anexo 2 - Repositorio Digital UTE

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
INDICADORES DE HIGIENE Y Salmonella EN HORNADO
EXPENDIDO EN CUATRO LOCALES DE COMIDA TÍPICA DEL
MERCADO MUNICIPAL DE SANGOLQUÍ
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERO DE ALIMENTOS
JUAN FRANCISCO RIVERA CEVALLOS
DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE
Quito, Junio 2012
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2012
Reservado todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo Juan Francisco Rivera Cevallos, declaro que el trabajo aquí descrito es
de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o
calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas
que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
_____________________________
Juan Francisco Rivera Cevallos
C.I. 171467289-4
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Identificación de
microorganismos indicadores de higiene y Salmonella en hornado
expendido en cuatro locales de comida típica del Mercado Municipal de
Sangolquí.”, que, para aspirar al título de Ingeniero de Alimentos fue
desarrollado por Juan Francisco Rivera, bajo mi dirección y supervisión, en
la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las condiciones
requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
_____________________________
Bioq. María José Andrade Cuvi
DIRECTORA DEL TRABAJO
C.I. 171233837-3
DEDICATORIA
Dedicado con mucho amor a mis padres, Jorge y Susana. Ellos han
sido el pilar de mi formación personal y académica. Gracias por su cariño,
consejos y apoyo durante todos mis años como estudiante.
A mis hermanos, Jorge, Iván, Carolina y José Luis, por estar
presentes en mi vida y por ser un ejemplo a seguir. A toda mi familia. Y en
especial a la persona que siempre ha estado a mi lado y me ha apoyado en
todo momento, Dany.
Dedicado también a aquellas personas que han compartido
momentos inolvidables a lo largo de mi vida universitaria y hemos vivido
risas, preocupaciones, alegrías, buenos y malos momentos pero en especial
aprendimos lo que significa la amistad, mis amigos.
Y aquellos que luchan día a día por hacer sus sueños realidad.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco principalmente a mis padres por darme el ejemplo y
enseñarme lo bueno y lo malo de la vida. Gracias, por el apoyo brindado a lo
largo de la realización de esta tesis, especialmente por la ayuda y soporte
incondicional ofrecido. Gracias, a mi familia por apoyarme siempre y estar
pendientes de mí.
Agradezco a mi Directora de tesis, Bioq. María José Andrade por
permitirme trabajar en este proyecto y por las enseñanzas, ayuda y apoyo
brindado durante la elaboración del mismo. Además, de ser la guía oportuna
en la dirección de mi tesis, su paciencia y por estar pendiente de mi futuro. Y
por ser una excelente profesional.
Agradezco a la Universidad Tecnológica Equinoccial y a la Carrera de
Ingeniería en Alimentos por haberme formado durante estos años, me ha
impartido conocimientos y experiencia que me permitirán
desarrollarme
como un buen profesional en esta área.
Tambien
agradezco
a
mis
profesores
por
impartirme
sus
conocimientos y por su continuo esfuerzo para hacer que el Ecuador siga
avanzando por el rumbo del éxito y por darme la formación para ser un gran
profesional y una buena persona. Para afrontar los retos del futuro y ser
alguien competitivo.
Finalmente agradezco a mis amigos y compañeros por haber
compartido conmigo esta etapa tan importante de mi vida. Por haber estado
ahí desde el inicio hasta el final de la carrera universitaria, de cada uno de
ustedes me llevo recuerdos inolvidables.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN ...................................................................................................... vii
ABSTRACT .................................................................................................... viii
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1
1.1 Objetivos .................................................................................................. 6
2. MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 8
2.1 Enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA´s) .................................... 8
2.2 Contaminación en los alimentos ............................................................. 11
2.3 Microorganismos indicadores de contaminación en alimentos............... 13
2.3.1 Coliformes totales ....................................................................... 15
2.3.2 Coliformes fecales ....................................................................... 16
2.4 Escherichia coli ..................................................................................... 17
2.4.1 Generalidades ............................................................................ 17
2.4.2 Enfermedades causadas por E. coli ............................................ 19
2.4.3 Alimentos implicados................................................................... 20
2.4.4 Análisis microbiológico de E. coli ................................................ 20
2.5 Salmonella............................................................................................. 25
2.5.1 Generalidades ............................................................................ 25
2.5.2 Enfermedades trasmitidas por Salmonella .................................. 26
2.5.3 Alimentos implicados.................................................................. 27
2.5.4 Análisis microbiológico para la determinación de Salmonella ..... 27
2.5.5 Epidemiología de E. coli y Salmonella ........................................ 30
2.6 Hornado................................................................................................. 32
2.7 Intoxicaciones producidas por hornado en Ecuador.............................. 35
2.8 Agrio ...................................................................................................... 36
3. METODOLOGÍA ......................................................................................... 38
3.1 Descripción y toma de muestra ............................................................. 38
i
PÁGINA
3.2 Preparación de la muestra .................................................................... 41
3.3 Recuento, aislamiento, e identificación de E. coli .................................. 41
3.3.1 Prueba presuntiva ...................................................................... 41
3.3.2 Prueba confirmativa .................................................................... 42
3.3.3 Pruebas complementarias (IMViC).............................................. 43
3.3.3.1 Prueba para indol .............................................................. 43
3.3.3.2 Prueba del rojo de metilo (RM) ......................................... 43
3.3.3.3 Prueba de voges proskauer (VP) ...................................... 43
3.3.3.4 Prueba para la utilización del citrato ................................. 43
3.4 Aislamiento e identificación de Salmonella............................................ 44
3.4.1 Pre-enriquecimiento no selectivo ................................................ 44
3.4.2 Enriquecimiento selectivo........................................................... 44
3.4.3 Aislamiento .................................................................................. 45
3.4.4 Purificación .................................................................................. 45
3.4.5 Selección..................................................................................... 45
3.4.6 Confirmación bioquímica ............................................................. 46
3.4.6.1 Prueba de la ureasa .......................................................... 46
3.4.6.2 Prueba de lisina - descarboxilasa ..................................... 46
3.4.6.3 Prueba de Voges - Proskauer ........................................... 46
3.4.6.4 Prueba del indol ................................................................ 47
3.4.6.5 Prueba de la utilización del citrato..................................... 47
3.5 Análisis estadístico ................................................................................ 47
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................... 48
4.1 Recuento, aislamiento e identificación de coliformes totales, coliformes
…..fecales, y Escherichia coli ...................................................................... 48
4.2 Aislamiento e identificación de Salmonella ........................................... 56
4.2.1 Aislamiento ................................................................................. 56
4.2.2 Selección .................................................................................... 58
4.2.3 Confirmación bioquímica ............................................................ 59
ii
PÁGINA
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES............................................. 62
5.1 Conclusiones ........................................................................................ 62
5.2 Recomendaciones ................................................................................. 63
GLOSARIO ..................................................................................................... 65
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 66
ANEXOS ......................................................................................................... 73
iii
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 2.1 Características generales de E. coli ............................................... 19
Tabla 2.2 Criterios para la evaluación microbiológica de la calidad de los
-----------alimentos ........................................................................................ 32
Tabla 3.1 Clasificación de los coliformes por las pruebas IMViC ................... 44
Tabla 4.1 NMP de coliformes fecales por gramo de muestra analizada......... 52
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 2.1 Determinación de NMP de coliformes en muestras sólidas o
…………alimentos ...................................................................................... 16
