fueron perfundidos con
solución salina a 4°C, inmediatamente removidos, pesados y homogenizados en un
homogeneizador Potter-Elvehejm utilizando diferentes buffers y proporciones de ellos
para cada una de las determinaciones que abajo se detallan. Todos los procedimientos
fueron llevados a cabo a 4°C.
Para la determinación tanto de la ferroquelatasa hepática (FQ), como la de
URO-D, el tejido se homogeneizó en KCI 0,154 M (1g de tejido se llevó a 5 ml), se
centrifugó a 700 x g por 15 minutos y el sobrenadante así obtenido se centrifugó a
11.000 x g por 20 min en centrífuga Sorvall. El sobrenadante fue usado como fuente de
enzima para la determinación de URO-D (previo pasaje por columnas de Sephadex G25, como se describirá en detalle en el ítem 3.4.1.2) y el pellet obtenido luego de esta
última centrifugación se lavó con un pequeño volumen de KC1 0,154 M y se volvió a
centrifugar a 11.000 x g por 20 min. Las mitocondrias así obtenidas se congelaron a
-20°C por 24-48 hs antes de ser utilizadas para la medición de la FQ.
96
Materiales y Métodos
Para la determinación del contenido de ALA y PBG en hígado, así como para
la determinación de la actividad enzimática de ALA-S, el hígado fue homogenizado en
proporción 1:3 (p/v) en un buffer Tris–HCl 0,1mM, NaCl 0,9% y 0,5mM EDTA, pH
7,4.
Para la determinación del contenido de porfirinas, los homogenatos se
prepararon con KCl 0,154M en una proporción 1:5 (p/v).
Para la determinación de las actividades PEPCK y G6Pasa, 1 gramo de hígado
fue homogeneizado en 3 volúmenes de sacarosa 0,25M. El homogenato se centrifugó
por 20 min a 11.000 x g en una centrífuga Sorvall para precipitar el debris celular y las
mitocondrias. El sobrenadante obtenido fue centrifugado durante 1 hora a 100.000 x g
en la ultracentrífuga Beckman, separando nuevamente pellet (fracción microsomal) y
sobrenadante (fracción soluble o citosol). Esta fracción soluble fue utilizada para
realizar las determinaciones de actividad enzimática de la PEPCK, mientras que la
fracción microsomal se resuspendió en sacarosa 0,25M + 1 mM EDTA, pH 7 (1
ml/gramo tejido), y se guardó a -20°C toda la noche, descongelándose luego para la
determinación de la actividad de G6Pasa.
Para la determinación de la actividad de PK se realizó un homogenato 1:4 en
buffer Tris–HCl 50mM, 0,1M KCl, 5mM MgSO4, 1mM EDTA, pH 7,5 conteniendo
0,2mM de fructosa-1,6-difosfato y 10mM de β-mercaptoetanol. Las determinaciones
enzimáticas se realizaron en sobrenadantes preparados por un único paso de
centrifugación del homogenato durante 1 h a 100.000 x g.
Para la determinación de la actividad de PC se realizó un homogenato 1:5 en
buffer Tris-acetato 50mM, 5mM de MgSO4, 5mM de EDTA, pH 6,5; sonicando sobre
hielo 3 veces por 20 seg cada vez, con el fin de liberar las enzimas asociadas a
partículas y ultra-centrifugando a 100.000 x g por una hora para obtener la fracción
soluble necesaria para dicha determinación.
Se realizaron además, homogenatos 1:10 con ácido perclórico 6% para el
análisis del contenido de glucógeno hepático. Luego de calentar y centrifugar a 11.000
x g por 20 min, el sobrenadante se precipitó con 2 volúmenes de etanol helado. El
97
Materiales y Métodos
precipitado luego se disolvió en agua para que el contenido de glucógeno sea
determinado como equivalentes de glucosa.
Para la medición de la captación de glucosa por el hepatocito, se cortaron 4
porciones de 0,25 g de hígado en cubos de 2mm de lado, que luego fueron incubadas en
4 cajas de Petri de 10 ml con 1 ml de DMEM en cada una durante 5 min a 37°C. El
transporte de glucosa y el binding no específico fue definido como los eventos que
ocurren en presencia 1 μM de citocalasina B agregada durante dicha incubación.
Para la determinación de las enzimas glucógeno-sintetasa (GS) y glucógenofosforilasa (GP), los hígados se homogenizaron en 3 volúmenes de sacarosa 0,25M +
1mM EDTA. El homogenato se centrifugó durante 10 min a 2.000 x g en una centrífuga
de mesa, se descartó el debries celular y el sobrenadante resultante, fue utilizado en las
determinaciones.
Para la determinación de peroxidación lipídica en tejido hepático el contenido
de TBARS se ensayó a partir de un homogenato 1:10 en KCl 154mM. También fueron
utilizadas las fracciones microsomales y mitocondriales de ese mismo homogenato para
poder determinar en qué sub-fracción se generaba más daño a lípidos. La obtención de
mitocondrias y microsomas se realizaron a través del fraccionamiento subcelular por
centrifugaciones diferenciales descripto en ítems anteriores (preparación de fracción
citosólica en medición para la actividad de PEPCK). Brevemente, se podría describir
este fraccionamiento como una sedimentación de la fracción mitocondrial por
centrifugación a 11.000 x g durante 20min a partir del homogenato descripto para esta
determinación, y separación de la fracción citosólica de la microsomal, por una ultracentrifugación a 100.000 x g por 1 h.
Para ensayar el contenido de proteínas carboniladas en el citosol, se utilizó una
pequeña porción de la misma fuente enzimática que se preparó para PEPCK,
conteniendo 2mg de proteínas (aproximadamente en un volumen de 200 μl).
Para la medición de las actividades CAT y SOD total, los hígados fueron
homogeneizados (1:10 p/v) en una solución conteniendo 140mM KCl en un buffer
25mM de fosfato de potasio pH 7,4 y luego centrifugado a 900 x g por 15 min. El
98
Materiales y Métodos
sobrenadante resultante (una suspensión con organelas) fue utilizado para realizar las
determinaciones enzimáticas.
En los ensayos para determinar el binding de los receptores de glucocorticoides
(GR), los hígados de animales previamente adrenalectomizados (48h antes) fueron
rápidamente removidos al sacrificar los animales, cortado en pequeñas piezas y lavado
con buffer GR a 4 °C repetidas veces (10 mM Hepes + 5 mM EDTA, 10% glicerol
(v/v), 20mM Na2MoO4, 2mM DTT y 0,1mM PMSF a pH 7,4) y homogenizado en una
proporción de 2g de tejido en 3ml de dicho buffer (1:1,5 p/v). La fracción citosólicas
soluble, fue preparada a partir del homogenato por centrifugaciones diferenciales.
Luego de sedimentar la fracción mitocondrial por centrifugación a 11.000 x g durante
20 min., la fracción citosólica fue separada de la microsomal por una ultracentrifugación a 100.000 x g por 1 h.
El contenido de triptófano y/o serotonina en tejido hepático fue determinado
realizando un homogenato en ácido perclórico 0,6M en proporción 1:4 (p/v),
protegiendo en todo momento tanto el órgano como el homogenato de la luz, para no
producir degradación de estos aminoácidos y sus metabolitos. El homogenato se
centrifugó inmediatamente durante 20 min a 11.000 x g y el sobrenadante resultante se
filtró a través de filtros Millipore SJHU013NS para luego ser inyectados en una
columna de HPLC Waters µBondapack C18.
La actividad de la triptófano pirrolasa (TDO o TRPp) hepática fue determinada
en homogenatos de hígado realizados en menos de 3 min de sacrificado el animal, en
6,5 volúmenes de buffer 140mM KCl 2,5mM NaOH protegiendo tanto el órgano como
el homogenato de la luz para no producir degradación de los metabolitos involucrados
en esta determinación.
99
Materiales y Métodos
3.4.1. Determinación de actividades enzimáticas del camino del hemo.
3.4.1.1. Actividad hepática de la 5-aminolevulínico-sintetasa (ALA-S).
Aproximadamente 1 g de tejido se homogeneizó con solución que contiene
buffer Tris-HCL 10 mM (pH 7,4), NaCl 0,9% y EDTA 0,5 mM de tal forma de
obtener 3 ml de homogenato/g de hígado. La actividad de ALA-sintetasa se ensayó en
los homogenatos por el método de Marver et al., (1966). La mezcla de incubación
contiene 0,5 ml de homogenato, 0,5 ml de glicina 0,4 M, 0,2 ml de EDTA 0,1 M, 0,8 ml
de buffer Tris-ClH 0,2 M (pH 7,2) en un volumen final de 2 ml.
Se incubó a 37°C durante 1 h al aire y con agitación. Se desproteinizó con 0,5
ml de TCA 25% en frío y se centrifugó a 1.500 rpm en centrífuga de mesa por 15 min.
Se pirrolizó el ALA usando 1 ml del sobrenadante obtenido de cada tubo más
1 ml de buffer acetato de sodio 0,1 M pH 4,6 y 50 μl de acetilacetona, vortexeando hasta
lograr la integración de todos los componentes y calentando a 100°C por 10min. Se
agregó luego de enfriar 2 ml de reactivo de Ehrlich a cada tubo, vortexeando
nuevamente. Luego de pasados 7 min a temperatura ambiente (y antes de los 15 min), el
producto (ALA pirrolizado) se determinó espectrofotométricamente a 553 nm, restando
la absorbancia de los blancos respectivos, con un M de 6,1 x 10
4
nM-1. cm-1 para el
ALA. (Mauzerall & Granick, 1956).
El reactivo de Ehrlich fue preparado en el momento de su uso con 0,4g de paradimetilamino benzaldehído (pDMAB) + 12 ml de acético glaciar + 3,4 ml de ácido
perclórico 70% y llevado a 20 ml de volumen final con acético glaciar.
3.4.1.2. Actividad Uroporfirinógeno-decarboxilasa (URO-D)
La actividad de la enzima URO-D fue medida de acuerdo al trabajo descripto
por Wainstok de Calmanovici et al., (1984) con modificaciones más recientes según
describe Chaufan et al., (2002).
100
Materiales y Métodos
El substrato de la reacción, el uroporfirinógeno III se obtuvo reduciendo la
uroporfirina III (Porphyrin Products) con amalgama de sodio al 3% (preparada según el
método de San Martín de Viale, 1970) a uroporfirinógeno III que fue utilizado
inmediatamente luego del filtrado (Mauzerall & Granick, 1958).
La incubación fue llevada a cabo en una mezcla (Vf: 1,5 ml) conteniendo:
buffer fosfato de potasio 0,067 M pH 6,8; 1 mM de GSH reducido; 0,1 mM EDTA;
usando 4 µM de uroporfirinógeno III como sustrato y aproximadamente 200 µl de
citosol (previamente filtrado en Sephadex G25 para sacar las porfirinas en caso de
animales tratados) como fuente enzimática (conteniendo 3 mg prot/ml). Los ensayos se
llevaron a cabo de manera anaeróbica y en oscuridad, a 37°C por 30 min con agitación
mecánica. La reacción se detuvo reoxidando el porfirinógeno en presencia de luz y
luego desproteinizando.
Las porfirinas formadas fueron separadas por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) en un cromatógrafo de la SERIE Spectra (Thermo Separation
Products) Modelo P200, a través de una columna Waters µBondapack C18 de fase
reversa (300 x 3,9 mm) y luego cuantificadas como porfirinas libres, a través de un
detector de fluorescencia Waters FL 2000, seleccionando para la detección 404nm como
longitud de onda de excitación y 618nm como longitud de onda de emisión tal como lo
describen Lim et al., (1983).
Los solventes utilizados en el gradiente de elución, fueron acetonitrilo y buffer
acetato de amonio 1 M, pH 5,16. Fue utilizado un gradiente lineal de 10% a 30% de
acetonitrilo en buffer acetato de amonio (v/v) durante 15 min, seguido por una elución
isocrática con 30% de acetonitrilo en buffer acetato de amonio por otros 15 minutos
(Lim et al., 1983), siendo la velocidad de flujo de aproximadamente de 1ml/min.
Para realizar los cálculos de los nmoles detectados se utilizaron los coeficientes
determinados previamente en el laboratorio, considerando la concentración de porfirinas
como el área bajo la curva de retención vs nmoles de porfirinas. El valor para copro´gen
fue: 4,4 x 10-4 nmoles/área. Luego se expresó la actividad de la enzima, convirtiendo el
área integrada como nmoles de COPROgen III formado/mg proteína.hora.
101
Materiales y Métodos
3.4.1.3 Actividad ferroquelatasa (FQ)
La actividad enzimática de la FQ se determinó en las fracciones mitocondriales
previamente obtenidas por centrifugación diferencial del homogenato antes descripta y
congeladas a -20°C. La solución de PROTO IX, utilizada como sustrato, se preparó
según lo describen Porra & Jones (1963). Para conocer la concentración de la solución
de PROTO IX se hizo una dilución conveniente con HC1 5% y se midió la absorbancia
a 407,5 nm. Se utilizó un  mM de 275. Luego la protoporfirina fue disuelta de manera
de obtener una solución madre 1mM en buffer Tris HCl 40 mM pH 8,2 con el agregado
de Tween 80 al 2% (p/v).
Para determinar la actividad de ferroquelatasa, el medio de incubación contenía
en un volumen final de 3,2 ml: 100 nmoles de PROTO IX, 200 nmoles de SO4Fe
(preparado en agua al momento de usarse), 30 µmoles de succinato de sodio, 140
µmoles de buffer Tris HCl pH 8,2 y 0,8 ml de la suspensión de las mitocondrias
(correspondientes a 8 mg de proteínas microsomales). Este y los blancos de sustrato (sin
PROTO IX) se incubaron a 37°C durante 1h en oscuridad. Al finalizar la incubación se
adicionaron, sobre hielo y bajo campana, 1 ml de piridina y 0,5 ml de NaOH 1N.
Pasados otros 20 min se agregó en los tubos 1 ml de agua. La mezcla se dividió en dos
cubetas, en una se agregó una punta de espátula de Na2S204 y en la otra 50 µl de
K3[Fe(CN)6] 3 mM y se midió la diferencia de absorbancia del hemocromógeno oxidado
y reducido (Porra & Jones, 1963). La formación de producto fue calculada con la
diferencia de absorbancias (A556nm-A538nm) entre el máximo de la banda a (556 nm)
y el mínimo entre las bandas alfa y beta (538 nm) restando los valores del blanco para
cada caso. El valor usado para mM fue de 12,5.
102
Materiales y Métodos
3.4.2. Contenido de intermediarios hepáticos del camino del hemo.
3.4.2.1. Contenido hepático de ALA y PBG
Para determinar los contenidos de ALA y PBG, una porción de homogenato
hepático completo fue desproteinizada con 0,6M de TCA y centrifugada por 15 min a
1.500 x g según la técnica de Marver et al., (1966).
Entre 0,5-1 ml de sobrenadante se ajustaron a pH 5,5–6,0 con HCl. El
contenido fue determinado esencialmente por el método de Piper et al., (1973). Para ello
se utilizaron dos columnas de intercambio iónico; el PBG fue eluído de una columna
Dowex 1 con ácido acético 1N, mientras que el ALA se eluyó de una columna Dowex
50W con acetato de sodio 1M luego de remover la urea en un primer paso con agua. El
ALA pirrolizado (ver técnica para determinación del producto en el ensayo de ALA-S)
y el PBG se midieron espectrofotométricamente a 553 nm, con un M = 6,1 x 104
nM-1.cm-1 para el PBG utilizando el reactivo de Ehrlich, como describe Mauzerall &
Granick (1956).
3.4.2.2. Contenido de porfirinas hepáticas
El contenido de porfirinas fue determinado espectrofotométricamente en
porciones de 0,1–0,5 ml de homogenatos hepáticos como porfirinas totales libres en 5%
(p/v) HCl. Esto se hace luego de precipitar las proteínas y la extracción cuantitativa de
las porfirinas determinadas con la adición de 5 volúmenes de acetato de etilo/ ácido
acético (3:1 v/v) y la posterior transferencia de las porfirinas al HCl 5%, como describe
San Martín de Viale et al., (1977).
El contenido total de porfirinas fue determinado espectrofotométricamente
usando la corrección de la fórmula de Rimington & Sveinsson, (1950) para compensar
la absorción inespecífica de fondo. Para ello se hacen lecturas de absorbancia a 3
diferentes longitudes de onda, la del máximo de Soret (Amax), 380 y 430 nm y se calcula
la Acorr mediante las expresiones:
A= 2.Amax - (A380 + A430); Acorr = A/K
103
Materiales y Métodos
donde K es el factor de corrección. Para determinar K (1,844), se utilizaron curvas de
calibración para uroporfirinas, coproporfirinas y protoporfirinas en 5% de HCl. (Tomio
et al., 1970).
3.4.3. Determinación de actividades enzimáticas hepáticas. Gluconeogénesis y
Glucólisis.
3.4.3.1. Actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK)
La actividad de la enzima gluconeogénica PEPCK fue medida de acuerdo con
el método de Petrescu et al., (1979) usando 2’-deoxiguanosina 5’-difosfato (dGDP)
como nucleótido sustrato, y midiendo la oxidación del NADH. La mezcla de reacción
contenía en 1 ml: 50 mM de buffer Tris-HCl pH 7,4 + 20 mM de bicarbonato de sodio
(saturado con CO2) + 0,5 mM de PEP + 1 mM de MnCl2 + 2 unidades de MDH en Tris
y 0,1 mM de NADH en Tris. Alícuotas de 20 µl de fracción citosólica fueron utilizadas
en cada ensayo.
GTP + oxalacetato ↔ GDP + PEP + CO2
La reacción fue iniciada con el agregado de 0,2 mM de dGDP y la cinética
seguida entre 2 y 5 min, mientras la actividad se mantuvo lineal. El oxalacetato formado
durante la reacción enzimática reversa fue espectrofotométricamente determinado,
observando desaparición en el tiempo de la absorbancia a 340 nm (cinética) por NADH
en presencia de MDH. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente, y se utilizó
un M para el NADH de 6,22 x 109 μM-1.cm-1. Los resultados de la actividad PEPCK se
expresaron como nmoles de NADH oxidado.min-1.mg proteínas-1.
3.4.3.2. Actividad de piruvato carboxilasa (PC)
La actividad de la enzima gluconeogénica PC fue determinada por el método
de Berndt et al., (1978).
La mezcla de incubación de 1,2 ml de volumen total contenía: 200 µmol de
buffer Tris HCl pH 8,0; 4 µmol de piruvato; 2 µmol ATP; 10 µmol de MgCl2; 30 µmol
104
Materiales y Métodos
de KHCO3; 10 µmol acetil-fosfato; 1 µmol de CoA; 4 U de CS y 20 U de
fosfotransacetilasa. En los ensayos controles, el piruvato no fue agregado. Una alícuota
de 50 µl de sobrenadante conteniendo aproximadamente 0,15 mg de proteínas fue
utilizada para iniciar la reacción inversa y catalizar la formación de oxalacetato a partir
del piruvato en una incubación de 30 min a 37 °C. Inmediatamente el oxalacetato
formado se transformará en citrato por acción del citrato sintetasa (CS), la
fosfotransacetilasa, el ATP y la acetil-CoA.
El citrato fue determinado luego de otros pasos de precipitación de proteínas y
centrifugación, mediante su clivaje a acetato y oxalacetato; y éste último reducido con
MDH en presencia de NADH. Los cambios de absorbancia fueron medidos
espectrofotométricamente a 340 nm, como se describió anteriormente para la
determinación de PEPCK.
La reacción se llevó a cabo midiendo la cinética de desaparición del NADH
por 2 min a temperatura ambiente, con un M = 6,22 x 10 9 μM-1. cm-1 para el NADH
Los resultados de la actividad PC se expresaron como μmoles de NADH oxidado.
min-1.mg proteínas-1.
3.4.3.3. Actividad de glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa)
La actividad de G6Pasa fue medida siguiendo la técnica de Baginski et al.,
(1974) a través del fosfato inorgánico liberado del sustrato utilizado (G6P).
Una alícuota de 50 µl de suspensión microsomal hecha con el pellet de la
centrifugación a 100.000 x g resuspendido en 1ml de sacarosa 0,25 M + EDTA 1mM
(conteniendo aproximadamente 40 µg de proteínas), fue incubada con 450 µl de
reactivo conteniendo G6P 0,1M; histidina 35mM; agua y EDTA 10 mM (en proporción
2: 5: 1: 1) a pH 6,5; en baño con agitación a 37 °C por 30 min.
Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Los blancos de reactivos se
hicieron remplazando la suspensión microsomal por agua y los blancos de muestra
remplazando el reactivo de G6P por agua. La reacción se frena a los 30 min con 2,5 ml
TCA 8%. Luego se centrifuga por 15 min a 5.000 x g y el sobrenadante se usa en la
medición del fosfato inorgánico liberado (Pi).
105
Materiales y Métodos
El fosfato se determinó espectrofotométricamente a 660 nm por el color del
complejo de fosfo-molibdato formado, usando como reactivo reductor una parte de
acido ascórbico 10% (p/v) en 6 partes de molibdato de amonio 3,6 mM (0,42% p/v en
SO4H2 1N). Así se incuban 50 μl del sobrenadante con 700 μl de reactivo reductor y
250 μl de agua, por 20 min en baño con agitación a 45°C (Ayes, 1966).
Se utilizó un M = 4,25 x 109. M-1. cm-1 para el Pi. Los resultados de la
actividad G6Pasa se expresaron como μmoles de Pi.min-1.mg proteínas-1.
3.4.3.4. Actividad de piruvato quinasa (PK)
La actividad de la enzima glucolítica PK fue medida de acuerdo a la técnica
descripta por Imamura & Tanaka (1982) por el método acoplado de NADH-LDH.
Cada ml de la mezcla de ensayo contenía: 50 µmoles de buffer Tris HCl pH
7,5; 0,1 mmoles de KCl; 5 µmoles de MgSO4; 0,5 µmoles de F1,6BP; 2 µmoles de
ADP; 2 µmoles de PEP; 0,18 µmoles de NADH y 8 U de LDH. En los ensayos
controles, el PEP no fue agregado. Una alícuota de 10 µl del sobrenadante conteniendo
aproximadamente 30 µg de proteínas fue utilizada para iniciar la reacción en la cubeta
del espectrofotómetro conteniendo 1ml de la mezcla de reacción preincubada para
obtener una temperatura entre 25 y 37 °C.
La actividad PK fue medida por el piruvato formado a partir del PEP + ADP el
cual se redujo con LDH en presencia de NADH.
La reacción se llevó a cabo midiendo la cinética de desaparición del NADH
por 2 min a dicha temperatura, con un M = 6,22 x 10 9. μM-1. cm-1 para el NADH. Los
resultados de la actividad PK se expresaron como μmoles de NADH oxidado. min-1. mg
proteínas-1.
3.4.4. Contenido de glucógeno hepático
El glucógeno fue determinado realizando un homogenato hepático 1:10 (p/v)
en ácido perclórico 6% como se describe en el trabajo de Taira et al., (2004). Este
106
Materiales y Métodos
homogenato fue calentado a 100°C por 5 min, luego enfriado y centrifugado a 10.000
x g por 20 min. Con el sobrenadante obtenido, el glucógeno fue tratado en frío con 1,3
volúmenes de etanol 96%, y se permitió el precipitado durante toda una noche en
heladera.
El precipitado fue luego disuelto en agua, y el glucógeno determinado a través
de la reacción de fenol-ácido sulfúrico para la determinación de azúcares de acuerdo al
protocolo de Dubois et al., (1956) utilizando fenol al 5% en agua y ácido sulfúrico 96%
(en proporción 1:1:5) y midiendo absorbancia de la muestra a 490nm. Fue realizada
previamente una curva de calibración con glucosa, donde se obtuvo un factor de 0,491
μmoles de equivalentes de glucosa/ml de mezcla de reacción para este método.
Los resultados fueron expresados como μmoles equivalentes de glucosa
(contenidos en el glucógeno) /g tejido hepático.
3.4.5. Transporte de glucosa por tejido hepático- Captación por el hepatocito
La captación de la glucosa por el hepatocito fue medida usando un análogo de
glucosa marcada no metabolizable 3-O-(metil d3H)-glucosa tal como lo describe Enan
et al., (1992). Una porción de 0,25g de hígado fue incubada en 1 ml de DMEM por 5
min a 37 °C, antes del agregado de 1 µCi de 3-O-(metil-d-3H)-glucosa (2,5 ng por
ensayo)
Luego de 30 min de incubación a 37°C, se determinó el transporte de glucosa,
removiendo el medio y lavando el tejido tres veces con 1 ml de DMEM helado. El
tejido se transfirió a un vial que contenía líquido de centelleo OptiPhase Hi-Safe 3, y
luego de un tiempo de espera de 3hs la radioactividad incorporada fue medida en el
contador de centelleo Beckman.
Tanto el transporte como el binding no específico de glucosa fueron definidos
como los eventos ocurridos en presencia de 1 µM de citocalasina B con lo que se incubó
el tejido 20 min antes del agregado del radioactivo.
107
Materiales y Métodos
La captación de glucosa fue entonces calculada restando a los dpm totales
correspondientes a las muestras, los dpm de aquellas que contenían citocalasina B,
sustancia que inhibe el transporte de glucosa activo al interior de la célula. El resultado
fue expresado como pg de glu captada/g tejido.
3.4.6. Determinación de actividades enzimáticas del metabolismo del glucógeno.
3.4.6.1. Actividad de la Glucógeno Sintetasa (GS)
La actividad de la GS fue medida usando el ensayo colorimétrico de Leloir and
Goldemberg (1960). La mezcla de incubación contenía 5mM de UDP-glucosa, 10mM
de G6P, 5mM de EDTA, 0,8% de GlnIII, 0,15M de buffer glicina pH 8,5 y el
sobrenadante de 2.000 x g como fuente enzimática.
