universidad autónoma de baja california sur tesis bióloga marina
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA TESIS "DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA E HISTOLÓGICA DEL SISTEMA REPRODUCTOR DEL PULPO Octopus hubbsorum (BERRY, 1953)" QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA MARINA PRESENTA: GARCÍA FLORES MARITZA DIRECTORA: DRA. BERTHA PATRICIA CEBALLOS VÁZQUEZ LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, MÉXICO, AGOSTO DE 2015 "Nunca consideres el estudio como una obligación sino como una oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber" Albert Einstein Dedicatoria Este trabajo está dedicado principalmente a mis padres Samuel García Silva y Virginia Flores Cecilio por permitirme cumplir el sueño desde pequeña de ser Bióloga Marina, por todo su apoyo incondicional, económico y moral, por darme la oportunidad de aprender a vivir sola y a valerme por mi misma, por confiar en mí en todo momento al saber que estoy sola en una nueva, lejana y desconocida ciudad, por los buenos consejos que me han dado en este nuevo camino, por los buenos deseos que me brindaron al empezar un nuevo semestre en la carrera, por darme ánimos y no darme por rendida al estar lejos de ustedes por mucho tiempo, gracias por ser unos excelentes padres y hacerme de mi una mejor persona, LOS AMO. A mis hermanos Samuel, Oswaldo e Ixchel por apoyarme en mis momentos de depresión al querer abortar la misión de estar aquí y estudiar biología marina, gracias a ustedes ahora puedo decir que estoy en el lugar correcto, estudiando lo que más me gusta!!. Gracias por estar siempre conmigo, cuidarme y darme ese apoyo incondicional en cualquier momento. A mis hermosas princesas Maninalli, Zazil y Yetzali que siempre me sacan sonrisas y me hacen sentir como toda una Doctora al preguntarme cosas del mar y dejarlas sorprendidas con todas las maravillas del inmenso mar jajaja. A Raúl Cruz Cosío por ser una excelente y maravillosa persona conmigo, por todas las sonrisas, el amor, la compañía, la paciencia y la seguridad que me das, por hacerme sentir que no estoy sola y apoyarme incondicionalmente, sinceramente no pude haber encontrado a otra persona mejor que tú, gracias por ser mi compañero a lo largo de estos 4 años. A la familia Cruz Cosío por brindarme todo su apoyo y amor, por permitirme ser como un miembro más de su familia, me hacen sentir muy feliz al saber que he encontrado a unas excelentes personas. LOS QUIERO MUCHO. Finalmente a todos mis compañeros de la carrera, que sin darnos cuenta nos convertimos en una gran familia paceña, pondría sus nombres pero son muchísimos jajaja los quiero a TODOS!!!. Agradecimientos Agradezco muy especialmente a mis padres que me ayudaron a conseguir lo que siempre había deseado, sin ellos no habría llegado hasta aquí. A la Universidad Autónoma de Baja California Sur por su formación académica y al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas (CICIMARIPN) por permitirme laborar en sus instalaciones. Agradezco también muy especialmente a la Dra. Bertha Patricia Ceballos Vázquez por aceptarme trabajar en su proyecto, mil gracias por todas las enseñanzas, por el apoyo incondicional y todo el tiempo que me ha brindado, por sus buenos consejos, no solo en mi trabajo sino también personalmente, por su valiosa amistad, no cabe duda que usted es una excelente persona a la cual admiro y aprecio mucho GRACIAS!. Al B.M. Marco A. Medina López que me ha apoyado muchísimo con los pulpitos, las revisiones y los buenos consejos que me has dado. GRACIAS marquito por ser una estupenda persona conmigo, por ser un gran amigo y quererme muchooo!!! jajaja sabes que te quiero y espero que nuestra gran amistad dure para siempre!!. Gracias por todo. Al B.M. Carlos A. Aguilar Cruz por el gran apoyo y tiempo que me ha brindado, por las enseñanzas de nuevas técnicas histológicas y consejos para perfeccionar mi técnica en montar laminillas, gracias también por las revisiones y consejos que me ha dado para mí trabajo. Al Dr. Marcial Arellano Martínez por brindarme su apoyo en el laboratorio, por amenizar las salidas a Sta. Rosalía, fueron muy divertidas jamás las voy a olvidar. Por brindarme su confianza y su valiosa amistad. Agradezco a todo el laboratorio de Invertebrados Marinos por su gran apoyo, por sus consejos y por ser unas excelentes personas conmigo, en especial a Nefer y Almita!! gracias por todas sus enseñanzas en cuanto a pulpitos y maniobras en el laboratorio y por su gran amistad, las quiero! Agradezco a mi novio, colega, confidente y mejor amigo Raúl por llevarme y traerme de aquí para allá jajaja gracias por todo tu apoyo, por tu paciencia y por aguantarme en mis momentos de estrés ..ups.. por brindarme todo tu tiempo cuando más lo necesite, por hacerme reír cuando me ponía triste al no saber qué hacer con la tesis y al hacerme sentir que puedo salir adelante, al no darme por vencida y ser capaz de lograr lo que me propongo. Gracias te amo!!!! Finalmente agradezco a todas las personas que me brindaron su apoyo y me dieron ánimos para salir adelante. GRACIAS. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1 II. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 3 II.1. Posición Taxonómica .............................................................................................................. 3 II.3. Alimentación ........................................................................................................................... 5 II.4. Reproducción ........................................................................................................................... 5 III. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 7 IV. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................ 8 IV.1. Objetivos particulares ............................................................................................................ 8 V. METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 9 V.1. Trabajo en campo .................................................................................................................... 9 V.2. Trabajo en laboratorio ............................................................................................................. 9 V.3. Descripción morfológica ......................................................................................................... 9 V.4. Descripción histológica ......................................................................................................... 10 V.4.1. Tinción Tricrómica de Gomori........................................................................................... 12 VI. RESULTADOS........................................................................................................................... 14 VI.1. Descripción morfológica del sistema reproductor femenino de O. hubbsorum ................... 16 VI.2. Descripción histológica del sistema reproductor femenino de O. hubbsorum ..................... 18 VI.2.1. Ovario .......................................................................................................................... 18 VI.2.2.Oviducto proximal y distal ............................................................................................ 20 VI.2.3. Glándula oviductal ....................................................................................................... 22 VI.3. Descripción morfológica del sistema reproductor masculino de O. hubbsorum ................. 24 VI.4. Descripción histológica del sistema reproductor masculino de O. hubbsorum ................... 27 VI.4.1. Testículo ....................................................................................................................... 27 VI.4.2. Ducto espermático........................................................................................................ 