Figura 2.2 Microfotografía de barrido electrónico de Escherichia coli ............ 18
Figura 2.3 Pruebas IMViC ............................................................................. 24
Figura 2.4 Microfotografía de barrido electrónico de Salmonella ................... 25
Figura 2.5 Plato de hornado ecuatoriano ....................................................... 33
Figura 2.6 Chancho hornado ecuatoriano ...................................................... 33
Figura 2.7 Agrio.............................................................................................. 37
Figura 3.1 Locales ubicados en el mercado ................................................... 38
Figura 3.2 Restaurantes ubicados en la avenida ........................................... 39
Figura 3.3 Plato de hornado ........................................................................... 39
Figura 3.4 Plato de hornado con agrio ........................................................... 40
Figura 4.1 Tubos con campana de Durham y caldo BGBL ............................ 48
Figura 4.2 NMP de coliformes totales por gramo de muestra analizada ........ 49
Figura 4.3 Recuento de coliformes fecales ................................................... 51
Figura 4.4 Prueba del Indol en caldo TSB ..................................................... 51
Figura 4.5 Cultivo de E. coli en agar EMB...................................................... 54
Figura 4.6 Tinción Gram de E. coli: bacilos Gram negativos.......................... 54
Figura 4.7 Presencia de E. coli en las muestras analizadas .......................... 55
Figura 4.8 Presencia de E. coli en los locales analizados.............................. 55
Figura 4.9 Colonias de Salmonella en BGA ................................................... 57
Figura 4.10 Colonias de Salmonella en SSA ................................................. 57
Figura 4.11 Colonias de Salmonella en BSA ................................................. 58
Figura 4.12 Crecimiento positivo de Salmonella en agar TSI y LIA ............... 58
Figura 4.13 Resultados positivos para Salmonella ........................................ 59
Figura 4.14 Presencia de Salmonella en locales analizados ........................ 60
v
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO 1
Brotes de ETA en América Latina según alimento implicado.......................... 73
ANEXO 2
Tabla de enfermedades comunes trasmitidas a través de los alimentos,
causadas por bacterias . ................................................................................. 74
ANEXO 3
Procedimiento recuento, aislamiento e identificación de E. coli ...................... 77
ANEXO 4
Procedimiento identififcación de Salmonella .................................................. 79
ANEXO 5
Tabla del NMP (Número mas probable) ......................................................... 81
ANEXO 6
Esquema de determinación de coliformes totales, fecales y E. coli ................ 82
ANEXO 7
Esquema de método de detección de Salmonella ......................................... 83
ANEXO 8
Autorizacion del Municipio de Rumiñahui para la selección de locales ........ 86
ANEXO 9
Informe entregado al Municipio del Cantón Rumiñahui ................................. 87
vi
RESUMEN
El hornado es un plato típico tradicional característico del Cantón
Rumiñahui y de la región Sierra del Ecuador, es consumido por locales y
extranjeros. En esta investigación se analizaron: coliformes totales,
coliformes fecales, Escherichia coli y Salmonella debido a que estos
microorganismos son indicadores de contaminación de alimentos. Las
muestras analizadas fueron el hornado, el agrio y la mezcla hornado/agrio
con el fin de determinar cuál de estas presenta contaminación. Para la
identificación de coliformes totales, fecales y E. coli se aplicó la metodología
establecida por la Norma INEN 1 529-8, y para el estudio de Salmonella se
aplicó la Norma INEN 1 529-15. Los resultados obtenidos determinaron que
las muestras analizadas de hornado de cuatro locales de la ciudad de
Sangolquí se encontraron contaminadas por microorganismos como E. coli y
Salmonella que indicaron deficiencia en la práctica higiénica relacionadas
con este alimento. Se determinó que el 58% de muestras analizadas fueron
positivas para E. coli. También se determinó la presencia de Salmonella en
el 4% de las muestras analizadas correspondientes a las muestras de Agrio
y la mezcla de Hornado/Agrio. Cabe recalcar que en las muestras de
Hornado no se encontró la presencia de Salmonella. Uno de los resultados
más relevantes de este estudio de investigación fue la notoria presencia de
microorganismos indicadores de higiene en las muestras de hornado/agrio.
Estos
resultados
indican
que
las
muestras
pudieron
haber
sido
contaminadas por causas tales como: mala higiene de los manipuladores
directos, la calidad sanitaria de las materias primas usadas para la
elaboración de este plato, por contaminación cruzada de los utensilios
utilizados o de los espacios físicos donde se procesó este alimento. Se
recomienda un mayor control de higiene de los locales de expendio de
comidas típicas.
.
vii
ABSTRACT
Hornado is a traditional dish of the Rumiñahui zone and the Sierra
region of Ecuador and is consumed by domestic and foreign visitors. In this
study we analyzed: total coliforms, fecal coliforms, Escherichia coli and
Salmonella, because these organisms are indicators of fecal contamination in
foods. The samples were hornado, agrio and the mix of hornado/ agrio with
the objective to identify which of these samples are contaminated. For the
identification of total and fecal coliforms and E. coli we followed the
methodology established by the Norm INEN 1 529-8, and for the study of
Salmonella was used the Norm INEN 1 529-15. The results determined that
the samples from four locations in the city of Sangolquí were found
contaminated by microorganisms such as E. coli and Salmonella which
indicate deficiencies in hygienic practice that has to do with this food. It found
that 58% of samples tested positive for E. coli. We also found the presence
of Salmonella in 4% of the mixtures tested for samples of Agrio and the
Hornado/Agrio mixture. It is noteworthy that the samples of Hornado did not
show the presence of Salmonella. One of the main findings of this research
was the strong presence of hygiene indicator microorganisms in samples of
hornado/agrio. These results indicate that the samples could have been
contaminated for reasons like: poor hygiene of direct food handlers, sanitary
quality of raw materials used in the preparation of this dish, crosscontamination of equipment used or the physical spaces where this food was
processed. We recommend greater control of hygiene of local typical food
restaurants.
viii
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
Las Enfermedades Transmitidas por alimentos (ETA’s) son aquellas
que “causan daño a los consumidores cuando estos ingieren comida
contaminada por microorganismos patógenos” (Pacheco, 2007), esta
contaminación puede originarse de muchas formas, desde que el alimento
es producido, manipulado, conservado y transportado hasta cuando es
servido o comercializado. La forma más común de contaminación es debido
a la falta de higiene y por deficiencias en la manipulación por parte de las
personas que están en contacto directo con el alimento. Las ETA’s pueden
causar problemas muy graves en la salud de los seres humanos e incluso la
muerte especialmente en los grupos más vulnerables que son los niños,
ancianos y mujeres embarazadas. Estas enfermedades se manifiestan
como: infecciones que ocurren cuando se ingieren microorganismos vivos
perjudiciales; intoxicaciones que se producen por la ingesta de toxinas
presentes en alimentos y toxi-infecciones que resultan de la ingestión de
comida contaminada por microorganismos y éstos a su vez producen o
liberan toxinas. Los síntomas más comunes en las ETA’s son las diarreas y
los vómitos, pero pueden presentarse signos como: dolores abdominales,
dolores de cabeza, fiebre, síntomas neurológicos, visión doble, ojos
hinchados, dificultades renales, entre otras, de manera que varían de
acuerdo a la cantidad de alimento contaminado consumido y al tipo de
contaminación. Según la FDA (Food and Drug Administration) el 2 o 3% de
ETA’s pueden llevar a una enfermedad de largo plazo (Fernández y col.,
2001); por ejemplo, la bacteria Escherichia coli O157:H7 puede causar fallas
en el riñón en niños y la Salmonella puede provocar artritis reactiva y serias
infecciones. Según brotes que fueron notificados al Sistema Regional de
Vigilancia Epidemiológica de las ETA’s (SIRVETA), desarrollado por el
Instituto
Panamericano
de
Protección
de
alimentos
y
Zoonosis
(PANALIMENTOS) y que se encuentra en “fase de consolidación” respecto a
la detección y registro de brotes y casos (Mattar y col., 2005), entre 1993 y el
2002, se produjeron 6324 brotes de ETA’s en América Latina y el Caribe que
1
provocaron 228.579 casos y 314 muertes (Mattar y col., 2005) y a través de
estudios realizados por la FAO (Food and Agriculture Organization) los
alimentos más susceptibles a sufrir contaminación y que pueden hacer daño
a las personas incluyen el pescado, agua y carnes rojas. Por tal motivo y de
acuerdo con la información sobre la ocurrencia de ETA’s en América, los
riesgos que rodean a la inocuidad alimentaria plantean una preocupación
evidente para la salud pública, que además de afectar las condiciones de
salud de la población general, tienen un impacto directo en actividades como
el turismo y el comercio de alimentos, que se encuentran en expansión; por
ejemplo, en Ecuador y en países subdesarrollados o pobres es muy popular
la venta de comidas típicas ambulantes, en mercados o en sitios donde la
higiene es escasa y esto repercute cuando se dan casos de enfermedades
transmitidas por alimentos y causan daño a la población nacional, tomando
relevancia cuando turistas extranjeros consumen alimentos en estos lugares
y a causa de ello sufren la muy conocida “diarrea del viajero” originada por
microorganismos contaminantes. En Ecuador se han reportado 28 brotes de
ETA’s con un total de 1859 enfermos y 12 fallecidos entre los años 1997 al
2002 (Rivero y Baquero, 2004).
