UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “SEROPREVALENCIA Y FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS CON LA PRESENCIA DE Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis EN CAPRINOS DE CINCO MUNICIPIOS DE LA ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ”. TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE: TESIS COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE: MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: ADASUÉ MAGDALENO MÉNDEZ ASESORES: DR. DAVID I. MARTÍNEZ HERRERA DRA. CLORINDA DEL CARMEN SARABIA BUENO VERACRUZ, VER. JULIO 2011 ÍNDICE GENERAL Título: Pág.: Índice general………………………………………………………………………. i Índice de cuadros………………………………………………………………….. ii Dedicatoria………………………………………………………………………….. iv Agradecimientos……………………………………………………………………. V Fuente de financiamiento………………………………………………………….. vi Resumen……………………………………………………………………………. vii Abstract……………………………………………………………………………… viii 1. Introducción……………………………………………………………………… 1 2. Antecedentes…………………………………………………………………….. 4 3. Justificación……………………………………………………………………… 7 4. Hipótesis…………………………………………………………………………. 8 5. Objetivos…………………………………………………………………………. 9 5.2 Objetivo general…………………………………………………………….. 9 5.2 Objetivos específicos……………………………………………………….. 9 6. Material y métodos……………………………………………………………… 10 6.2 Estudio observacional y tamaño de muestra…………………………….. 10 6.1 Lugar de estudio y localización……………………………………………. 10 6.3 Criterios de inclusión y exclusión………………………………………….. 11 6.4 Muestreo serológico………………………………………………………… 11 6.4 Técnicas de laboratorio…………………………………………………….. 12 6.5 Variables…………………………………………………………………….. 13 ii 6.6 Análisis estadístico………………………………………………………… 13 7. Resultados y discusión……………………………………………………….. 14 7.1 Seroprevalencia general del estudio……………………………………. 14 7.2 Seroprevalencia por municipio…………………………………………… 15 7.3 Seroprevalencia por unidad de producción…………………………...... 16 7.4 Seroprevalencia por estado productivo………………………………….. 16 7.5 Seroprevalencia por raza………………………………………………….. 18 7.6 Seroprevalencia por el lugar de procedencia…………………………… 18 7.7 Seroprevalencia en animales con diarrea………………………………. 19 7.8 Seroprevalencia en animales con disminución de la condición corporal………………………………………………………….. 20 7.9 Seroprevalencia por unidad de producción en el manejo de excretas. 21 7.10 Seroprevalencia en unidades de producción con limpieza de Instalaciones………………………………………………………………. 22 8. Conclusiones……………………………………………………………………. 23 9. Literatura………………………………………………………………………… 24 10. Anexos…………………………………………………………………………. 27 iii ÍNDICE DE CUADROS Cuadro: Pág: Cuadro 1. Seroprevalencia de paratuberculosis por municipio……………… 15 Cuadro 2. Seroprevalencia de paratuberculosis por unidad de Producción……………………………………………………………. 16 Cuadro 3. Seroprevalencia de paratuberculosis por estado Reproductivo………………………………………………………….. 16 Cuadro 4. Seroprevalencia de paratuberculosis por raza……………………. 18 Cuadro 5. Seroprevalencia de paratuberculosis por el lugar de Procedencia…………………………………………………………... 19 Cuadro 6. Seroprevalencia de paratuberculosis en animales con diarrea…. 19 Cuadro 7. Seroprevalencia de paratuberculosis en animales con disminución de la condición corporal………………………………. 20 Cuadro 8. Seroprevalencia de paratuberculosis en unidades de producción que manejan excretas en potreros………………….. 21 Cuadro 9. Seroprevalencia de paratuberculosis en unidades de producción con limpieza de instalaciones…………………………. 22 iv DEDICATORIA Este logro se lo dedico al ser más especial que puede haber en mi vida, a mi MAMÁ, por ser la que me enseñó a soñar, a plantearme metas, a confiar en mí y en Dios, porque gracias a su ejemplo, sé que los sueños se pueden alcanzar; porque desde que tuve noción de querer estudiar esta maravillosa carrera, nunca me dio la espalda y me apoyó en todo momento, al alimentar cada día mis ganas de seguir adelante, porque en los momentos en los que flaquee y pensaba en desistir, estuviste ahí para recordarme que ese no era mi destino, que no podía abandonar esta pasión por los animales que tuve desde la infancia, porque siempre despejas mi camino cuando lo veo un poco obscuro, porque muchas veces me sorprendes con tu sabiduría y tu fortaleza, y aunque ya no sea una niña, sigo pensando en querer ser como tú, tener esa fuerza, ese valor, ese ánimo que me hace recordar lo maravilloso que es este planeta y esta vida a pesar de todas las adversidades. TE AMO MAMÁ. v AGRADECIMIENTOS A Dios, por ser la esencia de mi vida, por estar conmigo en todo momento y permitirme vivir momentos tan increíblemente maravillosos a lo largo de mi carrera, por conocer a gente sorprendente, la cual mediante su amistad y compañía hacen que mi vida sea hermosa. A mi Facultad, porque alimentó mi ser cada día que pisé sus pisos, recorrí sus pasillos, observé sus murales y me senté en sus salones en los que aprendí tantas cosas para formarme como profesional, porque mediante las experiencias agradables pero mejor aún, con experiencias difíciles y un tanto dolorosas, aprendí a valorar las oportunidades que tenemos en la vida, como estudiar y tratar de ser mejor humano. A los profesores en los que observé un gran valor como ser humano y como profesionales, que en realidad practican su vocación de enseñar, que saben que el conocimiento acumulado y resguardado no sirve de nada a menos que se trasmita y no conozca de límites, que me provocaron tenerles admiración y un lugar muy especial en mi memoria y mi corazón. A mi familia y amigos que son los que día a día me hacen recordar y asegurar que existe un Dios de amor y que sí se puede ser feliz a pesar de todo. Al Dr. David Martínez y a mis compañeros y amigos del peculiar equipo de trabajo que hicimos y por los momentos inolvidables que pasé con ellos en los muestreos (Ornelas, Sandra, Javi, Mayra). Gracias por su amistad. Finalmente a las hermosas personas que conocí y con las que conviví en mi servicio social y que también alimentaron mi alma de felicidad en la última etapa de mi carrera. vi FUENTE DE FINANCIAMIENTO El presente trabajo fue financiado con recursos de la Fundación Produce Veracruz (FUNPROVER), con apoyo parcial del proyecto ”ESTUDIO INTEGRAL DE LOS PRINCIPALES AGENTES ETIOLÓGICOS QUE AFECTAN LA PRODUCCIÓN DE LOS PEQUEÑOS RUMIANTES” clave 30-2009-0896 bajo la supervisión del Dr. David Itzcóatl Martínez Herrera. vii RESUMEN Magdaleno Méndez Adasué. 