30 VI.4.3. Región proximal y distal de la glándula espermatofórica accesoria ............................ 32 VI.4.4. Glándula espermatofórica ............................................................................................ 34 VI.4.5. Saco de Needham ......................................................................................................... 36 VI.4.6. Hectocotilo ................................................................................................................... 38 VII. DISCUSIÓN .............................................................................................................................. 40 VIII. CONCLUSIONES.................................................................................................................... 47 IX. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 49 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.Octopus hubbsorum 4 Figura 2. Ubicación anatómica del sistema reproductor de Octopus hubbsorum 14 Figura 3. Anatomía externa del sistema reproductor femenino 16 Figura 4. Micrografías del ovario 19 Figura 5. Micrografías de los oviductos 21 Figura 6. Micrografías de la glándula oviductal 23 Figura 7. Anatomía externa del sistema reproductor masculino 24 Figura 8. Tercer brazo derecho con modificación (hectocotilo) 26 Figura 9. Micrografías del testículo 28 Figura 10. Micrografías del ducto espermatofórico 31 Figura 11. Micrografías de la porción proximal y distal de la glándula accesoria 32 Figura 12. Micrografías de la glándula espermatóforica accesoria 34 Figura 13.Micrografías del saco de Needham 36 Figura 14.Micrografías del hectocotilo 39 Figura 15. Fotografías donde se aprecian las diferencias en la posición anatómica de los oviductos de O. hubbsorum y O. insularis 41 Figura 16. Fotografía donde se aprecia la segmentación de las espermatecas y las glándulas periféricas en la glándula oviductal de O. hubbsorum. 43 Abreviaciones utilizadas en el texto y figuras C Cilios Gc Glándula central Ca Capilar sanguíneo Gea Glándula espermática accesoria Ce Conducto excurrente Gp Glándula periférica Cf Células foliculares Invg Invaginaciones Cml Células musculares lisas L Lumen Cr Cromatóforos Li Lígula D Ducto Ml Músculo liso De N Núcleo N Nucléolo Dr Ducto espermático Porción distal de la glándula espermática accesoria Dorsal Ovc Ovocito Dstp Ducto espermatofórico Ovg Ovogonia E Estroma P Pedúnculo Ec Espermatocitos Pa Ecls Epitelio columnar simple Pgea Eclc Epitelio columnar ciliado Sg Parénquima Porción proximal de la glándula espermática accesoria Secreción glandular Eclsc Epitelio columnar simple ciliado Sn Saco de Needham Eg Espermatogonias T Testículo Em Tc Tejido conectivo Tg Tejido glandular Et Espermátidas Epitelio columnar pseudoestratificado ciliado Espermatecas Tr Trabécula Ez Espermatozoides Ts Tubos seminíferos Fc Fibras colágenas Fibras de músculo estriado somático Fibras musculares lisas V Vitelo Vn Ventral Vs Vasos sanguíneos Dgea Eclpsc Fmes Fml RESUMEN Octopus hubbsorum es una especie de gran importancia comercial en el Pacífico mexicano, sin embargo presenta pocos estudios acerca de su biología, ecología y aspectos reproductivos. Se han realizado diversos trabajos en octópodos sobre las características macroscópicas e histológicas del sistema reproductor, enfocados básicamente en el ovario y su proceso de maduración, pero no existen descripciones histológicas detalladas del sistema reproductor para ambos sexos. En el presente estudio se describe morfológica e histológicamente el sistema reproductor femenino y masculino del pulpo Octopus hubbsorum. Se analizaron 21 ejemplares de Octopus hubbsorum: 10 hembras y 11 machos capturados en febrero de 2015. El rango de peso para las hembras fue de 50g a 1203.6g y la longitud de manto de 10.5cm a 15cm y los machos presentaron un peso de 447g a 994.7g y la longitud de manto de 9.5cm a 12.4cm. En primer lugar se realizó la descripción morfológica del sistema reproductor para hembras y machos y se caracterizó y ubicó cada una de las partes que lo integran. Para la descripción histológica se utilizó la tinción tricrómica de Gomori. Este estudio constituye la primera descripción histológica del sistema reproductor de esta especie y sienta las bases para futuras investigaciones sobre su biología básica. Palabras clave: Octópodo, glándula oviductal, saco de Needham, hectocotilo, Tricrómica Gomori I. INTRODUCCIÓN El Phyllum Mollusca se caracteriza por su gran diversidad morfológica y por presentar una gran importancia ecológica al ocupar posiciones intermedias en la cadena alimenticia, así como por incluir recursos pesqueros explotados para alimentación y ornamentación. Entre los grupos que incluye se encuentra la clase Cephalopoda constituida por pulpos, calamares y sepias (Brusca y Brusca, 1990), la cual es un componente importante de la biomasa marina (Rathjen, 1991). Debido a su habilidad para mimetizarse y a la gran capacidad de aprender, los pulpos (Orden Octopoda) se encuentran entre los cefalópodos más conocidos (Young, 1965; Norman, 2000). Los octópodos son de cuerpo corto, redondeado en forma de saco y no poseen aletas laterales (excepto algunas formas de profundidad), tienen ocho brazos circumorales cuyas bases están conectadas por una umbrela, carecen de tentáculos y poseen ventosas sésiles, sin anillos quitinosos, a lo largo de los brazos (Roper et al., 1995). Los pulpos presentan una gran importancia en las redes tróficas marinas debido a que son presas de aves acuáticas, mamíferos odontocetos, de un gran número de especies de peces e incluso de otros pulpos (Guerra, 1992). Además a nivel mundial existen importantes pesquerías de pulpo (Paust, 2000). En México más del 90% de la producción nacional proviene de la península de Yucatán, donde se extrae O. vulgaris y O. maya (Solís-Ramírez y Chávez, 1986). La reproducción es una etapa de gran relevancia en el ciclo de vida de una especie, sobre todo de aquéllas sujetas a explotación pesquera, ya que de ella depende la perturbación y la recuperación de la población que muere por causas naturales y por pesca (Jiménez Badillo et al., 2008). La maduración y los cambios gonádicos asociados al ciclo reproductivo de organismos acuáticos, frecuentemente se predicen empleando las escalas macroscópicas de madurez sexual, los índices gonádicos y el factor de condición (Olivares et al., 2001). El análisis histológico del sistema reproductor, completa el conocimiento de las características de las funciones de las gónadas y permite estimar con confiabilidad las 1 diferentes fases del ciclo gonádico y reproductivo de cualquier especie (Jiménez Badillo et al., 2008). En los pulpos sólo se han realizado descripciones macroscópicas e histológicas detalladas del sistema digestivo (Garri y De Cidre, 2013), del ojo (Wells y Wells 1977), y en relación con el sistema reproductor sólo se han hecho descripciones de la glándula oviductal (Fröesch y Marthy, 1975) y del proceso de maduración de la gónada (Boyle y Chevis, 1992, Ishiyama et al, 1999; Olivares et al., 2001; Cuccu et al., 2013, De Lima et al., 2013 y Sieiro et al., 2014). Octopus hubbsorum se distribuye desde el Golfo de California hasta Oaxaca (Domínguez-Contreras et al., 2013) es la principal especie que soporta la pesquería en el Pacífico mexicano (Sánchez-García, 2012), la cual es considerada como artesanal o de subsistencia y alcanza 600 toneladas anuales y aunque la pesca se realiza todo el año la captura se incrementa en los meses de abril a septiembre (Zlatanos et al., 2006). Aunque es una especie de importancia comercial presenta pocos estudios acerca de sus aspectos reproductivos. Se han realizado estudios sobre las características morfológicas del sistema reproductor en relación con la maduración sexual, los trabajos histológicos que existen se han enfocado básicamente en la gónada y su proceso de maduración (Bravo-Olivas, 2008; Pliego-Cárdenas, 2009); sin embargo, no existen descripciones histológicas detalladas del sistema reproductor como un todo en esta especie, tomando en cuenta que este tipo de estudios presenta una gran importancia ya que permite establecer las bases biológicas para implementar medidas de manejo de los recursos pesqueros (Silva et al., 2002). El presente trabajo describe la anatomía macroscópica y constituirá la primera descripción histológica detallada del sistema reproductor en hembras y machos de O. hubbsorum mediante técnicas histológicas que permitirá precisar a detalle las células y tejidos sanos con el propósito de contar con una herramienta que permita identificar la presencia de parásitos, enfermedades y alteraciones histocitológicas causadas por condiciones de cultivo o medio natural. 