Por otro lado, el hornado sin duda alguna es uno de los platos más
tradicionales y deliciosos del Ecuador principalmente de la región sierra, el
origen de su nombre se debe a que el cerdo, chancho o puerco que es
criado y engordado para este fin se lo hornea en un horno de arcilla dando
así su sabor característico (Abad, 2000). La preparación de este plato
gastronómicamente típico del país es todo un arte y se lo elabora
artesanalmente; se lo hace realizando unos hábiles cortes en la carne y
agregando ciertos condimentos como: sal, ajo, achiote, comino, pimienta,
chicha, manteca de chancho y otras especias que varían de local en local. Al
plato de hornado siempre se lo sirve con una guarnición (acompañante) que
en términos del argot popular se lo conoce como “agrio” el mismo que está
elaborado a partir de: agua, sal, cebolla, tomate riñón, trozos de ají, panela
raspada, perejil, culantro, entre otros (Pazos, 2002). Muchas son las
2
ciudades que tradicionalmente ofrecen este alimento, por ejemplo:
Sangolquí, Ibarra, Riobamba, Guamote y Azogues.
Sin embargo, el contraste entre la alta demanda en el consumo de
este alimento con las malas condiciones sanitarias de algunos de los lugares
donde se lo expende y las incorrectas prácticas de manufactura por parte de
las personas que manipulan este producto han hecho que la ciudadanía y
las autoridades pongan en la mira a los procesos sanitarios de elaboración
del hornado. En el año 2006 el Diario Hoy (distribuido a nivel nacional)
publicó que: “La elaboración del hornado genera debate cada año pero igual
se consume. Creen que el problema tiene relación con el reportaje de un
canal de televisión que mostró un hornado lleno de gusanos en el mercado
de San Roque (Quito)”.
Como se explicó anteriormente, el hornado es comercializado con el
agrio, estos dos productos pueden estar contaminados con microorganismos
como Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes, Trichinella
spiralis y Staphylococcus aureus, causantes de ETA´s, si no se siguen
correctas normas de manipulación de alimentos (FSIS, 2003).
Las bacterias Escherichia coli y Salmonella son dos de los
microorganismos patógenos más comunes y estudiados dentro del campo
alimenticio ya que son considerados indicadores de contaminación fecal, lo
que permite a los investigadores saber si los alimentos estudiados son o no
de buena calidad, inocuos y aptos para el consumo humano (Fernández,
2008). Ambos se encuentran en el intestino de humanos y de animales,
pertenecen a la familia de las Enterobacteriaceae, es decir son bacterias
entéricas o enterobacterias, estas bacterias comprenden un grupo
relativamente
homogéneo
de
las
gamma
Proteobacterias,
que
fenotípicamente se caracterizan por ser bacilos Gram negativos no
esporulados, inmóviles (en su gran mayoría) y anaerobios facultativos
(Madigan y col., 2006). Entre las enterobacterias se encuentran especies
patógenas para el hombre, los géneros más comunes y más representativos
3
de las bacterias entéricas patógenas son, entre otros, la Escherichia coli y
Salmonella.
Los
miembros
del
género
Escherichia
son
habitantes
universales de todos los animales de sangre caliente (incluido el hombre),
viven en el intestino, donde cumplen una función nutricional, sintetizando
vitaminas, en especial la vitamina K. Algunas cepas de E. coli son patógenas
y han sido relacionadas con el desarrollo de cuadros diarréicos en niños
especialmente en guarderías infantiles; estas cepas enteropatógenas de E.
coli cada vez están más frecuentemente asociadas a infecciones cuasidisentéricas y cuadros febriles agudos; dichas cepas forman antígeno K, el
cual permite la colonización del intestino delgado y producción de una
enterotoxina la misma que es la responsable de los cuadros diarreicos
(Madigan y col., 2006). Salmonella y Escherichia son muy parecidos ya que
ambos géneros tienen un 50% de homología en su ADN y debido a que
estos dos microorganismos están genéticamente muy relacionadas, a veces
su identificación genera considerable dificultad. Sin embargo, y en contraste
con la mayoría de las Escherichia, los miembros del género Salmonella son
usualmente patógenos para humanos o para otros animales de sangre
caliente. En humanos, las enfermedades más comunes causada por la
Salmonella son la fiebre tifoidea y la gastroenteritis (Madigan y col., 2006).
Debido a la trascendencia de enfermedades producidas por estas
bacterias, se han tomado medidas elementales para prevenirlas como la
aplicación de principios de inocuidad alimentaria que aseguran la calidad en
la producción y elaboración de los productos alimenticios y garantiza la
obtención de alimentos sanos, nutritivos y libres de peligros para la
población (Insunza y Soto, 1998).
Las bacterias pueden estar presentes en los alimentos y los
consumidores no se dan cuenta de aquello porque éstas no son visibles, a
menudo no producen cambios de sabor, olor o, incluso, alteraciones en su
aspecto, muchas veces los productos están contaminados y no se los
detecta; debe tomarse en cuenta además que, los alimentos son fuente
principal de contaminación por parte de agentes patógenos, tanto químicos
4
como biológicos (bacterias, virus y parásitos) a los cuales ninguna persona
es inmune, ya sea en los países en desarrollo o en los desarrollados. El
ICMSF (por sus siglas en inglés: International Commission on Microbiological
Specifications for Foods), en su guía simplificada para el entendimiento y
uso de objetivos de inocuidad de los alimentos y objetivos de rendimiento
explica que las enfermedades causadas por patógenos alimentarios
constituyen a lo largo y ancho del mundo problemas de Salud Pública y
prevenirlos es la mayor meta de la sociedad (ICMSF, 2006).
Mientras la eliminación total de las ETA´s se mantenga como una
meta inalcanzable, los agentes gubernamentales de Salud Pública y la
industria están conminados a reducir la incidencia de enfermedades debida
a los alimentos contaminados” (ICMSF, 2006).
Las principales causas para la contaminación con microorganismos
transmisores de enfermedades alimentarias se deben a una mala
preparación, cocción, manipulación o almacenamiento de los alimentos, una
vez contaminados, las bacterias comienzan a multiplicarse y hacen que el
consumo de estos sea peligroso para la salud, es por eso que se debe
aplicar el concepto de inocuidad alimentaria que constituye un factor clave
para garantizar la salud de la población (Pacheco, 2007).
La alimentación representa una de las actividades más importantes
del ser humano de manera que al preparar alimentos estos deben ser
elaborados con las más altas normas de higiene y contar con buenas
condiciones sanitarias con el objetivo de brindar alimentos saludables, a fin
de mejorar la calidad de vida de los consumidores.
La ingesta de alimentos contaminados por microorganismos es una
de las causas más comunes de contraer enfermedades, es por eso que se
debe concienciar a la sociedad sobre los riesgos que se corre al consumir
alimentos en lugares donde las condiciones sanitarias no son adecuadas;
de esta manera se puede beneficiar a la salud de las personas que
frecuentan estos establecimientos de comida típica en general, previniendo
5
enfermedades que perjudiquen a la salud y creando buenos hábitos
alimenticios.
El empleo del índice de coliformes como indicadores de organismos
patógenos en los alimentos es una práctica vigente en la actualidad. Los
organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higiénica. El
hallazgo de gran número de estos microorganismos en los alimentos y en el
agua indica polución o contaminación fecal. Ya que las enfermedades
transmitidas generalmente son de carácter intestinal, la presencia de
polución indica la posibilidad de que existan agentes etiológicos productores
de estas enfermedades (García, 2004). Por tal motivo, este estudio se basa
en el recuento e identificación de microorganismos indicadores de higiene en
el hornado y el agrio con el fin de detectar deficiencias higiénicas en estos
productos que se expenden en locales de venta popular, y de esta manera
dar a conocer a las autoridades competentes del Municipio del Cantón
Rumiñahui para que se tomen las medidas de prevención necesarias
respecto al tema.
A través de las autoridades de Salud e Higiene del Cantón Rumiñahui
se concienciará a los propietarios de los locales en donde se expende este
tipo de comida con el fin de que mejoren la calidad de los alimentos que se
expenden, mediante la aplicación de buenas prácticas de manipulación de
alimentos, higiene personal y buenas condiciones sanitarias.