2011. SEROPREVALENCIA Y FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A LA PRESENCIA DE Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis EN CAPRINOS DE CINCO MUNICIPIOS DE LA ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ”. Tesis de licenciatura. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. México. Directores: Dr. David I. Martínez Herrera, Dra. Clorinda del Carmen Sarabia Bueno. 40 pp. El objetivo fue determinar la seroprevalencia de paratuberculosis caprina y los factores de riesgo mediante un estudio transversal polietápico y estratificado en unidades de producción (UP) de cinco municipios del centro del estado de Veracruz (Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla y Tlacolulan.). El periodo en el que se realizó el estudio fue de febrero a junio del 2010. El tamaño de la muestra se calculó con el programa Win Episcope Versión 2.0 bajo la modalidad de “estimar proporciones” para una prevalencia estimada del 50%, error de 5% y 95% de confianza, obteniéndose un total de 182 animales y seis animales por UP. Las UP se estimaron con las tablas de valores propuestas por Cannon y Roe, donde se obtuvieron 26 UP, muestreándose seis en el municipio de Tlacolulan y cinco para el resto de los municipios. Se muestrearon hembras mayores a tres meses de edad, y a todos los sementales. La obtención de la muestra de sangre se realizó por punción de la vena yugular con tubos al vacío sin anticoagulante que se transportaron a 4 °C al laboratorio de Microbiología de la Posta Zootécnica Torreón del Molino, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia donde se separó el suero y se realizó prueba de ELISA indirecta en modalidades de tamiz y confirmatoria con el empleo de kits comerciales del Institut Pourquier para la identificación de anticuerpos IgG contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, con una sensibilidad absoluta entre el 40.8-66% y una especificidad de 99-99.8%. En cada UP se realizaron dos encuestas; una general para cada UP y otra individual para cada caprino. La seroprevalencia se determinó con el uso del programa VassarStat® para cálculo de proporciones y para los factores de riesgo la razón de momios (RM). La seroprevalencia general fue de 0.6% (IC95%: 0.03-3.5). Por municipios, únicamente se observaron reactores en el municipio de Coatepec, lo que implica una seroprevalencia de 20% (IC95%: 1.0 – 70.12), la seroprevalencia por UP fue de 3.85% (IC95%: 0.2 – 21.59), por lo que respecta a la seroprevalencia por estado reproductivo, se observó un 3.85% (IC95%: 0.2 – 21.6) debido a un semental que resultó positivo. La seroprevalencia por raza fue de 2% (IC95%: 0.11 – 12.24), correspondiendo a animales de la raza Saanen. La seroprevalencia por lugar de procedencia fue de 1.82% (IC 95%: 0 – 3.66) en animales que fueron comprados fuera de la UP, la seroprevalencia en animales con diarrea o con disminución de la condición corporal fue de 0% (IC95%: 0-53.71); la seroprevalencia relacionada con manejo de excretas en potreros y limpieza de instalaciones, fue de 3.85% (IC95%: 2-21.59). No se encontraron factores de riesgo o de protección y se concluye que existe una baja distribución de paratuberculosis caprina entre las UP del centro de Veracruz. Palabras clave: Enfermedad de Johne, cabras, enteritis granulomatosa. viii ABSTRACT Magdaleno Méndez, Adasué. 2011. SEROPREVALENCE AND RISK FACTORS ASSOCIATED WITH Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis INFECTION IN CAPRINES FROM FIVE MUNICIPALITIES AT THE CENTRAL ZONE OF THE STATE OF VERACRUZ, MEXICO. Veterinary Medicine Bachelor Degree, University of Veracruz. Veracruz. Mexico. Directors: Dr. David I. Martínez Herrera, Dr. Clorinda del Carmen Sarabia Bueno.40 pp. The objective of the study was to determine the seroprevalence and risk factors of caprine paratuberculosis through a cross-sectional and stratified survey in five municipalities at the center of the state of Veracruz (ie. Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla, and Tlacolulan). The study was conducted from February to June 2010. Sample size was calculated with the program Win Episcope Ver. 2.0 using the "estimate proportions" mode for an estimated prevalence of 50%, an error of 5%, and a 95% confidence level, yielding a total of 182 animals and six animals per production units (PU). PU number was estimated by the tables of values proposed by Cannon and Roe in 1982, obtaining 26 PU, six for the municipality of Tlacolulan and five for each one of the other municipalities. Females older than 3 months-old and all the stallions were sampled. Blood samples were obtained by puncturing the jugular vein with vacuum tubes without anticoagulant and were transported at 4 °C to the laboratory of Microbiology of the School of Veterinary Medicine, where serum was separated and indirect ELISA was performed using commercial kits. Two surveys were conducted, one collecting data from each PU, and another for each individual goat. Seroprevalence and calculation of risk factors and odds ratio (OR) were determined using the VassarStat® program. Overall seroprevalence was 0.6% (95% CI: 0.03-3.5). Reactors