2 II. ANTECEDENTES II.1. Posición Taxonómica (Bouchet, 2015) Reino Animalia Phyllum Mollusca Clase Cephalopoda (Cuvier, 1797) Subclase Coloidea (Bather, 1888) Superorden Octopodiforme (Berthold & Engeser, 1987) Orden Octopoda (Leach, 1818) Suborden Incirrata (Grimpe, 1916) Familia Octopodidae (D’ Orbigny, 1839-1842) Género Octopus (Cuvier, 1797) Especie Octopus hubbsorum (Berry, 1953) O. hubbsorum carece de concha, presenta un cuerpo redondeado a oval de color café, sin ocelos, en la cabeza se alojan los ojos, el cerebro y tres corazones, dos de ellos bombean sangre a las dos branquias y el tercero al resto del cuerpo; cubiertos por el manto se ubican el resto de las vísceras, así como los sistemas reproductivo y digestivo, el depósito de tinta que emplean para escapar de sus depredadores; también cuentan con un sifón, el cual a diferencia del de los calamares, puede cambiar de dirección, con el que expulsa una gran cantidad de agua, impulsándose así a gran velocidad; posee ocho brazos que cuentan con ventosas pegajosas y convergen en el cuerpo del animal; en su punto de convergencia presentan la boca provista de un pico córneo (Guerra, 1992) (Fig. 1). La umbrela es carnosa, cubriendo los brazos en un cuarto de su longitud y continuando con un par de estrechas quillas carnosas con reducido ángulo distal del brazo(CastellanosMartínez,. 2008). En los machos, el tercer brazo derecho se denomina hectocotilo (Berry, 1953). La longitud máxima del manto reportada es de 120 mm (Roper et al., 1995). Tiene un ciclo de vida corto, aproximadamente de 10 meses; sin embargo las hembras son las que viven más tiempo y pueden alcanzar una longevidad de hasta 15 meses (López-Uriarte, 2006). 3 Figura1. Octopus hubbsorum donde se puede apreciar la coloración A) Vivo, B) Muerto. II.2. Hábitat y distribución O. hubbsorum es comúnmente encontrado en sustratos rocosos, oculto entre grietas durante el día y es poco común encontrarlo en la zona intermareal (Aguilar y GodínezDomínguez, 1995; López-Uriarte et al., 2005). Esta especie se distribuye de manera continua en el Pacífico mexicano por más de 2500 km de línea de costa, abarcando desde Puerto San Carlos en Sonora hasta Salina Cruz en Oaxaca, además, en el Golfo de California se distribuye desde Bahía de los Ángeles hasta Cabo San Lucas (700 km de línea de costa) y recientemente fue registrada su presencia en Bahía Magdalena en la costa occidental de la península de Baja California (Domínguez-Contreras et al., 2013). 4 II.3. Alimentación O. hubbsorum es un depredador oportunista, con una dieta que refleja la abundancia de la presa disponible (Alejo-Plata et al. 2009). Principalmente se alimenta de crustáceos decápodos, seguido de moluscos y peces, aunque también se ha reportado que bivalvos de la familia Carditidae son comunes en su dieta; suele atraer a sus víctimas moviendo rápidamente la punta de un brazo como si fuera un gusano (Castellanos-Martínez,. 2008; Sánchez y Alejo, 2004). II.4. Reproducción Se ha reportado que la reproducción de los octópodos está íntimamente relacionada con la temperatura del agua, el fotoperiodo y la disponibilidad de alimento (CastellanosMartínez,. 2008). En las hembras la maduración sexual es activada por la vitelogénesis, desencadenando un acelerado crecimiento del ovario a consecuencia de una gran acumulación de vitelo en los ovocitos (Boyle y Chevis, 1992). La producción de vitelo, la proliferación de células reproductivas, la maduración de la gónada y el desarrollo de los conductos son regulados por hormonas secretadas por la glándula óptica (Wells y Wells, 1977). Existen varios criterios para determinar la maduración sexual en las hembras: la apariencia macroscópica del ovario (Cortez et al., 1995), talla del ovario, glándulas oviductales y huevos (Boyle y Knobloch, 1983), índice gonadosomático (Smale y Buchan, 1981), e índices basados en la relación en peso del sistema reproductor (Guerra, 1975; Iribarne et al., 1991; Silva et al., 2004). Sin embargo, Boyle y Knobloch (1983) mencionan que el indicador más preciso para determinar madurez sexual es el análisis microscópico de los ovocitos. Algunos autores presentan estudios en donde describen morfológicamente el sistema reproductor de octópodos tanto de machos como de hembra, caracterizando cada una de las partes que lo integran, tal es el caso de Octopus rubescens (López Peraza et al., 2013), O. bimaculoides (Price, 1959), O. vulgaris (Brusca y Brusca, 2003; Silva et al., 2004), O. hubbsorum (Bravo-Olivas, 2008). Por otro lado, hay descripciones del desarrollo de los órganos de O. vulgaris, caracterizando macroscópicamente seis fases de desarrollo de hembras y machos (Cuccu et al., 2013). Otros trabajos describen la madurez gonádica 5 mediante escalas morfocromáticas, las cuales toman en cuenta características morfológicas como coloración, turgencia y textura de las gónadas (Sánchez-Cruz, 2006; Quetglas et al., 1998; Jiménez-Badillo et al., 2008). Los estudios histológicos que se tienen en octópodos están más centrados en los estadios de madurez gonadal en especies como Eledone moschata y E. massay (Álvarez y Haimovici, 1991; López Peraza et al., 2013), E. cirrhosa (Boyle y Knobloch, 1984); O. mimus (Ishiyama et al., 1999; Olivares-Paz et al., 2001; Zamora y Olivares 2004), O. vulgaris (Jiménez Badillo et al., 2008; Calderón-Manrique y Ruiz-Castillo, 2009; Cuccu et al., 2013) O. rubescens (López-Peraza et al., 2013), O. bimaculoides (Price, 1959), incluyendo a O. hubbsorum (Bravo-Olivas, 2008). Por último Fröesch y Marthy (1975) describen histológicamente la estructura y función de la glándula oviductal presente en el sistema reproductor de las hembras en Octópodos. Pero a pesar de la gran cantidad de estudios histológicos encaminados al estudio de la reproducción en pulpos no existen descripciones a profundidad de su sistema reproductor. 6 III. JUSTIFICACIÓN Octopus hubbsorum representa una de las principales especies de octópodos explotados en el Pacífico mexicano y a pesar de la importancia de este recurso presenta pocos estudios histológicos de su sistema reproductor enfocados básicamente en la gónada y su proceso de maduración, sin embargo, es importante abordar un estudio descriptivo a nivel de tejidos para conocer lo que ocurre en los órganos y su posible funcionamiento, además de que el estado de salud de los organismos no siempre es evidente en observación macroscópica, en particular cuando se tiene presencia de parásitos o quistes. De igual manera deficiencias alimenticias y daños causados por enfermedades en el medio natural, así como en sistemas de cultivo solo pueden ser identificados a través de observaciones microscópicas de los tejidos afectados. Por ende, contar con una descripción tanto macroscópica como histológica de esta especie de importancia pesquera y futuramente acuícola permite tener un patrón de referencia a las condiciones normales de los tejidos y así poder corregir o prevenir daños mayores en las pesquerías al identificar las causas deficientes en la reproducción o reclutamiento. 