1.1
OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar microorganismos indicadores de higiene y Salmonella en
hornado expendido en cuatro locales de comida típica del Mercado Municipal
de Sangolquí.
6
Objetivos específicos

Realizar el recuento de coliformes totales y fecales en muestras de
hornado en cuatro locales de comida típica del Mercado Municipal de
Sangolquí.

Realizar el recuento, aislamiento e identificación de E. coli en hornado
en cuatro locales de comida típica del Mercado Municipal de
Sangolquí.

Identificar la presencia de Salmonella en muestras de hornado en
cuatro locales de comida típica del Mercado Municipal de Sangolquí.

Elaborar recomendaciones para los locales de venta de comida típica,
que se entregarán a través del Ilustre Municipio del Cantón
Rumiñahui.
7
2. MARCO TEÓRICO
2. MARCO TEÓRICO
2.1
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS
(ETA’S)
Las Enfermedades Transmitidas por alimentos (ETA’s, sigla como se
las reconoce en los distintos ámbitos vinculados a la alimentación) son
aquellas que se originan por la ingestión de alimentos contaminados con
agentes en cantidades suficientes para afectar la salud del consumidor.
Sean sólidos naturales, preparados o bebidas simples como el agua, los
alimentos pueden originar dolencias provocadas por patógenos, tales como
bacterias, virus, hongos, parásitos o componentes químicos, que se
encuentran en su interior (PANALIMENTOS, 2005).
Según Benenson (1997), las enfermedades de origen alimentario,
incluidas las intoxicaciones e infecciones, son patologías producidas por la
ingestión accidental, incidental o intencional de alimentos o agua,
contaminados
en
cantidades
suficientes
con
agentes
químicos
o
microbiológicos, debido a la deficiencia en el proceso de elaboración,
manipulación, conservación, transporte, distribución o comercialización de
los alimentos y agua.
Bajo ciertas circunstancias los alimentos comunes pueden causar
consecuencias graves, incluso la muerte. A pesar del progreso que
actualmente se ha logrado en el mejoramiento general de la calidad e
inocuidad de los alimentos producidos, todavía se presentan enfermedades
transmitidas a través de los alimentos, causadas por patógenos microbianos
(Knabel, 2009).
Durante las últimas décadas, se han identificado varios nuevos
patógenos importantes que se transmiten a través de los alimentos, algunos
de los cuales pueden crecer a temperaturas de refrigeración. También se
8
han identificado nuevos métodos de propagación de estos microorganismos
patógenos. Los cambios en las poblaciones, en los estilos de vida de los
consumidores y en las preferencias alimentarias han producido cambios en
la formulación, manufactura y distribución de los alimentos. Estos cambios,
asociados a la habilidad que tienen los microorganismos para evolucionar
rápidamente y adaptarse a su medio ambiente, presentan nuevos retos
microbiológicos para todas las personas involucradas en la industria
alimentaria (Knabel, 2009).
Según el Codex Alimentarius (Código Alimentario), debe asegurarse
la inocuidad de los alimentos para garantizar que los mismos, al ser
preparados o ingeridos, no causen daño al consumidor. Los alimentos son
fuentes principales de exposición a agentes contaminantes, tanto químicos
como biológicos (virus, parásitos y bacterias). Por tanto, la inocuidad de los
alimentos es reconocida universalmente como una prioridad de Salud
Pública para evitar que los consumidores sufran ETA’s, que se originan por
la ingestión de alimentos infectados con agentes contaminantes en
cantidades suficientes para afectar la salud del consumidor (Arenas y col.,
2009).
Los agentes responsables de las ETA’s son: bacterias y sus toxinas,
virus, parásitos, sustancias químicas, metales, tóxicos de origen vegetal y
sustancias químicas tóxicas que pueden provenir de herbicidas, plaguicidas,
fertilizantes (Arenas y col., 2009).
Dentro de todas las posibles causas mencionadas, las ETA’s de
origen bacteriano son las más frecuentes de todas. Estos microorganismos
se encuentran en una gran variedad de alimentos. Especialmente en
aquellos conocidos como de alto riesgo. En algunos casos los alimentos
pueden contaminarse durante su producción o recolección, en otros casos el
descuido durante la elaboración de estos en el hogar así como el uso de
utensilios que fueron previamente utilizados para preparar alimentos
contaminados (OPS, 1999). Productos de origen animal, tales como
pescados y mariscos, carnes rojas, pollos, además de frutas y verduras,
9
huevos y productos lácteos están asociados con las ETA´s (Cast, 1994;
Bean y Griffin, 1990). Por otro lado, la carne que es uno de los productos
finales del proceso agroindustrial del ganado bovino o porcino, por su
composición química y sus ingredientes sensibles a la contaminación, es
considerada como un alimento de alto riesgo en Salud Pública. En su
proceso
agroindustrial
de
obtención,
la
carne
y
sub-productos
inadecuadamente manipulados, pueden contaminarse con diversos agentes
patógenos y químicos causantes de ETA’s, muchos de los cuales proceden
de los animales vivos, por lo que el control en su aprovechamiento es
esencial para reducir el nivel de contaminación en mataderos, plantas de
procesamiento y en la manipulación del producto final (Arenas y col., 2009).
En el grupo de las ETA´s se pueden distinguir tres tipos: infecciones,
intoxicaciones y toxi-infecciones (OPS, 1999):
Infecciones alimentarias.- Producidas por la ingestión de alimentos
o agua contaminados con agentes infecciosos específicos tales como
bacterias, virus, hongos, parásitos, que en el intestino pueden multiplicarse
y/o producir toxinas (OPS, 1999).
Intoxicaciones alimentarias.- Producidas por la ingestión de toxinas
producidas en los tejidos de plantas o animales, o productos metabólicos de
microorganismos en los alimentos, o sustancias químicas que se incorporan
a ellos de modo accidental o intencional en cualquier momento desde su
producción hasta su consumo (OPS, 1999).
Toxi-infecciones alimentarias.- Producidas por la ingestión de
comida contaminada por microorganismos y éstos a su vez producen o
liberan toxinas.
Los síntomas de estas enfermedades se desarrollan durante 1-7 días
posteriores al consumo del alimento contaminado e incluyen alguno de los
siguientes: fiebre, dolor de cabeza, nauseas, vómitos, dolor abdominal,
diarrea. Los síntomas tanto de las infecciones como intoxicaciones varían
de acuerdo al tipo de agente responsable así como la cantidad de alimento
10
contaminado que fue consumido. Para las personas sanas, las ETA’s son
enfermedades pasajeras, que sólo duran un par de días y sin ningún tipo de
complicación. Pero para las personas susceptibles (niños, ancianos, mujeres
embarazadas y personas enfermas), pueden llegar a ser muy graves, dejar
secuelas o incluso provocar la muerte (PANALIMENTOS, 2007).
2.2
CONTAMINACIÓN EN LOS ALIMENTOS
La calidad de los alimentos es un factor de vital importancia para el
desarrollo del ser humano es por ello que el comer es una actividad básica
para el hombre, la selección y el planeamiento de los alimentos se ven
influidas por la historia, la cultura y el ambiente, además de la disponibilidad
y las preferencias personales. De este modo, la comida preparada en
condiciones sanitarias, asociada a una correcta nutrición, resulta un factor
esencial para la salud. Una alimentación saludable contribuye a elevar la
calidad de vida de las personas y un plato de comida apetitoso influye
benéficamente sobre el crecimiento, desarrollo, rendimiento escolar y
laboral. (Schinitman, 2005).
En general la producción de alimentos libres de contaminantes no
sólo depende del lugar de su producción sino también de los procesos de
elaboración y de las personas que tienen contacto con ellos. La
contaminación de los mismos puede producirse en cualquier momento
desde su cosecha, pasando por la elaboración a nivel industrial, hasta
cuando se prepara la comida en el hogar (Ortiz y col., 2008).
Con frecuencia, la contaminación bacteriana de los alimentos es la
principal causa de problemas de salud en relación con el consumo de
alimentos. Las consecuencias de una contaminación bacteriana de
alimentos más comunes incluyen gastroenteritis, diarreas, molestias
gastrointestinales, entre otros. Por orden de importancia, las salmonelosis
son la principal causa de problemas alimentarios, seguidas por los trastornos
provocados por los estafilococos y los clostridios. Además de estos
11
contaminantes, existen los llamados patógenos emergentes: Campylobacter,
Yersinia, Listeria y ciertas cepas de Escherichia coli, de importancia
creciente, debido en parte a que, según Ortiz y col., (2008) cuando se
aplican las medidas higiénicas preventivas para evitar la presencia de los
microorganismos clásicos, se favorece involuntariamente el crecimiento de
los emergentes, menos competitivos que los clásicos, pero más resistentes a
las medidas habituales de control del crecimiento microbiano.