Luego de 30 min de incubación at 37 °C, la actividad de la GS fue frenada por
calentamiento a 100 °C durante 4 min (Graham & Whistler, 1976), y el UDP liberado
fue estimado con el agregado a muestras, estándares y blancos de: 0,25µmol PEP
diluído en KCl 0,4M; 2,5 µmol PK diluída en MgSO4 0,1M. Luego de incubar por 15
min a 37°C se agrega 150µl DNPH 0,1% en 2N HCl. A los 5 min, se adicionan 200µl
NaOH 10N y 1,1ml EtOH 95% para evitar la turbidez por el glucógeno. Finalmente se
centrifugó y se leyeron los sobrenadantes a 520nm. Los resultados se expresaron como
nmoles de UDP.g hígado-1.min-1.
3.4.6.2. Actividad de la Glucógeno Fosforilasa (GP)
Esta actividad enzimática fue ensayada de acuerdo con el método de Newman
& Armstrong (1978). Las concentraciones finales de los reactivos en el ensayo fueron
50 mM de G1P, 1% de Gln III, 0,15 M de NaF, 1 mM de 5-AMP, 0,5M de Na2SO4, en
buffer citrato pH 6,5 y el sobrenadante de 2.000 x g como fuente enzimática.
La actividad se midió como la tasa de liberación de fosfato inorgánico después
de 15 minutos de incubación a 37°C.
El fosfato se determinó espectrofotométricamente a 660 nm por el color del
complejo de fosfo-molibdato formado, usando como reactivo reductor una parte de
acido ascórbico 10% (p/v) en 6 partes de molibdato de amonio 3,6 mM (0,42% p/v en
108
Materiales y Métodos
SO4H2 1N). Así se incuban 50 μl del sobrenadante con 700 μl de reactivo reductor y 250
μl de agua, por 20 min en baño con agitación a 45°C (Ayes, 1966).
Se utilizó un M= 4,25 x 10 9 M-1.cm-1 para el Pi. Los resultados de la actividad
GS se expresaron como nmoles de Pi. min-1. g hígado-1.
3.4.7. Determinación de parámetros de estrés oxidativo.
3.4.7.1. Determinación de la peroxidación lipídica por TBARS
El malondialdehído (MDA) se ensayó como describe el método que utiliza
Ennamany et al., (1995) al extraer con butanol el complejo rojo que se genera entre el
MDA y el ácido tiobarbitúrico para evitar la interferencia por porfirinas endógenas.
En tubos de ensayo de 10 ml de capacidad, se añaden respectivamente 100 µl
de muestras problema (microsomas, mitocondrias u homogenato entero, de acuerdo a la
determinación a realizar), 100 µl de H2O destilada (muestra blanco), o 100 µl de
solución control (muestra control) y a continuación los siguientes reactivos en el orden
que se describe: 1,5 ml de TBA 0,8%; 0,2ml de SDS 8,1%; 1,5ml de acético 20%
ajustando pH por encima de 3.0 y llevando a Vf:4ml con agua destilada.
Esta mezcla de reacción se mantiene 60 minutos a 5º C. Transcurrido este
tiempo, se lleva a ebullición en un baño de agua a una temperatura entre 95 y 100 ºC
durante 60 minutos, para desarrollar la máxima coloración en todas las muestras. Los
tubos se tapan con bolas de cristal como condensadores para evitar pérdidas de líquido
por evaporación.
Una vez finalizada la reacción, se procede a la extracción de los complejos con
2,5 ml de una solución de n-butanol piridina (15:1 v/v) y 0,5 ml de agua destilada,
enfriando previamente los tubos en un baño de hielo.
Tras mezclar y centrifugar a 4.000 x g. durante 10 minutos, las capas superiores
o sobrenadantes se recogen en un tubo limpio y se procede a la lectura de las
109
Materiales y Métodos
absorbancias a 532 nm, frente a un blanco de reactivos utilizando un M= 1,56 x 105
M−1 cm−1 (Ohkawa et al., 1979).
3.4.7.2. Concentración de proteínas carboniladas
Se realizó un homogenato 1:10 con 50mM de buffer fosfato conteniendo 1mM
de EDTA, luego se centrifugó durante 60 minutos a 100.000 xg.
Los grupos carbonilos formados en el citosol fueron cuantificados agregando
1ml de 10mM de DNPH en 2M HCl a un volumen de citosol conteniendo 2mg de
proteínas (200 µl aproximadamente).
Se mantuvo a temperatura ambiente y oscuridad durante 1 hora, agitando en
vortex cada 10 minutos. Las muestras fueron precipitadas con TCA 20% (concentración
final) y centrifugadas a temperatura ambiente durante 5 minutos.
El pellet se lavó dos veces con TCA 10% y luego tres veces con 1ml de etanol:
acetato de etilo (1:1) para remover el DNPH libre. Los pellets fueron resuspendidos en
1ml de clorhidrato de guanidina 6M (pH 2,3) durante 15 minutos a 37ºC, agitando con
vortex.
El contenido de carbonilos se determinó midiendo la absorbancia a 390nm con
un M = 2,2 x 104 M-1.cm-1 (Levine et al., 1994).
La concentración de proteínas para el ensayo de proteínas carboniladas fue
determinada mediante una curva realizada con seroalbúmina bovina solubilizada en
clorhidrato de guanidina y leída a 280 nm junto con las muestras (Reznick & Paker,
1994)
3.4.8. Actividades de las defensas antioxidantes
3.4.8.1. Actividad superóxido dismutasa (SOD)
La actividad de la SOD fue determinada por la tasa de autoxidación de la
epinefrina a adenocromo (Misra & Fridovich, 1972). De esta manera, se define una
110
Materiales y Métodos
unidad como la cantidad de SOD necesaria (o mg proteína necesarios) para inhibir la
autoxidación del 50% de la epinefrina.
Se comienza con un homogenato 1:10 en buffer fosfato de Na 50 mM pH 7,4;
1mM EDTA y se centrifuga a 5.500 x g por 15 min. Se toma el sobrenadante y se
reserva en frío y oscuridad hasta su uso. Se colocan en la cubeta 2,85 ml de buffer
glicina 50 mM, pH 10,2 y 100 μl de buffer fosfato 20 mM, pH 7,4 y se le agregan 50μl
de solución de epinefrina 60 mM.
Luego se mezcla por inversión o con una pequeña espátula de plástico y se
mide la autoxidación de la epinefrina hasta los 810 seg. Se toma luego la pendiente de la
parte lineal de la curva (que ronda aproximadamente un valor de 0,024). Se repite el
procedimiento con la muestra variando el volumen de tal forma de obtener un 50% de
inhibición (aproximadamente 10μl para las ratas controles).
La solución de sustrato se prepara con epinefrina en HCl 20 mM (si es
epinefrina base libre se debe disolver en HCl 10 mM). Se debe siempre controlar que el
pH quede en 2. El M = 2,6 x 103 M-1.cm-1 de la epinefrina a 270 nm y se utiliza para
medir la concentración en la muestra. Se mide la formación de adenocromo a 485 nm
con un M = 4,5 x 103 M-1.cm-1.
Ue/mg prot = 1/ mg de proteína necesarios para lograr el 50% de inhibición.
3.4.8.2 Actividad Catalasa (CAT)
La actividad CAT fue medida registrando la diferencia en la absorbancia del
H2O2 a 240 nm durante 1 min (Chance et al., 1979). Se hace un homogenato 1:10 en
buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,4 + 1 mM EDTA; se centrifuga durante 20 min a
5.500 xg. Se toma el sobrenadante y se diluye al medio (0,5 ml) con buffer fosfato de
sodio 50 mM pH 7,4 + 1 mM EDTA (0,5 ml) y se le agrega 125 µl Tritón X-100 al
20%. Se enfría a 0 ºC durante 5 min y se usa como fuente de enzima.
Se prepara la solución de sustrato, que consiste en H2O2 en buffer fosfato de
sodio 50 mM pH 7,4. Para 20 ml de buffer se agregan aproximadamente 14 μl H 2O2
111
Materiales y Métodos
60%. Según el catálogo de Sigma, la absorbancia a 240 nm debe estar entre 0,52 y 0,55
y en general las mediciones realizadas dieron entre 0,50 y 0,53.
Se colocan en la cubeta 2,99 ml de la solución del sustrato y se le agregan 10μl
de solución de enzima. Se mezcla en la misma cubeta por inversión con parafilm y se
mide la pendiente de la curva utilizando el programa Catalasa del espectrofotómetro
(240 nm, 0,6-0,3 rango, 1-60 seg). Si el Δ Abs/min es mayor a 0,07 conviene utilizar
menos enzima. Se utilizó el M = 4 x 10-2 mM-1.cm-1 para el H2O2. Los resultados se
expresan como μmoles de H2O2/ min.mg prot.
3.4.9. Determinación de receptores de glucocorticoides (GR)
Para los ensayos de binding, los hígados de los animales previamente
adrenalectomizados (48 h antes y ayunados por 24 h) se retiraron inmediatamente luego
de sacrificarlos, se cortaron en trozos pequeños, se enjuagaron repetidas veces con buffer
GR enfriado en hielo (que consta de 10 mM de Hepes + 5 mM de EDTA, 10% (v/v) de
glicerol, 20 mM de Na2MoO4, 2 mM de DTT y 0,1 mM de PMSF, pH 7,4) y se
homogeneizaron (650 mg de tejido/ ml) en el mismo buffer.
La fracción citosólica se preparó a partir del homogenato, por centrifugación
diferencial. Después de la sedimentación de la fracción mitocondrial a 11.000 x g durante
20 min, la fracción citosólica se separó de la fracción microsomal como sobrenadante de
la centrifugación a 100.000 x g durante 60 min. Todos los pasos se llevaron a cabo a 4°C.
El binding se determinó por triplicado empleando 400-600 mg proteínas
citosólicas y 1,25 nM de 3H-DEX en buffer GR.
Los parámetros de binding se obtienen por el desplazamiento de la unión
específica de la 3H-DEX con siete concentraciones de DEX no marcadas (0,5-100 nM).
Todas las incubaciones se llevaron a cabo en un volumen final de 0,5 ml a 4 °C.
Después de alcanzado el equilibrio, el remanente de 3H-DEX fue eliminado mediante la
adición de un volumen igual de carbón-dextran en buffer fosfato salino, pH 7,4
(2%:0,2%). La unión específica se calcula restando la unión no específica obtenida en
112
Materiales y Métodos
muestras paralelas después de la adición de un exceso de DEX no marcada. Las
constantes aparentes de disociación (Kdapp) y el número aparente de los sitios de unión
(Bapp) fueron obtenidos empleando el Programa de ligandos (Software David Rodbard,
NIH). Todas las determinaciones se llevaron a cabo en el mismo momento del día para
evitar la influencia de las variaciones por el fotoperíodo (Pozzi et al., 1997).
3.4.10. Determinación de metabolitos hepáticos del TRP por HPLC
Las muestras de hígado de ratas normales y tratadas se prepararon de acuerdo al
método de Wolf & Kuhn (1983) detallado por Llambías et al., (2003). Brevemente, una
alícuota del sobrenadante del homogenato a 12.000 x g se mantuvo a 4-8°C en la
oscuridad hasta su uso. Todas las muestras se filtraron utilizando filtros Millipore
SJHU013NS con un tamaño de poro de 0,45 mm antes de ser inyectada en una columna
de HPLC Waters µBondapack C18 reversa (300 x 4,6 mm diámetro interno)
Un cromatógrafo líquido de la SERIE Spectra Modelo P200 y un detector de
fluorescencia Waters FL 2000 con una longitud de onda de excitación de 290 nm y una
longitud de onda de emisión de 330 nm, se utilizó para determinar el TRP y el contenido
de serotonina (5-HT) mediante una corrida con solución isocrática de acetato de sodio 40
mM a pH 3,5 siguiendo el método descrito por Moran & Fitzpatrick (1999). Las
soluciones fueron filtradas a través de filtros de 0,45mm y el agua milliQ o el buffer
degaseados con burbujeo en He. La velocidad de flujo utilizada fue de 1,0 ml/min. La
columna se operó a temperatura ambiente y el detector fue fijado en el rango 0–20. Todos
los cromatogramas, tiempos de retención y áreas debajo de los picos fueron analizadas
con un integrador Data Jet que se programó con atenuación de 8 y velocidad de graficado
de 0,25 cm/min.
3.3.11- Enzimas del camino quinurenérgico: actividad de la TRP pirrolasa.
El homogenato fue realizado en una proporción 1:6,5 g hígado/buffer de
homogenato (140mM de KCl y 2,5mM de NaOH). Inmediatamente entre los 4-8 min
después de extraer el hígado y hacer el homogenato, se tomaron 0,5 ml para la reacción.
113
Materiales y Métodos
Estos tiempos se estrechan así, para proteger tanto al hígado como al homogenato de la
luz. La mezcla de reacción contenía 40 ml de buffer fosfato 0,2M pH 7; 50 ml de H2O y
10 ml de TRP 0,03 M en buffer (todo hecho por duplicado, más los blancos a tiempo 0) .
Luego se procedió a dividir en 2 cada ensayo y agregarle a cada mitad: 100 µl
hematina 2 µM en NaOH 0,1M o solo 100 µl NaOH 0,1M. Se midió a 365 nm y se
expresó como µmol quinurenina/hora.g hígado.
La medición de la actividad enzimática se determinó mediante la formación de
quinurenina a partir de L-TRP en homogeneizados de hígado ya sea en ausencia
(actividad holoenzima) o presencia (actividad enzimática total) de hematina.
La actividad de la apoenzima, calculada por diferencia, se utilizó entonces para
medir la relación de actividad entre holoenzima/ apoenzima, que indica el grado de
saturación de hemo de la apoenzima. La actividad se midió en presencia de L-TRP
como se describe por Badawy & Evans (1975).
3.5 DETERMINACIONES URINARIAS
3.5.1. Contenido de intermediarios del camino del hemo- ALA, PBG y porfirinas
3.5.1.1. ALA y PBG en orina
Los ensayos para ALA, PBG y porfirinas se realizaron con muestras de orina
de 24 horas (o 16 hs según el tratamiento realizado).
Se determinó en porciones de 0,3-1 ml de orina, esencialmente por el método
de Piper et al., (1973). Luego de una centrifugación a 500 x g por 15 min, el
sobrenadante se ajustó a pH 5,5–6,0 con HCl. Se utilizaron dos columnas de
intercambio iónico por separado, el PBG se eluyó de una columna Dowex 1 con ácido
acético 1N y el ALA se eluyó de una columna Dowex 50W con acetato de sodio 1M,
después de eliminar la urea en un primer paso con agua. El ALA pirrolizado y el PBG
se midieron espectrofotométricamente a 553 nm, con un M = 6,1 x 104 nM-1.cm-1 para
el PBG utilizando el reactivo de Ehrlich, como describe Mauzerall & Granick (1956).
114
Materiales y Métodos
La recuperación del ALA, el PBG y las porfirinas por estos procedimientos
fueron 95, 98 y 90% respectivamente
3.5.1.2. Porfirinas urinarias de ratas
La orina se recolectó utilizando jaulas metabólicas y se determinaron las
porfirinas de acuerdo con la metodología de Piper et al., (1973) con modificaciones
(Wainstok et al., 1984)
La orina se homogeneizó y se mantuvo congelada hasta su evaluación realizada
con el uso de una columna de resina de intercambio Dowex 1.
Entre 0,3-1 ml de muestras de orina se utilizaron en cada determinación y se
eluyeron las porfirinas de la columna con 10% (p/v) de HCl
El contenido total de porfirinas fue determinado espectrofotométricamente
usando la corrección de la fórmula de Rimington & Sveinsson, (1950) para compensar
la absorción inespecífica de fondo. Para ello se hacen lecturas de absorbancia a 3
diferentes longitudes de onda, la del máximo de Soret (Amax), 380 y 430 nm y se calcula
la Acorr mediante las expresiones:
A= 2.Amax - (A380 + A430); Acorr = A/K
donde K es el factor de corrección. Para determinar K (1,844) se utilizaron
curvas de calibración para uroporfirinas y coproporfirinas en medio ácido. Los
coeficientes de absorción se utilizaron para calcular las porfirinas libres totales, como
valores medios (Tomio et al., 1970; Tomio & San Martín de Viale, 1972)
3.5.2. Determinación de parámetros de estrés oxidativo (QL)
La orina total se recogió empleando jaulas metabólicas durante las 16hs post
intoxicación en el caso de la intoxicación aguda, y 24 hs en el caso de las ratas
intoxicadas con HCB.
115
Materiales y Métodos
Las orinas así recolectadas se homogeneizaron y se mantuvieron congeladas
hasta la evaluación. El total de la quimioluminiscencia urinaria (QL) se midió como lo
describió Ríos de Molina et al., (1998).
Alícuotas de 1 ml de orina se centrifugan a 500 x g durante 10 min. En un
contador de centelleo líquido Beckman LS-3150P, operado en el modo out-offcoincidence, se realizó la cuantificación de QL, expresándola como CPM x 10-3 para el
volumen total de orina.
3.6 DETERMINACIONES PLASMÁTICAS
3.6.1. Contenido de glucosa plasmática
Los niveles de glucosa en ayunas en plasma, fueron determinados utilizando un
Kit enzimático de glucemia (Wiener Laboratorio, Rosario, Santa Fe, Argentina) tal cual se
lo utilizó en el trabajo de Mazzetti et al., (2004).
3.6.2. Determinación de insulina plasmática
La insulina normal plasmática se midió por radioinmunoensayo (RIA) a través
del método de Herbert et al., (1965). Se utilizó
125
I-insulina monoiodada de cerdo. El
antisuero de cobayo antiporcino contra insulina fue suficientemente inespecífico como
para permitir el desplazamiento de la insulina de rata.
Este antisuero mostró reactividad con insulina normal, pero no con proinsulina
o insulina glicosilada.
3.6.3. Determinación de corticosterona plasmática.
La sangre se centrifugó a 5.000 x g durante 10 minutos para obtener la fracción
plasmática. Las muestras de plasma se mantuvieron a -20 °C hasta el ensayo. Los
116
Materiales y Métodos
ensayos se realizaron usando un Kit
125
I-RIA para ratas y ratones de Biomedicals ICN.
(MP Biomedicals, Costa Mesa, CA., USA.)
Los niveles plasmáticos de corticosterona (CORT) se midieron mediante RIA
como se describió previamente (Gomez-Sanchez et al., 1975; Denari & Ceballos, 2005).
El plasma se extrajo dos veces con éter etílico, se evaporó y volvió a disolver en buffer
borato 100 mM, gelatina 0,1%, a pH 8,0.
Las pérdidas durante todo el procedimiento se calcularon en muestras paralelas
mediante la adición de [3H]-CORT. El antisuero contra CORT se utilizó en una dilución
final de 1:22,500. La reactividad cruzada con la aldosterona fue inferior a 0,1% (Gomez
Sanchez et al., 1975). La reactividad cruzada con otros esteroides fueron:
desoxicorticosterona (0,34%), testosterona (0,10%), progesterona (0,02%), y menos de
0,01% para todos los demás esteroides ensayados.
La sensibilidad del ensayo fue de 50 pg/ml. Coeficientes intra e inter-ensayo de
variación fueron menores de 8% y 12%, respectivamente. La concentración de la CORT
se ensayó por triplicado. CORT se expresa como microgramos de hormona por cada
100 ml de plasma (µg/100 ml).
3.7 DETERMINACIONES EN OTROS TEJIDOS
3.7.1. Determinación de la captación de glucosa en grasa parda, timo y bazo
La captación de la glucosa por estos otros tejidos (adiposo, timo y bazo) fue
medida usando un análogo de glucosa marcada no metabolizable, 3-O-(metil-d-3H-glu)
tal como lo se describe para el tejido hepático (Enan et al., 1992).
Una porción de 0,25g de tejido fue incubada en 1 ml de DMEM por 5 min a
37 °C, antes del agregado de 1 µCi de 3-O (metil-d-3H)-glucosa (2,5 ng por ensayo)
Luego de 30 min de incubación a 37°C, se determinó el transporte de glucosa,
removiendo el medio y lavando el tejido dos veces con 1 ml de DMEM helado. El tejido
117
Materiales y Métodos
se transfirió a un vial que contenía líquido de centelleo OptiPhase Hi-Safe 3, y la
radioactividad incorporada fue medida en un contador de centelleo Beckman.
El transporte de glucosa no específico y el binding fueron definidos como el
evento ocurrido en presencia de 1 µM de citocalasina B.
La captación de glucosa fue entonces calculada restando a los dpm totales
correspondientes a las muestras, los dpm de aquellas que contenían citocalasina B.
3.7.2. Determinación de insulina pancreática en islotes de Langerhans
Los islotes de Langerhans se obtuvieron a partir de páncreas de rata tratados con
colagenasa, de acuerdo con el método de Lacy & Kostianovsky (1967). La perfusión de
islotes se llevó a cabo de acuerdo con Burr et al., (1969) con ligeras modificaciones de
Basabe et al., (1986).
Fueron utilizados la totalidad de los islotes del páncreas de cada animal
(sacrificados en la 6ª semana de intoxicación con HCB y controles). Se realizaron
perfusiones de los islotes de Langerhans y a partir de ellos se cuantificó la secreción de la
insulina.
Para evaluar la secreción de insulina a partir de islotes pancreáticos perfundidos,
se integró el área bajo las curvas de la secreción. Las muestras de los minutos 1 y 2 se
utilizaron para la determinación de línea de base. Un estímulo de glucosa de 16,5 mM se
añadió al buffer de perfusión entre los minutos 3 y 40. El primer pico de secreción se
integró entre los 3 y 7 minutos, y el segundo pico entre los 8 y 40 minutos de perfusión.
Este experimento se llevó a cabo con los animales tratados con HCB en la 6ª semana vs
los animales controles.
Las muestras fueron recogidas después de un período de recuperación inicial de
15 min en tubos que contenían 0,2 ml de EDTA 0,25 M. Luego fueron de inmediato
congelados a -20 °C hasta su determinación con el método por inmunoensayo de Herbert
et al., (1965). En este ensayo, el uso del carbón-dextran 80 (peso molecular promedio),
permite la adsorción casi instantánea de la insulina libre, pero no así de la insulina unida a
118
Materiales y Métodos
su anticuerpo. El uso de este carbón revestido con dextrano, hace más sencillo y más
rápido el inmunoensayo en líquidos biológicos, donde se utilizan diferentes diluciones del
radioisótopo.
3.7.3. Determinación de corticosterona en glándulas adrenales .
Las glándulas suprarrenales se obtuvieron de animales controles y tratados con
HCB. Las ratas fueron adrenalectomizadas 48 hs antes de ser sacrificadas.
Primeramente se determinó el peso del animal y se administró una solución por vía
intraperitoneal de anestésico pentobarbital sódico (40 mg/kg p.c.). Se esperaron unos
minutos hasta completar el efecto esperado y con el animal anestesiado, se practicó una
incisión longitudinal en la piel y el tejido subcutáneo del dorso en una línea imaginaria
entre la última costilla y la columna, haciendo antes la asepsia de la región con solución
de iodo.
La glándula suprarrenal está ubicada generalmente en el lado anterior del
riñón, cerca de la grasa perirrenal. Utilizando una pinza anatómica se pellizcó y arrastró
la grasa perirrenal suavemente a través de la incisión. Con la ayuda de unas tijeras
delicadas de punta roma, se corta la grasa por debajo de la glándula suprarrenal y riñón,
procediendo a la separación de la misma. Las suprarrenales fueron rápidamente
colocadas en solución fisiológica enfriada en hielo. Durante la cirugía, se debe mantener
el tejido expuesto humedecido en solución salina. Los tejidos seccionados y la piel se
suturan con hilo, hasta cerrar la incisión. Se repitió el mismo procedimiento para la
ablación de la glándula contralateral.
Los animales fueron provistos durante las 48h siguientes con dos bebederos,
uno con agua y otro con solución fisiológica
Cada adrenal fue cortada en cuatro piezas aproximadamente iguales. El tejido
fue incubado en 2 ml de medio de Krebs-Ringer-glucosa que contiene Hepes 10 mM
(pH 7,4) en presencia y ausencia de 1 UI de ACTH.
Las incubaciones se llevaron a cabo a 37 °C con agitación continua en
atmósfera de aire y se detuvieron después de 1 h por el enfriamiento de las muestras
119
Materiales y Métodos
sobre hielo. Los medios de incubación fueron rápidamente separados y se almacenaron
a -20 °C hasta el momento de la determinación de corticosterona por RIA (GomezSanchez et al., 1975).
3.7.4. Determinación de Proteínas
La concentración de proteínas fue determinada de acuerdo con el método de
Lowry et al., (1951), para realizar los cálculos en cada ensayo mediante una curva con
albúmina de suero bovina (BSA).
La concentración de proteínas para el ensayo de proteínas carboniladas fue
determinada mediante una curva realizada con seroalbúmina bovina solubilizada en
clorhidrato de guanidina y leída a 280 nm junto con las muestras (Reznick & Paker,
1994).
3.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Los resultados se expresan como la media ± error estandar (E.S). Los
parámetros de binding, Kdapp y Bapp fueron obtenidos empleando el Programa de
ligandos (Software David Rodbard, NIH). Antes del análisis estadístico de los datos se
probaron la normalidad y la homocedasticidad con los test de Lilliefors y Bartlett,
respectivamente. Los datos no transformados fueron probados para los modelos de uno
o dos sitios.