were only observed in the municipality of Coatepec, implying a seroprevalence of 20% (95% CI: 1.0 - 70.12); by UP, seroprevalence was 3.85% (95% CI: 0.2 - 21.59); with regard to reproductive status, the observed seroprevalence was 3.85% (95% CI 0.2 - 21.6) as a result of the presence of one seropositive buck. Seroprevalence by breed was 2% (95% CI: 0.11 - 12.24), with positive cases coming from the Saanen breed. Seroprevalence by place of origin was 1.82% (95% CI: 0 - 3.66), and found in animals that were purchased out of the PU. Seroprevalence in animals with diarrhea or showing a low body condition score was 0% (95% CI 0-53.71). Seroprevalence associated to manure management in pastures and cleaning facilities was 3.85% (95% CI 2-21.59). There were no risk or protective factors detected for caprine paratuberculosis, but it is concluded that the disease has a low distribution among the sampled PU in central, Veracruz, Mexico. Keywords: Johne's disease, epidemiology, goats, granulomatous enteritis. ix 1. INTRODUCCIÓN La paratuberculosis es una enfermedad crónica que afecta a muchas especies animales, en particular a los rumiantes y dentro de entre ellos a los caprinos, en los que causa enteritis granulomatosa. Es causada por un bacilo ácido-alcohol resistente que por semejanza génica es compatible con las bacterias Grampositivas y que pertenece al género Mycobacterium (Carter y Wise, 2004). Es una enfermedad consuntiva que no muestra signos clínicos a simple vista y que si a caso, se puede llegar a observar diarrea en estados terminales pero no es común, por lo que el diagnóstico mediante sólo el reconocimiento clínico es casi imposible (Díaz y Santillán, 2005). Es de distribución mundial y en algunos países llega a ser la principal causa de muerte y/o desecho, porque produce una merma considerable en la producción de leche y por tanto, tiene mayor importancia en cabras lecheras; sin embargo, es menos común que se presente como un padecimiento individual de alguna cabra o inclusive en rebaños pequeños (Soberón, 2011). Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map) es resistente a una gran cantidad de antibióticos debido a su capacidad intracelular por ser una micobacteria, por lo cual no conviene aplicar un tratamiento curativo contra la infección, resiste por muchas semanas e incluso un año en el ambiente y llega a resistir la pasteurización, en particular si ésta es deficiente (Díaz y Santillán, 2005). La principal forma de transmisión es por vía fecal-oral; sin embargo, existen casos de infección intrauterina (Merkal et al., 1982). Afecta por lo general a cabras de dos a tres meses de edad debido a la ingestión de leche contaminada con heces o 1 inclusive por la eliminación mamaria de la bacteria en madres infectadas (SENASA, 2000). Las bacterias permanecen latentes en los nódulos mesentéricos durante meses o años, aunque las manifestaciones se observan hasta la vida adulta del animal (Soberón, 2011). Después en situaciones de estrés, el animal infectado puede empezar a eliminar las micobacterias en heces y más adelante manifestar la diarrea (Soberón, 2011). Por otra parte, esta bacteria se ha asociado con la enfermedad de Crohn en los humanos, por lo que aún de forma controvertida, se le podría considerar como una zoonosis de importancia en la salud pública (Acha y Szyfress, 2001). Debido al largo periodo de latencia, a la persistencia del organismo en el medio y la naturaleza endémica de la enfermedad, las cabras en un rebaño infectado pueden clasificarse en las categorías de individuos resistentes o no infectados, infectados-no eliminadores, infectados subclínicamente-eliminadores inaparentes y clínicamente afectados-eliminadores aparentes (Ábalos, 2011). Debido a que el aislamiento de esta bacteria es tardío y un poco complicado, puesto que toma hasta 12 semanas, se han utilizado otras técnicas para su diagnóstico (Soberón, 2011) como son las pruebas serológicas (ELISA), anatomopatológicas (histopatología) y pruebas moleculares (PCR). La paratuberculosis es un problema de rebaño más que individual, ya que por sus características, es muy difícil de erradicar, sobre todo en países como México, donde no se cuenta con los recursos económicos, infraestructura o apoyo adecuado de instituciones gubernamentales, al igual que por la falta de difusión y organización de los caprinocultores. Por esto, se deben aplicar más que nada, medidas de control encaminadas al menos para bajar la prevalencia e incidencia 2 de la enfermedad en los rebaños infectados y reducir las pérdidas económicas generadas por esta infección (Soberón, 2011). Aunque en México aún no existen estudios sero-epidemiológicos extensos en caprinos, se estima que la enfermedad se ha difundido a partir de su introducción en el país, quizá por la importación de pié de cría proveniente de Estados Unidos de América (Soberón, 2011). 3 2. ANTECEDENTES La paratuberculosis o enfermedad de Johne fue descrita por primera vez en Alemania por Johne y Frothingham en 1895 en la especie bovina (Kruze et al., 2007); sin embargo, y aunque se conoce desde entonces, no se había demostrado una presencia preponderante en las unidades de producción de rumiantes que ha incrementado su importancia en los últimos años, en dependencia de los avances que se hacen en el control de otras enfermedades como brucelosis y tuberculosis (Ábalos, 2011). Al igual que en el bovino, la paratuberculosis en pequeños rumiantes tiene una amplia distribución mundial (Acha y Szyfress, 2001), a pesar de haber sido descrita por primera vez en caprinos por Twort e Ingram (1912) en Alemania. Se conocen tres grupos diferentes de cepas de Map. Uno de ellos con una amplia distribución, que ocasiona la enfermedad en el ganado vacuno y es fácil de cultivar a partir de heces o tejidos tras una incubación de 6 a 12 semanas. El segundo grupo esta formado por cepas ovinas y caprinas, difíciles de cultivar a partir de heces, pese a que en ellas los gérmenes sean muy numerosos. El tercer grupo incluye las cepas identificadas en ovejas procedentes de Islandia, Canadá y Sudáfrica (Radostits et. al., 1999). Por otra parte, se sabe que la cepa específica para la cabra de Noruega no es patógena para las vacas, que las cepas aisladas en ciervos son similares a las bovinas y que las cabras salvajes son sensibles a las cepas bovinas de Nueva Zelanda (Radostits et al., 1999). 