Debido a la importancia en Salud Pública de las toxiinfecciones
alimentarias, la labor del microbiólogo de alimentos se dirige, en muchos
casos, al control destinado a evitar el consumo de productos elaborados en
condiciones deficientes y que, por tanto, sean potencialmente peligrosos.
Para ello, según expone Narang (2004), debe tenerse en cuenta, a la hora
de realizar un análisis microbiológico de alimentos:
a) Las fuentes de contaminación del alimento.
b) Las rutas de infección del patógeno.
c) La resistencia de los patógenos a condiciones adversas.
d) Las necesidades de crecimiento de los patógenos.
e)
Minimizar
la
contaminación
y
el
crecimiento
de
los
microorganismos.
f) Técnicas de detección y aislamiento.
g) Método de muestreo proporcional al riesgo.
Todas las personas involucradas en la industria alimentaria (desde el
productor hasta la persona que prepara el alimento) deben reconocer la
necesidad de vigilancia para controlar los riesgos microbiológicos, a fin de
reducir las enfermedades transmitidas a través de los alimentos (Knabel,
2009).
12
Los
microorganismos
presentes
en
los
alimentos
son
muy
preocupantes para la Salud Pública a escala mundial; actualmente se
reconoce que más de 200 enfermedades son causadas por alimentos,
donde los microorganismos comúnmente involucrados han sido Salmonella
spp.,
Escherichia
coli
enterotoxigénica
(ETEC),
Escherichia
coli
enteropatógena (EPEC), Escherichia coli enterohemorrágica 0157:H7
(EHEC), Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes y Staphylococus
aureus. Estos microorganismos se encuentran relacionados con productos
de origen pecuario. Aunque la mayoría de las bacterias causantes de ETA's
normalmente se destruyen por los procesos normales de cocción, aquellos
alimentos mal cocidos o almacenados en condiciones inapropiadas, pueden
originar casos de diarreas, colitis, gastroenteritis aguda, además de causar
complicaciones a largo plazo como artritis reactiva (debida a Salmonella,
Shigella y Yersinia) síndrome de Guillan Barré (debida a Campylobater) y el
síndrome urémico hemolítico (debido a E. coli O157:H7). Estas bacterias
patógenas, se caracterizan por causar alta morbilidad en la población en
general; no obstante, son los niños, ancianos, mujeres embarazadas y
pacientes inmunocomprometidos quienes constituyen la población más
susceptible, pudiendo sufrir consecuencias graves y hasta fatales (Arenas y
col., 2009).
2.3
MICROORGANISMOS INDICADORES DE
CONTAMINACIÓN EN ALIMENTOS
Se consideran microorganismos indicadores aquellos organismos (o
grupos de microorganismos) que advierten oportunamente de un manejo
inadecuado o contaminación, que incrementan el riesgo de presencia de
microorganismos patógenos en alimentos. Además, permiten un enfoque de
prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o
contaminación (Pierson y Smoot, 2001). Los principales microorganismos
indicadores en alimentos se dividen en:
13
- Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso:
mesófilos aerobios (determinados por recuento total), hongos y levaduras, y
coliformes totales.
- Indicadores de contaminación fecal: coliformes fecales, E. coli,
Enterococos, Cl. perfringens.
El grupo de los coliformes constituyen un grupo heterogéneo con
hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que
involucra. Son enterobacterias que pertenecen al género Escherichia y a
otros relacionados como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia. Son
gérmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferación, y a la vez de fácil
cultivo e identificación, y por lo tanto muy útiles como indicadores de
contaminación, pero no son enteropatógenos como grupo (como tampoco lo
es E. coli) y por lo tanto su presencia en alimentos, ambiente o pacientes no
certifica la etiología de una infección intestinal o un brote de ETA (Camacho
y col., 2009).
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por
vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario
contar
con
microorganismos
que
funcionen
como
indicadores
de
contaminación fecal. Estos deben ser constantes, abundantes y exclusivos
de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los
patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse fuera del
intestino (Camacho y col., 2009).
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la
materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la
capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en
aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de
contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes
en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación
reciente (Camacho y col., 2009).
14
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino
que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere
un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios
que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción,
entre otros), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias
(Camacho y col., 2009).
La
selección
de
indicadores
en
un
alimento
depende
fundamentalmente de los riesgos implicados y de lo que se requiera saber
para liberar, controlar o mejorar el alimento, manteniendo el enfoque
preventivo (Osuna, y col. 2010). Entre los microorganismos indicadores
incluidos en este estudio, están los coliformes totales, coliformes fecales,
Escherichia coli y Salmonella.
2.3.1 COLIFORMES TOTALES
El grupo de las bacterias coliformes totales, comprende todos los
bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados,
que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48
horas a 35°C ± 1ºC.
Durante mucho tiempo se consideraron evidencia de contaminación
fecal, pero se ha demostrado que muchos de ellos pueden vivir e incluso
crecer en el suelo, el agua y otros ambientes. Actualmente se consideran un
excelente indicador de la eficiencia de los procesos de sanitización y
desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos
productos procesados. Su determinación se basa generalmente en la
capacidad de fermentar lactosa (Osuna, y col. 2010).
Para la cuantificación de cantidades muy bajas de coliformes totales
se utiliza el método del número más probable (NMP) que es un método
estadístico en tres etapas. También se pueden detectar por recuento en
placa utilizando agar bilis-rojo violeta (ABRV) en el cual las colonias
fermentadoras de lactosa causan el viraje del indicador; pueden detectarse
15
por filtración en membrana (Millipore) e incubación en medios adecuados,
además se utilizan métodos rápidos como las placas Petrifilm y reacciones
cromogénicas o fluorogénicas (Alonso y Poveda, 2008).
2.3.2 COLIFORMES FECALES
Las bacterias coliformes fecales se consideran el indicador más
adecuado de contaminación con heces de animales y humanos, por ejemplo
en pescados y mariscos, carnes, leche, alimentos procesados, entre otros.
La determinación se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del
método del NMP. Generalmente se combinan las determinaciones, según se
requiere (Osuna, y col. 2010).
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede
realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con
características selectivas y diferenciales (Camacho y col., 2009). En la figura
2.1 se muestra un diagrama para detectar el número más probable de
coliformes (FDA, 2003) en muestras sólidas o alimentos.
Figura 2.1 Determinación de NMP de coliformes en muestras sólidas o
alimentos. (FDA, 2003).
El grupo de las bacterias coliformes fecales, está constituido por
bacterias Gram negativas capaces de fermentar la lactosa con producción
16
de gas a las 48 horas de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye
una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia
coli (Osuna, y col. 2010).
La E. coli se considera indicador de contaminación fecal reciente,
humana o animal en productos como agua embotellada, leche y jugos,
alimentos infantiles y alimentos procesados en general. Se caracteriza por
ser termotolerante (fermenta lactosa a 44.5°C), produce indol a partir de
triptófano y produce glucuronidasa, características que se usan para su
identificación en laboratorio, generalmente en la etapa final del NMP o de
alguno de los otros métodos, incluyendo Petrifilm (Osuna, y col. 2010).
2.4
Escherichia coli
2.4.1 GENERALIDADES
La Escherichia coli forma parte de la familia Enterobacteriaceae
(Ewing, 1985), fue descubierta por el biólogo alemán Theodor Von Escherich
en 1860. Von Escherich la bautizó como bacterium coli “bacteria del
intestino”, del griego kolon “intestino”. La microbiología sistemática se
encargó de nombrar el género Escherichia en honor a su descubridor (Páez,
2009).
E. coli es una de las especies bacterianas más minuciosamente
estudiadas (Figura 2.2), no solamente por sus capacidades patogénicas sino
también como sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas,
poblacionales y de diversa índole (Neidhardt, 1999).
17
Figura 2.2 Microfotografía de barrido electrónico de Escherichia coli.
(Rocky Mountain Laboratories, 2005).