Los datos en los estudios donde se analizó respuesta en el tiempo fueron
sometidos a análisis de varianza de una vía (ANOVA) y diferencias significativas entre
las medias por el test-F de Fisher, utilizando el Programa BioStat. En todos los casos, el
valor de 0,05 fue utilizado como nivel de significancia, por debajo del cual se rechazó la
hipótesis nula de igualidad.
Las comparaciones múltiples de medias entre grupos de tratamientos (post
ANOVA), fueron realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer, a través del Programa
BioStat, Multiple Comparisons Mode.
120
Resultados
4. RESULTADOS
4.1. MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA CRÓNICA POR HCB
Con el fin de caracterizar el modelo de porfiria hepática crónica por la
administración de HCB en ratas Wistar, y de establecer si este pesticida induce daño
hepático, se evaluaron las alteraciones producidas en diversos metabolismos (el de la
glucosa, hemo, TRP entre otros). Con tal propósito se investigó el efecto producido por
la administración de HCB a lo largo de las semanas subsiguientes a la intoxicación,
sobre diversos parámetros y en diferentes órganos y fluídos.
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO
EXPERIMENTAL?
4.1.1. Parámetros hepáticos y actividad enzimática clave del camino del hemo.
En roedores, el HCB produce inhibición de la actividad de la uroporfirinógeno
decarboxilasa (URO-D) y la consiguiente alteración del camino biosintético del hemo,
que se manifiesta bioquímicamente con la sobreproducción de porfirinas. En la
manifestación de estas características de la porfiria inducida por HCB, que semeja en
gran medida a una porfiria cutánea tarda (PCT), existe un tiempo de retardo típico.
Luego de realizar un esquema de 5 días de intoxicación con el xenobiótico, la
administración se discontinúa y los efectos de ésta se observan a lo largo de las
semanas, comenzando a ser notorios en algunos casos, pasada la 2ª semana y llegando a
acentuarse, más allá de la 9ª semana post tratamiento (más de 2 meses de interrumpida
la intoxicación).
Con el propósito de evaluar el impacto del HCB sobre la enzima del camino del
hemo que es clave en este tipo de porfiria, se midió el efecto del tratamiento sobre la
actividad hepática de la URO-D, que genera coproporfirinógeno (COPROgen) como
producto final de la decarboxilación, y cuya actividad es expresada como formación de
nmoles de COPROgen III/ mg. hora.
122
Resultados
Como puede verse en la Figura 4.1, el HCB promueve la disminución de la
actividad de URO-D, incluso desde la 2ª semana de tratamiento con un 43% de
inhibición comparado con su control (132 ± 6,2 vs 76 ± 3,1 nmol COPROgen/ mg. h) y
va creciendo a medida que el tiempo post-tratamiento progresa. La URO-D va
perdiendo dramáticamente su actividad (hasta un 90-95% de inhibición) entre la 5ª y 6ª
semana de intoxicación.
A su vez, las porfirinas (Figura 4.1) comienzan a acumularse en el hígado
durante la 3ª semana (7,3 ± 2,8 vs 3,2 ± 1,7 µg porfirinas/g hígado, como valor control).
Los niveles de porfirina se convierten en estadísticamente significativos respecto al
control durante la 5ª semana y alcanzan notables incrementos a partir la semana 6 (más
de 50 veces). Los animales tratados con HCB de acuerdo con el programa de
intoxicación discontinua, desarrollaron así una porfiria bien definida. De hecho, una
gran cantidad de porfirinas se acumularon en el hígado a la 6ª semana de la intoxicación
(2,9 ± 1,1 como valor control vs. 148 ± 12 µg /g de tejido fresco). Teniendo en cuenta
que estos parámetros bioquímicos son considerados como marcadores efectivos de la
inducción de porfiria y persistencia del HCB, se puede asegurar que este modelo
representa una porfiria crónica experimental del tipo PCT, de acuerdo a experiencias
anteriores en nuestro laboratorio (Billi de Catabbi et al., 2000;. Billi de Catabbi et al.,
2005).
4.1.2. Intermediarios del camino del hemo en orina. Determinación de porfirinas.
El análisis de las porfirinas totales en la orina de ratas tratadas con HCB (3 ±
0,82 µg/ 24 h, como valor control promedio) mostró un aumento de 15 veces y hasta
aproximadamente 50 veces entre la 4ª y 8ª semana respectivamente (Figura 4.2). Este
importante incremento de la excreta de porfirinas indica que, una verdadera porfiria se
desarrolla en los animales tratados con HCB. Tanto las porfirinas hepáticas como
urinarias, presentaron un máximo de absorción de 406-407nm en la banda de Soret,
indicativo de porfirinas altamente carboxiladas (8- y 7-COOH).
123
Resultados
Porfirinas (mg/g hígado)
160
90
Porfirinas
Actividad URO-D
75
140
120
60
100
45
80
60
30
40
20
15
0
0
Control
2da
3ra
5ta
Actividad URO-D (nmol COPROgen/h.mg)
180
6ta
Tiempo (semanas)
Figura 4.1 Efecto de hexaclorobenceno (HCB) sobre la uroporfirinógeno decarboxilasa hepática
(URO-D) a lo largo del tiempo post-intoxicación, y en paralelo, el contenido de porfirinas hepáticas. La
actividad URO-D se expresa como nmol COPRO´gen/mg proteínas.hora y el contenido de porfirinas
como µg porfirinas/g hígado fresco. Cada barra representa la media ± E.S. de diez animales. Los
detalles experimentales se describen en la sección 3, Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a
análisis de varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F
(Fisher)
Diferencias significativas respecto a los valores del grupo control (P <0,05)
La Figura 4.2 muestra también que la intoxicación por HCB fue eficaz y que la
acumulación de porfirinas una vez que se inicia, continúa en aumento durante varias
semanas después de terminado el tratamiento.
124
Resultados
160
Porfirinas urinarias (µg/24 hs)
control
140
HCB
120
100
80
60
40
20
0
2da
4ta
6ta
8va
Tiempo (semanas)
Figura 4.2. Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la concentración de porfirinas en orina a lo
largo del tiempo post intoxicación. Cada barra representa la media ± E.S. de seis animales. La
concentración se expresa como µg de porfirinas altamente carboxiladas/ 24 h. Los detalles
experimentales se describen en la sección 3, Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de
varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F (Fisher)
Diferencias significativas respecto a los valores del grupo control (P <0,05)
EN BUSCA DE ALTERACIONES PROVOCADAS SOBRE EL METABOLISMO DE LA
GLUCOSA EN ESTA PCT EXPERIMENTAL
4.1.3. Niveles plasmáticos de glucosa y contenido de glucógeno hepático.
El nivel de glucosa en plasma muestra una importante disminución a causa del
tratamiento con HCB (7,8 ± 0,62 nmol glu/l, como valor control promedio) y es
estadísticamente significativo ya en la 3ª semana, alcanzando los valores más bajos
(40% de pérdida) en el tiempo más crítico posterior al drogado, que se visualiza en la
Figura 4.3, durante la 6ta semana.
125
Resultados
9
Control
HCB
Glucosa plasmática
(mmol glucosa/l)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
Tiempo (semanas)
Glucógeno hepático
(µmol glu/g tejido hepático)
Figura 4.3: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la concentración de glucosa plasmática a lo
largo del tiempo. Cada punto en los gráficos representa la media ± E.S. de diez animales. La
concentración se expresa como mmol de glucosa/ litro. Los detalles experimentales se describen en la
sección 3, Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y las
diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F (Fisher)
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Control
HCB
0
2
4
Tiempo (semanas)
6
8
Figura 4.4: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre el contenido de glucógeno hepático a lo largo
del tiempo. Cada punto en los gráficos representa la media ± E.S. de diez animales. La concentración se
expresa como µmol de glucosa/ g tejido hepático. Los detalles experimentales se describen en la sección
3, Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y las
diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F (Fisher)
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
126
Resultados
El HCB afectó también de manera significativa el contenido de glucógeno
hepático (3,9 ± 0,81 µmol glu/g tejido como valor control promedio), promoviendo una
acumulación del polisacárido desde la 2ª semana post-tratamiento y alcanzando en la 6ª
semana, valores de más de tres veces respecto al control (Figura 4.4).
4.1.4. Actividades enzimáticas del metabolismo de la glucosa
Los índices de la gluconeogénesis y la glucólisis, se pueden estimar por ejemplo,
midiendo la actividad de las enzimas claves de ambas vías: PEPCK, PC y G6Pasa para
la gluconeogénesis y PK como ejemplo de enzima clave del último paso de la vía
glucolítica.
Como primer paso, las actividades de las enzimas gluconeogénicas (PEPCK, PC,
y G6Pasa) se determinaron en los hígados de las ratas con o sin período de ayuno de 24
h. En la Tabla IV.1, se muestra claramente que las ratas Wistar hembras utilizadas a lo
largo de estos experimentos, exhiben un 40-60% de aumento en las actividades
enzimáticas con un período de 24 h de inanición.
Tabla IV.1. Respuesta de las actividades de enzimas gluconeogénicas al ayuno
PC(a)
Estado
mmol/min.mg)
Sin ayuno
Ayuno 24 h
PEPCK (a)
G6Pasa(a)
(nmol/min.mg)
mmol/min.mg)
0,135±0,028
8,01±0,46
0,353±0,031
0,210±0,038*
11,12±0,84*
0,574±0,033*
Tabla IV.1 (a) Los resultados son expresados como las medias ± ES de cinco animales en cada grupo.
Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se
realizaron por el Test-F
* Diferencia significativa respecto a las no ayunadas, P<0.05
Por otra parte, la actividad específica de PEPCK exhibe una disminución
dependiente del tiempo, como consecuencia de la intoxicación por HCB (Figura 4.5).
127
Resultados
Los resultados muestran que la inhibición alcanzada de la enzima es de alrededor del
55% en la 5ª semana de tratamiento post-fungicida (promedio grupo control: 10,57 ±
0,84 mol NADHox/min.mg proteína), momento en que las porfirinas se acumulan
notablemente en el hígado (Figura 4.1).
Asimismo el HCB promueve una disminución precoz de la actividad específica
de PC (Figura 4.6), que se profundiza, avanzando en el tiempo transcurrido posttratamiento (promedio grupo control: 0,22 ± 0,04 mmol NADHox/min.mg proteína).
Una pérdida de hasta un 60% de esta actividad enzimática, se observa en períodos de
tiempo más largos.
Actividad PEPCK (mol/min.mg proteína)
14
12
control
HCB
10
8
6
4
2
0
2da
3ra
5ta
Tiempo (semanas)
6ta
Figura 4.5: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la actividad de la fosfoenol-piruvato
carboxiquinasa (PEPCK) hepática a lo largo del tiempo.
Cada barra representa la media ± E.S. de diez animales. La actividad se expresa como nmol de NADH
oxidado/min. mg proteína (realizado por reacción acoplada). Los detalles experimentales se describen en
la sección 3, Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y
las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
128
Resultados
Siguiendo con el estudio de las enzimas gluconeogénicas, la intoxicación con el
xenobiótico, muestra una inhibición temprana de la actividad específica de la G6Pasa
Actividad de PC hepática (mmol/min.mg)
0,3
control
HCB
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
2da
3ra
5ta
6ta
Tiempo (semanas)
Figura 4.6: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre las actividad de la enzima piruvato carboxilasa
hepática (PC) a lo largo del tiempo.
Cada barra representa la media ± E.S. de diez animales. La actividad se expresa como µmol de NADH
oxidado/min. mg proteína (para el sistema por acoplamiento). Los detalles experimentales se describen
en la sección 3, Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA
y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
donde en la 2ª semana se aprecia un 25% de inhibición (Figura 4.7). Este efecto se
mantiene constante hasta la 5ª semana. A partir de entonces, se calcula una pérdida aún
mayor de dicha actividad gluconeogénica (37%) cuando las ratas mostraron estar
claramente porfíricas (promedio grupo control: 0,57 ± 0,04 mmol Pi/min.mg proteína).
Pasando al camino de degradación de la glucosa, la actividad específica de la PK
no se vio afectada de manera significativa (Figura 4.8) en los tiempos post-tratamiento
129
Resultados
ensayados (promedio grupo control: 0,55 ± 0,15 mmol NADH oxidado/min.mg proteína;
promedio grupo tratado con HCB: 0,53 ± 0,14 mmol NADH oxidado/min.mg proteína)
control
Actividad de G6Pasa hepática
(mmol/min.mg proteína)
0,7
HCB
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
2da
3ra
5ta
6ta
Tiempo (semanas)
Figura 4.7: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la actividad de la enzima glucosa 6-fosfatasa
hepática (G6Pasa) a lo largo del tiempo.
Cada barra representa la media ± E.S. de diez animales. La actividad se expresa como µmol de fosfato
inorgánico/min. mg proteína. Los detalles experimentales se describen en la sección 3, Materiales y
Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre las
medias se realizaron por el Test-F
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
Los resultados muestran que las actividades de las tres enzimas gluconeogénicas
disminuyen en respuesta al tratamiento con HCB (30 a 55% para PEPCK, 31 a 42%
para G6Pasa, y el 50% para PC). La actividad PEPCK disminuyó en todas las semanas
del tratamiento así como la G6Pasa, mientras que la actividad de la PC se redujo a partir
de la 5ª semana de tratamiento. La enzima de la glucólisis PK, no mostró diferencias
130
Resultados
significativas entre las actividades de los dos lotes de animales en cualquiera de los
tiempos medidos.
control
0,7
HCB
Actividad de la PK hepática
(mmol/min.mg)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
2da
3ra
5ta
6ta
Tiempo (semanas)
Figura 4.8: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la actividad de la enzima piruvato quinasa
hepática (PK) a lo largo del tiempo.
Cada barra representa la media ± E.S. de diez animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. La actividad se expresa
como µmol de NADH oxidado/min. mg proteína. Los detalles experimentales se describen en la sección
3, Materiales y Métodos.
¿EXISTIRÁ VARIACIÓN EN LA CAPTACIÓN DE GLUCOSA DE RATAS TRATADAS
CON HCB, EN LOS DIVERSOS TEJIDOS ESTUDIADOS?
4.1.5. Perturbaciones del transporte de glucosa en órganos y tejidos.
Con el fin de analizar si la intoxicación producida por HCB generaba alguna
alteración en la absorción de glucosa, dado que esta alteración se había informado para
otros compuestos clorados con capacidad porfirinogénica similar al HCB (por ejemplo
131
Resultados
para el 2-3-7-8-tetraclorodibenzo-p-dioxina; TCDD), la captación de 3-O-metil-3H-Dglucosa fue medida a diferentes tiempos post-tratamiento en diversos órganos de ratas
tratadas con HCB y de ratas control.
4.1.5.1. Captación de glucosa por el tejido hepático
Como se describe en la Figura 4.9, los animales tratados con HCB mostraron
una menor captación de glucosa por el hígado en comparación con los controles
(promedio grupo control: 430 ± 57 pg/g hígado.30 min), con descensos a lo largo de
todas las semanas estudiadas. La disminución observada desde la 3ª a la 9ª semana fue
estadísticamente significativa (50% respecto al control).
4.1.5.2. Captación de glucosa por otros tejidos: grasa parda, timo y bazo
Para el estudio de posibles alteraciones en la absorción de glucosa por otros
tejidos distintos del hígado, la captación de glucosa se midió en la grasa abdominal,
timo y bazo. Los resultados en la Figura 4.10 mostraron que la absorción de glucosa en
el tejido adiposo de ratas tratadas con HCB aumentó ligeramente en la semana 5 y
también posteriormente, siendo los incrementos más importantes observados entre la 7ª
y 9ª semana con aproximadamente un 75 y 125% de incremento respectivamente
(promedio grupo control: 110 ± 12 pg/g hígado.30 min).
En el caso del timo y bazo, por el contrario, la captación de glucosa fue muy
baja en los animales tratados con HCB en todos los tiempos ensayados. Los niveles
disminuyeron de 40 a 70% en el timo (promedio grupo control: 142 ± 15 pg/g hígado.30
min; Figura 4.11) y de 40 a 60% en el bazo (promedio grupo control: 111 ± 13 pg/g
hígado.30 min; Fig. 4.12).
132
Resultados
Control
HCB
Captación de 3-O- 3H-metil Glu
(pg/g hígado/30 min)
600
500
400
300
200
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (semanas)
Figura 4.9: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la incorporación de glucosa marcada
radioactivamente en tejido hepático a lo largo del tiempo.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. La captación se
expresa como pg 3-O-(metil-3H-glucosa) incorporada/(g tejido. 30 min). Los detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
133
Captación de 3-O- 3H-metil Glu (pg/g grasa/30min)
Resultados
250
Control
HCB
200
150
100
50
0
0
1
2
3
4
5
6
Tiempo (semanas)
7
8
9
Fiura. 4.10: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la incorporación de glucosa en tejido graso,
marcada radioactivamente a lo largo del tiempo.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. La captación se
expresa como pg 3-O-(metil-3H-glucosa) incorporada/ (g tejido. 30 min). Los detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
134
Resultados
Control
HCB
Captación de 3-O-metil 3H-Glu
(pg/g timo/30 min)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (semanas)
Figura 4.11: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la incorporación de glucosa marcada
radioactivamente en timo a lo largo del tiempo.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. La captación se
expresa como pg 3-O-(metil-3H-glucosa) incorporada/ (g tejido. 30 min). Los detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
135
Resultados
Control
HCB
Captación de 3-O- 3H-metil Glu
(pg/g bazo/30 min)
140
120
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (semanas)
Figura 4.12: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la incorporación de glucosa marcada
radioactivamente en bazo a lo largo del tiempo.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. La captación se
expresa como pg 3-O-(metil-3H-glucosa) incorporada/ (g tejido. 30 min). Los detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05).
¿HAY CAMBIOS EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO DEBIDOS A LA ACCIÓN
DEL HCB?
4.1.6. Metabolismo del glucógeno. Niveles y actividades enzimáticas de síntesis y
degradación.
4.1.6.1 Contenido hepático de glucógeno
Con el objeto de determinar si el HCB es capaz de producir alteraciones en el
contenido hepático de glucógeno, la concentración de este polisacárido fue medida en
136
Resultados
hígado de ratas tratadas con HCB a diferentes tiempos. La Figura 4.13 muestra un ligero
incremento de los niveles de glucógeno en ratas tratadas con HCB. Aun cuando esa
diferencia no fue muy importante durante la primera etapa del tratamiento (3ra a 5ta
semana), fue siendo cada vez más y más significativa en las siguientes semanas. Así el
incremento de los niveles de glucógeno en el lote de ratas tratadas con HCB fue 2,5
veces mayor que las ratas control en la semana 7 y llegó a 3 veces en la semana 9 post
intoxicación (grupo control: 3,9 ± 1,2 vs 12,2 ± 2,3 µmol glu/g hígado).
4.1.6.2. GS – Síntesis del glucógeno
Los niveles de las enzimas que son responsables de la degradación y la síntesis
del glucógeno (glucógeno fosforilasa, GP y glucógeno sintetasa, GS) se determinaron
con el fin de dilucidar si el tratamiento con HCB produce cambios en estas actividades
enzimáticas, teniendo en cuenta el aumento de los niveles de glucógeno (Figura 4.13).
Los efectos del HCB sobre la actividad de GS se muestran en la Figura 4.14. Un
aumento de la actividad enzimática se puede observar desde la 5ª a la 9ª semana, en la
que los valores de ratas tratadas con HCB fueron 3-4 veces más altos que los del grupo
control (grupo control: 4,2 ± 1,2 vs 16,1 ± 2,3 nmol UDP/g hígado.min).
Por otro lado, una ligera disminución se detectó en las semanas 7ª y 9ª con
respecto a la 5ª, pero la actividad se mantuvo todavía muy aumentada (3 veces)
respecto al control.
Este aumento correlaciona ligeramente con el contenido de glucógeno
observado en las ratas tratadas con HCB, ya que el aumento del glucógeno es
importante a partir del 7ª semana, mientras que el aumento de la actividad de la GS es
importante a partir de la 5ª semana.
137
Glucógeno hepático (mmol glu/g hígado)
Resultados
16
Control
HCB
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (semanas)
Figura 4.13: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre el contenido de glucógeno hepático a lo largo
del tiempo transcurrido post-intoxicación.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. El contenido hepático
de glucógeno fue aislado por precipitación con etanol y se cuantificó por la reacción de fenol-acido
sulfúrico. Los detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos. Los datos se
expresaron como µmoles de glucosa/ g de hígado
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
4.1.6.3. GP - Degradación del glucógeno
La actividad de la glucógeno fosforilasa (GP), enzima responsable de la
degradación del glucógeno en respuesta a la intoxicación con la droga se muestra en la
Figura 4.15. Se puede observar que la actividad enzimática en el hígado de animales
tratados con HCB siempre es marcadamente menor que en los controles en todo el
tiempo ensayado, y que la reducción en los niveles de su actividad enzimática era
variable en los diferentes tiempos. La reducción de la actividad fue estadísticamente
138
Resultados
20
Control
HCB
Glucógeno Sintetasa
(mol UDP/g hígado/min)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (semanas)
Figura 4.14: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la actividad de GS a lo largo del tiempo
transcurrido post-intoxicación.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. Los datos se sometieron a análisis de varianza
de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. La actividad GS fue
determinada usando UDP-glu como sustrato y midiendo la cantidad de UDP liberado en el ensayo de
P.K. Los detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
Los datos se expresaron como nmoles de UDP liberado /g de hígado/min
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
significativa durante las semanas 5, 7 y 9 (75%) respecto a los valores del grupo control
(4,8 ± 0,8 vs 1,2 ± 0,6 nmol Pi/g hígado.min). Las Figuras 4.14 y 4.15, muestran el
aumento de la actividad GS y la disminución de la actividad de la GP, lo que podría
explicar el aumento en el contenido de glucógeno (como ya se observó en la Figura
4.13).
139
Resultados
8
Control
HCB
Glucógeno Fosforilasa
(nmol Pi/g hígado/min)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo (semanas)
Figura 4.15. Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la actividad de la glucógeno fosforilasa
hepática en el tiempo transcurrido post-intoxicación.
Cada punto representa la media ± E.S. de seis animales. La actividad GP fue determinada como el
fosfato liberado (Pi) a partir de la glucosa-1-P y el glucógeno usando como fuente enzimática
sobrenadante de 2.000 x g de los correspondientes homogenatos. Los detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una
vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. Los datos se expresaron como
nmoles de Pi /g de hígado.min.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
EN BUSCA DE LAS CAUSAS DEL DESCENSO DE LA PEPCK Y LA GP: ¿SE DEBERÁ A
INTERFERENCIAS EN EL SISTEMA REDOX?
4.1.7. Parámetros de estrés oxidativo- Producción de ROS.
Teniendo en cuenta: 1) que se ha propuesto que el HCB puede actuar como una
droga soluble en lípidos que se une a los citocromos y que no es rápidamente
140
Resultados
metabolizada, desacoplando así la cadena de transporte de electrones de la actividad
mono-oxigenasa y consecuentemente favoreciendo la producción de especies de
oxígeno reactivas (ROS) (Ferioli et al., 1984); 2) que las ROS son capaces de oxidar
lípidos, proteínas, hidratos de carbono o ácidos nucleicos, inactivando funciones
celulares claves (Halliwell & Gutteridge, 1999); 3) que se ha reportado que la
quimioluminiscencia urinaria espontánea puede constituir un método rápido, simple y
sensible para evaluar disturbios asociados con estrés oxidativo (Ríos de Molina et al,
1998); se midieron en los lotes tratados con HCB y en los controles, peroxidación
lipídica en hígados y quimioluminiscencia espontánea en orinas, para evaluar estos
parámetros de estrés oxidativo en este modelo experimental y poderlos relacionar con
las alteraciones producidas en el metabolismo de los hidratos de carbono.
4.1.7.1. Peroxidación lipídica en tejido hepático
Como puede verse en la Tabla IV.2, la peroxidación de los lípidos medida a
través del contenido de malondialdehido (MDA), aumentó como resultado del
tratamiento con el fungicida a cada tiempo ensayado, tanto en homogenato como en la
fracción microsomal hepática. Estos niveles de aumento en la 2ª semana, se mantienen
altos en las semanas intermedias, y muestran un fuerte incremento al final del tiempo
medido, posterior a la intoxicación con HCB. Dichos incrementos observados en la
semana 6ª fueron de 65 % y de 400% para homogenato y microsomas respectivamente.
Es de destacar que todos los valores obtenidos para los animales tratados en todas las
semanas y en las 2 fracciones subcelulares fueron estadísticamente superiores a los
controles (220,6 nmol MDA/g.h para homogenato hepático y 22,4 nmol MDA/g.h para
fracción microsomal hepática).
141
Resultados
Tabla IV.2
Tratamiento
Tiempo
(semanas)
Control
Efecto hexaclorobenceno (HCB) sobre el contenido de
malondialdehído (MDA) en el tiempo.
MDA en homogenato
MDA en fracción microsomal
(nmol de MDA /g hígado.h)
(nmol de MDA / mg proteínas.h)
220,6 ± 13,8..
22,4 ± 3,4..
2
249,4 ± 15,3*
30,0 ± 5,6*
3
254,5 ± 12,1*
35,5 ± 2,6*
5
278,8 ± 12,5*
37,3 ± 1,0*
6
363,5 ± 41,2*
111,9 ± 24,6*
Tabla .IV.2. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre
las medias se realizaron por el Test-F. Los resultados se expresan como la media ± E.S. de diez animales
en cada grupo.
Quimoluminiscencia urinaria diaria
(cpm totales x 10-3)
* Diferencia significativa respecto al grupo de animales control, p <0,05.
350
300
CONTROL
HCB
250
200
150
100
50
0
2da
3ra
4ta
6ta
Tiempo (semanas)
Figura 4.16. Eefecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la quimioluminiscencia urinaria diaria en
las semanas ensayadas.