7 IV. OBJETIVO GENERAL Describir el sistema reproductor del pulpo Octopus hubbsorum. IV.1. Objetivos particulares Describir la ubicación anatómica y características morfológicas de los órganos reproductores que integran el sistema reproductor de machos y hembras. Describir las características microscópicas de los órganos reproductores de machos y hembras. 8 V. METODOLOGÍA V.1. Trabajo en campo Para la obtención de muestras del presente trabajo se recurrió a la captura comercial, la cual se realizó por personal capacitado mediante buceo semiautónomo tipo "hooka" (con compresor de aire), usando "gancho" como arte de pesca, a una profundidad no mayor de 15 m. Las muestras biológicas se trasladaron en una hielera al Laboratorio de Invertebrados Marinos del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas-Instituto Politécnico Nacional (CICIMAR-IPN) en La Paz, Baja California Sur, México, en donde se llevó a cabo su identificación y procesamiento. V.2. Trabajo en laboratorio La toma de datos morfométricos de cada ejemplar se realizó mediante una cinta métrica (1 mm de precisión) midiéndose la longitud total (LT) considerada desde el extremo distal del manto hasta la punta del brazo más largo, y la longitud del manto dorsal (LM) comprendida desde el extremo distal del manto hasta la altura media de los ojos. Adicionalmente se pesaron los organismos en una balanza electrónica (Scout Pro-600) (0.01 g de precisión). V.3. Descripción morfológica Para la descripción macroanatómica general, se realizó una incisión en el tejido muscular del manto para extraer la masa visceral y posteriormente el sistema reproductor femenino (conformado por ovario, glándulas oviductales y oviductos) y el masculino (conformado por el testículo, saco de Needham, glándulas accesorias, ducto excurrente y brazo hectocotilizado). Se observó cuidadosamente y se tomaron notas de las posiciones, estructuras y conexiones de cada uno de los órganos reproductores, tomando fotografías con una cámara fotográfica Canon EOS 3R. 9 V.4. Descripción histológica Para la revisión histológica nuevamente se realizó una incisión en el tejido muscular del manto extrayéndose la masa visceral y el sistema reproductor femenino y masculino, obteniéndose los órganos reproductores mencionados ya anteriormente y se procedió a su fijación en solución Finefix® (Milestone) ácido acético (9:1), el periodo de fijación fue de 24 a 36 horas. Una vez completado el proceso de fijación, se cortaron porciones transversales y longitudinales de cada órgano de aproximadamente 5 mm de grosor. Las muestras de tejido se colocaron en cassettes histológicos etiquetados con nombre de la especie, fecha, número de organismo y clave del tipo de órgano. Se procesaron mediante la técnica histológica convencional descrita por Humason (1979), la cual consiste en deshidratación, aclarado, inclusión en parafina, corte y tinción. Procedimiento 1. Deshidratación Alcohol Etílico 80% I 2 horas Alcohol Etílico 80% II 2 horas Alcohol Etílico 96% I 2 horas Alcohol Etílico 96% II 2 horas Alcohol Etílico 100% I 2 horas Alcohol Etílico 100% II 2 horas Alcohol Etílico 100% III 2 horas 2. Aclarado Alcohol Etílico 100% / Neo Clear (Merck Millipore) 1 hora Neo Clear 1 hora Neo Clear / Parafina 1 hora 3. Inclusión Parafina I 1 hora Parafina II 1 hora Parafina II 1 hora 10 Para la inclusión se utilizó una mezcla de parafina y polímeros (Paraplast X-tra) con un punto de fusión de 54-56° C. Los cortes se realizaron en un micrótomo de rotación marca "Leica 2040 Reicher Jung", a un grosor de 4 µm. Los cortes se colocaron en un baño de flotación con grenetina a una temperatura de 54° C, recogiéndolos en porta objetos cuidando que no queden burbujas. Se obtuvieron cuatro portaobjetos por cada órgano, con aproximadamente 2 a 4 cortes en cada uno. Para la tinción se utilizó la técnica tricrómica de Gomori. 11 V.4.1. Tinción Tricrómica de Gomori (López et al., 1982). Soluciones: a) Colorante Gomori (Hycel) b) Solución Bouin Ácido pícrico solución acuosa concentrada 75 mL Ácido acético 5 mL Formaldehido 37-40% 25 mL c) Ácido fosfomolíbdico acetificado Agua destilada 10 mL Ácido fosfomolíbdico 0.7 g Ácido acético 1 mL Procedimiento 1. Desparafinar los cortes e hidratar de acuerdo a lo siguiente: Xilol I 10 minutos Xilol II 5 minutos Xilol III 5 minutos Alcohol Etílico 100% 5 minutos Alcohol Etílico 100% 5 minutos Alcohol Etílico 95% 5 minutos Alcohol Etílico 70% 5 minutos Agua destilada 5 minutos 2. Solución Bouin 30 minutos Esta solución mordente hace que los tejidos adquieran mayor colorante y a su vez los hace más vívidos. 3. Lavar en agua corriente hasta desaparecer la coloración amarilla de la solución Bouin 4. Lavar en agua destilada 2 minutos 5. Tinción de hematoxilina férrica 5 minutos 12 6. Lavar en agua corriente 3 minutos 7. Tinción con colorante Gomori 15 minutos 8. Ácido fosfomolíbdico acetificado 5 segundos 9. Deshidratar en: Alcohol Etílico 70% 5 minutos Alcohol Etílico 95% 5 minutos Alcohol Etílico 95% 5 minutos Alcohol Etílico 100% 5 minutos Alcohol Etílico 100% 5 minutos 10. Aclarar en: Xilol I 5 minutos Xilol II 5 minutos Xilol III 5 minutos 11. Montar con Cytoseal, resina sintética. Resultados Núcleos: violeta Fibras colágenas: verde Eritrocitos: rosados Músculo: rojo Finalmente se prosiguió al análisis histológico de las laminillas mediante el microscopio Olympus BX41, tomándose micrografías con una cámara fotográfica Camedia Olympus C5060 de cada uno de los órganos reproductores de hembras y de machos para la representación de los tejidos observados en las laminillas. 13 VI. RESULTADOS Se recolectaron 21 ejemplares de Octopus hubbsorum: 10 hembras y 11 machos en el mes de Febrero de 2015. El rango de peso para las hembras fue de 50 g a 1203.6 g y la longitud del manto de 10.5 cm a 15 cm y los machos tenían un peso de 447 g a 994.7 g y la longitud del manto de 9.5 cm a 12.4 cm. La anatomía del sistema reproductor de O. hubbsorum se ajusta al modelo general que se observa en la mayoría de los octópodos, se sitúa en el posterior de la cavidad del manto (Fig. 2). El aparato reproductor es una evaginación fuera del saco visceral y permanece unida por un rudimento ligamentoso. 14 Figura 2. del Octopus hubbsorum, A) Sistema reproductor femenino, B) Sistema reproductor masculino. Abreviaturas: De, Ducto espermático; Gea, Glándula espermatofórica accesoria; Gov, Glándula oviductal; Ov, Ovario; Ovp, Oviducto proximal; Ovd, Oviducto distal; Sn, Saco de Needham; T, Testículo. 15 VI.1. Descripción morfológica del sistema reproductor femenino de O. hubbsorum El sistema reproductor femenino constó de un ovario, oviductos proximales, glándulas oviductales y oviductos distales (Fig. 3). Figura 3. Anatomía externa del sistema reproductor femenino de Octopus hubbsorum. A) Fase en desarrollo, B) Fase postdesove. Abreviaturas: Gov, Glándula oviductal; Ov, Ovario; Ovc, Oviducto común; Ovd, Oviducto distal; Ovp, Oviducto proximal. 16 El sistema reproductor femenino cuenta con un solo ovario, el cual está rodeado por una membrana ovárica delgada de un color blanco translúcido que permite ver el cambio de coloración que sucede con el progreso del estado de madurez del ovario, esta membrana está conectada al principal saco visceral por un divertículo embrionario (Fig. 3B). El ovario es casi redondo, pero su forma y tamaño varían conforme avanza la maduración gonadal. La región ventral del ovario tiene una abertura que forma un embudo que conduce a un ducto común, el ducto común se divide dando origen a los dos oviductos proximales. Los oviductos proximales desembocan en las glándulas oviductales de forma redonda, estas glándulas oviductales presentan un disco café que las rodea y va tomando un color más oscuro y aumentan de tamaño conforme avanza el grado de madurez. Finalmente, las glándulas oviductales desembocan en los dos oviductos distales cuya porción final se encuentra abierta hacia la cavidad del manto. 