La familia de las enterobacterias está integrada por bacilos Gram
negativos no esporulados, móviles con flagelos perítricos o inmóviles,
aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y
en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos
en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa
negativos, reductores de nitratos a nitritos (Benavides, 2010).
Según Olivet (2008), son bacterias de rápido crecimiento y amplia
distribución en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales. En
conjunto, la importancia de las enterobacterias en patología humana puede
cuantificarse constatando que constituyen el 50% aproximadamente de
todos los aislamientos clínicamente significativos en los laboratorios
microbiológicos y hasta el 80% de todos los bacilos Gram negativos
identificados. Integran también esta familia otros géneros asociados con
infecciones intestinales, como son Salmonella, Shigella y Yersinia.
E. coli y otras especies del género Escherichia son generalmente
móviles, producen ácido y gas a partir de la glucosa, arabinosa y
habitualmente de la lactosa y otros azúcares. Producen reacción positiva de
rojo de metilo y negativa de vogues-proskauer. Son incapaces de crecer en
medio con citrato como única fuente de carbono y energía. Son H2S, ureasa
y fenilalanina negativos, pero en general son indol positivo y tienen la
capacidad de decarboxilar la lisina, como lo muestran los datos presentados
18
en la tabla 2.1. Se clasifican en más de 170 serogrupos O según las
características antigénicas de su LPS (lipopolisacáridos) y en serotipos por
la combinación de antígenos O y H flagelares. Otros antígenos presentes en
distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su
clasificación o identificación (Olivet, 2008).
Tabla 2.1 Características generales de Escherichia coli.
(Neidhardt, 1999).
(+) = amplia mayoría de cepas positivas
2.4.2 ENFERMEDADES CAUSADAS POR Escherichia coli
E. coli puede ser causa de enfermedad endógena en pacientes
debilitados o en situación de alteración de la pared intestinal (peritonitis,
sepsis, entre otras), pero las infecciones entéricas provocadas por este
germen no son causadas por las cepas que habitan normalmente el
intestino, sino por líneas especialmente patógenas en esta localización
(Nataro y Kaper, 1998), que se transmiten por vía fecal-oral de persona a
persona o a través del agua y alimentos.
La dosis requerida para enfermar parece ser del orden de 10 a 100
células por gramo o mililitro. Se produce diarrea acuosa o usualmente con
sangre, dolores abdominales severos, náuseas, vómitos y a veces fiebre. La
19
colitis hemorrágica puede derivar en una falla aguda del riñón o en Síndrome
Urémico Hemolítico (SUH) en el 5 % de los infectados. Del 3 a 5 % de los
que padecen SUH sufren la muerte. Los que consiguen recuperarse
padecen fallas renales, complicaciones neurológicas y otras secuelas por
mucho tiempo (Michanie, 2003).
2.4.3 ALIMENTOS IMPLICADOS
Son varios los alimentos implicados en infecciones por E. coli como
por ejemplo carne picada insuficientemente cocida, hamburguesas, carne de
cerdo, agua de pozos, jugos no pasteurizados, frutas, yogur, vegetales
crudos, salame, lechuga, leche cruda y otros como sustitutivos del café,
hortalizas, ensaladas y purés de patatas, sushi y quesos blandos madurados
por mohos. Los alimentos con mayor índice de contaminación por E. coli
son: carne de vacuno, carne de cerdo, aves de corral y carne de cordero.
También están implicadas diversas carnes de mamíferos y aves. La carne
bovina ha sido el alimento involucrado con mayor frecuencia en brotes en los
EE.UU., y las hamburguesas poco cocidas el alimento más frecuente
(Michanie, 2003).
2.4.4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE E. coli
Los métodos de laboratorio utilizados para la detección o recuento de
microorganismos forman parte del criterio microbiológico. La selección del
método a utilizar debe privilegiar a aquellos métodos estandarizados y de
alta sensibilidad que hayan sido validados por organismos internacionales y
nacionales de referencia (Código Alimentario Argentino, 2005).
Según Pascual y Calderón (2000), para la detección de la bacteria E.
coli, intervienen las siguientes pruebas:
1) Presuntiva
2) Confirmativa
20
3) Complementaria
La prueba presuntiva para diferenciación de los bacilos entéricos
Gram negativos se basa en la valoración de la fermentación de la lactosa
sobre medios de cultivo adicionados con este carbohidrato, como el caldo
lactosa (BGBL), el caldo lauril triptosa (CLT), el caldo MacConkey, o el
Medio E.C. que son medios selectivos y de enriquecimiento ya que inhiben
el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los
coliformes a la vez que permite que éstos crezcan sin restricción. Los
coliformes son lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentarla con
producción de ácido y gas, estos signos son los que se buscan en la prueba
presuntiva (Camacho, 1990).
La prueba confirmativa se basa en la siembra en agar EMB Levine;
el cual es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos
de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo
de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Este medio combina
las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor
rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies
de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de
utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo,
está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un
efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico.
Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada
o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras (MacFaddin,
2003).
Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo BGBL a 44,5 ºC,
producción de indol y crecimiento característico sobre el agar EMB, se hace
la lectura en la tabla del NMP para obtener el número de E. coli por gramo o
ml de muestra (Pascual y Calderón, 2000).
21
En la prueba complementaria, según explica MacFaddin (2003), las
bacterias
pertenecientes
a
la
familia
Enterobacteriaceae,
pueden
identificarse a través de una serie de pruebas bioquímicas, que permiten
determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso
permiten determinar la existencia de una secuencia metabólica. Con este fin
se han desarrollado diversos esquemas de clasificación, uno de los más
conocidos y utilizados corresponde al IMViC que son un grupo de cuatro
reacciones bioquímicas que se utilizan para la diferenciación fisiológica de
los bacilos coliformes. Las cuatro reacciones bioquímicas son (IMViC):
I: Formación de indol a partir de triptófano
M: Prueba del rojo de metilo
V: Prueba de Voges-Proskauer
iC: La utilización del citrato como fuente de carbono
Prueba del indol (I):
Esta prueba se la puede analizar en los medios de SIM (sulfuro indol
movilidad) o TSB (caldo triptona de soya), el primero es utilizado también
para investigar la motilidad y la producción de H2S. Estos medios están
enriquecidos con triptófano, aminoácido suministrado por una peptona
adecuada que se descompone en indol por acción de la enzima triptofanasa,
presente en algunos microorganismos. Esta prueba va a consistir en
observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando está en
presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de
kovacs que produce una coloración al reaccionar con él (MacFaddin, 2003).
Prueba del rojo de metilo (M):
Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el
crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampón fosfato.
Debido a la acidez producida, el medio virará de amarillo a rojo considerando
22
la prueba positiva al añadir un reactivo. El procedimiento es el mismo que el
del indol, con la diferencia que, en lugar de añadir indol de kovacs, debe
añadirse rojo de metilo (como indicador) (MacFaddin, 2003).
Prueba de Voges-Proskauer (V):
Algunas bacterias producen acetil-metil-carbinol (producto intermedio
en la degradación de la glucosa de los hidratos de carbono), que en
presencia de KOH y aire, se oxida para dar di-acetilo, que reacciona con αnaftol y un producto de descomposición de la arginina de la peptona, para
producir un color rojo (MacFaddin, 2003).
Prueba del citrato (iC):
Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo
problema para utilizar el citrato como única fuente de carbono. Para esta
prueba se utiliza el agar de Simmons que contiene citrato de sodio y azul de
timol como indicador. Si la reacción es positiva el indicador se vuelve azul
(debido a la producción de amoníaco que lo alcaliniza). Los demás
microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde, indicando
una reacción negativa (MacFaddin, 2003).
Escherichia coli responde a las pruebas IMViC de la forma siguiente
(Figura 2.3):
Indol (I) =
positivo (+).
rojo de metilo (M) =
positivo (+).
Voges -Proskauer (V) =
negativo (-).
citrato (iC) =
negativo (-).
23
Figura 2.3 Pruebas IMViC
Por otro lado, según estadísticas de los CDC (2006) (U.S. centers for
disease control and prevention por sus siglas en inglés (CDC) o centros
para el control y la prevención de enfermedades) se calcula que la E. coli
causa unos 73,000 casos de infección, entre ellos 61 muertes, cada año en
los Estados Unidos. Los alimentos implicados en brotes de ETA’s son
alimentos mal cocinados (en especial carnes crudas o poco cocidas) y otros
alimentos, como espinacas, coles de Bruselas, lechuga, leche sin
pasteurizar y jugo.