Cada punto representa la media ± E.S. de diez animales. Los detalles experimentales se describen en la
sección 3 Materiales y Métodos. Los datos se sometieron a análisis de varianza de una vía ANOVA y las
diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F. Los datos se expresaron como cpm totales x 10-3
(en los ml totales de orina diaria).
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
142
Resultados
4.1.7.2. Quimioluminiscencia urinaria
Las mediciones de quimioluminiscencia urinaria total diaria (Figura 4.16)
muestran que este parámetro crece en función del tiempo luego del tratamiento con
HCB en el grupo de animales tratados. Todos los aumentos son estadísticamente
significativos respecto de los controles (valor control medio: 71,7 cpm x 10-3) a partir de
la 2ª semana, donde los valores de los animales tratados superan al doble el de los
animales control. En la 6ª semana, estos aumentos superan en 4 veces a los del control.
¿EXISTEN ALTERACIONES DEL ESTADO HORMONAL QUE REGULA EL
METABOLISMO DE LA GLUCOSA? ESTUDIOS SOBRE GC E INSULINA.
Teniendo en cuenta que el tratamiento con HCB produce un bloqueo de la
PEPCK y de la GP (Figuras 4.5 y 4.14); que la PEPCK está regulada positivamente por
GC y negativamente por insulina; que GP está activada por glucagón y epinefrina
mientras que insulina disminuye su actividad; pareció interesante estudiar el efecto de la
droga porfirinogénica HCB sobre los niveles plasmáticos de insulina y sobre el patrón
de secreción pancreática de esta hormona proteica estimulada por glucosa, así como
sobre el nivel plasmático de GC, el número y afinidad de los receptores hepáticos de GC
(GR) y sobre la biosíntesis de GC en tejido adrenal con el objeto de encontrar las causas
potenciales de los decrementos de PEPCK y GP a través de sus moduladores
hormonales que llevarían a una menor disponibilidad de glucosa en el hepatocito.
4.1.8. Determinación del nivel de insulina en plasma y secreción pancreática.
Como puede verse en la Figura 4.17, los animales tratados con HCB mostraron
niveles de insulina plasmática menores (2-4 veces menos) que los animales del grupo
control (promedio grupo control: 22,1± 2 µU/ml plasma)
La disminución en el nivel plasmático de dicha hormona se incrementa a medida
que la intoxicación con HCB se hace más evidente (Figura 4.17).
143
Resultados
El HCB no parece afectar de forma significativa la secreción de insulina de
islotes pancreáticos de Langerhans, perfundidos y estimulados con glucosa, ensayados
durante las semanas 3 y 6 del tratamiento. Los islotes perfundidos mostraron un patrón
bifásico de secreción de insulina similar, tanto para los animales del grupo control como
para aquellos tratados, como puede verse en la Fig.4.18, donde se muestra el patrón de
secreción de animales ensayados en la 6ª semana. A pesar de que la diferencia no fue
estadísticamente significativa, los datos provenientes de animales tratados con HCB se
mantuvieron, en general, ligeramente por debajo que los de animales controles.
Control
HCB
Insulina plasmática (mU/ml)
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo (semanas)
Figura 4.17: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre los niveles de insulina plasmática en las
semanas ensayadas.Cada punto representa la media ± E.S. de diez animales luego de transcurridos los
diferentes tiempos post tratamiento. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3
Materiales y Métodos. Los datos se expresaron como µU/ml plasma. Los datos se sometieron a análisis
de varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el F-Test
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
144
Resultados
Secreción insulina (mU/min.islote)
8
Control
HCB
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
Tiempo (minutos)
Figura 4.18: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre la curva de secreción de insulina de los islotes
pancreáticos de Langerhans de ratas, perfundidos y estimulados con glucosa (ensayados durante la 6ta
semana). Cada punto representa la media de las determinaciones de insulina ± E.S. de diez animales en
cada punto del tiempo, después del estímulo con la glucosa. Las muestras de los minutos 1 y 2 fueron
utilizadas para la determinación de la línea de base. Un estímulo de 16,5 mM de glucosa se añadió al
tampón de perfusión entre los 3 y 40 minutos. El primer pico secretor fue integrado entre los 3 y 7
minutos, y el segundo pico entre los 8 y 40 minutos de perfusión. Este experimento fue llevado a cabo con
los islotes de animales tratados con HCB en la semana 6. Otros detalles experimentales se describen en
la sección 3 Materiales y Métodos. Los datos se expresaron como µU/min.islote. Los análisis estadísticos
en los datos de secreción de insulina fueron estudiados a través de ANOVA y su significancia con el Test
de Scheffe
4.1.9. Glucocorticoides plasmáticos (CORT), receptores (GR) y síntesis adrenal
4.1.9.1 Concentración de corticosterona plasmática vs. Porfirinas.
Con el fin de determinar si el HCB es capaz de producir alteraciones en el
contenido de glucocorticoides (GC) en coincidencia con el inicio de la porfiria, la
concentración de corticosterona (CORT) se midió en el plasma de ratas tratadas con
HCB y ratas control a diferentes tiempos (2, 4, 6 y 8 semanas) en paralelo con la
determinación del contenido de porfirinas urinarias ya mostradas en la Figura 4.2.
145
Resultados
El análisis de la orina de ratas tratadas con HCB mostró un importante
incremento de la excreta de porfirinas desde la 4ta a la 8va semana (40-130 µg/orina
24h respecto de los valores control: 2-4 µg/orina 24h), lo que indica una significativa
porfiria desarrollada en los animales tratados con HCB. Con ello se demuestra también
que la intoxicación por HCB fue eficaz y que la acumulación de porfirinas una vez que
se inicia, continúa en aumento durante varias semanas después de terminado el
tratamiento.
La Figura 4.19, muestra que después del tratamiento con HCB, a las 2
semanas se puede observar una caída significativa en el nivel plasmático de CORT
(disminución del 23%) en comparación con los animales tratados con vehículo (valor
medio controles: 12,4 ± 0,4 µg/100 ml plasma). Esta reducción en los valores
plasmáticos de CORT alcanza el máximo después de la 4ª semana (58%),
permaneciendo constante a partir de ésta, hasta la 8ª semana.
4.1.9.2 Análisis del número y afinidad de los GR hepáticos.
Para analizar el efecto del tratamiento con HCB sobre la respuesta hepática a los
GC, el número y la afinidad de los GR fue analizada en cada condición experimental.
La Tabla IV.3 describe cómo el tratamiento HCB produce una pérdida rápida y
significativa en el número de GR citosólicos. También muestra que la afinidad de los
receptores de glucocorticoides (GR, Kdapp) permanece constante durante todo el
tratamiento, mientras que el número de sitios de binding (Bapp) disminuye
significativamente desde la 2ª (16%), a la 4ª (40%), y a la 8ª (52 %) semana en
comparación con los animales control.
146
Resultados
control
HCB
Nivel de corticoides en plasma
(mg/100ml)
14
12
10
8
6
4
2
0
2da
4ta
6ta
Tiempo (semanas)
8va
Fiura 4.19: Efecto del hexaclorobenceno (HCB) sobre los niveles de corticosterona plasmáticos en los
tiempos ensayados. Cada barra representa la media ± ES de determinaciones realizadas por duplicado
en cuatro animales. Los niveles de CORT plasmáticos fueron medidos por RIA. Los datos se sometieron a
análisis de varianza de una vía ANOVA y las diferencias entre las medias se realizaron por el Test-F
Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos. Los datos se expresan
como µg CORT/ 100 ml de plasma.
Diferencias significativas respecto a valores de ratas control (P <0,05)
Tabla IV.3 -Parámetros de afinidad y “binding” de los receptores de GC (GR)
Semana
2
4
8
Grupo
Control
Kdapp
3,24± 0,02
HCB
3,35± 0,26
Bapp
523,1± 4,3
453,9± 23*
Control
3,31± 0,03
533,0± 19
HCB
Control
3,58± 0,33
3,50± 0,39
332,2± 14*
HCB
3,42± 0,59
267,9± 12*
567,1± 8,9
Tabla IV.3: Los parámetros de “binding” (Bapp), fueron obtenidos por desplazamiento de la [ 3H]-DEX
(1,25nM) de pegado específico, con diferentes concentraciones de DEX no marcada radioactivamente
(0,5 a 100nM). Las experiencias fueron desarrolladas con un rango de entre 400-600µg de proteínas
citosólicas en buffer GR. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y
Métodos. Los valores representan la media de determinaciones por triplicado realizadas en cuatro ratas
por grupo ± E.S. Los Kdapp y Bapp fueron calculados usando un programa de ligandos. El Kd app fue
expresado en 10-10 M y el Bapp en fmol/mg proteína.
*Diferencias significativas respecto a valores de ratas control, p<0,05.
147
Resultados
ESTUDIANDO LA RAZÓN DE LA CAÍDA EN LA CONCENTRACIÓN DE CORT POR
EFECTO DEL HCB. ¿SERÁN DEBIDOS A DEFECTOS EN SU SÍNTESIS ADRENAL?
Con el fin de comprobar si la disminución en el CORT plasmático podría
deberse a un daño en la producción de CORT por la glándula suprarrenal, se estudió la
biosíntesis de CORT en presencia y ausencia de ACTH. La Tabla IV.4 muestra que, de
la 4ª semana en adelante, la capacidad de biosíntesis basal de las glándulas suprarrenales
de los animales intoxicados con HCB está notablemente disminuida (46% y 51% en las
semanas 4 y 8, respectivamente).
Tabla IV.4 - Producción de CORT basal y estimulada con ACTH, en adrenales
Tratamiento
CORT (pg/ml)
Semana
2
4
8
Grupo
Control
-ACTH
135± 24
+ACTH
945± 61
HCB
Control
HCB
Control
141± 38
158± 44
86± 23*
149± 42
923± 39
998± 41
679± 42*
1012± 82
HCB
73± 15*
457±56*
Tabla IV.4: Las adrenales fueron obtenidas de los animales controles y de los tratados con HCB. El
tejido fue incubado en ausencia (-ACTH) y presencia de 1nM (+ACTH). Las incubaciones se llevaron a
cabo a 37°C y se frenaron luego de una hora por enfriamiento rápido. El medio fue inmediatamente
separado y guardado a -20°C hasta la determinación de CORT por RIA. Otros detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos. Los valores representan la media de experiencias por
duplicado realizadas con cuatro animales por grupo ± E.S.
* Diferencias significativas respecto a animales controles, p<0,05.
Un grado similar de deterioro (porcentajes semejantes de disminución)
provocado por el tratamiento con HCB, se observó en ensayos estimulados con ACTH.
Por otra parte se registraron los pesos de las glándulas suprarrenales y éstos no
fueron significativamente modificados [controles: 35,2 ± 1,3 mg; tratados con HCB:
36.7 ± 1,6 mg (8ª semana)] lo que sugiere que las diferencias en la producción de CORT
no son debidas a una disminución en el peso de las glándulas.
148
Resultados
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO EN ESTE MODELO
DE PCT EXPERIMENTAL POR HCB
Teniendo en cuenta que la administración de triptófano (TRP) resulta en
hipoglucemia y la presencia de sus metabolitos de las rutas serotoninérgica y
quinurenérgica dañan la gluconeogénesis y la formación de glucógeno (Veneziale et
al.,1967; Elliot et al.,1976; Smith and Pogson, 1977) y que una de las enzimas de la ruta
quinurenérgica es una hemoproteína; es decir, que hay interconexiones entre los
metabolismos del hemo, de los hidratos de carbono y del triptófano, se quisieron
investigar algunos aspectos del metabolismo del triptófano en relación a esta porfiria y
al metabolismo de la glucosa.
4.1.10. Contenido hepático de triptófano (TRP)
Las ratas controles exhibieron un contenido de TRP de 7,42 ± 0,61 µg/g de
hígado. Las ratas tratadas con HCB durante las semanas 2, 3 y 5 mostraron valores
similares de este compuesto indólico (7,98 ± 0,41 µg /g hígado) a los del grupo control
en hígado.
En tratamientos de HCB más largos (6-8 semanas) se advierte un aumento
moderado y estadísticamente significativo en los niveles del triptófano (10,55 ± 0,37
µg/g hígado), que supera los valores de control en aproximadamente el 20%.
4.1.11. Metabolitos hepáticos del TRP medidos por HPLC.
4.1.11.1. Cromatogramas de elución.
En las Figuras. 4.20 y 4.21 se muestran cromatogramas típicos de elución en
HPLC del triptófano y sus metabolitos de degradación en extractos de hígados
obtenidos de ratas normales (y/o porfíricas, sacrificadas durante las semanas 2, 3 y 5 de
intoxicación con HCB).
149
Resultados
Figuras 4.20 y 4.21. Dos diagramas de extractos de hígados corridos en HPLC, utilizando como fase
movil Acetato: Metanol en proporción 65:32 (ver descripción en el texto y en Materiales y Métodos)
Los tiempos de retención para los estándares en minutos fueron de: 9,71min
para la serotonina o 5-hidroxitriptamina (5-HT) y 13,75 min para el triptófano (TRP), en
tanto que el resto de los metabolitos [5-hidroxindolacético (5-HIAA), 5-hidroxitriptofol
(5-HTOL), quinurenina, etc.] no fueron señalados a través de estándares ni
determinados (n.d.). Las corridas mostradas en las figuras, se llevaron a cabo con fase
móvil compuesta de 10mM de acetato de sodio pH 4,5+ metanol, en una relación 65:35.
Los cálculos para 5-HT y TRP no mostraron variaciones significativas en los
tiempos ensayados para ratas intoxicadas con HCB vs ratas controles. Las ratas en
general (controles e intoxicadas con HCB por 2, 3 y 5 semanas) exhibieron un
contenido de TRP promedio de 7,983 ± 0,41 µg/g de hígado y de 5-HT promedio de
3,682± 0,11 µg/g de hígado. Estudios de nuestro laboratorio hechos en colaboración con
Llambías et al., (2003, 2004), muestran un moderado aumento en el contenido de TRP
hepático más alla de las 6 semanas de tratamiento con HCB (aproximadamente un 20%
de diferencia entre ratas tratadas vs controles).
150
Resultados
4.2. MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA POR AIA/DDC
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO
EXPERIMENTAL DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA?
4.2.1. Actividades enzimáticas y precursores del camino del hemo.
Los cambios en la biosíntesis de porfirinas fueron estudiados utilizando
diferentes dosis de AIA/DDC, para evaluar sus efectos sobre algunos parámetros claves
del metabolismo del hemo, en este modelo de intoxicación aguda. Por lo tanto, las
actividades de ALA-S (enzima regulatoria del camino) y FQ (enzima particularmente
afectada por acción del DDC), y el contenido de los precursores ALA y PBG en el
hígado fueron estudiados.
4.2.1.1 La actividad ALA-S es dosis dependiente
Para la determinación de las siguientes actividades se utilizó un esquema de
drogado de animales, que brevemente se describe a continuación, y se puede ampliar
consultando la sección 3 de Materiales y Métodos.
Los animales fueron inyectados por vía subcutánea (s.c.) con tres dosis
diferentes de AIA y por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis única de DDC,
resultando en los siguientes grupos: grupo L (100 mg AIA + 50 mg de DDC/kg de peso
corporal), grupo M (250 mg AIA + 50 mg de DDC/kg de peso corporal), y grupo H
(500 mg AIA + 50 mg de DDC/kg de peso corporal). El grupo control (grupo C) sólo
recibió los vehículos: solución fisiológica, sc. y aceite de maíz, ip. Otros detalles
experimentales se describen en la sección 3.
Como puede verse en la Figura 4.22, la administración de AIA/DDC aumenta la
actividad de ALA-S hasta en un 300% en el grupo H (500 mg de AIA + 50 mg de
DDC/kg de peso corporal), y este aumento es estadísticamente diferente a los grupos C
(control), L (100 mg AIA + 50 mg de DDC/kg de peso corporal) y M (250 mg de AIA +
50 mg de DDC/kg de peso corporal). El valor medio de ratas controles es de 23,4 ± 4
µmol ALA/mg.h.
151
Resultados
ALA-S (mmol/mg proteína.h)
120
100
80
60
40
20
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.22 - Efecto del tratamiento con AIA/DDC sobre la actividad de ALA-S de acuerdo a las dosis
de AIA utilizada. El desarrollo de la porfiria fue estimado midiendo la actividad de la enzima ALA-S.
Los animales fueron inyectados por vía subcutánea (sc) con tres dosis diferentes de AIA y por vía
intraperitoneal (ip) con una dosis única de DDC, resultando en los siguientes grupos: L (100 mg AIA +
50 mg de DDC/kg de peso corporal), M (250 mg AIA + 50 mg de DDC/kg de peso corporal), y H (500
mg AIA + 50 mg de DDC/kg de peso corporal). El grupo control (grupo C) sólo recibió los vehículos:
solución fisiológica, sc. y aceite de maíz, ip. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3
Materiales y Métodos. La actividad ALA-S, se expresa como µmol/ mg de proteína. hora. Los valores
representan la media de experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S. Las
comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de TukeyKramer.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C
P <0,05 es significativamente diferente del grupo L.
4.2.1.2 Actividad Ferroquelatasa (FQ)
Por otro lado, teniendo en cuenta que el DDC afecta particularmente la actividad
de la enzima que sintetiza hemo a partir de hierro y PROTO IX, fue medida la actividad
de la FQ. Como era de esperar, dado que la dosis de DDC inyectada fue fija para todos
los grupos tratados, la actividad de esta enzima disminuyó alrededor del 50% en todos
ellos, con respecto al control (1,34 ± 0,2 nmol hemo/mg prot.h) (Figura 4.23)
152
Resultados
FQ (nmol hemo/mg proteína.h)
2
1,6
1,2
0,8
0,4
0
C
L
M
H
Figura 4.23: Efecto del tratamiento con AIA/DDC sobre la actividad de ferroquelatasa (FQ) de
acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal cual se describe en la Fig. 4.22.
Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos. La actividad
ferroquelatasa, se expresa como nmol de hemo/ mg de proteína. hora Los valores representan la media
de experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S. Las comparaciones
múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
4.2.1.3 Contenidos hepáticos de ALA y PBG dosis dependiente
El efecto del tratamiento sobre los precursores del camino de hemo en el hígado
se describe en las siguientes dos figuras. Ambos precursores, ALA (Figura 4.24) y PBG
(Figura 4.25), se incrementaron en todos los grupos ensayados (L, M y H) cuando
fueron comparados con los valores del control (8,2 ± 0,8 nmol ALA/g hígado y 0,4 ±
0,1 nmol PBG/g hígado). Los porcentajes de ALA aumentaron en un 25, 250 y 280%,
así como el PBG, donde los incrementos fueron del 650, 3900, y 5000% para los grupos
L, M y H, respectivamente.
153
Resultados
35
ALA hepático ( nmol/ g)
30
25
20
15
10
5
0
C
L
M
H
Figura 4.24 - Efecto del tratamiento con AIA/DDC sobre el contenido de ALA hepático de acuerdo a
las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal cual se describe en la Fig. 25. Otros
detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos. Los contenidos de ALA
hepáticos son expresados como nmol /g de hígado fresco. Los valores representan la media de
experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S. Las comparaciones múltiples
entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C
P <0,05 es significativamente diferente del grupo L.
Los contenidos de ALA y PBG hepáticos en el grupo H se vieron incrementados
en comparación con el control, y fueron estadísticamente diferente tanto del grupo L
como del control. Además, el contenido de PBG en el grupo H fue estadísticamente
diferente al grupo M.
154
Resultados
PBG hepático (nmol/g)
20
16
12
8
4
0
C
L
M
H
Figura 4.25 - Efecto del tratamiento con AIA/DDC sobre el contenido de PBG hepático de acuerdo a
las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal cual se describe en la Fig. 4.22. Otros
detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos. Los contenidos de ALA y PBG
hepáticos son expresados como nmol /g de hígado fresco. Los valores representan la media de
experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S.
Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de TukeyKramer.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C
P <0,05 es significativamente diferente del grupo L.
P <0,05 es significativamente diferente de M.
ALTERACIONES PROVOCADAS EN EL METABOLISMO DE LA GLUCOSA:
GLUCONEOGÉNESIS, GLUCÓLISIS.
4.2.2. Actividades enzimáticas de la gluconeogénesis
Para evaluar el impacto de las drogas porfirinogénicas en estudio sobre el
camino de síntesis de glucosa, se midieron las actividades de dos enzimas claves y
155
Resultados
regulatorias de este camino como son la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK) y
la glucosa 6-fosfatasa (G6Pasa).
4.2.2.1. Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK)
La Figura 4.26, muestra la actividad de PEPCK, enzima que transforma
oxalacetato en PEP, medida en el hígado de animales tratados con diferentes dosis de
AIA/DDC, así como en los controles. Después de 16 h de tratamiento, la actividad
PEPCK sufrió un 30 y 24% de inhibición en los grupos H y M, respectivamente, en
comparación con los controles (valor: 10,1 ± 0,8 nmol NADHox /mg prot. min) y
dichos valores fueron estadísticamente diferentes de los grupos C y L.
PEPCK (nmol NADHox/mg prot.min)
12
10
8
6
4
2
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.26: Efecto dosis-respuesta sobre la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa
(PEPCK) hepática por el tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los
animales fueron inyectados tal cual se describe en la Fig. 4.16. Otros detalles experimentales se
describen en la sección 3 Materiales y Métodos. La actividad PEPCK es expresada como nmol
NADHox/mg de proteína.min. Los valores representan la media de experiencias por duplicado realizadas
con seis animales por grupo ± E.S. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron
realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C
P <0,05 es significativamente diferente del grupo L.
156
Resultados
4.2.2.2. Glucosa 6 fosfatasa (G6Pasa)
Asimismo se estudió el efecto de AIA/DDC sobre la enzima que libera glucosa
y fósforo a partir de G6P, la glucosa 6-fosfatasa (G6Pasa).
La Figura 4.27, muestra la actividad de G6Pasa, medida en el hígado de
animales tratados con diferentes dosis de AIA/DDC, así como en los controles. La
actividad solo tuvo un 12% de inhibición significativa en el grupo H, en comparación
con los animales controles (valor medio controles: 0,17 ± 0,02 µmol Pi/mg prot.min).
G6Pasa (µmol Pi/mg prot.min)
0,2
0,16
0,12
0,08
0,04
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.27 - Efecto dosis-respuesta sobre la actividad de la glucosa 6 fosfatasa (G6Pasa) hepática por
el tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados
tal cual se describe en la Fig. 4.22. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales
y Métodos. La actividad G6Pasa es expresada como µmol Pi/mg de proteína. min. Los valores
representan la media de experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S. Las
comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de TukeyKramer.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
157
Resultados
4.2.3. Glucólisis- Piruvato Quinasa (PK)
También se quiso investigar si estaba afectado el camino de degradación de la
glucosa y para ello se evaluaron los cambios observados en una de las enzimas
regulatorias, la PK. La Figura 4.28 muestra la actividad de la misma, medida en el
hígado de animales tratados con diferentes dosis de AIA/DDC, así como en los
controles. La actividad tuvo una inhibición importante en todos los grupos, y
estadísticamente significativa en comparación a los animales controles (0,34 ± 0,08
µmol NADHox /mg. min), llegando en algunos casos al 50%.
PK (µmol NADHox/mg prot.min)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.28: Efecto dosis-respuesta sobre la actividad de la piruvato quinasa (PK) hepática por el
tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal
como se describe en la Fig. 4.22. Otros detalles experimentales se describen en sección 3 Materiales y
Métodos. La actividad PK es expresada como µmol NADHox/mg de proteína.min. Los valores
representan la media de experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S. Las
comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de TukeyKramer. Los valores entre los grupos L, M y H no fueron estadísticamente significativos entre si, pero si
diferentes al grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
158
Resultados
DAÑOS PROMOVIDOS EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO
4.2.4. Niveles de glucógeno y actividades enzimáticas de su metabolismo
Monitoreando las alteraciones provocadas en el proceso de almacenamiento de
glucosa en el hígado por el tratamiento con AIA/DDC se exploraron los contenidos de
glucógeno y las actividades de las enzimas responsables de su síntesis y degradación:
glucógeno sintetasa (GS) y glucógeno fosforilasa (GP) respectivamente.
4.2.4.1. Glucógeno hepático total
Como puede verse en la Fig. 4.29 el tratamiento porfirinogénico con AIA/DDC
incrementó los depósitos de glucosa en el hígado. Así el aumento de los niveles de
glucógeno hepático fue para la dosis mayor (H) de 4 veces respecto al control (valor
grupo C: 4,9 ± 0,3 µmol glucosa/g hígado) mientras que en la dosis M y L también fue
evidente con incrementos de 3 y 2,5 veces respectivamente.
Glucógeno (µmol glucosa/g hígado)
20
16
12
8
4
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.29: Efecto del tratamiento con AIA/DDC sobre el contenido de glucógeno hepático total de
acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal cual se describe en la Fig. 4.22.
El contenido de glucógeno hepático es expresado como µmol glucosa /g de hígado fresco. Los valores
representan la media de experiencias por duplicado realizadas con seis animales por grupo ± E.S. Las
comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de TukeyKramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C
P <0,05 es significativamente diferente del grupo L.
159
Resultados
4.2.4.2. Glucógeno Sintetasa (GS)
La Figura 4.30 muestra que la GS, enzima encargada de sintetizar glucógeno,
aumenta ligeramente en hígado de ratas tratadas con sendos xenobióticos. Es también
dosis dependiente y se incrementa en un 28% en el grupo que recibe la dosis mayor de
AIA, siendo los valores de este grupo (H) estadísticamente diferentes no sólo de los
controles (valor grupo C: 98,4 ± 7 nmol UDP liberado/mg.h) sino también de los grupos
M y L.