17 VI.2. Descripción histológica del sistema reproductor femenino de O. hubbsorum VI.2.1. Ovario El ovario de O. hubbsorum se encuentra envuelto por una membrana de tejido conectivo fibroso, principalmente fibras colágenas, con células musculares lisas y algunos vasos sanguíneos (Fig. 4A y B). Adicionalmente, se encuentra una membrana basal desde donde se extienden unas trabéculas de tejido conectivo fibroso (estroma) en forma de ramificaciones hacia el lumen del ovario, inmersas entre este tejido se encuentran las células germinales (ovogonias) y en desarrollo (ovocitos), constituyendo el parénquima (Fig. 4A). Las ovogonias son células germinativas pequeñas poco conspicuas granulosas, cuando aumentan su tamaño las ovogonias se aprecian más frecuentemente teniendo un núcleo (vesícula germinal) grande bien definido y centrado (Fig. 4C). Los ovocitos primarios presentan una capa de células foliculares. A lo largo de todo el desarrollo los folículos permanecen unidos al estroma que forma una vaina mediante las células de la teca que rodean al ovocito (Fig. 4D). En el citoplasma de los ovocitos vitelogénicos se observan con gránulos de vitelo; estos ovocitos presentan pliegues foliculares (invaginaciones de las células foliculares y el estroma hacia dentro del citoplasma del ovocito) (Fig. 4E). Finalmente, se observan los ovocitos maduros completamente llenos de vitelo y con invaginaciones foliculares reducidas hacia la periferia (Fig. 4F). 18 Figura 4. Micrografías del ovario de Octopus hubbsorum. A) Ovario en desarrollo, 10X; B) Detalle de la membrana ovárica de un ovario inmaduro, 40X; C) Ovocitos primarios, 40X; D) Detalle de la vaina que une un ovocito al estroma, 40X; E) Ovocitos vitelogénicos en fase de foliculogénesis, 40X; F) Ovocito maduro, 40X. Abreviaturas: Cf, células foliculares; Cml, Células musculares lisas; E, estroma; Fc, fibras colágenas; Invg, invaginaciones; L, lumen; N, núcleo; n, nucléolo; Ovc, ovocito; P, pedúnculo; Pa, parénquima Tc, tejido conectivo; Tr, trabécula; Ovg, ovogonia V, vitelo. 19 VI.2.2.Oviducto proximal y distal La pared del oviducto proximal está compuesta de tejido conectivo y por fibras de células musculares lisas, fusiformes y paralelas entre sí, con algunos vasos sanguíneos (Figs. 5A y B). El lumen del oviducto está rodeado por un epitelio columnar simple ciliado y tejido conectivo que forma pliegues (Figs. 5B y C). La pared del oviducto distal muestra una compleja red de musculatura lisa que forma fascículos fibromusculares con orientación; longitudinal externa y transversal interna (Figs. 5D y F). En el oviducto distal se observan en el centro del lumen grandes masas compactas de espermatozoides, rodeadas de epitelio columnar simple ciliado y tejido conectivo, además no presenta los pliegues de la porción proximal (Fig. 5E). 20 Figura 5. Micrografías de los oviductos de Octopus hubbsorum. A) Corte longitudinal de un oviducto proximal, 4X; B) corte transversal de un oviducto proximal, 20X; C) Detalle del lumen del oviducto proximal, 40X; D y F) Detalle de la pared del oviducto distal, 20X y 40X; E) Lumen del oviducto distal con grandes masas de espermatozoides compactas, 20X. Abreviaturas: Fml, Fibras musculares lisas; Eclsc, epitelio columnar simple ciliado; Ez, espermatozoides; L, lumen; Tc, tejido conectivo; Vs, vasos sanguíneos. 21 VI.2.3. Glándula oviductal La glándula oviductal está rodeada por una pared compuesta de tejido conectivo, músculo liso y algunos vasos sanguíneos. Está constituida por espermatecas y tejidos glandulares, ubicados en áreas separadas bien definidas. Las espermatecas se ubican en la parte dorsal (Fig. 6A) y en forma circular alrededor de la región central de la glándula oviductal (Fig. 6B). Las espermatecas presentan un epitelio columnar simple ciliado con núcleos esféricos u ovalados basales. Dentro de la luz de la espermateca los espermatozoides se acumulan con las cabezas en dirección al tejido y en contacto con los cilios del epitelio y los flagelos dirigidos hacia el lumen central (Figs. 6C y D). Se apreciaron espermatecas de diferentes tamaños ya que éste va aumentando conforme se va llenando de espermatozoides (Fig. 6B). Existen dos tipos de tejido glandular, uno ubicado en la parte externa de la glándula oviductal (glándula periférica) y el otro en la parte intermedia cercano a las espermatecas (glándula central) (Figs. 6A y B). El tejido glandular periférico está compuesto por glándulas tubulares ramificadas de tipo alveolar, mientras que el tejido glandular central es de tipo tubular simple acinar (Figs. 6E). En el centro de la glándula oviductal se encuentra un conducto central cuyo lumen está rodeado por epitelio columnar simple ciliado, que conecta al oviducto proximal con el oviducto distal (Fig. 6F). 22 Figura 6. Micrografías de la glándula oviductal de Octopus hubbsorum. A) Corte longitudinal, 4X; B) Corte transversal, 4X; C) Detalle del epitelio columnar simple ciliado de las espermatecas llenas de espermatozoides, corte longitudinal, 40X; D) Espermateca con espermatozoides libres en el lumen, Corte transversal, 40X; E) Detalle del tejido glandular central y periférico, corte longitudinal, 40X; F) lumen central de la glándula oviductal, Corte transversal, 40X. Abreviaturas: Dr, Dorsal; Eclsc, epitelio columnar simple ciliado; Et, espermateca; Ez, espermatozoides; Gc, glándula central; Gp, glándula periférica; L, lumen; Ml, músculo liso; Tc, tejido conectivo; Vn, Ventral; Vs, vaso sanguíneo. 23 VI.3. Descripción morfológica del sistema reproductor masculino de O. hubbsorum El sistema reproductor masculino está rodeado por una membrana delgada que presenta un color blanco translúcido que permite ver el cambio de coloración que sucede con el progreso de madurez del testículo (Fig. 7A). Una vez que se ha retirado la membrana se puede apreciar que el sistema reproductor masculino se compone de un testículo, un ducto espermatofórico, parte proximal de la glándula espermatofórica, parte distal de la glándula espermatofórica, una glándula espermatofórica accesoria, un complejo espermatofórico (saco de Needham) y de un conducto excurrente (Fig. 7B). Figura 7. Anatomía externa del sistema reproductor masculino de Octopus hubbsorum. A) Sistema reproductor envuelto en la membrana, B) Sistema reproductor extendido, C) testículo donde se pueden apreciar la gran cantidad de túbulos seminíferos. Abreviaturas: De, ducto espermatofórico; Dgea, parte distal de la glándula espermatofórica accesoria; Ce, conducto excurrente; Gea, glándula espermatofórica accesoria; Pgea, parte proximal de la glándula espermatofórica accesoria; Sn, Saco de Needham; T, testículo; Ts, túbulos seminíferos. 24 El testículo tiene una forma ovalada y en un estado inmaduro presenta una coloración amarilla-blanquecina; cuando el grado de madurez aumenta se observa de un color más blanco, al igual que las hembras el testículo aumenta de tamaño conforme avanza la maduración, sin embargo éste alcanza un menor tamaño que el ovario. El testículo presenta una gran cantidad de túbulos seminíferos que en estadios avanzados de madurez se pueden apreciar a simple vista a través de la membrana de tejido conectivo que lo cubre (Fig. 7C); en la región ventral se observa una abertura que forma un embudo dando origen al ducto espermático. Este órgano es muy delgado y se presenta de forma compactada y enrollada el cual conecta al testículo con la glándula espermatofórica accesoria. La porción proximal de la glándula espermatofórica accesoria presenta una forma triangular ancha mientras que la proporción distal es un pequeño tubo extendido en los extremos proximales de la glándula espermatofórica accesoria uniéndose ésta con el saco de Needham. La glándula espermatofórica accesoria se observa en forma de 'bastón' y con un mayor tamaño y anchura, la glándula espermatofórica accesoria está conectada al saco de Needham en el cual se lleva a cabo el empaquetamiento de los espermatóforos de tal manera que éstos puedan ser liberados por el conducto excurrente el cual presenta una abertura en la porción final (Fig. 7B). En los machos, el tercer brazo derecho está modificado en un órgano intromitente (hectocotilo), el cual presenta un ducto delgado de color blanquecino en la parte ventral/interna y termina en una lígula, estructura en la punta del brazo en forma de pala que facilita la trasferencia de espermatóforos a la hembra (Fig. 8). 