4 En Chile se realizó un estudio (Kruze et al., 2007) para conocer la prevalencia de la enfermedad; para ello, se utilizaron técnicas de diagnóstico bacteriológico de cultivos fecales y su confirmación por PCR. Así, de 383 animales muestreados, se identificó el 9.1% como positivos, en rebaños cuya característica común era que no practicaban medidas de manejo para prevenir la infección de los animales jóvenes y habían importado animales. Se ha observado la mayor variedad de cepas en Estados Unidos de América, aunque se han realizado trabajos en Australia, Nueva Zelanda y países europeos (Chávez et al. 2004). Se ha hecho un único estudio en el Valle de México en el que se identificó el polimorfismo genético de las cepas aisladas de Map en un rebaño donde existían antecedentes de paratuberculosis a partir de evidencias serológicas y bacteriológicas, donde se encontró que la cepa C1 fue la más común al igual que en otros países, por lo que se sabe que es la más distribuida a nivel mundial (Chávez et al., 2004); la cepa C1 no es específica de las cabras y se establece que mientras no exista una exigencia oficial para importar animales libres de paratuberculosis a México, se tiene el riesgo de ingreso de animales con infección subclínica a los hatos nacionales. Se realizó un estudio (Fávila et al., 2007) en los estados de Querétaro y Morelos en donde existían antecedentes clínicos y serológicos de paratuberculosis y cuyo diagnóstico fue Map por la técnica de PCR a partir de leche de cabras donde se identificó al Map C1 como la cepa que tiene mayor distribución. En México se han realizado actividades encaminadas a prevenir la transmisión de la enfermedad; por lo cual se hizo en 2009 un Taller de trabajo de planeación estratégica para la atención de paratuberculosis en bovinos, ovinos y 5 caprinos de México (CONASA, 2009). A pesar de esto, se necesitan más estudios para conocer la prevalencia de la enfermedad en los estados y municipios, así como poner más atención en aquellos con un mayor inventario caprino y donde la caprinocultura es la actividad principal de la población. Por otra parte, debido a que el inventario caprino de Veracruz es en apariencia bajo, puesto que el 90% de las actividades destinadas a la caprinocultura en la entidad veracruzana se desarrolla en 14 municipios de la zona centro y que también en su mayoría corresponden a los más marginados (INEGI, 2009), se adolece de información sobre la presencia de Map en los rebaños caprinos y más aún, sobre su impacto en la producción y en la economía de los caprinocultores. 6 3. JUSTIFICACIÓN Como en Veracruz no se han realizado trabajos encaminados a conocer la presencia de la paratuberculosis en la entidad, el presente trabajo se realizará con el objetivo de determinar la seroprevalencia y los factores de riesgo asociados con esta condición en cinco de los 14 municipios (Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla, Tlacolulan) en los que la caprinocultura es una de las principales actividades de la población dentro de la zona centro del estado (Huerta, 2010), pues la población que practica esta actividad tiene un nivel socio – económico bajo y sus ingresos dependen en gran medida de ella. La población beneficiada serán los caprinocultores de la zona, pues sabrán si tienen la enfermedad en su rebaño y conocerán las medidas que deben aplicarse para prevenir la enfermedad. 7 4. HIPÓTESIS La seroprevalencia de paratuberculosis en caprinos de los municipios de Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla y Tlacolulan es de al menos 50%. 8 5. OBJETIVOS 5.1 General Determinar la seroprevalencia y factores de riesgo asociados a la paratuberculosis caprina en los municipios de Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla y Tlacolulan, Veracruz en la temporada de estiaje 2010. 5.2 Específicos 5.2.1 Realizar el diagnóstico serológico de paratuberculosis caprina, mediante la prueba de ELISA, en los municipios de Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla y Tlacolulan para determinar la seroprevalencia. 5.2.2 Identificar factores de riesgo asociados a la presencia de paratuberculosis, por medio de la aplicación de encuestas epidemiológicas a los propietarios o encargados de los rebaños en estudio, en los municipios de Coatepec, Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla y Tlacolulan. 9 6. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1 Lugar de estudio y localización Este estudio se realizó en la zona centro del estado de Veracruz en el área de influencia del Distrito de Desarrollo Rural (DDR) 04 Coatepec de la Delegación Estatal de la SAGARPA; al norte colinda con el DDR 02 Martínez de la Torre, al este con el DDR 06 La Antigua, al sur con el DDR 05 Fortín y al oeste con el estado de Puebla. El DDR 04 abarca una superficie de 5.49 % (402 056 has.) del total del estado y 31 municipios, de los cuales 14 son en los que se concentra más del 90% del inventario caprino de la zona centro de la entidad y que corresponde a los de Chiconquiaco, Coacoatzintla, Coatepec, Emiliano Zapata, Ixhuacán de los Reyes, Jalacingo, Las Minas, Las Vigas de Ramírez, Perote, Tatatila, Teocelo, Tlacolulan, Villa Aldama y Xico. Los municipios tienen una altitud que varía entre 885 y 2,400 msnm. El clima es templado húmedo regular a excepción del municipio de Perote, en el que predomina el clima frío seco. Las temperaturas promedio oscilan entre 12 y 25 °C. 6.2 Estudio observacional y tamaño de muestra. El tipo de estudio fue transversal polietápico y estratificado; los rebaños se seleccionaron al azar, a partir de conglomerados. La cantidad de animales a muestrear, se calculó mediante el programa Win Episcope Version 2.0 (Thrusfield et al., 2001) bajo la modalidad de “estimar proporciones” para una prevalencia estimada del 50%, un error de 5% y 95% de confianza, lo que implica un total de 10 182 animales. El número de unidades de producción (UP) a ser muestreadas se calculó por conglomerados de acuerdo con la tabla de valores propuesta por Cannon y Roe (1982) que proporciona la cantidad de UP necesarias para conocer la presencia de la enfermedad y el número de animales que deben muestrearse en cada una a partir de una muestra general; como el número total de UP que existían en los cinco municipios seleccionados era de 95, solo se muestrearon 26 UP y dentro de éstas, seis animales. 6.3 Criterios de inclusión y exclusión Criterios de inclusión: Se muestrearon hembras mayores a los tres meses de edad y a todos los machos sementales que tenían los propietarios en los que se incluyeron a sementales prestados por otro productor y que se encontraron en la unidad de producción. Criterios de exclusión: Se excluyeron a todas las crías de menos de tres meses de edad y a los machos que no son contemplados para sementales. 6.4. Muestreo serológico La toma de muestra de sangre se realizó por la punción de la vena yugular con el empleo de tubos al vacío con tapón rojo marrón sin anticoagulante. Las muestras se transportaron a 4 °C al Laboratorio de Microbiología de la Posta Zootécnica “Torreón del Molino”, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, donde fueron centrifugadas por 15 minutos a 1000 x g para extraer el suero. Una vez 11 separado el suero se almacenó en tubos cónicos de tipo Eppendorf® en congelación a -20 °C hasta su procesamiento serológico. 6.5. Técnicas de laboratorio Se utilizó la prueba de ELISA indirecta en modalidades de tamiz y confirmatoria con el empleo de kits comerciales de “Institut Pourquier” para la identificación de anticuerpos IgG contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis. La prueba tiene una sensibilidad absoluta entre el 40.8-66% y una especificidad absoluta de 99-99.8%. Todas las muestras de suero sanguíneo fueron probadas por duplicado en un kit comercial de ELISA para suero, plasma y leche (“Institut Pourquier, POURQUIER® Elisa Paratuberculosis Antibody Screening”, Francia), basado en el principio de proveer el antígeno del M. paratuberculosis revestido a pocillos de microplacas de poliestireno y eliminar las reacciones cruzadas de las muestras a ensayar diluyéndolas e incubándolas en una solución buffer que contiene un extracto de M. phlei. Al seguir las instrucciones del fabricante, se realizó la absorción de las muestras por M. phlei, diluyéndolas a una concentración de 1:20 para controles y sueros y e incubándolas a temperatura del laboratorio (21 °C) por una hora. Después, se transfirieron a las microplacas de poliestireno de 96 pocillos revestidos del antígeno del M. paratuberculosis, a razón de 100 µL de controles y sueros. Posterior a ello, fueron incubadas por 45 min. a temperatura del laboratorio (21 °C) y se lavaron tres veces con solución de buffer. Transcurridos 10 12 minutos, se detuvo la reacción adicionando 100 µL de solución de frenado. La lectura se realizó a 450 nm en un espectrofotómetro “Bio rad model 680 microplate reader”. 6.6 Variables Se realizaron dos cuestionarios (anexos 1 y 2), uno en general para cada UP muestreada y otro individual aplicado a cada animal muestreado. Las variables de interés para este estudio fueron el tipo de explotación, la procedencia de los animales, la raza, el manejo de las excretas, la limpieza de bebederos y comederos, la condición corporal, la etapa reproductiva del animal, y por último, la presencia de diarreas. 6.7 Análisis estadístico La seroprevalencia se determinó con el uso de la fórmula propuesta por Thrusfield (2005), en donde se dividió el número de animales reactores entre el número total de animales. Los intervalos de confianza de 95% se calcularon con el programa Vassarstats® y la asociación entre variables, mediante razón de momios de acuerdo con lo propuesto por Thrusfield (2005). RM = A/C÷B/D= A·D÷B·C. Donde: A= animales enfermos expuestos B= animales enfermos no expuestos C= animales sanos expuestos D= animales sanos no expuestos 13 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Seroprevalencia general del estudio La seroprevalencia general de paratuberculosis en cabras de los municipios estudiados fue de 0.6% (IC95%: 0.03-3.5). Los estudios que se han realizado sobre paratuberculosis en cabras demuestran diferentes prevalencias encontrándose por ejemplo, 9.1% de animales positivos en rebaños caprinos chilenos (Kruze et al., 2007); 26% de prevalencia en regiones de España (Falconi et al., 2005); en Argentina un 24% de animales dudosos por medio de prueba cervical comparativa (PCC) con derivado proteínico purificado (DPP) en cabras lecheras, y un 50% de animales dudosos por medio de PCC con DPP en cabras productoras de carne (Underwood et al., 2002). A nivel nacional un estudio demostró 6.7% de prevalencia en rebaños del centro del Valle de México (Chávez et al., 2004); en un análisis descriptivo de casos recibidos en un laboratorio en Calamanda, Querétaro (Méndez et al., 2008), hubo 0% de animales positivos. Sin embargo Humara et al. (2007) realizaron un trabajo para identificar Map mediante PCR en los estados de Querétaro y Morelos en rebaños donde existían antecedentes clínicos y serológicos de paratuberculosis. Por otra parte, Chávez (2011) ha reportado una prevalencia en rastro de 1.2- 8.4%. Se encuentra una similitud en solo un resultado de los estudios ya realizados (Méndez et al., 2008) y del presente estudio, que es en el análisis descriptivo de casos recibidos en un laboratorio de Calamanda, Querétaro donde los resultados de las muestras recibidas de cabras para diagnóstico de 14 paratuberculosis resultaron negativas, al demostrar 0% de seroprevalencia, que entran en el intervalo de confianza para este estudio que es de 0.03 a 3.5%. 