GS (nmol UDP liberado/ mg.h)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.30 - Efecto dosis-respuesta sobre la actividad de la Glucógeno sintetasa (GS) hepática por el
tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal
cual se describe en la Fig. 4.22. La actividad GS fue determinada usando UDP-glu como sustrato y
midiendo la cantidad de UDP liberado en el ensayo de PK. La actividad GS es expresada como nmol
UDP liberado/mg de proteína.h. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron
realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3
Materiales y Métodos.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de M.
160
Resultados
4.2.4.3. Glucógeno fosforilasa (GP) - Degradación del glucógeno
Estudiando la enzima de velocidad limitante de la degradación del glucógeno, se
vio que el tratamiento porfirinogénico empleado produjo importantes alteraciones en
esta enzima. Como puede verse en Figura 4.31 la actividad de GP también mostró una
disminución estadísticamente significativa de alrededor del 53% y del 38% en el grupo
H con respecto al grupo C y grupo L (2,24 ± 0,22 y 1,73 ± 0,21 nmol Pi/g.min,
respectivamente). En el grupo M, GP sufrió 36% de inhibición en comparación con C.
GP (nmol Pi/g higado.min)
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.31 - Efecto dosis-respuesta sobre la actividad de la Glucógeno fosforilasa (GP) hepática por
el tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados
tal cual se describe en la Fig. 4.22. La actividad GP fue determinada como el fosfato liberado (Pi) a
partir de la glucosa-1-P y glucógeno, usando como fuente enzimática sobrenadante de 2.000 x g de los
correspondientes homogenatos. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron
realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3
Materiales y Métodos. La actividad GP es expresada como nmoles Pi/ g de hígado.min
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
161
Resultados
4.2.5. Transporte de glucosa en tejido hepático
Otro aspecto que se quiso explorar fue el de la captación de glucosa por el
hígado, a los fines de ver si había alguna interferencia en el proceso de transporte del
azúcar, como consecuencia del tratamiento con AIA/DDC.
De esa forma se observó que en animales porfíricos, la captación de glucosa
(figura 4.32) mostró un aumento dependiente de la dosis (50% a la dosis máxima) es
decir, la célula hepática de dichos animales estaría captando más glucosa.
180
Captación de 3H-Glu
(pg glucosa/ g hígado)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.32 - Efecto dosis-respuesta sobre la captación de glucosa hepática por el tratamiento con
AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal cual se describe
en la Fig. 4.22. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el
Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
La captación de la 3H-glu es expresada como pg Glu/ g de hígado fresco
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
162
Resultados
EN BUSCA DE LAS CAUSAS DEL DESCENSO DE PEPCK Y GP- INTERFERENCIAS
EN EL SISTEMA REDOX
4.2.6. Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)- Estrés oxidativo.
Para determinar el efecto de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y el daño
que puede causar este tratamiento en biomoléculas esenciales, tales como los lípidos, se
midió la producción de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) en dos
fracciones hepáticas: homogenato total de hígado y microsomas hepáticos, que es la
fracción subcelular de este tejido más rica en membranas.
4.2.6.1. Peroxidación lipídica en tejido hepático
La peroxidación lipídica medida en homogenatos como TBARS exhibió un
aumento significativo, por acción de las drogas porfirinogénicas, en el grupo L (22%),
grupo M (40%) y en el grupo H (72%) con respecto al grupo control (128 ± 10 nmol
MDA/ g hígado fresco. hora), mostrando un comportamiento droga-dependiente de las
dosis (Figura 4.33). En comparaciones múltiples entre los grupos analizados, salvo en el
grupo L cuyos aumentos sólo difirieron estadísticamente del control, los aumentos
registrados en los grupos M y H fueron estadísticamente significativos y diferentes de
cualquiera de los otros grupos y entre sí.
Por otra parte se quiso analizar el daño producido no sólo en homogenato total
sino en la fracción microsomal, como arriba se mencionó. En la tabla IV.5, pueden
verse los resultados obtenidos en forma comparativa. En dicha tabla se observa un
aumento significativo tanto en la fracción microsomal, como en el homogenato, se ve
también que el incremento depende de la dosis, que el aumento más significativo fue en
la fracción microsomal y que éste supera en aproximadamente cuatro veces al registrado
en el homogenato total.
Así, en el homogenato, las TBARS aumentan con respecto al control en los
grupos L, M, y H, como fue mencionado para la figura 4.33, mientras que en los valores
de fracción microsomal los aumentos fueron del 75, 150, y 330%, respectivamente,
para dichos grupos, y en todos los casos estadísticamente significativos.
163
Resultados
TBARS (nmol MDA/g higado.hora)
250
200
150
100
50
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.33 - Efecto dosis-respuesta sobre la peroxidación lipídica en homogenato hepático por el
tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizadas. Los animales fueron inyectados tal
cual se describe en la Fig. 4.22. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron
realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3
Materiales y Métodos. La peroxidación es expresada como nmol MDA formado/ g de hígado fresco. hora
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de M.
Tabla IV.5. Peroxidación lipídica como formación de TBARS en homogenatos y
microsomas hepáticos de ratas tratadas con AIA/DDC vs ratas controles.
TBARS en homogenato
TBARS en microsomas
Grupos
(nmol MDA/g hígado fresco. h)
(nmol MDA/mg proteínas. h)
C
128 ± 10
20 ± 5
L
156 ± 12*
35 ± 3*
M
179 ± 13*,#
50 ± 8*,#
H
220 ± 12*,#,§
86 ± 9*,#,§
Tabla IV.5. El malondialdehido (MDA) se evalúa como TBARS. Los animales fueron inyectados tal cual
se describe en la Fig. 4.22. La peroxidación en homogenato es expresada como nmol MDA/ g de hígado
fresco. hora. La peroxidación en microsomas es expresada como nmol MDA/ mg de proteínas. hora. Las
comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test de TukeyKramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
*P < 0,05 es signif. diferente respecto a C; #P < 0,05 es signif. diferente respecto a L.;
§
P < 0,05 es
signif. diferente respecto a M`
164
Resultados
4.2.6.2. Carbonilación de proteínas en tejido hepático
Así como se evaluó el daño a lípidos producido por el ambiente oxidativo
generado por el tratamiento, se quiso investigar el correspondiente daño a proteínas. A
tal fin se
determinó la carbonilación de las proteínas, ya que las ROS son las
responsables de la carbonilación y del daño sobre las proteínas de membrana.
Como muestra la Figura 4.34, después de 16 h del tratamiento, las proteínas
citosólicas carboniladas sufrieron importantes aumentos de 2,3 y 3 veces en los grupos
M y H respectivamente, estadísticamente significativos en comparación con el grupo
control C (1,4 ± 0,3 nmol carbonilos/ mg), y el grupo L (Figura 4.34).
nmol carbonilos/mg proteínas
8
6
4
2
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Fig. 4.34 - Efecto dosis-respuesta sobre el contenido de carbonilos citosólicos hepático por el
tratamiento con AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal
cual se describe la Fig. 4.22. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron
realizadas mediante el Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3
Materiales y Métodos. La carbonilación es expresada como nmol carbonilos/ mg prot.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
165
Resultados
4.2.6.3- Quimioluminiscencia urinaria (QL)
Teniendo en cuenta que se ha reportado que la quimioluminiscencia urinaria
espontánea puede constituir un método rápido, simple y sensible para evaluar disturbios
asociados con estrés oxidativo (Ríos de Molina et al., 1998) se midió en los lotes
tratados con AIA/DDC y en los controles, quimioluminiscencia espontánea en orinas
para evaluar estos parámetros de estrés oxidativo en este modelo experimental y
poderlos relacionar con las alteraciones producidas en el metabolismo de los hidratos de
carbono.
En lo que respecta a la quimioluminiscencia urinaria, los valores mostraron un
aumento estadísticamente significativo, del 127% en el grupo L [(116,8 ± 38) × 103
cpm] y 205% en el grupo M [(156,2 ± 60) x 103 cpm] con respecto al control [(51,7 ±
25) × 103 cpm], (Figura 4.35). Por otro lado, los animales tratados con la dosis más altas
(grupo H) cayeron en un sueño profundo debido al tratamiento y por tanto, el volumen
de excreción urinaria no fue suficiente para realizar la determinación de
quimioluminiscencia.
Quimioluminiscencia urinaria
(cpm. 10 3)
240
200
160
120
80
40
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Fig. 4.35 - Efecto dosis-respuesta sobre la quimioluminiscencia urinaria diaria por el tratamiento con
AIA/DDC, de acuerdo a las dosis de AIA utilizada. Los animales fueron inyectados tal cual se describe
la Fig. 4.22. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el
Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
La quimioluminiscencia es expresada como cpm x 10 3/ ml orina24 h
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
166
Resultados
4.2.7. Actividades de las defensas antioxidantes
Los sistemas enzimáticos de defensas (Figuras 4.36 y 4.37) mostrados a través
de las actividades de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), respectivamente,
fueron medidas en los hígados de animales tratados con AIA/DDC y en los controles.
4.2.7.1. SOD
Como puede verse en la figura 4.36, la actividad de SOD responde
positivamente al estrés oxidativo. Así ella aumentó 235% en el grupo H, el 41,6% en el
grupo M, y el 19% en el grupo L, con respecto al grupo control (11,4 ± 2 U SOD/ mg.
min).
U SOD/mg proteína.min
45
36
27
18
9
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.36. Dosis-respuesta de la actividad de SOD por el tratamiento con AIA/DDC.
Los animales fueron inyectados con las mismas dosis indicadas en la Fig. 4.22. Cada barra representa la
media ± E.S. de seis animales. El contenido se expresó como U/mg proteína. min para la actividad SOD
(donde una U es definida como la cantidad de enzima necesaria para inhibir el 50% de la autoxidación
de la epinefrina).Las comparaciones múltiples entre grupos se realizaron usando la prueba de TukeyKramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de M.
167
Resultados
4.2.7.2. CAT
La actividad de CAT (Figura 4.37) por el contrario, sufrió 24, 11 y 9% de
inhibición en los mismos grupos, respectivamente. Tanto SOD y CAT mostraron un
comportamiento droga dependiente, estadísticamente significativo de la dosis en
comparaciones múltiples entre grupos analizados (valor C: 57,9±2µmol H2O2/mg. min).
mm H2O2/mg proteína.min
70
60
50
40
30
20
10
0
Grupo C
Grupo L
Grupo M
Grupo H
Figura 4.37: Dosis-respuesta de la actividad de CAT por el tratamiento con AIA/DDC.
Los animales fueron inyectados con las mismas dosis indicadas en la Fig. 4.22. Cada barra representa la
media ± E.S. de seis animales. El contenido se expresó como µmol H2O2 consumido/ mg proteína. min.
Las comparaciones múltiples entre grupos se realizaron usando la prueba de Tukey-Kramer. Otros
detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo C.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de L.
P <0,05 es significativamente diferente del grupo de M.
168
Resultados
MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE PREVENTIVO A LA INTOXICACIÓN.
Por otra parte se quiso investigar si la melatonina (Mel), que deriva del camino
serotoninérgico del triptófano y de la que se ha reportado capacidad atrapante de
radicales libres y antioxidante, puede modular los efectos producidos por el tratamiento
con AIA/DDC sobre el ambiente oxidativo, la biosíntesis de la glucosa y el camino del
hemo; es decir si puede modular la porfiria aguda inducida por estas drogas en ratas
intoxicadas.
A tal efecto, se midieron en el modelo de intoxicación aguda como parámetros
del camino del hemo e indicadores de porfiria: los precursores ALA y PBG en orina y
las enzimas hepáticas ALA-S (regulatoria del camino) y FQ (enzima blanco de la acción
del DDC); como parámetros de la gluconeogénesis hepática: las enzimas claves y
regulatorias: PEPCK y G6Pasa; y como marcador de estrés oxidativo: la peroxidación
lipídica mediante la estimación de los TBARS en el homogenato total y en microsomas
de hígado.
Todos estos parámetros se midieron en lotes de animales que fueron
aleatoriamente separados para cada experiencia en cuatro grupos: C (grupo Control),
Mel (grupo Melatonina), I+Mel (grupo intoxicado con AIA/DDC junto al tratamiento
con Melatonina) e I (grupo intoxicado con AIA/DDC). La Mel fue inyectada en dos de
los grupos con una concentración de 10 mg/kg de peso corporal, 3 veces al día (en los
horarios de las 8, 12 y 16hs) durante los 2 días previos a la intoxicación, disuelta en
solución salina justo antes de ser administrada ip. a los animales de los grupos
correspondientes, tal como se describe en Materiales y Métodos. La intoxicación fue
llevada a cabo con AIA y DDC (300 mg/kg. pc, sc. + 50 mg/kg. pc, ip.) luego del
pretratamiento de 2 días con Mel en los grupos correspondientes. El grupo Control (C)
recibió solo los vehículos de las drogas y del protector Mel. Las ratas tuvieron un ayuno
total de 24h (8h antes del drogado con AIA/DDC y 16h después del mismo) antes de ser
sacrificadas, aunque con libre acceso a los bebederos de agua. Las mediciones fueron
hechas 16h post-intoxicación. Los resultados obtenidos pueden verse en la Tabla IV.6.
169
Resultados
Tabla IV.6: Acción de melatonina (Mel) sobre parámetros del camino del hemo,
de la biosíntesis de glucosa y del estrés oxidativo en modelo de porfiria aguda.
Parámetro (frac. hepática)
Melatonina
(Mel)
AIA/DDC
(I)
AIA/DDC+ Mel
(I+Mel)
ALA
orina
113±9
237±14 * #
179±12 * # §
PBG
orina
64±15 *
456±29 * #
331±22 * # §
ALA-S
(homogenato)
106±13
426±27 * #
320±21 * # §
FQ
(mitocondrias)
98±15
29±4 * #
33±5 * #
PEPCK
(citosol)
124±11
45±5 * #
70±6 * # §
G6Pasa
(microsomas)
83±12
85±7 *
92±7....
*#
TBARS
(homogenato)
98±10
145±11
TBARS
(microsomas)
96±5
121±9 * #
124±10 * # §
94±7 §
Tabla IV.6. Cada valor representa el porcentaje de aumento o disminución de contenidos o actividades
ensayadas respecto al valor control (100%). Los animales fueron inyectados tal cual se describe el texto
precedente, en cuatro grupos: C (control) Mel (melatonina i.p.10mg/k pc, 6 veces en 2 días previos a la
intoxicación); I: intoxicados con AIA/DDC (300mg/k peso corporal + DDC 50 mg/k peso corporal) y por
último I+Mel: grupo pre-tratado por 2 días con Mel y luego intoxicados con AIA/DDC en igual
concentración que grupo I. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y
Métodos. Las comparaciones múltiples entre grupos de tratamientos fueron realizadas mediante el Test
de Tukey-Kramer. Las actividades y contenidos de los valores controles fueron:
Contenido de ALA en orina, valor control 6µg ALA /24 h
Contenido de PBG en orina, valor control 1,93µg PBG /24 h
Actividad de ALA-S, valor control 24 µmol ALA/mg prot.h
Actividad de FQ, valor control 1,28 nmol piridin.hemocromógeno/mg prot.h
Actividad de PEPCK, valor control 9,7 nmoles NADH consumidos/ mg prot.min
Actividad de G6Pasa, valor control 0,574µmoles Pi / mg prot.min
TBARS h valor control 228 nmoles MDA / g hígado. h
TBARS microsomas valor control 20 nmoles MDA / mg prot. h
Los valores representan la media de experiencias por duplicado de seis animales por grupo ± E.S.
Las comparaciones múltiples entre grupos fueron realizadas a través del Test de Tukey-Kramer.
* P < 0.05 es significativamente diferente respecto a C.
#
§
P < 0.05 es significativamente diferente respecto a Mel.
P < 0.05 es significativamente diferente respecto a I.
En cuanto a la excreta de los precursores ALA y PBG por orina el tratamiento
con Mel tuvo un efecto positivo, particularmente notorio para el PBG, disminuyendo de
forma considerable la acumulación característica de estos metabolitos del camino del
hemo como consecuencia del tratamiento con AIA/DDC (Tabla IV.6). Estas
170
Resultados
disminuciones fueron del 25% para el ALA y de 28% para el PBG. La administración
de melatonina sola modificó los valores normales de excreción de ambos metabolitos
provocando una disminución marcada en los niveles de PBG (36%).
Como puede verse en dicha tabla, Mel atenuó a un 75% la inducción de la
enzima regulatoria del camino del hemo (ALA-S) promovida por AIA/DDC y la
melatonina sola no tuvo efecto sobre dicha enzima. Por otra parte, se observó muy
ligero efecto benéfico de la Mel sobre la inhibición producida por las drogas
porfirinogénicas en la actividad de FQ, que no llega a ser estadísticamente significativo.
La melatonina per se tampoco afectó la actividad de esta enzima que sintetiza hemo.
Como puede observarse además en la misma Tabla IV.6, la administración de
Mel tuvo también un efecto benéfico a nivel de las enzimas de la biosíntesis de glucosa.
En efecto, su administración conjunta con AIA/DDC restauró en un 25% la actividad de
PEPCK que había sido dañada en un 55% por el tratamiento porfirinogénico y recuperó
en un 8% la actividad de la G6Pasa, que había perdido 15% de su actividad por acción
del AIA/DDC. La administración del compuesto indólico solo, no modificó
sustancialmente la actividad de la PEPCK ni de la G6Pasa.
Asimismo se observó que el estrés oxidativo mejoró como consecuencia de la
administración conjunta de Mel + AIA/DDC respecto al producido por las drogas
porfirinogénicas solas, tanto en homogenato como en microsomas. En efecto, como
puede verse en la Tabla IV.6, en homogenato la producción de TBARS disminuyó en un
15%, producción que estuvo aumentada en un 45% por el tratamiento porfirinogénico
solo. Similarmente en microsomas la Mel redujo en un 22% los TBARS producidos por
acción de las drogas AIA/DDC. La administración de Mel sola no modificó la
peroxidación lipídica en ninguna de las 2 fracciones subcelulares ensayadas.
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRP EN ESTE MODELO DE
PORFIRIA AGUDA
Para evaluar el impacto de este tratamiento porfirinogénico sobre el
metabolismo del triptófano (TRP) y las rutas serotoninérgica y quinurenérgica, se
171
Resultados
estudió el hígado, midiendo la concentración de serotonina (5-HT); los niveles del TRP
y además la actividad de la triptófano pirrolasa (TRPp).
4.2.8 Camino serotoninérgico
Como se muestra en la Tabla IV.7, el tratamiento combinado con AIA/DDC
promueve una disminución en el nivel de serotonina, que fue más marcado en dosis
altas (20% en el grupo M, y 38% en el grupo H) y significativamente diferente al grupo
control. La disminución en el nivel de 5-HT en el grupo H fue estadísticamente
diferente respecto a la del grupo M. Por otro lado, la concentración hepática de TRP
aumentó un 23% en la dosis más alta ensayada con respecto al grupo C.
Tabla IV.7 Niveles hepáticos de Serotonina (5-HT) y Triptófano (TRP) de ratas
tratadas con AIA/DDC vs ratas controles.
5-HT hepático
TRP hepático
Grupos
(µg/g hígado fresco)
(µg/g hígado fresco)
C
0,682 ± 0,051
7,981 ± 0,362
L
0,630 ± 0,045
8,225 ± 0,303
M
0,546 ± 0,039*
9,030 ± 0,491
H
0,421 ± 0,030 *
, #, §
9,872 ± 0,624 *
,#
Tabla IV.7. Cada valor representa la media ± E.S. de seis animales. Las ratas fueron inyectadas y
divididas en los grupos detallados en la Fig. 4.22. El contenido de TRP y 5-HT es expresado como mg
TRP o 5-HT/g hígado fresco. Las comparaciones múltiples entre grupos fueron realizadas a través del
Test de Tukey-Kramer. Otros detalles experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
* P < 0,05 es significativamente diferente respecto a C.
#
§
P < 0,05 es significativamente diferente respecto a L.
P < 0,05 es significativamente diferente respecto a M.
4.2.9. Enzimas del camino quinurenérgico. Actividad de la TRPp.
La vía de degradación del TRP se ensayó midiendo la actividad hepática de la
enzima TRPp. Los resultados demostraron que había un aumento marcado y
estadísticamente significativo en la actividad de todas sus formas (holo, apo, y enzima
total), y que era dependiente de la dosis respecto al grupo control. La actividad fue
medida en presencia o ausencia de hemo exógeno.
172
Resultados
La Tabla IV.8 muestra un aumento del 30, 70, y 120% para las tres especies
enzimáticas holo, total, y apo-TRPp, respectivamente, en la dosis media ensayada
(grupo M), y 90, 150, y 230% de aumento respectivamente, en la dosis mayor de AIA
(grupo H). Los valores de actividad de todas las especies de la enzima, tanto en la dosis
más alta y mediana analizadas (los grupos H y M) fueron significativamente diferentes
de los medidos respecto al control y la dosis más baja (grupo L), con excepción de la
actividad de la holoenzima en el grupo M. Además, la actividad de la apoenzima (apoTRPp) en el grupo H también fue significativamente diferente de la observada en el
grupo M. Como también puede verse en la Tabla IV.8, el tratamiento con AIA/DDC
provoca una reducción dosis-dependiente en el grado de saturación de la enzima
(holoenzima/ apoenzima). Esta disminución fue del 10; 40 y 42% para los grupos L, M
y H, respectivamente, cuando los valores medios fueron comparados con los del control.
La pérdida del grado de saturación del hemo observada en los dos grupos, M y H es
estadísticamente significativa cuando se compara tanto con el C como con el grupo L
Tabla IV.8. Síntesis de quinurenina generada por la triptófano pirrolasa
(TRPp) en presencia o ausencia de hemo exógeno.
Holoenzima
TRPp total
Apoenzima
Holoenzima/
(µmol quinurenina
(µmol quinurenina (µmol quinurenina
apoenzima
formada/g hígado)
formada/g hígado) formada/g hígado)
(unidades)
3,07 ± 0,14
5,51 ± 1,02
2,44 ± 0,89
1,25 ± 0,18
3,29 ± 0,19
6,17 ± 0,67
2,87 ± 0,47
1,14 ± 0,15
4,04 ± 0,69*
9,48 ± 1,41*,#
5,43 ± 1,37*,#
0,74 ± 0,14*,#
5,81 ± 1,04*,#
13,87 ± 1,54*,#
8,06 ± 1,31*,#,§
0,72 ± 0,09*,#
Tabla IV.8. Cada valor representa la media ± E.S. de seis animales. Las ratas fueron inyectadas y
divididas en los grupos detallados en la Fig. 4.22. Enzima Total: actividad en presencia de hemo
exógeno. Holoenzima: actividad en ausencia de hemo exógeno. Apoenzima: diferencia entre la enzima
total y la holoenzima. Grado de saturación del hemo: relación entre holoenzima/apoenzima. Las
actividades fueron expresadas como µmol quinurenina formada/g hígado fresco. Las comparaciones
múltiples entre grupos fueron realizadas a través del Test de Tukey-Kramer. Otros detalles
experimentales se describen en la sección 3 Materiales y Métodos.
* P < 0.05 es significativamente diferente respecto a C.
#
§
P < 0.05 es significativamente diferente respecto a L.
P < 0.05 es significativamente diferente respecto a M.
173
Discusión
5. DISCUSIÓN
5. 1. MODELO DE PORFIRIA CRÓNICA POR HCB.
Con el fin de caracterizar el modelo de porfiria experimental inducido por
hexaclorobenceno (HCB) en ratas hembras de la cepa Wistar; de establecer si este
xenobiótico generaba alteraciones en el metabolismo de la glucosa y si estas
alteraciones eran debidas a variaciones en la capacidad de los tejidos para transportar
glucosa, a interferencias debidas al estado oxidativo, a cambios en el estado hormonal o
en el metabolismo del triptófano; se evaluaron cada una de las modificaciones
producidas sobre dichos parámetros, causadas por la administración del xenobiótico en
función de las semanas transcurridas desde el inicio de la intoxicación.
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO DE PORFIRIA
CRÓNICA EXPERIMENTAL POR HCB?
Como ya es sabido, en ratas, ratones, conejos, cobayos y aves (aunque los más
utilizados son las ratas y los ratones) el HCB produce inhibición de la actividad de la
uroporfirinógeno-decarboxilasa (URO-D) y la consiguiente alteración del camino
biosintético del hemo, manifestada bioquímicamente con la sobreproducción de
porfirinas (Billi de Catabbi et al., 2000; Billi de Catabbi et al., 2005). Así, la
administración de HCB a ratas, constituye un muy buen modelo para mimetizar una
porfiria cutanea tarda (PCT) humana (San Martín de Viale et al., 1970). La droga induce
al citocromo P450 (CYP) (Wainstok de Calmanovici et al., 1984), que en su
metabolismo oxidativo y debido a su lenta metabolización, desacopla la cadena de
transporte de electrones microsomal (ETC) con producción de especies reactivas de
oxígeno (ROS) que generan un inhibidor de la URO-D a partir de su sustrato, UROgen.
(Figura 1.5, pág 37), (Ríos de Molina et al., 1980; Billi de Catabbi et al., 1997, 1999).
Como consecuencia de este bloqueo enzimático, se produce una desregulación del
camino metabólico del hemo, con sobreproducción de intermediarios (Cochón et al.,
2005; San Martín de Viale, 2007).