25 Figura 8. Tercer brazo derecho con modificación (hectocotilo) de Octopus hubbsorum. Abreviaturas: D, ducto; Li, lígula. 26 VI.4. Descripción histológica del sistema reproductor masculino de O. hubbsorum VI.4.1. Testículo Histológicamente el testículo de O. hubbsorum está envuelto en una membrana de tejido conectivo con algunos vasos sanguíneos (Fig. 9A); se encuentra organizado por una gran cantidad de túbulos seminíferos densamente compactados (Fig. 9B), separados por una delgada capa de tejido conectivo con vasos sanguíneos, en los túbulos seminíferos tiene lugar la espermatogénesis. La maduración de las células espermáticas es concéntrica, va desde la membrana basal a la región central, con las espermatogonias en la pared del túbulo, espermatocitos y espermátidas en capas concéntricas hacia el lumen, donde se acumulan los espermatozoides (Fig. 9A). Las espermatogonias son células pequeñas y redondas con núcleos altamente granulados, ubicadas a nivel basal en el túbulo seminífero, las espermatogonias dan origen a los espermatocitos primarios y secundarios. Los espermatocitos primarios se observaron de mayor tamaño y con núcleo granuloso, una vez formados los espermatocitos primarios se inicia una migración desde la parte basal hacia la luminal del túbulo seminífero. Los espermatocitos secundarios son células de vida muy breve razón por la cual no se observan con facilidad, estas células dan origen a las espermátidas. Las espermátidas presentan un tamaño grande con forma alargada u oval, en las cuales finalmente se da la espermiogénesis (transformación a espermatozoides). Los espermatozoides son células alargadas compuestas por una cabeza que alberga el núcleo y una cola que corresponde a la porción más larga. Conforme se acumulan los espermatozoides empiezan a ocupar cada vez mayor espacio dentro de los tubos seminíferos hasta llenarlos completamente (Fig. 9B). 27 28 Figura 9. Micrografías del testículo de Octopus hubbsorum. A) Detalle de los túbulos seminíferos, 40X; B) Túbulos seminíferos compactados, 4X. Abreviaturas: Ec, espermatocitos; Eg, espermatogonias; Em, espermátidas; Ez, espermatozoides; L, lumen; Tc, tejido conectivo; Ts, túbulos seminíferos; Cs, capilar sanguíneo. 29 VI.4.2. Ducto espermático El ducto espermático está constituido por tejido conectivo de sostén a lo largo de su estructura y cubierto por una membrana basal (Fig. 10A). El tejido conectivo está conformado por un epitelio plano simple, se logran observar vasos sanguíneos y fibras de músculo liso. En la parte más cercana al lumen se observa un epitelio columnar simple ciliado y en la parte interna del ducto se encuentran los espermatozoides altamente compactados (Fig. 10B). Es posible que la función de este conducto consista de la compactación de espermatozoides en una estructura cilíndrica. 30 Figura 10. Micrografías del ducto espermatofórico de Octopus hubbsorum. A) Detalle del tejido conectivo del ducto espermatofórico, 20X; B) Espermatozoides altamente compactados, 40X. Abreviaturas: Fml, fibras de músculo liso; Eclc, epitelio columnar simple ciliado; Ez, espermatozoides; L, lumen; Tc, tejido conectivo; Vs, vaso sanguíneo. 31 VI.4.3. Región proximal y distal de la glándula espermatofórica accesoria A través del ducto espermático el esperma llega a la glándula espermatofórica que tiene una forma tubular con pliegues en el interior; además presenta una gran cantidad de tejido glandular acinar (Fig. 11A). La región proximal y la región distal de la glándula constan de un epitelio columnar pseudoestratificado ciliado, se observa tejido conjuntivo de sostén con algunos vasos sanguíneos. En la región proximal se observan ductos espermáticos con grandes masas compactas de espermatozoides en organismos maduros y ductos vacíos en organismos juveniles (Fig. 11B). El tejido glandular está formado por un número de unidades secretoras compuestas por células columnares ciliadas con núcleos basales y su lumen es ciliado, cada glándula se encuentra separada por una capa gruesa de tejido conectivo y algunos vasos sanguíneos. 32 Figura 11. Micrografías de la región proximal y distal de la glándula espermatofórica accesoria de Octopus hubbsorum. A, C, E y G) Región proximal de la glándula espermatofórica accesoria, 10X, 20X, 40X, 40X; B, D, F y H) Región distal de la glándula espermatofórica accesoria, 40X, 4X, 20X, 40X. Abreviaturas Dstp, Ducto espermatofórico; Eclpsc, epitelio columnar pseudoestratificado ciliado; Ez, espermatozoides; L, lumen; Tc, tejido conectivo; Tg, Tejido glandular; Vs, vaso sanguíneo. 33 VI.4.4. Glándula espermatofórica La glándula espermatofórica se compone de unidades secretoras compactas rodeadas externamente por una membrana basal gruesa (Fig. 12A). El tejido glandular consiste de epitelio columnar ciliado con núcleos basales de tipo acinar (Fig. 12B). El lumen de la glándula es ciliado y cada glándula está separada entre sí por tejido conectivo y se alcanzan a observar fibroblastos y vasos sanguíneos. Se considera que esta glándula secreta una capa externa al espermatóforo para después ser depositados en el Saco de Needham en donde los espermatóforos serán almacenados. 34 Figura 12. Micrografías de la glándula espermatofórica accesoria de Octopus hubbsorum. A) Detalle del tejido conectivo y glandular de la glándula espermatofórica, 20X; B) Tejido glandular 40X. Abreviaturas: C, cilios; Eclc, Epitelio columnar ciliado ; Tc, tejido conectivo; Tg, tejido glandular. 35 VI.4.5. Saco de Needham Una vez que los espermatóforos son maduros, se depositan y se almacenan en paralelo entre sí en el saco del Needham. Este órgano se compone de epitelio columnar pseudoestratificado ciliado, rodeado con abundantes pliegues de tejido conectivo areolar a lo largo de su estructura. El saco de Needham es un saco largo ciego. La pared del saco de Needham está compuesta por tejido conectivo con una fina capa de fibras musculares. Desde la pared se extienden trabéculas que separan los espermatóforos almacenados, una de estas trabéculas se extiende completamente a través del saco de Needham dividiéndolo en dos compartimientos (Fig. 13). 36 Figura 13. Micrografías del saco de Needham de Octopus hubbsorum. A) Detalle del almacenamiento de los espermatóforos, 20X; B) Espermatoforo, 20X. Abreviaturas: Eclpsc, Epitelio columnar pseudoestratificado ciliado; Ez, espermatozoides; Tc, tejido conectivo; Tr, trabécula; Spt, espermatóforo. 37 VI.4.6. Hectocotilo El hectocotilo es uno de los brazos del macho con modificación para transferir los espermatóforos a las hembras. Principalmente está compuesto por diferentes capas de células musculares (tejido muscular estriado somático) que discurren en sentido longitudinal, circular y perpendicular, separados entre sí por fibras colágenas y tejido conjuntivo. Las células (fibras) musculares son columnares, presentan núcleo ovoide central y se observan finas estriaciones, está rodeado por una epidermis formada por un epitelio columnar pseudoestratificado y algunas células caliciformes de secreción mucosa. En la dermis se observan cromatóforos de gran tamaño. En el ducto espermatofórico se caracterizó por presentar tejido glandular y gran cantidad de secreción(Fig. 14). 