7.2 Seroprevalencia por municipio De los cinco municipios de estudio, solo se encontró un animal seropositivo que pertenece al municipio de Coatepec, lo que implica una seroprevalencia de 20% (IC95%: 1.0-70.12), como se observa en el cuadro 1. Cuadro 1. Seroprevalencia de paratuberculosis por municipio. Municipio Coatepec Chiconquiaco Yecuatla Coacoatzintla Tlacolulan Total Seroprevalencia 100% 0% 0% 0% 0% 20% IC 95% 5.46-100 0-13.34 0-12.70 0-12.01 0-11.17 1.0-70.12 RM 1 0 0 0 0 IC 95% 0.5-2 0 0 0 0 Las encuestas epidemiológicas demuestran que en el municipio de Coatepec hay mayor cantidad de animales comprados fuera del estado, que en los demás municipios (Chiconquiaco, Yecuatla, Coacoatzintla y Tlacolulan), donde los rebaños están conformados por animales nacidos en el rancho y en muy poca cantidad adquiridos fuera, en algunos de esos casos estos animales son prestados entre caprinocultores con el objetivo de aprovechar el supuesto valor genético de los mismos, lo que podría explicar la razón por la que se encontró al único animal seropositivo. 15 7.3 Seroprevalencia por unidad de producción La seroprevalencia por unidad de producción fue 3.85% (IC95%: 0.2 – 21.59), pues de nueva cuenta solo un animal perteneciente a una de las 26 UP muestreadas, resultó seropositivo como se aprecia en el cuadro 2. Cuadro 2. Seroprevalencia de paratuberculosis por unidad de producción. Municipio Coatepec Chiconquiaco Yecuatla Coacoatzintla Tlacolulan Total UP 5 5 5 5 6 26 Seroprevalencia 20% 0% 0% 0% 0% 3.85% IC 95% 0-70.12 0-53.71 0-53.72 0-53.73 0-48.32 0.2 – 21.59 RM 56.61 0 0 0 0 IC 95% 0.080-3.99 0 0 0 0 Una característica que tiene esta UP es que cuenta con dos sementales procedentes de fuera del estado de Veracruz, característica que no comparten otras UP al no tener ningún semental, sólo hembras en producción. 7.4 Seroprevalencia por estado productivo Como se observa en el cuadro 3, el animal que se encontró positivo corresponde a un semental, e implica una seroprevalencia del 3.85% (IC95%: 0.2 – 21.6) para esa etapa productiva, pues en ninguna de las otras se encontraron animales seropositivos. 16 Cuadro 3. Seroprevalencia de paratuberculosis por estado productivo Estado Número de productivo animales Seroprevalencia IC 95 % Primalas 24 0 0-17.17 Gestantes 22 0 0-18.5 Hembras en lactación 35 0 0-12.32 Sementales 26 3.85% 0.2-21.6 Destetados 2 0 0-80.21 Secas 4 0 0-60.42 En producción 69 0 0-6.57 Total 182 0.55% 0.03-3.50 RM 0 0 IC 95% 0 0 0 0.044 0 0 0 0 0-344.90 0 0 0 Por otro lado, a pesar de que las encuestas reflejan que también se han adquirido hembras de reemplazo procedentes de otros estados del país, ninguna parece estar infectada o haber entrado en contacto con la bacteria. Este dato demuestra una gran diferencia respecto a otro estudio (Kruze et al. 2007), en el que el total de la población estudiada pertenece a hembras en producción en donde sí se encontraron animales seropositivos; sin embargo, se excluyen el resto de las etapas productivas. Otro dato recabado en las encuestas epidemiológicas y que pudiera explicar este resultado, es el hecho de que en los municipios de estudio, la mayoría de los caprinocultores no cuentan con recursos económicos para la importación de animales; sin embargo, en las encuestas, los caprinocultores reiteraron en varias ocasiones, que muchos de los sementales que se encontraban en las unidades de producción, habían sido adquiridos en entidades distintas a Veracruz, hecho que se demuestra en lo señalado por Coca (2009) quien indica que los integrantes del Sistema Producto Especie Caprino del estado, les otorgaron sementales de 17 registro a caprinocultores veracruzanos adquiridos en los estados de Querétaro y Guanajuato. 7.5 Seroprevalencia por raza Como el fenotipo racial del único animal que resultó seropositivo corresponde a la raza Saanen, la seroprevalencia para el fenotipo fue de 2% (IC 95%: 0.11 – 12.24), según se puede observar en el cuadro 4. Cuadro 4. Seroprevalencia de paratuberculosis por raza Raza No. animales Seroprevalencia IC 95% Alpina francesa 53 0 0-8.42 Toggenburg 25 0 0-16.6 Saanen 49 2 0.11-12.24 Cruza 51 0 0-8.8 RM 0 0 0.006 0 IC 95% 0 0 0-47.46 0 Hasta el momento, no existen estudios que demuestren afinidad de la paratuberculosis por algún tipo racial en específico, pues el fenotipo racial solo adquiere importancia en razas lecheras (Alpina Francesa, Toggenburg y Saanen), ya que la importancia de la paratuberculosis radica en las pérdidas económicas por disminución de la producción (Underwood et al., 2002). A la fecha los estudios realizados en otras especies como bovinos (Sánchez et al. 2009) u ovinos (Tejedor, 1993) no consideran a la raza como variable a estudiar para determinarlo como factor de riesgo. 7.6 Seroprevalencia por el lugar de procedencia El semental seropositivo fue adquirido fuera del estado de Veracruz y de acuerdo con los datos recabados en la encuesta epidemiológica, se compró en el estado de Guanajuato, lo que representa una seroprevalencia de 1.82% (IC 95%: 0 – 3.66) como se puede ver en el cuadro 5. 