Según la Norma Legal Peruana (2003) de "criterios microbiológicos de
calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo
humano" se considera microorganismo de riesgo para la salud: moderado,
directo y de diseminación posiblemente extensa a Escherichia coli patógeno.
En productos cárnicos crudos los límites para E. coli son 50 - 5x102
UFC, mientras que en productos cárnicos (embutidos) cocidos o escaldados
el límite es de 10 - 102 UFC. En comidas preparadas cocidas a base de
24
carnes la presencia de E. coli tiene que ser <10 UFC (Norma Legal Peruana,
2003).
La Norma Técnica Ecuatoriana INEN de carne y productos cárnicos
(carne
molida)
INEN
1
348
1895-11,
establece
como
requisitos
microbiológicos valores máximos de 250 UFC/g para coliformes totales y
para coliformes fecales debe ser negativo. Para embutidos cárnicos
escaldados o cocidos el límite máximo es de <3 UFC/g (indica que en el
método de NMP (con tres tubos por dilución), no debe dar ningún tubo
positivo); sin embargo no existe en el Ecuador una norma que indique los
requisitos microbiológicos para el hornado.
2.5
Salmonella
2.5.1 GENERALIDADES
El género Salmonella es de taxonomía difícil, modificada en estos
últimos años por el aporte de estudios moleculares de homología de ADN
que han clarificado el panorama taxonómico de las enterobacterias. Para la
bacteriología clínica, Salmonella es un bacilo (Figura 2.4) patógeno primario
(como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. coli), anaerobio facultativo,
algunos son móviles y no fermentan la lactosa. Salmonella typhi es la única
serovariedad que no produce gas en la fermentación de los azúcares
(Brooks y col., 2002).
Figura 2.4 Microfotografía de barrido electrónico de Salmonella.
(Velilla, 2006.)
25
Clásicamente
se
distinguían
tres
únicas
especies
patógenas
primarias: S. typhi, S. cholerae-suis y S. enteritidis. A su vez, según la
serotipificación de Kauffman y White (1997), eran clasificadas en más de
2000 serotipos con base en los antígenos flagelares H (proteicos) y
antígenos somáticos O (fracción polisacárida del lipopolisacárido bacilar). S.
typhi posee además un antígeno de virulencia (Valentí y Rozman, 2000).
La Salmonella recibe su nombre por Daniel Elmer Salmon, un
patólogo veterinario estadounidense, quien descubrió la bacteria por primera
vez en 1885, aislándola de cerdos con cólera. La salmonelosis entérica está
habitualmente causada por Salmonella entérica subespecie entérica, con
más de 2.000 cepas descritas (Ryan y Ray, 2004), es de importancia en
países en desarrollo, donde su incidencia está en aumento, y en algunos
países, la enfermedad es endémica (Méndez y col., 2006).
2.5.2 ENFERMEDADES CAUSADAS POR Salmonella
La salmonelosis es una enfermedad de transmisión alimentaria, en
especial por alimentos de origen animal y pueden aparecer en brotes en
escuelas, guarderías, restaurantes y residencias de ancianos. El período de
incubación es por lo general entre 12 a 36 horas, a veces hasta 6 y 48 horas
(Durango y col., 2004).
En el caso de la Salmonella, la sola presencia de esta bacteria ya es
motivo para provocar síntomas en humanos saludables, según estudios
hechos con voluntarios (Bravo y col., 2007). La Salmonella habita
normalmente en la superficie de los huevos, la piel de tomates y de aquellos
frutos y verduras que tienen contacto con la tierra.
La fiebre tifoidea es otra de las enfermedades que pueden ser
ocasionadas por bacterias del género Salmonella. Habitualmente esta
enfermedad está provocada por cepas de Salmonella entérica serotipo typhi
(Salmonella typhi). El único reservorio de la Salmonella typhi es el hombre,
de modo que se transmite de una persona a otra (Valentí y Rozman, 2000).
26
2.5.3 ALIMENTOS IMPLICADOS
El género Salmonella, agente etiológico de la salmonelosis, afecta a
aves de corral, vacunos, porcinos y ovinos, entre otras especies. Estas
bacterias, son los más frecuentes agentes causales de enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA’s). En el período 1995-1999 fueron el
segundo grupo bacteriano más importante causante de ETA’s en
Latinoamérica y el Caribe. La carne de aves, huevos y productos derivados
son alimentos que, muy frecuentemente, ocasionan brotes de ETA’s (Velilla,
2006).
La Salmonella es la causa mayoritaria de los brotes de toxiinfecciones
alimentarias y de alteraciones gastroentéricas. El principal reservorio de
Salmonella son las aves de corral, el ganado vacuno y el porcino; por lo
tanto, son fuentes de infección importantes las carnes de estos animales y
los huevos. Tradicionalmente, los ovoproductos y los preparados a base de
huevo han sido los alimentos que han causado el mayor índice de brotes de
Salmonella y los de mayor riesgo sanitario, especialmente aquellos que
contienen huevo crudo, como la mayonesa, las salsas, los helados, las
cremas, las masas de pastelería, entre otros. Otros alimentos implicados son
la leche no pasteurizada, el chocolate, así como los brotes de semillas de
soja o alfalfa y las carnes poco cocinadas, principalmente de cerdo, de ave y
carnes fermentadas (CRESA, 2003).
2.5.4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO PARA LA DETERMINACIÓN
DE Salmonella
Según se indica en el manual de bacteriología analítica (BAM) de los
Estados Unidos y la metodología de otros países de la Comunidad
Económica Europea, el usar métodos de cultivo tradicionales sigue siendo la
referencia más importante para la detección de microorganismos de interés
sanitario para el ser humano (Quintanilla, 2008).
27
Todos los métodos para detección de Salmonella, involucran en
mayor o menor grado las siguientes etapas:
1) Pre-enriquecimiento
2) Enriquecimiento Selectivo
3) Aislamiento Diferencial
4) Pruebas Bioquímicas Presuntivas
5) Pruebas Bioquímicas Confirmativas
6) Serología con anticuerpos específicos
Cada una de las etapas anteriores tiene una duración mínima de 24 a
48 horas, lo cual lleva a terminar el ensayo o análisis del patógeno en
períodos no menores a 7 días en la mayoría de los casos. Para Salmonella,
específicamente serían 9 días (Quintanilla, 2008).
El pre-enriquecimiento, según explica Quintanilla (2008) tiene como
objetivo el desarrollo general de microorganismos del tipo similar a aquel que
se está buscando que se desarrollen por lo menos 2 o 3 logaritmos. Todos
aquellos microorganismos que no son del mismo grupo (en el caso de
Salmonella, aquellos diferentes al grupo Enterobacteriaceae) suelen ser
inhibidos o tienen crecimiento marginal durante este paso. Los caldos más
usados suelen ser el lactosado, el agua peptonada bufferada y el caldo soya
tripticaseína.
El enriquecimiento selectivo (E.S.) como su nombre lo indica, es
buscar llevar a un nivel cercano al 1,000,000 de células/mL (106) y
neutralizar eficazmente a otros miembros que puedan tener un desarrollo
similar en la microflora del alimento que se está analizando. En el caso
específico de Salmonella, durante esta etapa se busca desarrollarla por
encima de bacterias coliformes como E. coli, Citrobacter y Proteus. En esta
28
etapa suelen usarse caldos selectivos como el tetrationato, el Rappaport
Vassiliadis y el selenito cistina (Quintanilla, 2008).
Durante el aislamiento diferencial, se toma una asada del medio de
E.S. y se re-siembra por estriado en una sola placa o máximo en la mitad de
una placa de petri regular. El estriado debe ser lo suficientemente espaciado
para que al término del mismo, puedan llegarse a seleccionar colonias
puntiformes que puedan ser aisladas para el siguiente paso. Para el análisis
de Salmonella, existen más de 5 formulaciones de agar ampliamente usadas
entre los que están el agar entérico Hektoen, el agar verde brillante, el agar
de sulfito bismuto, el agar McConkey, el agar XLD y el agar Salmonella
Shigella (Quintanilla, 2008).
Las pruebas bioquímicas presuntivas se enfocan a buscar ciertas
características bioquímicas relacionadas con motilidad o desarrollo de algún
color, turbidez o precipitación sobre un agar o un caldo selectivo en tubo.