38 Figura 14. Micrografías del hectocotilo de Octopus hubbsorum. A) Detalle de la composición muscular del hectocotilo, 10X; B, C y D) Organización de la estructura del brazo hectocotilizado, 20X, 20X, 40X. Abreviaturas: Cr, cromatóforos; Ecls, Epitelio columnar simple; Fc, fibras colágenas; Fmes, Fibras de músculo estriado somático; Fml, fibras musculares lisas; Tc, tejido conectivo; Tg, tejido glandular; Sg, secreción glandular. 39 VII. DISCUSIÓN Existen diversos estudios de la biología reproductiva en octópodos donde se hacen análisis histológicos y/o macroscópicos (Price, 1959; Álvarez y Haimovici, 1991; Ishiyama et al., 1999; Sánchez-Cruz, 2006; Boyle y Knobloch, 1984; López Peraza et al., 2013; Quetglas et al., 1998; Olivares-Paz et al., 2001; Brusca y Brusca, 2003; Silva et al., 2004; Zamora y Olivares, 2004; Jiménez-Badillo et al., 2008; Calderón-Manrique y RuizCastillo, 2009; López-Peraza et al., 2013; Cuccu et al., 2013), incluyendo a O. hubbsorum (Bravo-Olivas, 2008). Sin embargo, aún cuando algunos de ellos presentan la descripción macroscópica del sistema reproductor, están más centrados en determinar los estadios de madurez gonadal, fecundidad y otros aspectos reproductivos como proporción sexual o talla de madurez. La descripción morfológica macroscópica del sistema reproductor femenino observada en O. hubbsorum es similar a la descrita para O. mimus (Olivares-Paz et al., 2001) y O. rubescens (López-Peraza et al., 2013), y en general corresponde al modelo universal establecido para otras especies del género Octopus (Morales, 1973; Arkhipkin, 1992; Boyle y Chevis, 1992). De acuerdo a este modelo universal el ovario presenta un oviducto común que posteriormente se divide para formar dos oviductos proximales, sin embargo existe una diferencia en la ubicación del oviducto común entre especies que no ha sido reportado anteriormente. En O. hubbsorum el oviducto común se encuentra en la parte externa del saco ovárico de tal forma que es posible apreciar la unión de los oviductos proximales, los cuales se encuentran muy cercanos entre sí y salen de la parte inferior del ovario; mientras que en O. bimaculoides y en O. insularis el oviducto común se encuentra totalmente dentro del saco ovárico de tal forma que los oviductos salen de manera independiente y en una posición lateral (Figura 15). 40 Figura 15. Fotografías donde se aprecia las diferencias en la posición anatómica de los oviductos de O. hubbsorum y O. insularis (De Lima et al., 2013). 41 En O. hubbsorum, los oviductos proximales finalizan en pequeñas aberturas musculares que desembocan en las glándulas oviductales en una disposición similar a la de O. vulgaris (Wells, 1978), O. mimus (Olivares-Paz et al., 2001), O. bimaculoides (Price, 1959) y E. cirrhosa (Álvarez y Haimovici, 1991). Las glándulas oviductales presentaron una forma esférica y reflejan a través de su membrana translúcida, dos compartimentos, una franja blanquecina situada abajo del oviducto proximal que corresponde a las espermatecas (cuyo color está dado por la acumulación de espermatozoides) y una segmentación longitudinal de color obscuro que corresponde a las glándulas periféricas que son las que predominan en la glándula oviductal. Estos dos compartimentos pueden ser observados a simple vista sobre todo cuando la hembra ha alcanzado el máximo grado de madurez (Figura 16). En O. hubbsorum se observó que las glándulas oviductales presentan espermatecas teniendo como función el almacenamiento de los espermatozoides al igual que en otros estudios realizados en el género Octopus (Fröesch y Marthy, 1975; Grubert y +Wadley 2000; Rodríguez-Rúa et al., 2005). El género Eledone carece de espermatecas, por lo tanto, los espermatozoides se mantienen en la cavidad del ovario, que es el sitio en donde se lleva a cabo la fertilización de los huevos (Fröesch y Marthy, 1975; Boyle y Rodhouse, 2005). En Vulcanoctopus hydrothermalis este almacenamiento tampoco existe debido a que las hembras no presentan espermatecas en la glándula oviductal (González et al., 2008). Por otra parte, los Loligínidos almacenan los espermatozoides en la boca, mientras que los calamares y sepias los almacenan en la cavidad del manto (López-Peraza et al., 2013). 42 Figura 16. Fotografía donde se aprecia la segmentación de las espermatecas y las glándulas periféricas en la glándula oviductal de O. hubbsorum. La descripción histológica del ovario de O. hubbsorum presenta una similitud con O. mimus, O. vulgaris, O. rubescens, O. insularis y O. bimaculoides (Olivares-Paz et al., 2001; Jiménez-Badillo et al., 2008; López-Peraza et al., 2013; De Lima et al., 2013 y Price, 1959). Con la técnica de tinción de Gomori se lograron observar a detalle cada una de las células germinales del ovario de O. hubbsorum, desde las ovogonias y ovocitos en desarrollo, hasta los ovocitos vitelogénicos, con diferentes grados de maduración. La maduración de los ovocitos es muy similar en las hembras de cefalópodos. El distintivo y la peculiaridad de la ovogénesis en los cefalópodos, es la formación de una segunda capa de células foliculares y la invaginación folicular (López-Peraza et al., 2013; DomínguezContreras, 2013). Los oviductos proximales y distales además de presentar un epitelio columnar simple ciliado, presentan fibras musculares las cuales podrían brindar la función de contracción para facilitar el transporte o liberación de los espermatozoides y facilitar la salida de los huevos al momento del desove, respectivamente. Una vez que los ovocitos maduros son liberados de su vaina folicular, descienden en el oviducto proximal uno por uno, mientras que los espermatozoides deben ser liberados de las espermatecas en la cavidad de la glándula oviductal para que la fertilización ocurra (Fröesch y Marthy 1975). Sin embargo, aún no se sabe cuál es el estímulo que ocasiona la removilización de los 43 espermatozoides, si éstos son liberados o se rompe el acrosoma y el núcleo (Fröesch y Marthy, 1975). En el género Eledone los espermatozoides entran en el ovario, en donde ocurre la fertilización, en este caso solo las hembras maduras presentan espermatozoides en el ovario. La ausencia de las espermatecas de la glándula oviductal en Eledone está posiblemente relacionado con un comportamiento sexual diferente (Fröesch y Marthy, 1975). En O. hubbsorum la glándula oviductal está constituida principalmente por músculo liso, espermatecas con un epitelio columnar simple ciliado con núcleos esféricos y dos tejidos glandulares, el tejido glandular central que es de tipo tubular simple y el tejido glandular periférico que está compuesto por glándulas tubulares simples ramificadas de tipo alveolar. Además de ser el sitio para la fertilización, en la glándula oviductal se lleva a cabo el recubrimiento de los huevos con una mezcla de dos sustancias secretadas. En el género Eledone las glándulas centrales y periféricas se desarrollan sincrónicamente y liberan sustancias durante el periodo de desove. Los exámenes histoquímicos de dichas sustancias, sugieren que la glándula central produce un mucopolisacárido sulfatado y la glándula periférica una mucoproteína (Fröesch y Marthy, 1975). Dichas sustancias están más relacionadas con la fijación de los huevos que con la protección del mismo (Fröesch y Marthy, 1975). El sistema reproductor masculino de O. hubbsorum es el típico del género Octopus. Arkhipkin (1992) describe que la estructura del sistema reproductor de machos es más uniforme en comparación con el de las hembras entre los órdenes de cefalópodos, siendo la única diferencia la forma del testículo que es redonda en pulpos y cónica en