Novedosa Función de CETPI (Isoforma de la Proteína Transferidora de Ésteres de Colesterol). Jaime Mas Oliva y Víctor García González Instituto de Fisiología Celular. UNAM. I. Introducción La proteína transferidora de ésteres de colesterol (CETP) es una glucoproteína plasmática que es secretada principalmente por el hígado y se encuentra asociada en mayor proporción a las lipoproteínas de alta densidad (HDL) [1]. CETP promueve la transferencia de ésteres de colesterol y triglicéridos entre lipoproteínas [1,2], principalmente direccionando el flujo de ésteres de colesterol de las HDL hacía lipoproteínas de baja (LDL) y de muy baja densidad (VLDL). El cambio en la composición de lipoproteínas mediado por CETP afecta el metabolismo y regula los niveles plasmáticos de lípidos [2,3]. En este sentido, extensos estudios en polimorfismos de CETP y deficiencias genéticas indican una relación directa entre su actividad, el colesterol asociado a las partículas HDL y enfermedad cardiovascular [4,5]. Estudios de mutagénesis sitio específica han mostrado que el dominio localizado en el Cterminal (E465-S476) estructurado como una α-hélice anfipática, corresponde con una región clave en la transferencia de lípidos (Figura 1) [6-8]. Durante la caracterización estructural de este dominio, se encontró que la disrupción del puente salino H 466-D470 a través de la mutación D470N origina la perdida de la estructura nativa, debido en parte al cambio del grupo hidroxilo cargado negativamente en la cadena lateral del ácido aspártico-470 por la amina presente en la asparagina (Figura 1) [6]. La resolución de la estructura tridimensional ha proporcionado una base sólida para la propuesta de que CETP opera a través de un mecanismo acarreador en la transferencia de lípidos [9], sin embargo estudios de nuestro laboratorio sugieren que el proceso de transferencia puede estar directamente relacionado con la formación de un sistema micelar lípidico, en donde la conservación de la estructura α-hélice en esta región debe ser crítica para este proceso [10]. El conocimiento acumulado en relación con la estructura y función del C-terminal de CETP ha permitido desarrollar en el laboratorio un trabajo de aplicación tecnológica para la determinación de los niveles plasmáticos de CETP como dato auxiliar en la clínica [11]. Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado que este dominio conteniendo la mutación D470N presenta la formación de estructura secundaria-β cuando se mantiene fuera de un ambiente lipídico, caracterización realizada a través de técnicas de espectroscopía y fluorescencia 1 [12]. Los resultados obtenidos muestran que el cambio conformacional de la α-hélice hacia una cadena-β induce la formación de fibrillas de tipo amiloide. Este tipo de estructuras causan efectos citotóxicos similares a los inducidos por el péptido β-amiloide, como la formación de especies reactivas de oxígenos y cambios en el balance de proteínas de la maquinaria celular de endocitosis [12,13]. Nuestros experimentos han permitido proponer que un delicado balance entre la estructura secundaria altamente dinámica del C-terminal de CETP, parámetros fisicoquímicos como la carga neta y el ambiente lipídico pueden definir el tipo de estructura secundaria adquirida. Alteraciones en este equilibrio podrían favorecer cambios en la estructura secundaria nativa, lo cual modificaría la capacidad de transferencia de lípidos. El sitio crítico para la unión y transferencia de lípidos está directamente conectado al Cterminal de CETP, sin embargo en nuestro grupo de trabajo se reportó el hallazgo de una forma alterna de CETP. Denominada CETPI, el ARNm de esta isoforma fue localizado solamente en el intestino delgado, una característica de esta variante es la pérdida del exón 16 y que 54 bases contenidas en el intrón 15 formen parte del nuevo ARNm, lo cual implica la sustitución de la estructura α-hélice del C-terminal por una estructura rica en prolinas, con una alta probabilidad de mantener un estado desordenado [14]. Considerando que la actividad transferidora de lípidos neutros se abate al modificar la estructura α-hélice del C-terminal de CETP, resulta importante describir cual puede ser la función de CETPI, ya que también fue encontrada en plasma [14]. De tal manera que el proyecto está centrado en el estudio de la función de esta nueva isoforma de CETP. Un primer acercamiento al estudio de CETPI ha sido la búsqueda de proteínas que pueden tener homología a nivel de estructura primaria y terciaria. Específicamente una proteína de unión a lipopolisacáridos (LPS) ha sido ampliamente caracterizada de modular el efecto biológico de los LPS y participar en la