175
Discusión
La principal ventaja del modelo crónico de intoxicación utilizado en el presente
trabajo es que, a diferencia de los protocolos de administración continua, involucra una
mínima exposición al HCB, utilizando tiempos de drogado cortos y dosis más bajas. A
pesar de la menor cantidad en la administración del fungicida, el desarrollo de la
porfiria con este esquema de intoxicación fue logrado de manera similar al obtenido con
el de tratamiento continuo, durante todo el procedimiento del estudio (Wainstok de
Calmanovici et al., 1984). De hecho, las 3 ó 4 semanas transcurridas desde finalizado el
drogado hasta el inicio fehaciente de la porfiria, se correspondieron de manera análoga
en ambos esquemas, hecho que también concuerda con los resultados publicados por
Mylchreest & Charbonneau (1997), donde observaron una acumulación de porfirinas
hepáticas del mismo orden en tiempos similares, con aumentos significativos desde la 3ª
semana, respecto al control.
De acuerdo con los parámetros determinados en la sección resultados de esta
Tesis, se puede concluir que este esquema discontinuado de intoxicación con HCB,
genera claramente una porfiria establecida. La reducción de la actividad de URO-D tiene
descensos significativos a partir de la 2ª semana desde el inicio del estudio, mientras que
el acúmulo de porfirinas se hace notorio recién en la 4ª y 5ª semana, tiempos que refieren
a incrementos significativos de las porfirinas urinarias y hepáticas, respectivamente. Así,
se puede asegurar que este modelo utilizado representa muy bien una porfiria crónica
experimental, del tipo PCT. La intoxicación por HCB fue eficaz y la acumulación de
porfirinas una vez que se inicia, continúa en aumento durante varias semanas después de
terminado el esquema de drogado (Billi de Catabbi et al., 2000a). Así, la masiva
sobreproducción de porfirinas altamente carboxiladas (8- y 7- COOH) alcanzó aquí un
5000% de incremento para las porfirinas hepáticas y un 3700% de incremento para las
porfirinas urinarias, como consecuencia del drástico bloqueo enzimático sobre la URO-D
(95%), en cuanto a pérdida de la actividad, provocada por el xenobiótico HCB.
La actividad URO-D de este trabajo se evaluó en el citosol hepático, utilizando
UROgen III como sustrato y expresando la actividad como la cantidad de COPROgen III
formado. El UROgen residual, los compuestos intermediarios de la decarboxilación (7COOH´gen, 6- COOH´gen 5-COOH´gen) y el producto final COPROgen, fueron
separados por HPLC después de la oxidación en presencia de luz a sus correspondientes
176
Discusión
porfirinas. Y aunque la formación de cada una de las porfirinas intermedias fue
corroborada en los cromatogramas, no se incluyen en la expresión de la actividad UROD, ya que la actividad por la suma de 7- + 6- + 5-COOH´gen + COPROgen es menos
sensible a la disminución de la actividad enzimática, que la expresada como cantidad de
COPROgen formado (solo producto final). Esto se debe a que la primera etapa de
decarboxilación del UROgen hacia el 7-COOH´gen es rápida, y que luego éste es muy
lentamente decarboxilado hasta el producto final.
ALTERACIONES PROVOCADAS SOBRE EL METABOLISMO DE LA GLUCOSA EN
ESTE MODELO DE PCT EXPERIMENTAL
En este área muy poco estudiada y casi carente de antecedentes, la presente Tesis
muestra en animales porfíricos, importantes disturbios metabólicos tanto en los caminos
anabólicos como catabólicos de la glucosa. Se observó un definido bloqueo en la
gluconeogénesis, determinado en 3 de sus enzimas claves, que vieron sus actividades
disminuidas en un 55% para la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK), 50% para la
piruvato carboxilasa (PC) y en un 42% para la glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa).
PEPCK y PC, las enzimas reguladoras de la vía, fueron afectadas de una manera
dependiente del tiempo transcurrido y de la evolución hacia un estado porfírico, como
consecuencia del tratamiento con HCB.
Es interesante que la G6Pasa sea la única enzima gluconeogénica de las
investigadas en esta Tesis, que se encuentra adosada a membrana, y cuya actividad no
depende de una regulación alostérica ni hormonal (Hers & Hue; 1983). Además, los
datos de estudios por spín label, sugieren que la molécula de HCB se incorpora entre las
cadenas de ácidos grasos de los lípidos de las membranas (Kószó et al., 1982) y así es
posible que el HCB, mediante la modificación del ambiente lipídico, afecte la actividad
de la G6Pasa, y reduzca de este modo su actividad. Por otra parte, la cantidad de HCB
que la membrana es capaz de absorber se completa velozmente, lo que explicaría porqué
la actividad de G6Pasa se reduce tan rápidamente en el tiempo de estudio, y esta
reducción se mantiene constante durante las semanas subsiguientes al tratamiento con
HCB.
177
Discusión
En refuerzo a estos disturbios, se determinó un descenso del 30% en los niveles
plasmáticos de glucosa y una disminución del 50% en la captación de glucosa por el
hígado. La captación fue también disminuida en timo y en bazo. Por otra parte, no se vio
afectada la PK, enzima determinada para evaluar la glucólisis durante el tratamiento con
HCB.
Como se mostró en la sección resultados, en la Tabla IV.1, las 24 h de ayuno
inducen fuertemente las actividades de las enzimas gluconeogénicas en la cepa de ratas
Wistar utilizada, tal como se había informado previamente para la cepa Sprague-Dawley
en un modelo de intoxicación con TCDD (Weber et al., 1991).
Vale la pena mencionar que la disminución aquí hallada de la actividad PEPCK
promovida por el HCB en la 6ta semana, supera la respuesta de inhibición de la misma
utilizando la dosis máxima de TCDD descripta en el trabajo de Fan & Rozman (1995).
Se sabe que el HCB y el TCDD (ambos xenobióticos policlorados) afectan la biosíntesis
del hemo (Marks et al., 1982), por un mecanismo similar (Cochón et al., 2005). Los
resultados aquí presentados añadirían a esta característica común, otra característica
metabólica, ya que ambos productos químicos afectan la vía de los hidratos de carbono
y su regulación, además de la ruta de síntesis del hemo.
En un estudio sobre el efecto de la TCDD en el metabolismo de los hidratos de
carbono, se sugirió que dado que la PK era parte de una vía glucolítica y que su
actividad elevada estimula la glucólisis del PEP (mientras que una actividad reducida
permite al piruvato entrar en el camino de la gluconeogénesis) sería posible que el
TCDD inhibiera la gluconeogénesis por inducción de la actividad de PK (Weber et al.,
1991). Basados en el paralelismo que en algunos aspectos se puede hacer entre el HCB
y el TCDD, se podría haber esperado un comportamiento similar aplicable para ambos
tóxicos. Sin embargo, en su conjunto, las dos enzimas no respondieron al tratamiento
con HCB de acuerdo con el patrón de alteración esperado por los estudios con TCDD.
Los resultados presentados demuestran claramente que la reducción inducida por HCB
de la gluconeogénesis no está relacionada con una preponderancia de la glucólisis, ya
que la actividad de la enzima glucolítica clave PK no se vio afectada en los animales
aquí intoxicados.
178
Discusión
Puesto que las enzimas gluconeogénicas, especialmente la actividad de PEPCK,
depende de un mecanismo hormonal muy complejo, es posible que el HCB reduzca la
gluconeogénesis a través de hormonas reguladoras o a través del TRP y su metabolitos
aumentados en este modelo y en el de TCDD (Unkila et al., 1995; Llambías et al.,
2003). Se sabe que los metabolitos del TRP, alteran la gluconeogénesis en este nivel
enzimático (Veneziale et al, 1967; Correia & Lunetta, 1989) y por otra parte, es posible
que puedan contribuir al descenso de PEPCK el estrés oxidativo que provoca el HCB,
como se discute más adelante.
Por otra parte, los contenidos de glucosa plasmática disminuidos y los de
glucógeno hepático aumentado, serían resultantes de la reducción de la gluconeogénesis
junto a un almacenamiento incrementado de glucosa y a una menor liberación de
glucosa de sus depósitos (Esquema Integratorio 1, pág. 184).
Este trastorno generalizado en el metabolismo de los hidratos de carbono,
conduce a los hepatocitos porfíricos a tener un menor nivel de glucosa libre disponible,
y dado que la glucosa reprime la actividad ALA-S (Tschudy et al., 1964), sus bajos
contenidos llevarían a la de-represión de esta enzima, lo que favorece su inducción,
hecho que se demostró para el HCB (Wainstok de Calmanovici et al., 1984). Esta “derepresión” se sumaría a la que produce la depleción de hemo inducida por el tratamiento
con la droga HCB. En esta porfiria se postula así una doble “de-represión” de ALA-S,
una mediada por la disminución del pool de hemo y otra por la disminución de la
glucosa disponible (Esquemas Integratorio 2. 194).
Esta condición de glucosa endógena deprimida también nos ayuda a entender
porqué las altas dosis de glucosa exógena (en las dietas) suprimirían el efecto
porfirinogénico del HCB (Ivanov et al., 1976). Los resultados contribuyen a la
comprensión del efecto protector y modulador que las dietas ricas en hidratos de
carbono tienen en las porfirias hepáticas (Kappas et al., 1995). Otros estudios en conejos
intoxicados, demostraron que una dieta con alto contenido de grasas y proteínas
incrementan el efecto tóxico del HCB y que por el contrario, las dietas altas en
carbohidratos suprimen al mismo (Ivanov et al., 1986).
179
Discusión
VARIACIÓN EN LA CAPTACIÓN Y TRANSPORTE DE GLUCOSA POR DIVERSOS
TEJIDOS DE RATAS TRATADAS CON HCB
El transporte de la glucosa juega un papel vital en el suministro de energía a la
célula, así como en la regulación del metabolismo celular. En el tejido adiposo, por
ejemplo, este transporte controla la relación entre la lipólisis y la lipogénesis, y en el
hepatocito, el metabolismo de la glucosa, el glucógeno y en la síntesis de ácidos grasos.
Los animales tratados con HCB mostraron una menor captación de glucosa por
el hígado en comparación a los controles, con descensos en todas las semanas
estudiadas. La disminución observada a partir de la 3ª semana fue estadísticamente
significativa y alcanza un 50% en el máximo tiempo estudiado, 9ª semana, respecto al
control.
Aquí se demostró que en ratas hembras de la cepa Wistar tratadas con HCB, el
transporte de glucosa en el hígado, bazo y el timo disminuye, mientras que aumenta solo
en el tejido adiposo. Estas observaciones sugieren que los posibles cambios en el
metabolismo de la glucosa inducidos por HCB no se limitan a un tejido particular, sino
que afectan vías metabólicas activas de diversos órganos y tejidos, tal como la
gluconeogénesis, glucógenolisis y glucogenogénesis, en acuerdo con lo enunciado en el
trabajo de Weber et al., (1987) para ratas intoxicadas con TCDD.
La reducción de la absorción de glucosa parece ser un hecho común a la acción
de compuestos clorados. De hecho se informó que en la preincubación de células
disociadas de corteza cerebral de ratas tratadas con lindano, disminuyó el transporte de
glucosa (Pulido et al., 1990) y que el dicloro-difenil-tricloroetano y el diclorodifenildicloro-etileno inhiben el transporte de glucosa activo en el intestino delgado de ratas
tratadas (Iturri & Wolff, 1982).
Se han corroborado diferencias de comportamiento entre tejido adiposo y otros
tejidos en la captación de glucosa en ratas intoxicadas con TCDD, de acuerdo con lo
informado por Gorski et al., (1988) o por Liu & Matsumura (1995) sobre la síntesis in
vivo de los ácidos grasos.
180
Discusión
En resultados obtenidos por Mylchreest & Charbonneau (1997) se evaluó la
distribución del HCB en tejido adiposo y hepático, luego de 24 días después de
suspendida la administración del 14C-HCB a ratas tratadas con el mismo protocolo que
el presentado aquí en esta Tesis, y la persistencia del tóxico hallada fue del 70% y 50%
respectivamente para ambos tejidos. Dichos resultados sugieren que las alteraciones
encontradas en el presente trabajo se deben a la presencia física de la droga, más que a
una posible respuesta adaptativa del tejido al exceso de la misma. La vida media del
HCB se ha estimado en 57 días después de un proceso acumulativo de dosis de 840
mg/kg p.c. y 150 días después de una dosis acumulada de 5.250 mg/kg p.c. (KuiperGoodman et al., 1977; Koss et al., 1978).
El aumento de la captación de glucosa en el tejido adiposo sería una de las causas
de la reducción en la concentración de la glucosa libre en sangre, y podría explicar el
aumento del metabolismo de los ácidos grasos en estas células, que conduce a
incrementar los depósitos de grasa, observación característica en las intoxicaciones con
HCB (Böger et al., 1979; Courtney, 1979; Kószó et al., 1982)
CAMBIOS EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO DEBIDOS A LA ACCIÓN
DEL HCB
Respecto al metabolismo del glucógeno, se observó un importante bloqueo en la
glucógenolisis, es decir de la liberación de glucosa de sus depósitos, llevada a cabo por la
glucógeno fosforilasa (GP) que vio su actividad dañada en un 75% como consecuencia
del tratamiento porfirinogénico con HCB. A su vez ese tratamiento de los animales
provocó una estimulación de la síntesis del glucógeno, ya que se observó un incremento
en la actividad de la glucógeno sintetasa (GS) del 300 % en los animales porfíricos. Todo
esto da cuenta del incremento observado en los niveles hepáticos de glucógeno en estos
animales, que fueron 3 veces superiores al de los animales control.
Los resultados presentados a lo largo de esta Tesis, muestran que el contenido de
glucógeno hepático aumenta después del tratamiento con HCB. Christian et al., (1986)
también informaron un incremento del contenido de glucógeno hepático como
consecuencia de un tratamiento con otro xenobiótico tan relacionado al HCB, como el
181
Discusión
TCDD. En estudios hepáticos ultraestructurales realizados en ratas tratadas con HCB, se
encontró que productos de almacenamiento, que muy probablemente se trataría de
glucógeno, remplazaban amplias zonas del retículo endoplasmático liso (Mollenhauer et
al., 1975). También han sido observadas extensas áreas del citoplasma de la zona
intermedia de los hepatocitos, que contienen numerosas partículas de glucógeno,
mientras que habría un bajo número de estas partículas en la zona centrilobular de los
mismos hepatocitos (Böger et al., 1979).
Sin embargo y contrariamente, Correia & Lunetta (1989) encontraron en su
trabajo, una menor cantidad de glucógeno en el hígado de ratas porfíricas tratadas con
fenobarbital y un análogo de la dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC). Otra
disminución del glucógeno se detectó también en ratas después de 8 y 16 semanas de
tratamiento con TCDD (Weber et al., 1983) mientras que descensos similares fueron
observados en ratones intoxicados con TCDD (Vos et al., 1974). Se informó además,
que la administración de bifenilos policlorados reduce la cantidad de glucógeno en
ratones (Nishizumi, 1970) y ratas (Kasza et al., 1976).
Sobre la base de estos resultados contrapuestos, se puede presumir que no hay
una respuesta claramente definida en los niveles de glucógeno por el tratamiento con
diferentes compuestos clorados, aunque todos ellos posean capacidad porfirinogénica.
Los resultados aquí expuestos muestran que, desde las primeras etapas del
tratamiento, hubo un incremento en los niveles de glucógeno, probablemente debido al
aumento de la actividad de la GS, observado en las primeras semanas de la
administración del xenobiótico y a una menor degradación a través de la actividad
disminuida de la GP, que contribuyen en su conjunto, al aumento de los niveles de este
polisacárido observado en ratas tratadas bajo el presente esquema de intoxicación con
HCB.
Para analizar cómo la perturbación del metabolismo del glucógeno y la glucosa
influencian el desarrollo de esta porfiria, dos hechos deben ser tenidos en cuenta. En
primer lugar, que la glucosa reprime la inducción del ALA-S y en segundo lugar, que el
HCB altera el metabolismo del glucógeno, como se demuestra en esta Tesis, generando
una mayor acumulación de éste, debido a un desequilibrio entre la biosíntesis (aumento)
182
Discusión
y las enzimas de degradación de glucógeno (disminución), lo que conduciría en
conjunto, a una reducción de la glucosa hepática disponible. Los niveles reducidos de
glucosa, serían entonces consecuencia de una disminución de la gluconeogénesis, junto
con un almacenamiento de glucosa aumentado, que no afecta la glucólisis (Esquema
Integratorio 1, pág. 184).
Este trastorno en el metabolismo de los hidratos de carbono conduce al
hepatocito porfírico a tener un menor nivel de glucosa libre. Dado que la glucosa
reprime la inducción de el ALA-S (Tschudy et al., 1964; Giger & Meyer 1981;
Schoenfeld et al., 1985), y que existe una reducción en la glucosa disponible durante el
tratamiento como consecuencia de los disturbios en su metabolismo, su almacenamiento
y transporte; el ALA-S se de-reprime sumándose de forma deletérea, a la inducción que
esta enzima presenta por el tratamiento con HCB (Wainstok et al., 1984).
Por lo tanto, todo lo antedicho contribuiría a describir el cuadro bioquímico de
esta porfiria, que constituiría un "efecto glucosa negativo" sobre la enzima clave
ALA-S. También explicaría el efecto beneficioso que la administración exógena de
glucosa tiene en las porfirias hepáticas.
LAS CAUSAS DEL DESCENSO DE LA PEPCK Y LA GP:
INTERFERENCIAS EN EL SISTEMA REDOX
Teniendo en cuenta que el HCB puede actuar como una droga soluble en lípidos
que se une a los citocromos, desacoplando así la cadena de transporte de electrones
(ETC) y consecuentemente favoreciendo la producción de ROS (Ferioli et al., 1984); y
que esas ROS son capaces de oxidar lípidos, proteínas, hidratos de carbono y ácidos
nucleicos (Figura 1.5, pág 37), inactivando funciones celulares claves (Halliwell &
Gutteridge, 1999); se estudió en ratas tratadas con HCB, la peroxidación lipídica en
hígados a través de la formación de TBARS y la QL espontanea en orinas. Así se
pudieron evaluar algunos parámetros de estrés oxidativo en este modelo experimental
para relacionarlos con las alteraciones producidas en el metabolismo de los hidratos de
carbono.
183
Discusión
Esquema Integratorio 1: El presente esquema muestra los disturbios que provoca la administración de
HCB en el metabolismo hepático de la glucosa y su transporte; y en el “status” hormonal de GC e
insulina, resultante de alteraciones provocadas en su síntesis adrenal y pancreática respectivamente.
SNC: sistema nervioso central; ACTH: hormona adenocorticotrófica; CYP: citocromo-P450; PTH:
hormona paratiroidea; GR: receptor de glucocorticoides; UGT: UDP-glucuronosil-transferasa; IDE:
enzima degradadora de insulina; flechas al costado de los compuestos indican incrementos o
decrementos en niveles o actividad; (≈): no hay variaciones significativas.
Puede verse el descenso de glucosa como consecuencia del bloqueo gluconeogénico (PC, PEPCK y
G6Pasa disminuidas) y glucógenolitico (GP disminuída), del aumento de su depósito como glucógeno
(GS incrementada), de un menor transporte; todo ello revelado en niveles plasmáticos de glucosa
reducidos. Se esquematiza la disrupción hormonal que provoca HCB en la síntesis adrenal de los GC a
nivel de 11-/21-hidroxilasas CYP (hemo) dependientes (disminuidas) a través de su efecto en el camino
del hemo, así como en la degradación hepática (UGT) aumentada. Ambos efectos llevan a la reducción
de niveles sanguíneos de corticosterona. El HCB provoca una caída en los niveles plasmáticos de
insulina, debido posiblemente a una actividad incrementada de IDE hepática estimulada por Ca ++ como
consecuencia del efecto del HCB en ese metabolismo, no estando significativamente afectada la
secreción pancreática.
184
Discusión
Las TBARS medidas, aumentaron como resultado del tratamiento con el
fungicida en todos los tiempos ensayados, tanto en homogenato como en la fracción
microsomal hepática. Los valores obtenidos en ratas tratadas, fueron estadísticamente
superiores en cada una de las semanas estudiadas.
Las mediciones de QL urinaria total diaria, muestran que este parámetro crece en
función del tiempo de tratamiento transcurrido, siendo los aumentos estadísticamente
significativos desde las primeras semanas. En este campo, los resultados mostraron
importantes alteraciones en dicho metabolismo, con un definido estrés oxidativo y
grandes incrementos en la producción de ROS. Así se documentaron aumentos del
400% para la peroxidación lipídica en la fracción hepática microsomal y de más del
300% para la quimioluminiscencia urinaria espontánea, en ratas porfíricas por HCB.
El deterioro de la gluconeogénesis (especialmente en la actividad de PEPCK) y
la variación asociada en los niveles de glucosa causados por el tratamiento HCB,
podrían ser consecuencia del estrés oxidativo producido por el fungicida. Los aumentos
en las TBARS y QL aquí reportados reflejan el estrés oxidativo y la producción de
radicales libres causados por la lenta metabolización del HCB (Ferioli et al., 1984).
Estos resultados concuerdan con los informes anteriores realizados en nuestro
laboratorio (Billi de Catabbi et al., 1997; Ríos de Molina et al., 1998).
Teniendo en cuenta que la disminución de la PEPCK y la generación de
radicales libres causados por el fungicida porfirinogénico (HCB) se producen en una
forma más o menos sincronizada y que ambos se hacen evidentes en la segunda semana,
podría ser que la reducción de la PEPCK fuese debida también al accionar de estas
especies reactivas de oxígeno (ROS) (Esquema Integratorio 2, pág 194)
Este efecto puede ejercerse a nivel del DNA, afectando la expresión del gen de
la PEPCK y reduciendo así los niveles de sus mRNA, como se ha informado en la
intoxicación con TCDD (Stahl et al., 1993) o actuar directamente sobre la actividad
enzimática de la proteína, como se publicó en el caso de otras proteínas (Wolff & Dean,
1986).
185
Discusión
Habría que considerar que el estrés oxidativo juega un papel importante en la
regulación celular, modulando a través de radicales libres, las actividades de las
quinasas y las fosfatasas, que actúan sobre los factores de transcripción (Guyton et al.,
1996). Por otra parte, el factor nuclear NF-1, implicado en la transcripción de la PEPCK
(Hanson & Reshef, 1997) parece ser particularmente sensible al estrés oxidativo (Morel
& Barouki, 1998).
El estrés oxidativo producido por el HCB puede modificar además el DNA y por
lo general producir 8-OH-dG (Horváth et al. 2001), lo que provoca efectos nocivos
(Cheng et al., 1992) que afectan el proceso de transcripción. Se podría postular así, que
los radicales libres producidos en exceso por el estrés oxidativo proveniente de la
intoxicación con HCB, podrían reducir la PEPCK, tal vez alterando su expresión
genética, ya sea directamente sobre el DNA, o indirectamente sobre factores de
transcripción a través fosforilaciones quinasa-dependientes.
La disminución de GP podría deberse a la acción deletérea de las ROS, aquí
incrementadas, sobre la proteína enzimática como se discute en detalle más abajo (pag
201). Ello atendiendo a la secuencia aminoacídica de GP que tiene en su sitio activo
amino ácidos susceptibles de oxidación y a que se sabe que ROS dañan a las proteínas
(Halliwell & Gutteridge, 1999).
ALTERACIONES DEL ESTADO HORMONAL. ESTUDIOS SOBRE
GLUCOCORTICOIDES E INSULINA
En la presente Tesis se informó que el tratamiento con HCB ocasiona notables
daños en ambas hormonas regulatorias del metabolismo hidrocarbonado. Un disturbio
sumamente importante fue el hallado tanto en los niveles plasmáticos de
glucocorticoides (GC) que se vieron drásticamente reducidos (60%), como en el número
de receptores hepáticos de GC que experimentaron una baja del (50-60%) manteniendo
su afinidad, así como también en la producción adrenal de GC que estuvo notablemente
deprimida (51%) tanto en presencia como en ausencia de ACTH.
186
Discusión
Existen diversos parámetros que son determinantes para establecer el nivel de
acción a nivel biológico de los GC. Sin lugar a dudas, los niveles plasmáticos de GC,
son un punto importante a tener en cuenta, pero el número y la afinidad de los
receptores hepáticos de GC también son aspectos relevantes, particularmente cuando se
estudia el efecto de un contaminante como el HCB en el metabolismo de la glucosa y
los daños producidos en el hígado por este xenobiótico. Este fungicida induce una
disminución significativa en la corticosterona plasmática (CORT), de acuerdo con los
resultados reportados por Foster et al., (1995) para ratas Sprague-Dawley
ovariectomizadas. Al respecto, este mismo equipo de trabajo informó que la mayor
disminución en la CORT se produce en la dosis más baja ensayada (1mg HCB/kg/día
durante 30 días en el agua de bebida). Resultados similares mostraron una alteración de
los niveles de CORT para otro plaguicida clorado, el TCDD, que promueve un aumento
en los niveles de GC tan tempranos como a 4 días desde el inicio del tratamiento (Gorski
et al; 1988)
Sin embargo, la CORT circulante disminuye antes de que sea detectado un
deterioro significativo de la capacidad de biosíntesis adrenal, lo que sugiere que otros
factores diferentes de la biosíntesis adrenal podrían estar involucrados. En un artículo
anterior, San Martín de Viale et al. (1976) reportaron un aumento en la actividad
hepática de la UDP-glucuronosil-transferasa (UGT) en ratas porfíricas por HCB. Así, es
posible especular que una mayor tasa de degradación hormonal hepática podría ser la
responsable de la disminución de la CORT a través de la formación de conjugados con
UDP-ácido glucurónico (UDP-GA) por la acción de UGT (Esquemas Integratorios 1 y
2, pág 184, 194).
