XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico ESTUDIO DEL CURSO TEMPORAL DE LA ENTRADA NUCLEAR DE LA PROTEÍNA GPN3, UNA PROTEÍNA NECESARIA PARA LA IMPORTACIÓN NUCLEAR DE LA RNA POLIMERASA II 1 Martin Antonio Mora García, 2Griselda Peña Gómez, 2Mónica R. Calera y 2Roberto Sánchez Olea. 1Unidad Académica Escuela de Biología de la Universidad Autónoma de Sinaloa (biologo_mora@live.com). Asesor: Dr. Roberto Sánchez Olea. 2Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí (rsanchez@ifisica.uaslp.mx). PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La proteína Gpn3 forma parte de la familia de las GTPasas GPN. Se ha descrito que Gpn3 interactúa físicamente con la RNA polimerasa II, la enzima que sintetiza los mRNAs y la mayoría de los snRNAs, y que es necesaria para su acumulación nuclear, lugar en donde realiza su función. La localización sub-celular de Gpn3 se ha podido estudiar mediante el uso de la proteína Gpn3 fusionada a proteínas fluorescentes, como la EYFP. La proteína Gpn3-EYFP de distribuye entre entre el núcleo y el citoplasma. Sin embargo, cuando Gpn3-EYFP se co-expresa con Gpn1, una proteína de la misma familia que Gpn3, Gpn3-EYFP se localiza principalmente en el citoplasma. Recientemente, se encontró que este efecto habitual de retención de Gpn3-EYFP en el citoplasma mediado por Gpn1 se pierde sustancialmente al tratar a las células con leptomicina B (LMB), un fármaco inhibidor de la exportina CRM1, ocasionando su acumulación nuclear. Lo anterior demuestra que Gpn3 posee un ciclo de transporte núcleo-citoplasmático. En este proyecto se cuantificará el curso temporal de la entrada de Gpn3-EYFP al núcleo celular. METODOLOGÌA Se sobre-expresó a las proteínas Gpn3-EYFP y Gpn1-Flag en células HEK 293/T17 mediante la transfección de las construcciones Gpn3-pEYFP y Gpn1Flag-pCMV5a por el método de fosfato de calcio. A las 24 horas se aplicó un tratamiento con LMB y se evaluó la localización de Gpn3-EYFP mediante microscopía de fluorescencia a diferentes tiempos. Como condición control se utilizaron a células transfectadas con Gpn3-pEYFP y Gpn1-Flag-pCMV5a sin tratamiento con LMB. Mediante el uso del software Image J, se medirá la intensidad media de fluorescencia tanto del citoplasma como del núcleo de las células. Los resultados se expresarán como el cociente de la intensidad media de fluorescencia del núcleo y la intensidad media de fluorescencia del citoplasma ± la desviación estándar, y se graficarán en función del tiempo. CONCLUSIONES Este trabajo de investigación aún se encuentra en proceso, sin embargo con los experimentos realizados a la fecha, hemos podido determinar que cuando se coexpresa con Gpn1-Flag, la proteína Gpn3-EYFP se acumula en el núcleo celular entre las 8 y las 24 horas después del tratamiento con LMB. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014