18 Cuadro 5. Seroprevalencia de paratuberculosis por el lugar de procedencia Procedencia Nacidos en el hato Comprados fuera Total No. animales 127 55 182 Seroprevalencia 0 1.82% IC95% 0-3.66 0.1-11.00 RM IC 95% 0 0 25.84 0.040-1.687 Aunque no se presenta una seroprevalencia alta, este dato apoya la opinión de Soberón (2011) al suponer que la principal fuente de infección de paratuberculosis se da por la entrada de animales a rebaños locales comprados en otros estados o en otros países, en especial si proceden de Estados Unidos de América, situación similar a lo referido por Chávez et al. (2004) que mencionan que al no existir al momento una exigencia oficial para importar animales libres de paratuberculosis a México, se tiene el riesgo de ingreso de animales con infección subclínica a los hatos nacionales. Por tal motivo, se puede interpretar que los rebaños que no adquieren animales de fuera, presentan menos probabilidad de contraer la enfermedad. 7.7 Seroprevalencia en animales con diarrea En el cuadro 6 se observa que el único animal seropositivo corresponde a uno que no presentó signos de diarrea, por lo que la seroprevalencia para esta variable de estudio fue de 0% (IC95%: 0-53.71). Cuadro 6. Seroprevalencia de paratuberculosis en animales con diarrea Signo de diarrea Con diarrea Sin diarrea Total No. animales Seroprevalencia IC95% 5 0 0-53.71 177 0.56 0.03-3.58 182 RM 0 0.31 IC 95% 0 0-1.98 19 Dado que la presentación de la enfermedad es de curso crónico, no se pueden llegar a observar signos evidentes de enfermedad sino hasta los cuatro o cinco años de edad. Bernardelli (2000) expone que los signos más frecuentes observados son edema, epífora, sonidos pulmonares, emaciación y procesos diarreicos, aunque otros autores (Chávez et al. 2004; Fávila et al. 2007), afirman que el único signo visible es diarrea profusa en los estados terminales de la enfermedad, lo que provoca emaciación progresiva. Por este motivo, se realizaron las encuestas a los propietarios y exploración física a los animales, identificándose cinco animales con diarrea pero ninguno fue seropositivo. 7.8 Seroprevalencia en animales con disminución de la condición corporal Ninguno de los animales muestreados y que presentaron condición corporal baja resultó seropositivo, por lo que la seroprevalencia en esta variable de estudio fue 0% (IC95%: 0-32.14) como se aprecia en el cuadro 7. Cuadro 7. Seroprevalencia de paratuberculosis en animales con disminución de la condición corporal. Condición corporal Baja Normal Total No. animales 11 171 182 Seroprevalencia 0 0.59 IC 95% 0-32.14 0.03-3.73 RM 0 0.64 IC 95% 0-0 0.019-21.72 Otro signo que se puede observar en los animales enfermos es emaciación debida a la pérdida progresiva de la condición corporal en los animales (Ábalos, 2011), por lo cual se puede presentar una mayor seroprevalencia en animales que presentan esta característica, situación que tampoco se observó en el presente 20 estudio, a pesar de que en los datos recabados en las encuestas se registraron 11 animales con disminución de la condición corporal. 7.9 Seroprevalencia por unidad de producción en el manejo de excretas Como ya se dijo, un solo animal perteneciente a una UP resultó seropositivo; sin embargo, en ella las excretas de los animales se integran a los potreros como abono y por tanto la seroprevalencia para esa característica, fue de 3.85% (IC95%: 2-21.59), como se observa en el cuadro 8. Cuadro 8. Seroprevalencia de paratuberculosis en unidades de producción que manejan excretas en potreros Manejo de excretas En potreros Otros Total UP 26 0 26 Serioprevalencia 3.85 0 IC 95% 2-21.59 0 RM 0.006 0.044 IC 95% 0-47.46 0 En las unidades de producción estudiadas, se observaron diferentes manejos para las excretas, como son la presencia de abono en potreros, utilizado para composta, y venta del mismo, entre otros. La principal fuente de infección de paratuberculosis se debe a la ingestión del microorganismo contenido en las deposiciones de material fecal (Díaz et al. 2005); sin embargo, en todas las UP que se estudiaron, el manejo de excretas es usado como abono en los potreros y debido a la gran resistencia del microorganismo, éste permanece viable por semanas o meses y los animales se infectan al pastorear en praderas contaminadas. 21 7.10 Seroprevalencia en unidades de producción con limpieza de instalaciones El total de los propietarios refirieron que diario se realizaba limpieza en las instalaciones o en algunas ocasiones, cada tercer día. Así, se observó una seroprevalencia de 3.85 % (IC95%: 0.2-21.6), como se aprecia en el cuadro 9, pues a pesar de ello, uno de los animales perteneciente a una UP, resultó seropositivo. Cuadro 9. Seroprevalencia de paratuberculosis en unidades de producción con limpieza de instalaciones Limpieza de instalaciones UP Seroprevalencia IC 95% Con limpieza 26 3.85 0.2-21.6 Sin limpieza 0 0 0 Total 26 RM 0.044 0 IC 95% 0 0 En las encuestas realizadas a los propietarios de las unidades de producción se observó si realizaban buenas prácticas de manejo como limpieza de instalaciones; es decir, comederos, bebederos y pisos. Esta variable fue tomada en cuenta debido a la importancia que representa la limpieza de las instalaciones en una UP, pues la micobacteria permanece viable en el suelo por semanas e incluso meses. (Díaz y Santillán, 2005; Díaz et al. 2005, Castellanos, 2010). 22 8. CONCLUSIONES La seroprevalencia general de paratuberculosis caprina en los cinco municipios estudiados fue de 0.6%. No se encontraron factores de riesgo o protectores para la paratuberculosis caprina en ninguna de las variables de los cinco municipios estudiados. 23 9. LITERATURA CITADA Ábalos P. 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Infect. 135 p: 1057-1068. 