Otra explicación involucra la globulina transportadora de corticoides (CBG).
Esta proteína se une con los GC con alta afinidad y por lo tanto podría regular la
disponibilidad de la CORT. La unión de CORT a CBG puede servir como un buffer
tisular contra los efectos potencialmente perjudiciales de la CORT elevada mediante la
regulación de la disponibilidad de la hormona libre a los tejidos target, o alterando las
tasas de clearence de la CORT (Breuner & Orchinik, 2002; Yding Andersen, 2002).
Por otra parte, un comportamiento similar se ha descrito para la hormona
tiroidea en ratas tratadas con HCB, en las que el nivel de la T4 en suero disminuye
187
Discusión
como consecuencia de un aumento en la degradación provocado por el incremento de la
deshalogenación de la T4 hepática (Kleiman de Pisarev et al., 1990). Sin embargo, a
mayores tiempos de intoxicación con HCB (más allá de 4 semanas) la disminución en el
nivel de CORT podría atribuirse tanto a la degradación hepática como a una función
adrenal alterada. En cuanto a la biosíntesis adrenal disminuida por el tratamiento con
HCB, la disponibilidad del colesterol, precursor biosintético de las hormonas
esteroideas, no parece ser responsable de dicha disminución. En efecto, en ratones, se ha
informado que la concentración de colesterol en plasma se incrementa por el tratamiento
con HCB, así como por otras drogas porfirinogénicas tales como la alil-isopropilacetamida (AIA) y la griseofulvina (Wada et al., 1969).
Este estudio muestra también que el HCB provoca una disminución de la
capacidad biosintética de la glándula adrenal, probablemente debido a la falla de una o
más enzimas esteroidogénicas (CYP C21-hidroxilasa y/o C11-hidroxilasa) sin modificar
el peso de la glándula (Esquema Integratorio 1, pág 184). En este sentido, vale la pena
mencionar que los bifenilos policlorados, que comparten con HCB la característica
común de ser compuestos clorados porfirinogénicos, producen una disminución en la
CYP C21-hidroxilasa suprarrenal, cuando se administra a los cobayos (Goldman &
Yawetz, 1992). Esta enzima tiene un papel clave en la biosíntesis de GC. El efecto de
HCB en la biosíntesis adrenal podría ser la respuesta de esta glándula a la acumulación
del fungicida. De hecho Foster et al., (1993), informó niveles residuales de HCB en la
glándula adrenal, superiores a los detectados en hígado y en suero.
Además de los efectos sobre CORT, el HCB también promueve una disminución
temprana e importante en el número de GR hepáticos (50-60%) sin afectar su constante
de disociación. Estos resultados coinciden con los descritos previamente en ratones
(Stohs et al., 1990) y en ratas hembras Sprague Dawley, (Sunahara et al., 1989) tratadas
con TCDD, droga relacionada con el HCB. Después del tratamiento de un día, la TCDD
también reduce la capacidad de unión de los GR hepáticos (38-50%), sin que ello afecte
el Kdapp (Sunahara et al, 1989; Stohs et al., 1990). Por otra parte, en estos documentos,
los valores de Bmax observados fueron de 300 (fmol/mg) en ratones HRS/J y de 400
(fmol / mg) en ratas Sprague-Dawley hembras. El número de GR hepáticos concuerda
con lo aquí informado para ratas Wistar hembras (500 fmol / mg). Como en los GR de
188
Discusión
hígados de ratones (2 nM) y ratas Sprague-Dawley (0,5 nM), los valores de Kdapp para
las ratas Wistar hembras fueron de alrededor de 3 nM.
Teniendo en cuenta que la respuesta temprana de la CORT a la intoxicación
HCB precede al efecto sobre la actividad PEPCK hepática regulada por GC, es posible
especular que la disminución de la enzima gluconeogénica podría ser una consecuencia
de la disrupción hormonal temprana causada por HCB sobre los niveles de CORT y sus
receptores. Por lo tanto, en esta porfiria experimental el efecto negativo que ejerce el
HCB sobre la PEPCK a través de los GC y sus receptores, podría sumarse al efecto que
tienen las ROS sobre esta enzima como se detalló más arriba (Esquema Integratorio 2,
pág 194).
En lo que respecta a la insulina los niveles plasmáticos de esta hormona se
vieron marcadamente disminuidos (65%). Sin embargo, la secreción de insulina por el
páncreas fue normal y no se mostró afectada en islotes de Langerhans perfundidos y
estimulados con glucosa tanto en las semanas 3ª como 6ª del estudio (Esquema
Integratorio 1, pág 184).
Uniendo esto último con los datos del comportamiento de las enzimas del
metabolismo de la glucosa, se demuestra que tanto la tasa de gluconeogénesis como los
niveles plasmáticos de insulina son deteriorados ante el tratamiento con HCB. Estos
resultados no concuerdan con los esperados, dado el conocido efecto regulador que
tiene la insulina sobre la gluconeogénesis. Los altos niveles de insulina debieran inhibir
la gluconeogénesis (Granner & Andreone, 1985). Sin embargo ambos parámetros en
este estudio decrecen.
El hecho de que el nivel normal de la insulina en plasma fue menor en los
animales tratados con HCB que en controles y que el patrón de secreción de insulina en
páncreas sin embargo es similar a los controles, sugiere que no hay alteración primaria
en el mecanismo de secreción de la insulina causada por el tratamiento. Por el contrario
los cambios inducidos por HCB en la homeostasis de la insulina serían una respuesta
compensatoria del organismo para estimular la gluconeogenesis. Una respuesta similar
fue informada para estos parámetros en un modelo de TCDD, droga que está
mecanísticamente relacionada con el HCB (Gorski & Rozman, 1987). Para resolver esta
189
Discusión
aparente paradoja, en su trabajo Weber et al. (1991) han propuesto que los cambios en
las actividades enzimáticas gluconeogénicas preceden a los cambios hormonales.
Considerando que la insulina deprime la PEPCK en el hígado, los disturbios que
se promueven por el HCB sobre el estatus de esta hormona, no serían la causa primaria
de la reducción de la actividad de PEPCK observada en animales tratados con HCB. Por
el contrario los cambios inducidos por HCB en la homeostasis de la insulina serían,
como se dijo, una respuesta compensatoria del organismo para estimular la
gluconeogénesis. La disminución de insulina observada en plasma podría deberse
quizás a un incremento en la degradación hepática de la hormona proteica, más que a la
formación de insulina glicosilada teniendo en cuenta al bajo tenor de glucosa hallado. A
este respecto, se ha informado que la hiperglucemia es responsable de la glucosilación
de la insulina (Abdel-Wahab et al., 1996)
Con respecto a la degradación de la insulina, se ha informado que es un proceso
secuencial de etapas múltiples, que involucra endocitosis, clivajes, reducción de puentes
disulfuro y multiples proteolisis, siendo la enzima que degrada la insulina (IDE) el
mecanismo enzimático primario para iniciar la degradación celular de la misma
(Duckworth et al., 1998). Esta IDE hepática es una proteasa activada por Ca++ (Ryan et
al., 1985). Andrews et al., (1988) observaron además, que el HCB afecta el
metabolismo del calcio promoviendo su acumulación, mediante la 1,25-diOH-vitamina
D3 y la hormona paratiroidea (PHT), cuyos niveles están aumentados significativamente
en ratas intoxicadas con HCB.
Con esos datos podría hipotetizarse, que los niveles disminuidos de insulina
plasmática del presente trabajo podrían ser reflejo de una degradación incrementada de
esta hormona, como consecuencia de la activación de IDE por concentraciones
incrementadas de Ca++, promovidas por el pesticida clorado HCB (Esquema Integrador
1, pág 184).
La perturbación que el HCB produce en el estado hormonal es un proceso
temprano, no sólo para la CORT (Foster et al., 1995), sino también para la T4 (Kleiman
de Pisarev et al., 1990). El efecto sobre los niveles plasmáticos se alcanza después de dos
semanas de finalizada la intoxicación, es decir, antes del disturbio general que provoca
190
Discusión
el HCB en el camino del hemo. De hecho, la alteración en la biosíntesis del hemo es
evidente recién a partir de la 4ª semana cuando el efecto es determinado por el aumento
de las porfirinas urinarias marcadoras del inicio y el desarrollo de porfiria, como
también se ha descripto en otros trabajos con ratas Wistar (Kleiman de Pisarev et al.,
1990; Billi de Catabbi et al.; 2000) donde una disminución significativa de URO-D
también se observó en paralelo a los mismos tiempos.
En consecuencia es interesante destacar que los resultados aquí presentados,
trabajando con la misma cepa de ratas y bajo las mismas condiciones experimentales,
podrían indicar que el nivel de CORT es un biomarcador más sensible para la
determinación de la intoxicación por HCB, que el aumento en la excreción de porfirinas
o la disminución de la actividad enzimática de URO-D.
El papel de los glucocorticoides y de sus receptores en el bloqueo de la
gluconeogénesis, fue así estudiado en el modelo de PCT por HCB. Este estudio se
realizó en el hígado de animales previamente adrenalectomizados y porfíricos (pasadas
las 8 semanas desde el tratamiento) y en relación con el efecto que el HCB tiene sobre
la actividad de la enzima PEPCK. Los resultados muestran que el compuesto clorado
HCB interfiere severamente con el metabolismo de los GC, y con su acción mediada
por los receptores. Estas alteraciones estarían relacionadas con la disminución de la
PEPCK. Por lo tanto, la reducción de los niveles plasmáticos de CORT, de su síntesis
adrenal y la merma del número de receptores, contribuirían a la disminución de esta
enzima y al bloqueo gluconeogénico relacionado que el tóxico provoca.
En resumen, esta parte del trabajo, muestra que el xenobiótico HCB, además de
producir graves disturbios en la vía del hemo dando lugar a una porfiria, promueve una
alteración hormonal de GC temprana e importante que resulta en un bloqueo de la
gluconeogénesis. De hecho, el xenobiótico provoca un descenso drástico en la síntesis
adrenal y en el nivel circulante de CORT, así como en el número de sus receptores
hepáticos. Esta alteración hormonal podría contribuir al control negativo de la síntesis
de glucosa a través de la regulación de la PEPCK, modulando la porfiria (Esquema
Integratorio 2, pág 194).
191
Discusión
Además, los disturbios promovidos por el HCB, también contribuyen a aumentar
el conocimiento sobre el desarreglo hormonal producido por este xenobiótico de alta
persistencia.
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO EN ESTE MODELO
DE PCT EXPERIMENTAL POR HCB
Puesto que ya se ha demostrado que la administración de TRP resulta en
hipoglucemia y que el TRP y sus metabolitos alteran la gluconeogénesis hepática
(Smith & Pogson, 1977), otro posible agente responsable de la disminución de la
gluconeogénesis podría ser dicho compuesto. Sin embargo, la cinética de alteración en
las actividades de las enzimas gluconeogénicas (PEPCK, PC y G6Pasa) y la del TRP no
son coincidentes. El aumento de TRP sólo fue observado en las últimas semanas del
tratamiento con HCB y podría ser debido a la marcada desregulación en la vía
metabólica del hemo, observada a estos tiempos como consecuencia de una disminución
drástica y sostenida en la actividad URO-D. Este hecho podría causar una disminución
en los niveles de hemo y esa disminución provocaría una reducción en la actividad de
TRP pirrolasa, ya que es una enzima cuyo grupo prostético es el hemo.
Sabiendo que la actividad de la TRPp es el paso limitante que regula la
disponibilidad fisiológica general del TRP, su descenso podría generar un aumento de
tal aminoácido. A este respecto, Weber et al. (1992) encontraron una fuerte disminución
de la actividad TRPp en el hígado de las ratas tratadas con TCDD, con un aumento
concomitante de los niveles plasmáticos de TRP y una disminución de la actividad
PEPCK. Por lo tanto, si el TRP contribuye a la disminución de la PEPCK, de alguna
manera estaría involucrado en las fases más tardías de la intoxicación con el fungicida.
Así, el TRP añadiría su efecto a la acción ejercida por el resto de los factores antes
mencionados.
192
Discusión
CONCLUSIÓN PARA EL MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA CRÓNICA POR HCB
El HCB bloquea la síntesis de glucosa, la liberación de glucosa desde sus
depósitos hepáticos, el transporte de glucosa al hígado y aumenta el almacenamiento de
glucosa como glucógeno. Todos estos disturbios contribuyen y llevan a una menor
disponibilidad de glucosa del hepatocito y a una menor concentración de glucosa
plasmática. Las posibles causas del descenso en su neosíntesis, podrían ser los múltiples
efectos negativos promovidos por el HCB sobre la PEPCK y ejercidos: 1) a través de los
GC y sus receptores (debido a la falta de estímulo por los niveles deprimidos en ambos
parámetros); 2) a través de ROS (debido al efecto deletéreo ejercido por su incremento);
3) en menor medida a través de TRP (debido al efecto inhibitorio del TRP aumentado).
El HCB podría también perturbar directamente la neosíntesis actuando sobre la G6Pasa,
dado que esta enzima está asociada a membrana y el HCB se incorpora entre las cadenas
de ácidos grasos de las membranas lipídicas.
Se postula que la disminución provocada por el HCB sobre la capacidad
biosintética de los GC de la glándula adrenal, podría ser debido a una falla en alguna de
las enzimas esteroideogénicas, como la CYP C21-hidroxilasa o C11-hidroxilasa, claves
en la biosíntesis de los GC. Disturbio que estaría provocado por el HCB, que se acumula
en glándula adrenal más que en hígado. La respuesta más temprana de los GC respecto a
las porfirinas urinarias y a la URO-D, los constituye como biomarcadores más sensibles
que los del camino del hemo, preferentemente a nivel de corticosterona en plasma
(CORT), para determinar una intoxicación por HCB.
Con respecto a la insulina, los disturbios provocados por el HCB en el status de
esta hormona, sugerirían que no son la causa primaria de la actividad reducida de la
PEPCK. Por el contrario los cambios inducidos por HCB en la homeostasis de la
insulina, serían una respuesta compensatoria del organismo para estimular la
gluconeogenesis y se deberían posiblemente a un incremento de la enzima que degrada
insulina como consecuencia de la activación de IDE por concentraciones incrementadas
de Ca++, promovidas por el pesticida clorado HCB.
193
Discusión
Esquema Integratorio 2: Esquema que muestra las acciones directas e indirectas del tratamiento con HCB
en distintas rutas metabólicas (hemo, hidratos de carbono, TRP, GC, cadena de transporte de electrones y
producción de ROS). Muestra la doble de-represión del ALA-S por la disminución de hemo y de la glucosa y
la triple contribución de ROS, TRP y GC al descenso de PEPCK.
ETC: cadena de transporte de electrones; UGT: UDP-glucuronosil-transferasa; CYP: citocromo-P450;
ROS: especies reactivas de oxígeno; TRP: triptófano; TRPp: TRP pirrolasa; GC: glucocorticoides;
flechas al costado de los compuestos indican incrementos o decrementos en niveles o actividad; (≈): no
hay variaciones significativas.
El HCB se une al CYP, desacopla la ETC de la actividad de monooxigenasa y favorece la producción de
ROS que por un lado generan al inhibidor de la URO-D, por oxidación del URO´gen, inhibiendo así el
camino del hemo (pool de hemo reducido) y de-reprimiendo a la ALA-S produciendo porfiria. Por otro
lado las ROS contribuyen al descenso de PEPCK, a la peroxidación de lípidos y a la dismuinución de
GP. El hemo reducido lleva por un lado a una TRPp disminuida y al aumento de TRP que a su vez
contribuye al descenso de PEPCK. Por otro lado esa reducción en el hemo lleva a CYP reducido y a una
síntesis disminuida de GC-CYP dependiente. A esta disminución de GC se suma el aumento de su
degradación que produce la UGT estimulada por HCB. Los GC disminuidos contribuyen al descenso de
PEPCK. El descenso de glucosa por bloqueo de la PEPCK, PC y G6Pasa, el bloqueo glucógenolitico
(GP) y el aumento de la glucogenogénesis (GS) llevan a la de-represión de la ALA-S que se suma a la derepresión provocada en esta enzima por la caída de hemo.
194
Discusión
Se sugiere que la PEPCK podría estar reducida por acción de las ROS
incrementadas, alterando quizás la transcripción génica de la enzima, actuando ya sea
directamente sobre el DNA o indirectamente sobre factores de transcripción a través de
fosforilaciones dependientes de kinasas.
Respecto al acúmulo de TRP podría ser debido a una baja actividad de TRPp
(primer paso de la vía quinurenérgica), ya que la TRPp es una enzima hémica y la
síntesis de hemo está sumamente deteriorada en animales porfíricos por HCB, debido al
drástico bloqueo (95%) que la droga produce sobre la URO-D y que lleva a la masiva
sobreproducción de porfirinas hepáticas altamente carboxiladas y al agotamiento de los
depósitos de hemo.
Dado que la glucosa reprime el ALA-S, los niveles bajos de glucosa aquí
reportados, modularían en consecuencia a esta porfiria, exacerbándola. El decremento de
la glucosa ejercería un efecto “de-represor” sobre la sintetasa (ALA-S), enzima
regulatoria del camino del hemo, y esta “de-represión” se sumaría a la que produce el
agotamiento del hemo inducido por el tratamiento con la droga HCB. En esta porfiria se
postula entonces, una doble “de-represion” de ALA-S, una mediada por la depleción de
hemo y otra por la disminución de la glucosa (Esquema Integratorio 2).
Estos resultados contribuyen a comprender el efecto terapéutico, preventivo y
modulador del tratamiento de las porfirias hepáticas humanas y experimentales con
glucosa y/o dietas ricas en carbohidratos.
195
Discusión
5.2. MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA POR AIA/DDC
¿CÓMO SE DESREGULA EL CAMINO DEL HEMO EN ESTE MODELO
EXPERIMENTAL DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA?
El modelo de porfiria hepática inducido por AIA y DDC que se discute en esta
parte de la Tesis, demostró ser capaz de promover una clara porfiria aguda. Esto se
evidencia en la alteración de la biosíntesis del hemo, con la característica acumulación
de sus precursores: ALA, mostrando un incremento del 280% y PBG uno de 5000% en
cuanto a contenidos hepáticos. Todo ello acompañado de una definida desregulación del
camino del hemo, evidenciada por un aumento del 300% de su enzima clave y
regulatoria, ALA-S. Esta desregulación fue consecuencia de dos acciones paralelas, por
un lado, un bloqueo del 50% producido por el DDC sobre la actividad de la enzima FQ,
que es la encargada de insertar una molécula de hierro a la protoporfirina IX para
sintetizar el grupo hemo; y por otro lado, de la degradación incrementada del pool de
hemo por acción tanto del AIA, como del DDC. Ambas acciones producen depleción de
hemo en la célula y así una marcada de-represión de ALA-S. La respuesta de los
parámetros estudiados fue dosis-dependiente y los porcentajes indicados corresponden a
la mayor dosis utilizada.
Ambas drogas porfirinogénicas, AIA y DDC, agotan el pool de hemo libre
provocando un desequilibrio en su camino biosintético. El AIA, actúa a través de la Nalquilación del grupo hemo, generando N-alquil-PROTO “pigmentos verdes” que
conducen al proceso suicida e irreversible de la inactivación del CYP (Esquema
Integratorio 3). En este proceso, el grupo hemo del CYP se destruye y en consecuencia,
el hemo libre disminuye, al intentar compensar dicha pérdida (Smith & De Matteis,
1980; Ortiz de Montellano & Mico, 1981).
Por su parte, el DDC, produce destrucción del hemo por N-alquilación, a traves
del grupo 4-Me que metila y conduce a la formación N-metil-PROTO, y al mismo
tiempo, reducción de la síntesis del hemo por acción de esa N-metil-PROTO que actúa
como un poderoso inhibidor de la actividad FQ, enzima de su síntesis (Marks et al.,
1988), (Esquema Integratorio 3).
196
Discusión
A su vez, Whiting & Granick (1976) han demostrado que, en un modelo
generado en hígado de embrión de pollo después de 18h de la intoxicación con una
combinación de estas mismas drogas, se puede inducir un incremento de 600 veces la
actividad de ALA-S.
Como fue desarrollado en la introducción de esta Tesis, las porfirias agudas en
humanos (AD-P, PAI, CPH, PV) son las más susceptibles al desencadenamiento y
exacerbación por drogas y factores metabólicos, pudiendo disparar así sus
manifestaciones clínicas (Elder, 1998a; Thadani et al., 2000; Thunell, 2000). Como
resultado, se produce una disminución de los depósitos de hemo hepático, por aumento
en su degradación o represión de su síntesis, lo que causa inducción del ALA-S hepático
y consiguiente aumento de precursores de la vía. Por tanto, en comparación al modelo
animal aquí presentado, en las porfirias humanas se genera también una deficiencia
aguda de hemo, marcada de-represión de la enzima ALA-S y exacerbación de la
producción de precursores del camino en el hígado, generando ataques de porfiria
(Tschudy & Bonkowsky, 1972).
En este trabajo, se presenta un modelo animal, que si bien no mimetiza desde el
punto de vista bioquímico con exactitud a una porfiria hepática aguda humana de las
descriptas, semeja con bastante fidelidad las características de las porfirias agudas en
general, en cuanto a alteraciones enzimáticas (ALA-S y FQ) y aumento de precursores.
De hecho, los primeros informes sobre la PV humana, describían una inhibición de la
actividad FQ y aumento de precursores de la vía por desregulación de ALA-S (Cole &
Marks, 1984).
Las drogas porfirinogénicas AIA y DDC pueden por tanto estimular
marcadamente la actividad de la enzima ALA-S por disminución del pool de hemo
hepático, reduciendo su control normal por retroalimentación (Moses et al., 1970;
Meyer & Marver, 1971; Whiting & Granick, 1976) lo que lleva a la acumulación de los
precursores ALA y PBG en el hígado y excreta en exceso de los mismos en orina,
generándose así un modelo de porfiria aguda en animales (Smith & De Matteis, 1980;
Marks et al., 1988).
197
Discusión
ALTERACIONES EN LAS ENZIMAS CLAVES DEL METABOLISMO DE LA GLUCOSA.
El hígado juega un papel importante en la homeostasis de la glucosa en sangre,
mediante el mantenimiento de un equilibrio entre la degradación y la producción de
glucosa, a través de la glucólisis, glucógenolisis y la síntesis de glucosa de novo (Hers,
1990; Nordlie et al., 1999). El modelo agudo aquí presentado fue muy útil para
relacionar este tipo de porfiria con las alteraciones de las enzimas claves del
metabolismo de la glucosa: PEPCK y G6Pasa para la gluconeogénesis; y PK para la
glucólisis.
La capacidad del AIA junto al DDC para generar porfiria se evidenció en la
inducción del ALA-S, que fue dependiente de la dosis y estadísticamente significativa
en cada una ellas. Acompañando esta inducción, se observó una disminución notable y
también dosis dependiente de las enzimas citosólicas PEPCK y PK, y una más leve y
observada solo en la dosis más alta, sobre la actividad microsomal de la enzima
gluconeogénica G6Pasa.
Si bien se existe una reducción de ambas actividades gluconeogénicas, que por sí
solas podrían conducir a una disminución de la glucosa disponible en el hepatocito,
también se comprobó un deterioro en la actividad de la enzima glucolítica PK. Los
resultados sugerirían que dicha merma se da en contraposición a la primera, para no
exacerbar aun más la falta de glucosa, contrarrestando y/o balanceando en parte el
bloqueo gluconeogénico recién descripto. Estos resultados demuestran por primera vez,
que la alteración causada por el AIA/DDC sobre esta enzima clave de la glucólisis,
daría lugar a un efecto compensatorio sobre la disponibilidad de la glucosa hepática en
animales intoxicados.
Retomando el tema del desbalance gluconeogénico, la enzima PEPCK mostró
también actividad deficiente en un modelo, en el que la administración de fenobarbital
(inductor hepático del CYP) y 3´,5´-dicarbetoxi-2,6-dimetil-4-etil-1,4-dihidropiridina
(inhibidor suicida del CYP) causó una brusca merma del pool de hemo hepático
(Correia & Lunetta, 1989). Dicho modelo presenta un patrón de acumulación de
intermediarios gluconeogénicos proximales a la PEPCK, como el malato y el aspartato
198
Discusión
que se vieron incrementados de manera significativa, mientras que los intermediarios
distales fueron suprimidos totalmente.
Como se expuso en el capítulo precedente, la PEPCK también mostró una menor
actividad en la intoxicación crónica con el fungicida HCB. En ese caso, el efecto del
tiempo transcurrido desde la intoxicación con el xenobiótico sobre la actividad
enzimática, mostró una disminución temprana, que se intensificó en el tiempo. Stahl et
al., (1993) también informaron una disminución de la PEPCK hepática en ratas tratadas
con otra droga porfirinogénica, como el TCDD, debido a una reducción en los niveles
de sus mRNA.
Una de las probables causas de disminución en las actividades enzimáticas en
este modelo agudo, podría deberse a un estado alterado del estrés oxidativo, hecho que
será discutido mas abajo en el ítem referente a las interferencias en el sistema redox.
DAÑOS SOBRE EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO.
Como fue reportado en la sección Resultados de esta Tesis, también se
observaron alteraciones de las enzimas del metabolismo del glucógeno, lo que generó
niveles aumentados en el contenido de glucógeno hepático de hasta 4 veces respecto al
control, en la dosis más alta de AIA/DDC utilizada. Además se observa que este
aumento del contenido de glucógeno hepático resulta dependiente de las dosis
administradas, lo que conduciría a una menor disponibilidad de glucosa libre.