sepia y calamar. El sistema reproductor masculino está conformado por un único testículo, un ducto espermatofórico, parte proximal de la glándula espermatofórica, parte distal de la glándula espermatofórica, una glándula espermatofórica accesoria, un saco de Needham ( complejo espermatofórico) y de un conducto excurrente. Sin embargo, diversos autores difieren en la nomenclatura de los órganos que componen el sistema reproductor masculino, a excepción de los testículos y el saco de Needham (Price, 1959; Álvarez y Haimovici, 1991; López-Peraza et al., 2013; Arkhipkin, 1992;; Boyle y Rodhouse, 2005), en el presente trabajo se utiliza la nomenclatura utilizada por Price (1959) y López-Peraza y colaboradores ( 2013), debido a que en dichos estudios se analizan detalladamente cada uno 44 de los órganos que conforman el sistema reproductor masculino sustentándose la nomenclatura. El ducto espermático es por lo general no pareado y curveado en su extremo proximal. El ducto espermático se describe como un órgano muy delgado y compactado que al ser extendido alcanza una longitud muy similar a la longitud total del cuerpo del pulpo y conecta al testículo con la glándula espermatóforica (López-Peraza, 2013). Price (1959) y Álvarez y Haimovici (1991) indican que el conducto espermático o conducto deferente distal está comunicando a la glándula espermática accesoria con el saco de la Needham. En este saco se lleva a cabo el empaquetamiento de los espermatóforos y son liberados por el conducto excurrente que es el órgano terminal del sistema reproductor. Este órgano también ha sido llamado pene (Leporati et al., 2008 y Price, 1959) sin embargo, el término conducto excurrente ha sido adoptado debido a que este órgano no presenta una función de penetración (Boyle y Knobloch, 1984; Boyle y Rodhouse 2005; López-Peraza et al., 2013). En los machos, el tercer brazo derecho está modificado en un órgano intromitente (hectocotilo), el cual presenta un ducto delgado en la parte ventral/interna que tiene como función el almacenamiento de los espermatozoides antes de la cópula. El brazo hectocotilizado termina en una lígula, estructura en la punta del brazo en forma de pala que facilita la succión de los espermatóforos desde el conducto excurrente y su posterior trasferencia a la hembra. En general, el sistema reproductor masculino es más complicado que en las hembras, sobre todo por el mayor número de glándulas accesorias involucradas en la formación del espermatóforo. Histológicamente el testículo de O. hubbsroum está envuelto en una membrana de tejido conectivo con algunos vasos sanguíneos (hemolinfáticos); se encuentra conformado por una gran cantidad de túbulos seminíferos densamente compactados, separados por una delgada capa de tejido conectivo. La maduración de las células espermáticas es concéntrica, va desde la membrana basal a la región central, con las espermatogonias en la pared del túbulo, espermatocitos y espermátidas en capas concéntricas hacia el lúmen donde se acumulan los espermatozoides. Varios autores concuerdan con esta descripción; Olivares45 Paz et al., 2001; López-Peraza et al., 2013) y otros autores han observado que este tejido está compuesto por vasos sanguíneos y células intersticiales (Price, 1959). La estructura histológica del ducto espermático de O. hubbsorum difiere a lo descrito por Price (1959) en O. bimaculoides y por López-Peraza y colaboradores (2013) en O. rubescens que presentan epitelio cubico ciliado y O. hubbsorum se observó epitelio columnar simple ciliado. La región proximal y la región distal de la glándula constan de un epitelio columnar pseudoestratificado ciliado, que tiene una dilatación bulbosa en contacto con el lúmen, de manera similar con lo descrito en O. rubescens (López-Peraza et al., 2013). De igual manera la descripción de la glándula espermatofórica coincide con lo descrito en O. bimaculoides (Price, 1959) presentando en su totalidad tejido glandular con células columnares ciliadas. Hasta el momento, la función de la glándula espermatofórica accesoria, con sus gruesas paredes, obviamente glandulares, es totalmente desconocido. La morfología general y la histología del saco de Needham descritas en O. rubescens (LópezPeraza et al., 2013) y O. bimaculoides (Price, 1959) presentan epitelio simple ciliado, sin embargo, en O. hubbsorum se observó un epitelio columnar pseudoestratificado ciliado. Finalmente, el hectocotilo está compuesto por diferentes capas de células musculares que discurren en sentido longitudinal, circular y perpendicular, separados entre sí por tejido conjuntivo, y que cuenta con un ducto delgado en la parte ventral/interna. Aunque no existen estudios sobre la descripción histológica detallada de este órgano a nivel histológico se pudo apreciar que este ducto presenta tejido glandular cuya secreción puede ser de ayuda para mantener hidratados a los espermatóforos y proporcionarles movilidad al momento en que éste lleve a cabo la cópula. 46 VIII. CONCLUSIONES La ubicación anatómica del sistema reproductor de O. hubbsorum corresponde al modelo general establecido para especies del género Octopus. O. hubbsorum presenta un oviducto común externo al saco ovárico de tal forma que se logran apreciar la unión de los oviductos proximales Histológicamente los oviductos presentaron epitelio columnar simple ciliado y fibras musculares, en los oviductos proximales podría influenciar en el transporte o liberación de los espermatozoides para llevar a cabo la fertilización., mientras que en los oviductos distales facilitarían el desove. Las glándulas oviductales de O. hubbsorum presentaron espermatecas que permiten el almacenamiento de los espermatozoides a diferencia de la especie Vulcanoctopus hydrothermalis, la familia lolingínidae y el género Eledone en los cuales las espermatecas están ausentes. La glándula oviductal se encontró constituida por tejido glandular periférico y tejido glandular central que aportan secreciones para el recubrimiento de los huevos al momento del desove. El sistema reproductor masculino de O. hubbsorum presentó la anatomía general del género Octopus. El testículo se encontró comunicado con el ducto espermático el cual se extiende hasta la parte proximal de la glándula espermatofórica siguiendo con la parte distal de la glándula espermatofórica y desembocando en la glándula espermatofórica accesoria la cual está conectada al saco de Needham finalizando en un conducto excurrete. El ducto espermático de O. hubbsorum se observó constituido por un epitelio columnar simple ciliado con grandes compactaciones de espermatozoides. La glándula espermatofórica presentó en su totalidad tejido glandular con células columnares ciliadas, las cuales aportan secreciones para el recubrimiento de los espermatóforos. El saco de Needham presentó un epitelio columnar pseudoestratificado ciliado el cual rodea los espermatóforos que son acumulados y empaquetados en compartimentos separados por trabéculas del tejido conectivo. 47 El hectocotilo presentó tejido glandular el cual aporta secreciones ayudando a mantener hidratados a los espermatóforos que se encuentran almacenados para su posterior expulsión por la lígula. Este estudio es de gran importancia debido a que es información biológica base de la especie que permite obtener un patrón de referencia de las estructuras normales de las células y tejidos del sistema reproductor de O. hubbsorum que pueden ser de gran utilidad en estudios futuros en caso de que se presenten enfermedades en ambientes naturales o durante cautiverio. 48 IX. BIBLIOGRAFÍA Aguilar, S.C. y E. Godínez- Domínguez. 1995. Presencia del pulpo Octopus hubbsorum (Cephalopoda:Octopoda) en el Pacífico central mexicano. Revista de Biología Tropical. 45(3): 678. Alejo-Plata, M.C. y G. G. 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