26 ANEXOS Cuestionario general Número de control: _____________ Encuestador: _______________________________________ Fecha: (____/ ____/_____) Nombre del Rancho: ___________________________________________________________ Nombre del propietario: _________________________________________________________ Domicilio: ____________________________________________________________________ Municipio: ___________________________ Localidad: _______________________________ Tipo de explotación: □ Estabulado □ Semi-estabulado □ Pastoreo. Número total de caprinos: ___________ Etapa Raza Cantidad Crías lactantes Destetados Hembras en producción Engorda Sementales Gestantes Método de identificación: □ Otro arete, □ Arete de campaña □ Arete SINIIGA □ Tatuaje □ Otro método: ______________________________________ Unidades de producción vecinas: □ SI ¿Cuántas? _____________ Especie □ NO Fin Zootécnico Distancia Otras especies: Domesticas: X Especie No. X Especie Ovinos Aves de corral Bovinos Perros y/o Gatos Porcinos Equinos No. Otros, Especifique: 27 Fauna Silvestre: □ Zopilotes ( ) □ Tlacuaches ( □ Venados ( ) □ Armadillos ( □ Murciélagos ( ) Alimentación: ) ) □ Suplementación □ Concentrado □ Vitaminas □Otros: ___________________________ □ Libre pastoreo □ Ensilado □ Henificado □ Sales minerales □ Otros: ____________________________________________________________________ Tipo de comedero: _____________________________________________________________ Animales/Comedero: ______ ¿Limpia los comederos? □ SI □ NO ¿Cómo los limpia?: ____________________________________________________________ Frecuencia de la limpieza: _______________________________________________________ Sanidad y Manejo: Recibe algún tipo de atención veterinaria: □ Si que frecuencia?: _____________________________ □ NO, en caso afirmativo, ¿Con Motivo de la consulta: ____________________________________________________________________________ □ Si □ NO Enfermedad Periodicidad ¿Desparasita a sus animales?: □ Si □ NO Producto Periodicidad ¿Vacuna a sus animales?: Lotifica los animales: □ SI □ NO 28 En caso afirmativo, ¿con qué criterio? □ Etapa productiva □ Edad □ Peso □ Raza □ Otro: _______________________________________________________ 2 Densidad (m /animal/corral): __________ ¿Dónde almacena los alimentos? _________________________________________________ Limpieza de instalaciones: □ Si ¿Limpia sus instalaciones (corrales, sala de ordeña, bodega, etc.)?: □ NO ¿Cómo limpia sus instalaciones?__________________________________________________ ¿Con qué frecuencia? _________________ Eliminación de excretas: □ Abono/Potrero □ Composta □ Las Otros________________________________________________________________________ Eliminación de Cadáveres: □ Incineración □ Se entierra □ Encalado □ Descomposición/aire libre □ Otro (s) ___________________________________________ Remplazos: Vende Porcentaje de reemplazos por año: ________ % Procedencia de reemplazos: Nacidos en el rancho: No. ________ Importados: No. _______ Estado (s): ________________________ Município (s): _______________________________ País: _________________ Moviliza sus animales: □ Si □ NO En caso afirmativo, lugar: _________________________________________________ Frecuencia:________________ Número de animales que moviliza: ________________ Motivos por los cuales moviliza sus animales: □ Engorda □ Venta □ Cambio de instalaciones □ Ferias y/o exposiciones □ Otros: _____________________________________________ □ Cambio de potreros Manejo reproductivo: □ Empadre Controlado □ Inseminación artificial □ Ambos ¿Presta su semental(es)? □ Si □ NO En caso afirmativo, ¿a quién se los presta? (Rancho o Lugar): _______________________ ¿Le prestan semental(es)? □ Si □ NO En caso afirmativo, ¿quién se los presta? (Rancho o Lugar): ________________________ Abortos: ¿ha tenido casos de abortos en el rancho?: □ Si □ NO En caso afirmativo, última vez que se presentaron casos: __________________________ No. De Animales afectados: __________________________________________________ Manejo al nacimiento: Toma calostro: □ Si □ NO Uso de madres sustitutas: □ Si □ NO Otros: _______________________________________________________________________ 29 Última temporada de partos: Fecha: ___________ Número de nacimientos: ______ Hembras: _____ Machos: ____ Muertes dentro de los primeros 60 días: ______ Hembras: _____ Machos: ____ Total de corderos destetados: _______ Comentarios: 30 Cuestionario individual Número de control: _____________ Encuestador: _______________________________________ Fecha: (____/ ____/_____) Nombre del Rancho: ___________________________________________________________ Nombre del propietario: _________________________________________________________ Domicilio: ____________________________________________________________________ Municipio: ___________________________ Localidad: _______________________________ No. Identificación: ________________ Raza: ____________________ Sexo: __________ Edad (meses): ___________ Condición corporal (1-5): _____________ Estado Productivo: _______________________ Procedencia: Estado: ______________________ Municipio: __________________________ País: ____________________ ¿Tomó calostro?: □ Si □ NO Signos clínicos Adultos: □ Incapacidad para mamar □ Postración □ Parálisis: Miembros afectados □ Flacidez muscular □ Fiebre □ Movimientos de pedaleo □ Secreción nasal □ Ruidos pulmonares a la auscultación □ Diarrea: □ Debilidad: □ M.A. □ M.P. □ Tos □ aguda ó □ crónica. Cría □ Fiebre □ Dificultad para respirar □ Ruidos a la auscultación □ Pérdida de apetito □ Palidez de las mucosas □ Mucosas de color amarillo □ Aborto □ Infertilidad □ Pérdida de la Condición Corporal □ Retención placentaria □ Baja en la producción de leche □ Diarrea: □ aguda ó □ crónica 31 1