Asimismo se observó que las actividades de estas enzimas del metabolismo del
glucógeno, las involucradas en su síntesis y en su degradación, fueron también
dependientes en función de la dosis de las drogas porfirinogénicas administradas. La
más afectada fue la enzima glucógenolitica, glucógeno fosforilasa (GP) que disminuye
al 50% en la dosis máxima; y en menor grado la enzima glucógenogenica, glucógeno
sintetasa (GS) que aumenta un 30% a igual dosis. En cuanto a estas enzimas, no hay
informes anteriores sobre la determinación de sus actividades en modelos de porfiria
aguda. Estos efectos, estimulador para la síntesis y depresor para la degradación, se
199
Discusión
corresponden con el aumento tan marcado de los niveles de glucógeno hepático, que
aquí se describen.
Por otra parte, la captación de glucosa en tejido hepático, mostró de igual forma
un incremento dependiente de la dosis, que alcanzó un 50% de aumento para la dosis
máxima ensayada. Es decir, la célula hepática captaría más glucosa para intentar
contrarrestar los defectos mencionados en los ítems anteriores (aumento en la actividad
de GS, descenso en la actividad de GP y descenso en enzimas de la gluconeogénesis:
PEPCK y G6Pasa).
En la discusión acerca del modelo de porfiria crónica causada por la
administración
de
HCB
a
ratas
Wistar,
estas
enzimas
glucógenolitica
y
glucógenogenica, GP y GS respectivamente, también mostraron una variación similar
en sus actividades, al compararlas con los animales controles. Por otra parte, en estudios
ultraestructurales de tejido hepático de ratas tratadas con HCB, se observó un cambio
importante en las regiones celulares que normalmente contienen retículo endoplásmico
liso. La proliferación del mismo se asoció a tratamientos con dosis bajas de HCB,
mientras que el aumento de productos de almacenamiento sustituyendo al retículo, se
observó en dosis mayores de HCB (Mollenhauer et al., 1975). También se observó que
numerosas partículas de glucógeno aparecieron en extensas áreas del citoplasma de los
hepatocitos situados en la zona intermedia, mientras que sólo pocas monopartículas de
glucógeno fueron depositadas en la zona centrilobullar (Böger et al., 1979). Estos
informes demuestran que en el modelo de HCB, hay un aumento del glucógeno
hepático.
Estos resultados demuestran por primera vez, que los daños causados por el
tratamiento con AIA/DDC en la síntesis y en la liberación de glucosa de sus depósitos,
llevaría a un déficit en la disponibilidad de glucosa hepática libre en los animales
tratados. Cooperan a este déficit las alteraciones vistas en la gluconeogénesis. En un
intento por compensar la baja de glucosa, los animales porfíricos reducen a la mitad la
actividad glucolítica de PK y tratan de captar más glucosa.
200
Discusión
OTRA POSIBLE CAUSA DEL DESCENSO DE PEPCK y GP - INTERFERENCIAS EN
EL SISTEMA REDOX
Teniendo en cuenta que el ALA es capaz de generar radicales libres y especies
reactivas de oxígeno (ROS) que actúan como pro-oxidantes tanto in vivo como in vitro
y que el AIA/DDC produce aumento del ALA en hígado, se estudió la producción de
ROS en busca de las causas del descenso de PEPCK y GP.
Los incrementos hallados y aquí presentados en relación a los marcadores del
estado oxidativo fueron múltiples: aumento en el contenido de proteínas carboniladas,
aumento en las TBARS, aumento en la quimiolumiscencia urinaria (QL) y aumento en
la respuesta antioxidante de SOD. Todos estos incrementos confirman el estrés
oxidativo e indican que la acumulación de ALA, proveniente de la desregulación de la
ALA-S, promueve un ambiente oxidativo en los animales con esta porfiria aguda por
AIA y DDC. En este sentido se observó, que el estrés oxidativo puede ser
desencadenado por exceso de ALA, tanto en el caso de una porfiria aguda intermitente
(PAI), como en el envenenamiento accidental por plomo (Bechara, 1996).
En base a los patrones similares que exhiben tanto las actividades enzimáticas de
PEPCK y GP como los marcadores de estrés oxidativo medidos, en sus respuestas a las
diferentes dosis de AIA/DDC, se sugiere un vínculo entre las ROS y los decrementos
de PEPCK y GP. Considerando la relación dosis-respuesta observada en la
carbonilación de proteínas citosólicas y en las actividades enzimáticas de PEPCK y GP
(enzimas citosólicas) en el tratamiento con AIA/DDC, se sugiere que el decremento de
dichas actividades enzimáticas podrían deberse en parte al daño oxidativo que sufren
sus estructuras proteicas durante la carbonilación de las mismas que se vio aumentada.
A ese respecto, en lo concerniente a GP, como puede verse en figura 5.1, la lys
681 responsable del binding de fosfato de piridoxal (cofactor necesario para la actividad
enzimática) y las Cys 109 y 143, implicadas en la asociación de las subunidades que
permiten una conformación proteica activa de la GP, serían aminoácidos blancos para la
carbonilación.
201
Discusión
Figura 5.1. Secuencia aminoacídica de la GP de tejido hepático de rata: Se indican los aminoácidos Cys
(C109, C143) y Lys (K681) importantes para la estructura y catálisis, que serían target de carbonilación
(Schiebel et al., 1992).
Esta carbonilación de GP en sitios clave para su función enzimática llevaría a la
disminución de su actividad en los animales tratados con AIA/DDC tal como se
determinó experimentalmente.
Por lo tanto, el ALA acumulado produciría radicales libres que afectarían
negativamente la estructura y actividad GP, impidiendo la disponibilidad de glucosa
libre a partir de sus depósitos. Quizás sea este uno de los defectos subyacentes de los
pacientes con porfiria aguda, que hace que la administración exógena de glucosa los
beneficie.
202
Discusión
Los descensos que aquí se presentan en el modelo de AIA/DDC, están en
concordancia con los alcanzados por otras drogas, tales como las recién mencionadas,
HCB y TCDD (mostrado en la primer parte de la discusión; Stahl et al., 1993). De
acuerdo con estos resultados, las disminuciones observadas en el modelo agudo, darían
lugar a una disponibilidad insuficiente de glucosa dentro del hepatocito.
En el desarrollo de esta Tesis se mostró por otra parte, que la actividad CAT
sufrió una disminución leve, pero estadísticamente significativa, debido a la reducción
del pool de hemo libre provocada por ambas drogas. Esto era de esperarse, si se
consideraba la naturaleza de dicha enzima, dado que la CAT es una hemoproteína (Price
et al., 1962). Esa depleción de hemo no le permite así a esta enzima expresar su
respuesta antioxidante.
Respecto a la PEPCK, se sugiere que el decremento de su actividad enzimática
podría deberse en parte al daño oxidativo que sufre su estructura proteica al ser
carbonilada por parte de las ROS. En este sentido, PEPCK es susceptible de sufrir el
proceso de carbonilación de proteínas debido a la composición de su sitio activo, rico en
aminoácidos propensos a este tipo de modificación oxidativa como son Arg, Lys, y Thr,
altamente conservados en una variedad de especies (Figura 5.3; Aich et al., 2003).
Además, también se encuentran otros aminoácidos que sufren reacciones de oxidación
directa por ROS como la fenilalanina.
Por otra parte, los grupos carbonilos pueden ser introducidos a las proteínas a
través de una reacción secundaria de las cadenas laterales nucleofílicas de los
aminoácidos Cys, His, Lys, con aldehídos producidos por la formación de TBARS
durante la peroxidación lipídica (Dalle-Donne et al., 2003).
El aumento de peroxidación lipídica que se observa en este modelo, avala
también el estrés oxidativo en esta porfiria aguda inducida y contribuye a que se
produzca el evento de carbonilación mencionado anteriormente.
203
Discusión
Figura 5.2: Grupos carbonilos, aldehídos y cetonas se genereran a partir de las cadenas laterales de las
proteínas cuando son oxidadas (especialmente sobre las Pro, Arg, Lys, y Thr) Dalle-Donne et al., (2003)
Los resultados demuestran por primera vez, que las alteraciones causadas por el
AIA/DDC en enzimas claves relacionadas con la glucosa, implicadas en la síntesis y en
su liberación, darían lugar a un déficit en la disponibilidad de glucosa de los hepatocitos
de los animales tratados. Por lo tanto, en los pacientes que padecen porfiria hepática
aguda, el estrés oxidativo causado por la gran acumulación de ALA, actuaría sobre la
estructura de las proteínas de enzimas claves del metabolismo de los hidratos de
carbono, disminuyendo en definitiva, la cantidad de glucosa hepática disponible.
Figura 5.3. Secuencia aminoacídica comparativa de la enzima PEPCK de: C. glutamicum; citosol
hepático humano; citosol hepático de rata y de E. coli. Los residuos subrayados están localizados en el
sitio activo de la PEPCK, los cuales están muy conservados tanto en la forma GTP-dependiente como en
la ATP-dep. de E. coli. Los residuos de fenilalanina subrayados y en Itálica (F517, F525, F530) forman
el bolsillo de binding conservado de la forma GTP-d. Aich et al., (2003).
204
Discusión
Aquí también se demuestra que las ROS, generadas a partir de la acumulación
del ALA tienen un efecto perjudicial sobre los lípidos, y especialmente sobre los lípidos
de la membrana microsomal, actuando de la misma forma en la que sucede la pérdida de
la actividad PEPCK. Este bloqueo, junto con el deterioro de la actividad glucógenolitica
GP, promueve una baja de la glucosa hepática generado por las drogas AIA/DDC.
MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE PREVENTIVO EN LA INTOXICACIÓN
AGUDA POR AIA/DDC.
La melatonina (Mel) es un conocido antioxidante, secuestrante de radicales
libres y efectivo agente protector en numerosas patologías experimentales (Reiter,
1998a y 1999; Ng et al., 2000; Reiter et al., 2000). Se ha observado que la Mel es un
efectivo atrapante de radicales hidroxilo y radicales peróxido generados durante la
oxidación de los lípidos. Además, puede estimular la actividad de algunas enzimas
antioxidantes (Reiter et al., 1997a, 2000). Estas funciones están favorecidas por la
facilidad con que atraviesa las barreras morfo-fisiológicas y penetra en las células y en
compartimientos subcelulares (Reiter et al., 1997b, 2000).
Por lo tanto, era de esperar que la administración de Mel resultara beneficiosa
para el tratamiento de la sintomatología hepática aguda en animales porfíricos. Se
decidió así, investigar la capacidad de la Mel para revertir y/o prevenir el daño causado
en diversas vías metabólicas por la intoxicación con AIA/DDC.
La Mel per se no produjo modificaciones en los parámetros estudiados. No
fueron alterados ni el camino del hemo (salvo que redujo levemente al PBG eliminado
por orina), ni las enzimas del metabolismo de la glucosa, ni la peroxidación lipídica
hepática.
Sin embargo la administración de la hormona Mel previa a la intoxicación de
ratas con AIA/DDC muestra un claro efecto benéfico en los tres metabolismos
investigados. Así en el camino del hemo, se reporta un descenso en la excreción de
precursores ALA y PBG del 25 y 28% respectivamente, una disminución de la
inducción de la enzima regulatoria ALA-S del 30% y una reversión parcial de la
205
Discusión
inhibición de la FQ. La administración de Mel tuvo también un efecto benéfico a nivel
de las enzimas de la biosíntesis de glucosa. En efecto, su administración conjunta con
AIA/DDC restauró en un 25% la actividad de PEPCK y recuperó en un 8% la de la
G6Pasa. Asimismo se observó que el status oxidativo mejoró como consecuencia de la
administración conjunta de Mel + AIA/DDC respecto al producido por las drogas
porfirinogénicas solas, tanto en homogenato como en microsomas, alrededor de 20% en
ambos casos.
La administración de la hormona previa a la intoxicación de ratas con
AIA/DDC, logró una reducción significativa de la excreta de ALA y PBG por orina, si
bien no se alcanzó una reversión completa. También la actividad de ALA-S inducida
por las drogas se redujo cuando la Mel fue suministrada preventivamente, aunque la
reversión de la de-represión de esa enzima causada por la intoxicación aguda fue
parcial.
En diversas publicaciones se ha indicado que la Mel es un atrapante de radicales
libres y un potente antioxidante (Reiter, 1998a; Hardeland et al., 2003; Hardeland &
Pandi-Perumal, 2005; Tan et al., 2007), y en esta parte del estudio se pudo comprobar
una sustancial recuperación en las actividades de las enzimas gluconeogénicas PEPCK
y G6Pasa, que puede hacer suponer que la Mel es capaz de restablecer el mecanismo de
defensa antioxidante de la célula y ejercer un efecto protector sobre las enzimas, tanto
citosólicas como microsomales, contra el daño inducido por las drogas utilizadas.
Todos estos resultados nos hablan del papel e importancia de las especies
reactivas en el desarrollo de la porfiria y en los disturbios ocasionados en el
metabolismo de los hidratos de carbono, así como del efecto benéfico de la Mel que fue
un efectivo protector para el hígado de las ratas y podría ser usado como co-tratamiento
en pacientes con porfiria aguda.
206
Discusión
PERTURBACIONES EN EL METABOLISMO DEL TRP EN ESTE MODELO DE
PORFIRIA AGUDA
En el desarrollo de esta Tesis también se demostró, que el tratamiento
combinado con AIA/DDC deteriora la ruta serotoninérgica del metabolismo del
triptófano (TRP), causando una disminución en el nivel de serotonina (5-HT) y
concomitante aumento en el contenido hepático de TRP.
Al respecto, se ha demostrado que la administración del TRP resulta en
hipoglucemia y que el TRP y sus metabolitos alteran la gluconeogénesis hepática
(Smith & Pogson, 1977), mientras que los niveles de TRP hepático aumentan
significativamente en ratas porfíricas por HCB (Llambías et al., 2003).
Esta acumulación moderada de TRP, llevaría al aumento de la enzima triptófano
pirrolasa (TRPp). Así, se ha informado que el TRP produce un incremento vía sustrato
de la TRPp, que involucra la reducción en la degradación de la apoenzima prexistente,
pero con una velocidad de síntesis normal (Schimke et al., 1965; Knox, 1966; Badaway
& Evans, 1975).
Los efectos causados por este moderado aumento en la concentración hepática
de TRP in vivo, tal como es observado aquí, junto a la activación de la enzima TRPp in
vitro (Knox, 1966), sugieren que ambos eventos están involucrados en la conjugación
del hemo con la apoenzima y la subsecuente reducción de la holoenzima oxidada.
Luego de iniciada dicha conjugación, el TRP mantiene la forma activa y la protege
contra las enzimas de degradación, disminuyendo la disociación de la holoenzima en
hemo y apoenzima inactiva. Estos hechos favorecen a la TRPp sobre otras proteínas, en
la competencia por el grupo prostético. Esto conduce a un aumento en la actividad de la
holoenzima, como se observa en este modelo de ratas porfíricas tratadas con AIA/DDC.
Se puede especular que el tratamiento con AIA/DDC aumenta la síntesis de la
apoenzima y por consiguiente su actividad. Esta especulación se basa en las siguientes
consideraciones: (a) la propuesta de que el TRP aumenta la TRPp con una tasa normal
de síntesis de enzima, (b) los resultados que muestran que el tratamiento con AIA/DDC
promueve el aumento de actividad de la apoenzima más que de la holoenzima o la
enzima total, y (c) informes anteriores que muestran que la apo-TRPp tiene una vida
207
Discusión
media corta (cuatro veces más corta que la holoenzima) y por lo tanto es una especie
altamente susceptible a moduladores de la síntesis de proteínas (Badaway & Evans,
1975; Correia & Burk, 1978).
En los ensayos realizados en este trabajo, se mostró un aumento dependiente de
la dosis en todas las formas de TRPp, las activas (holo y total) y la inactiva (apo), y una
disminución en el grado de saturación de la enzima por el hemo, como consecuencia del
tratamiento combinando con AIA/DDC. Estos resultados concuerdan con los de
Badawy & Evans (1973), quienes informaron que la administración de estas drogas
porfirinogénicas solas y en una dosis fijas (AIA, 400 mg/ kg p.c. o DDC, 150 mg/ kg
p.c.) a ratas macho Wistar aumentaban la actividad total de la TRPp y simultáneamente
generaban una disminución de la saturación por hemo sobre la apoenzima recién
formada.
Sin embargo, la administración de 3´,5´-dicarbetoxi-2,6-dimetil-4-etil-1,4dihidropiridina (DDEP, análogo del DDC, inhibidor suicida del CYP y destructor agudo
de hemo) junto con el fenobarbital (FB, inductor hepático del CYP) probó reducir la
actividad de la TRPp (Correia & Lunetta, 1989). Esta discrepancia puede atribuirse al
hecho de que, aunque las sustancias porfirinogénicas DDEP y FB producen agotamiento
del pool de hemo, no promueven acumulación hepática de TRP como en el presente
modelo de porfiria. En lugar de TRP, que como se discutió anteriormente exacerba la
TRPp, estas drogas provocaron una acumulación hepática de 5-HT. En la ruta
serotoninérgica por lo tanto, estas drogas tienen un efecto diferente que el del
AIA/DDC.
Los datos muestran que la TRPp se incrementa en todas sus formas, mientras
que la saturación de la enzima por hemo se reduce, lo que parece ser una paradoja,
considerando la naturaleza hemo-proteica de la enzima TRPp y el efecto destructor que
tienen las drogas porfirinogénicas utilizadas sobre el hemo, para generar esta porfiria
hepática aguda. Con esta disminución del hemo, de hecho, podría esperarse que se
reduzca la actividad de la TRPp en lugar de aumentarse.
El AIA incrementa la destrucción del hemo hepático, y el DDC por un lado
promueve la inhibición de la FQ, lo que acarrea una disminución en la síntesis del grupo
208
Discusión
hemo y por otro, exacerba la degradación del mismo (Smith & De Matteis, 1980;
Litman & Correia, 1983). A pesar de la disminución en el pool de hemo, el aumento en
la síntesis de la apoenzima provocado por esta intoxicación da cuenta de la baja
saturación de la enzima por el hemo y de la formación aumentada de holoenzima, con el
fin de competir con otras proteínas que requieren este tipo de complejo porfirínico como
grupo prostético. La mayor formación de holoenzima es también una consecuencia del
múltiple y positivo efecto del aumento del TRP.
En el modelo de porfiria aquí estudiado, el metabolismo del TRP está
incrementado hacia la ruta quinurenérgica, la vía del NAD, mientras que se ve reducido
hacia la ruta serotoninérgica. Los resultados mostraron una mayor formación de
quinurenina en animales porfíricos, lo que acuerda con trabajos previos que informaron
que los pacientes con porfiria, presentan una mayor excreción urinaria de metabolitos
del TRP de la vía quinurenérgica (Price, 1961). El patrón de excreción de los
metabolitos en orina reportado por Price (1961) es consistente con una mayor actividad
de la TRPp, que conduce a una deficiencia funcional de la vitamina B6, manifestada en
la excreción anormal de algunos metabolitos implicados en reacciones catalizadas por
enzimas que requieren fosfato de piridoxal a lo largo de la ruta metabólica (Badaway &
Evans, 1973). Además, se ha informado que las ratas con deficiencia de piridoxina,
excretan cantidades anormalmente grandes de quinurenina y ácido xanturénico (White
et al., 1964). Ello es debido a que se vería afectada por la deficiencia vitamínica, la
enzima quinureninasa que trabaja con fosfato de piridoxal y es la encargada de la
degradacion de quinurenina (Fig.1.11, Pag 75). Dado que los resultados aquí obtenidos
indican: que la formación de quinurenina es mayor en animales porfíricos (90% de
incremento), que la quinurenina vía 3-hidroxiantranilato forma quinolinato, y que el
TRP podría inhibir la gluconeogénesis al ser convertido en ácido quinolínico
(compuesto cuya complejo ferroso coordinado inhibe a la PEPCK, Veneziale et al.,
1967), podría especularse que el bloqueo de la PEPCK inducido por el AIA/DDC sería
causado por el ácido quinolínico generado a partir de TRP (Esquema Integratorio 3. Pág
210). Resultados de nuestro laboratorio demuestran que el nivel total NAD se ve
incrementado por el tratamiento con AIA/DDC en este mismo modelo de porfiria (Faut,
2007). Esto podría reflejar el aumento del nivel de quinolinato, dado que el NAD se
forma a partir quinolinato, a través del ácido nicotínico (Esquema Integratorio 3).
209
Discusión
Esquema Integratorio 3: Esquema que muestra las acciones directas e indirectas del tratamiento con
AIA/DDC en distintas rutas metabólicas (hemo, hidratos de carbono, TRP y producción de ROS).
Muestra la doble de-represión del ALA-S por la disminución de hemo y de la glucosa; y la contribución
de ROS y TRP al descenso de PEPCK.
GP: glucógeno fosforilasa; GS: glucógeno sintetasa; Gly: glicina; ALA-S: aminolevulinato-sintetasa;
PBG: porfobilinógeno; Proto IX: protoporfirina IX; PEPCK: fosfoenolpiruvato carboxiquinasa; CYP:
citocromo-P450; ROS: especies reactivas de oxígeno; flechas al costado de los compuestos indican
incrementos o decrementos en niveles o actividad.
El AIA/DDC se une al CYP, generando N-alquil y N metil porfirinas a partir del CYP, reduciendo así el
pool de hemo y de-reprimiendo a la enzima ALA-S, generando una porfiria aguda con acumulación de
precursores ALA y PBG. El acúmulo de ALA genera ROS, que junto al aumento del TRP y sus
metabolitos de la vía quinurenérgica, contribuyen al descenso de PEPCK. El descenso de glucosa por
bloqueo de la PEPCK y el bloqueo glucógenolitico (GP) llevan a la de-represión de la ALA-S que se
suma a la de-represión provocada en esta enzima por la caída de hemo.
210
Discusión
CONCLUSIÓN PARA EL MODELO DE PORFIRIA HEPÁTICA AGUDA POR AIA/DDC
El esquema Integratorio 3 resume los efectos directos e indirectos del
tratamiento con AIA/DDC en diferentes rutas metabólicas como la del TRP y la vía
hemo, la generación de ROS y su impacto sobre el bloqueo gluconeogénico de la
PEPCK y glucógenolitico de la GP, tendientes a disminuir la glucosa.
Los descensos observados en este modelo agudo sobre la gluconeogénesis; en la
actividad glucógenolitica de GP y en el marcado incremento de los depósitos de
glucógeno hepáticos, conduciría a un déficit de disponibilidad de glucosa libre, lo que
se intenta compensar de forma parcial en animales tratados, reduciendo a la mitad la
actividad glucolítica de PK e intentando aumentar la captación de glucosa por dicho
tejido.
Por otra parte, los marcadores del estado oxidativo fueron múltiples: aumento en
el contenido de proteínas carboniladas, de la peroxidación lipídica, de la QL y de la
respuesta antioxidante de SOD. Todos estos incrementos confirman el estrés oxidativo e
indican que la acumulación de ALA, proveniente de la desregulación de la ALA-S,
promueve un ambiente oxidativo en los animales con esta patología aguda, lo que
sugiere un posible daño en las estructuras de las enzimas disminuidas.
Asimismo, la acción directa del TRP sobre PEPCK no podía ser descartada,
aunque influirá seguramente en menor grado, ya que la cantidad de TRP acumulada es
inferior a la de sus metabolitos derivados.
La administración de la hormona melatonina previa a la intoxicación de ratas
con AIA/DDC muestra un claro efecto benéfico en tres de los metabolismos
investigados. Así en el camino del hemo, se observó un descenso en la excreción de
precursores ALA y PBG, una disminución de la inducción de la enzima regulatoria
ALA-S y una reversión parcial de la inhibición de la FQ. Además, su administración
conjunta con AIA/DDC restauró parcialmente las actividades de dos enzimas
gluconeogénicas. Se observó también una mejora en las defensas antioxidantes de la
célula, tanto en homogenato como en microsomas hepáticos.
211
Discusión
Así, Mel se comportó como un efectivo protector para el hígado de las ratas y
podría ser usado como co-tratamiento en pacientes con porfiria aguda.
En síntesis, respecto al bloqueo gluconeogénico producido por el tratamiento
con AIA/DDC, contribuyen al descenso de PEPCK, la acción de las ROS, el ácido
quinolínico y en menor grado el TRP. Respecto del bloqueo glucógenolitico, el
descenso de GP sería consecuencia del daño estructural ocasionado por las ROS.
De esta forma, en este modelo de porfiria aguda las drogas administradas
producen un disturbio primario en el camino del hemo que lleva a la depleción del mismo
y como consecuencia a la inducción del ALA-S y de la porfiria. A estos disturbios deben
añadirse las alteraciones no reportadas previamente, en el metabolismo de los hidratos de
carbono, del triptófano y metabolismo oxidativo que concurren para determinar una baja
en la disponibilidad de glucosa libre. Esta baja de glucosa de-reprime a la ALA-S
exacerbando la porfiria. Es decir, habría una doble de-represión de la ALA-S, una por
depleción de hemo y otra provocada por la baja de glucosa (Esquema Integratorio 3).
El mecanismo a través del cual el deterioro de la neosíntesis y liberación de
glucosa se produce, proporcionaría la base molecular para explicar el rol benéfico que
juega la administración de carbohidratos a pacientes que sufren de porfirias hepáticas
agudas (Doss et al., 1985; Kappas et al., 1995), que en algunos casos se describió como
el tratamiento que salva la vida de estos pacientes (Tschudy, 1968; Bonkowsky, 1982).
También sería útil para explicar el hecho de que el alto consumo de glucosa en
animales previene la aparición de porfiria experimental por AIA (Rose et al., 1961), y
para comprender mejor las inter-relaciones e inter-regulaciones metabólicas entre la
glucosa, el hemo y metabolismo del TRP.
212
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