respuesta inmune innata ante la infección por bacterias Gram-negativas. La proteína bactericida/incrementadora de permeabilidad (BPI) se encuentra en los gránulos lisosomales de neutrófilos polimorfonucleares, presenta la propiedad de unir y neutralizar el efecto tóxico de los LPS de la membrana externa de las Gram-negativas [15,16]. De forma interesante BPI comparte una alta similitud a nivel de estructura tridimensional con CETP, sin embargo presentan una homología muy baja en la secuencia primaria. Considerando la convergencia estructural entre las dos proteínas, la cual se extiende a más de 400 residuos, CETP comparte los más importantes elementos estructurales con BPI, incluyendo el plegamiento global, la simetría y la arquitectura del dominio +NH3; sin embargo, presentan diferentes patrones de unión a moléculas de lípidos [17]. La principal diferencia entre 2 las dos proteínas radica en que BPI es más corta en los últimos 20aa del C-terminal, por lo que no presenta la región -hélice de unión a lípidos de CETP, de manera que la diferencia en la función de ambas proteínas debe estar directamente relacionada con esta región (Figura 2). Estudios con proteínas quiméricas conteniendo diferentes regiones del N y C-terminal de CETP con partes homologas de BPI también sugieren esta propiedad [18]. Debido a que CETPI no tiene la secuencia crítica requerida para la transferencia de lípidos y en cambio puede presentar una región desordenada, muy probablemente la actividad de transferencia de lípidos neutros es residual. Considerando las propiedades de unión a lipopolisacáridos descritas en la proteína BPI, sin la presencia de la región α-hélice en su dominio C-terminal y la alta similitud a nivel de estructura tridimensional con CETP, hemos planteado que la isoforma CETPI puede presentar la propiedad de unión a LPS, con la capacidad de ser una estructura con potencial bacteriostático o bactericida. Posiblemente a través de la evolución CETPI perdió la capacidad de transferir lípidos; sin embargo, conserva otra función que aún no se ha descrito y que en nuestras manos podría estar la respuesta. II. Resultados Considerando que solamente en intestino delgado fue detectada la expresión de CETPI, durante esta etapa de nuestra investigación se usó como modelo experimental la línea celular FHs74Int (ATCC) proveniente de intestino delgado, así como células Caco-2 procedentes de colon (ATCC). En una primer serie de experimentos se comprobó la expresión de CETPI en lisados de las células FHs74Int, identificando una banda cercana a 67 kDa; sin embargo, también se encontró otra muy cercana a 68 kDa con menor intensidad (Figura 3A), probablemente asociada con la forma no madura de la proteína. En el extremo N-terminal se encuentra un péptido señal de 17 residuos que es clave para su exportación al medio extracelular. Cuando células FHs74Int después de 10 días de incubación y con una confluencia del 90% se expusieron a concentraciones graduales de lipopolisacáridos (LPS) durante 12h, se encontró un aumento en la expresión de CETPI en los lisados celulares a partir de la concentración más baja (0.1ng/ml). Esta respuesta se mantuvo hasta la concentración de 1000ng/ml. De forma interesante, también se identificó la banda de 67 kDa en muestras recuperadas del medio extracelular de células tratadas de intestino delgado (Figura 3A). El hígado y el tejido adiposo son las principales fuentes de síntesis de CETP, aunque también se ha reportado su expresión en intestino delgado [19]. En la evaluación de la expresión de CETP en células FHs74Int se encontró un patrón de expresión diferente al de CETPI, ya que 3 en condiciones basales sin tratamiento con LPS no se encontró la expresión de CETP. Se registró la señal de esta proteína hasta concentraciones de 100ng/ml de LPS. En muestras recuperadas del medio extracelular no se detectó la banda correspondiente a CETP en ninguna de las condiciones evaluadas (Figura 3B). Sí bien, la principal función de CETP esta relacionada con la transferencia de lípidos entre lipoproteínas, en un trabajo reciente se ha reportado que la proteína purificada CETP también tiene la capacidad de unir LPS, aunque su constante de afinidad es tres órdenes de magnitud mayor que la de proteínas especializadas como BPI [20]. Esta referencia concuerda con nuestro resultado, ya que mientras CETPI está presente desde la concentración más baja usada de LPS (0.1ng/ml), en cambio la expresión de CETP fue detectada a partir del tratamiento con 100ng/ml de LPS. No está reportado si en un contexto fisiológico como en casos de infecciones sistémicas por bacterias Gram-negativas, CETP puede participar en la respuesta inmune a través de la unión a LPS. Empleando células que forman parte de la respuesta inmune innata como macrófagos y células de microglia también se detectó la presencia de CETPI, así como en células procedentes de colon (Caco2) (Figura 4). Considerando la expresión con respecto al control de carga β-actina, la señal fue más alta en células de colon. Así mismo, se ha evaluado la expresión de CETP en cultivos de células Caco2. Bajo condiciones basales no se detecto síntesis de CETP, aún bajo el estímulo con LPS. De manera que se decidió usar otros sistemas de lípidos como vesículas de fosfatidilcolina+colesterol, el extracto polar de lípidos de bacterias Gram-negativas, y una mezcla del extracto polar de lípidos bacterianos+LPS. En todas las condiciones evaluadas no se identificó la banda característica de CETP (Figura 5). Actualmente nos encontramos en la identificación de CETPI en estas mismas condiciones experimentales y estamos desarrollando de manera paralela la estrategia para la sobre-expresión y purificación de CETPI. La diferencia en la expresión de CETP y CETPI en células de intestino delgado tratadas con LPS sugiere una función diferente para estas proteínas, por lo que CETPI debe estar realizando otra función adicional a la transferencia de lípidos. Aunque hacen falta un mayor número de experimentos que confirmen nuestros resultados, estos son indicativos de la posible función bacteriostática y/o bactericida de CETPI asociada con la unión a este tipo de lípidos en la membrana externa de bacterias Gram-negativas. 4 IV. Figuras Figura 1. Estructura tridimensional de CETP. A) CETP está compuesta por cuatro dominios: un barril en cada lado de la proteína (presentados en verde y amarillo), una hoja-β central conectora entre los dos barriles (en rojo) y una extensión C-terminal (rectángulo azul). Estructura obtenida del Protein Data Bank; código de acceso: 2obd. B) Representación estructural del dominio Cterminal de CETP, mostrando la estructura secundaria de los últimos 24 aa, la cual está integrada por tres motivos: cadena β (G453-G462), una región poco estructurada (G462-P464) y la α-hélice anfipática (E465-S476), estructura clave en la transferencia de lípidos. A B C-terminal (24aa) GFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSLS 453 465 476 puente salino Hélice X EHLLVDFLQSLS Hélice Z (Mutación D470N) EHLLVNFLQSLS 466 470 5 Figura 2. Alineamiento de las proteínas BPI y CETP, realizado a través del servidor: Interactive Structure based Sequences Alignment Program (STRAP). Las estructuras se obtuvieron del Protein Data Bank; código de acceso: 2obd para CETP y 1bp1 para BPI. En color azul está representada la estructura de CETP y en verde la de BPI. Región C-terminal exclusiva de CETP 6 Figura 3. Efecto del tratamiento con LPS’s sobre la expresión de CETP y CETPI en el modelo celular de intestino delgado (células FHs74Int). A) Niveles de expresión de CETPI después de 12h de tratamiento utilizando concentraciones crecientes de LPS. B) Inmunotransferencia para la identificación de CETP. En los últimos tres carriles de cada gel se cargaron muestras del medio extracelular. La proteína β-actina fue usada como control de carga. A LPS (ng/ml) Extracelular LPS (ng/ml) 0 0.1 1 10 102 103 0 10 103 67 kDa CETPI 53 β-actina B 43 LPS (ng/ml) Extracelular LPS (ng/ml) 0 0.1 1 10 102 103 0 10 103 CETP 66 kDa β-actina 43 7 Figura 4. Detección de CETPI en lisados de células de colon (Caco2), macrófagos (RAW) y microglia (EOC). A) Membrana utilizada en la imunotransferencia teñida con rojo Ponceau. B) β-actina como control de carga. A kDa B Caco2 RAW EOC Caco2 RAW EOC 100 75 67 kDa CETPI 50 β-actina 43 kDa 8 Figura 5. Expresión de CETP y CETPI bajo tratamiento con diferentes tipos de moléculas lipídicas utilizando células FHs74Int. A) La expresión de CETP no fue identificada bajo el tratamiento con las diferentes mezclas lipídicas empleadas. Se utilizaron sistemas micelares compuestos de fosfatidilcolina (PC) y colesterol (Col), así como del extracto polar de lípidos de E. coli (Bacter), lipopolisacáridos (LPS) y mezclas de LPS con el extracto de E. coli (carriles A y B). B) Expresión de CETPI bajo el mismo tratamiento. La β-actina se usó como control de carga. 9 II. Referencias [1] Tall AR. (1993) Plasma cholesteryl ester transfer protein. J Lipid Res 34:1255-1274. [2] Barter PJ, Brewer HB Jr, Chapman MJ, Hennekens CH, Rader DJ, Tall AR (2003) Cholesteryl ester transfer protein: a novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23:160-167. [3] Morton RE (1990) Interaction of lipid transfer protein with plasma lipoproteins and cell membranes. 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