Estas pruebas permiten descartar si bacterias con un desarrollo en agar muy
parecido a la bacteria objetivo (para Salmonella, bacterias como Proteus
vulgaris, E. coli y Citrobacter freundii) y determinar en esta etapa si conviene
continuar a la búsqueda del género y especie del microorganismo en el
siguiente paso. Para Salmonella, los dos ensayos analíticos más comunes
incluyen el uso del agar triple azúcar hierro (TSI) y el agar lisina hierro (LIA)
(Quintanilla, 2008).
Las pruebas bioquímicas confirmativas, acorde al manual de
Bergey (Bergey,
1994), son el conjunto de análisis específicos para la
determinación del género y especie de los microorganismos. Estas incluyen
pruebas como el indol, citrato de Simmons, manitol, urea, rojo de metilo y
Voges
proskauer. Acorde a los resultados de cada una de ellas, se
determina la identidad del microorganismo.
La serología, usa antisueros específicos para cada microorganismo
que indican el detalle exacto de las características bioquímicas y fisiológicas.
29
Casi todas ellas son por aglutinación en látex y suelen demorar de 1 a 3 días
(Quintanilla, 2008).
Según la Norma Legal Peruana (2003) de "criterios microbiológicos de
calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo
humano" se considera microorganismos de riesgo para la salud: moderado,
directo y de diseminación posiblemente extensa a Salmonella.
La ausencia de Salmonella indica que los alimentos cárnicos crudos o
cocidos y comidas preparadas en base a carnes, pueden ser aptos para el
consumo humano sin riesgo a la salud (Norma Legal Peruana, 2003).
Por otra parte la Norma Técnica Ecuatoriana INEN de carne y
productos cárnicos (carne molida) INEN 1 348 1895-11, establece que para
cualquier producto cárnico la Salmonella debe estar ausente en 25 g de
muestra, para ser apto como producto de consumo humano.
2.5.5 EPIDEMIOLOGÍA DE E. coli y Salmonella
Bacterias causantes de ETA’s como E. coli y Salmonella pueden
contaminar diferentes tipos de alimentos como por ejemplo:
E. coli puede contaminar carne picada insuficientemente cocida,
hamburguesas, carne de cerdo, agua de pozos, jugos no pasteurizados (pH
3,5), agua contaminada por la bacteria, frutas, yogur, vegetales crudos,
salame, lechuga, quesos, leche cruda y otros. La carne bovina ha sido el
alimento involucrado con mayor frecuencia en brotes en los EE.UU., y las
hamburguesas poco cocidas el alimento más frecuente. Desde 1982 esta
bacteria está asociada a alimentos causantes de brotes en EE.UU y más
tarde en Japón y otros países (Michanie, 2003). En Ecuador, no se ha
documentado el aislamiento de este tipo de E. coli de alimentos
comprometidos
en
brotes;
es
decir,
no
existen
aún
evidencias
epidemiológicas documentadas de los casos esporádicos o brotes por
alimentos.
30
La infección por Salmonella está asociada con la ingestión de
alimentos preparados o manipulados inapropiadamente o previamente
contaminados. Las carnes, los productos lácteos y los huevos crudos son las
fuentes más probables de infección o de contaminación extra intestinal fecal
(Durango y col., 2004).
Los alimentos más proclives a contener Salmonella son los huevos
crudos o a medio cocer (mayonesas caseras, huevo poché, clara batida,
bebidas con yema de huevo, entre otros) carnes mal cocidas o que hayan
perdido la cadena de frío. En sí, todo alimento crudo de origen animal y las
frutas o verduras mal lavadas pueden trasmitir la enfermedad, también hay
que tener en cuenta que si éstos entran en contacto con utensilios o
productos listos para el consumo pueden contaminarlos y de ese modo
propagar la infección. Los alimentos que se contaminan con mayor
frecuencia corresponden a productos de origen animal, tales como: carnes
de ave, cerdo, bovino, huevo, leche y sus derivados y mariscos,
especialmente aquellos que habitan en el litoral y donde confluyen aguas
servidas (Insunza y Soto, 1998).
La presencia de Salmonella en platos preparados puede tener varios
orígenes, entre los más importantes, figuran la presencia del agente en las
materias primas animales o vegetales y la acción de personas al manipular
los alimentos en forma inadecuada que pueden producir una contaminación
cruzada entre materias primas y productos terminados. Por otra parte, si los
manipuladores son portadores sanos de Salmonella, existe también el riesgo
de que sean fuente de contaminación de los alimentos que manipulan
(Insunza y Soto, 1998).
Se debe tomar en cuenta los criterios o límites de presencia de
microorganismos que causan enfermedades al consumirlos en distintos
alimentos como se muestra en la tabla 2.2.
31
Tabla 2.2 Criterios para la evaluación microbiológica de la calidad de los
alimentos.
Microorganismo
Límites
Bacterias aerobias mesófilas (alimentos crudos)
< 1 x 106 UFC/g
Bacterias aerobias mesófilas (alimentos cocidos)
< 1 x 104 UFC/g
Mohos
< 20 UFC/g
Levaduras
< 50 UFC/g
Escherichia coli (alimentos crudos)
< 100/g
Escherichia coli (alimentos cocidos)
< 3 /g
Salmonella
Ausencia en 25 g
(Arango y col., 1997)
UFC/g: unidades formadoras de colonias por gramo de muestra.
2.6
HORNADO
El hornado de chancho o cerdo es un plato típico del Ecuador y hay
muchos lugares en los mercados populares que se especializan en la
elaboración de este producto, por lo general hornean el chancho o cerdo
entero en un horno de arcilla. Es un plato que utiliza el pernil del cerdo y
luego de un proceso de curación con ajo, sal, pimienta, comino y pimentón
se somete a procesos de cocinado y fritado.
La receta original utiliza una bebida tradicional llamada chicha y
también utiliza manteca de chancho. Como muchos otros platos típicos
ecuatorianos este plato se consume con acompañantes como el mote
(maíz), el curtido de cebollas y aguacate, como se indica en la figura 2.5.
32
Figura 2.5 Plato de hornado ecuatoriano.
La elaboración del hornado toma tiempo debido a que la carne de
chancho se debe marinar por tres días, esta es la manera de lograr que
todos los sabores de los condimentos sean absorbidos por la carne, pero
también se puede dejarlo marinar por solo un día o hasta un par de horas. El
proceso de horneado tarda aproximadamente 8 horas a una temperatura
que oscila entre 280°C a 300°C (Pazos, 2002).
El consumo de puerco horneado es una práctica que vino de España
(Pazos, 2002), en el Ecuador
el plato es conocido con el nombre de
“hornado”. No hay ciudad, pueblo o caserío del Ecuador que no ofrezca
hornado. Los lugares más populares donde se consume este plato típico en
la sierra, incluyen la provincia de Carchi, Sangolquí, Riobamba, Guamote,
Azogues. Los cerdos se exhiben enteros con ajíes frescos entre los dientes y
en grandes bandejas (Figura 2.6).
Figura 2.6 Chancho hornado ecuatoriano.
33
El hornado ecuatoriano se acompaña con agrio o chiriucho, palabra
quichua que significa ají frío. Agua, sal, cebolla, trozos de ají, algo de panela
o de chicha componen esta salsa. El contraste resalta el sabor de las
lonchas de carne blanca. De paso, se debe señalar que la edad del cerdo
determina la calidad del hornado (Pazos, 2002).
Según un reporte de la prensa escrita publicado en el año 2010; Este
plato típico se elabora en Ecuador desde la época de la conquista, cuando
los españoles trajeron los cerdos, pero es desde hace 50 años que empieza
a ser vendido a escala comercial. En aquel entonces no había más de dos o
tres familias que se dedicaban a prepararlos para entregarlos a los
mercados de Quito.
La crianza de cerdos en la zona se da porque el cantón Rumiñahui
fue conocido como “el granero” de Quito. Con los sobrantes del maíz y del
trigo se alimentaba a los cerdos. La costumbre era asar a los cerdos luego
de haber sacado el pan de los hornos de cangagua calentados con leña.
Hace aproximadamente 15 años la elaboración del hornado empezó
a convertirse no solo en el plato insigne de la zona, sino también en una
fuente de ingresos económicos. Al momento, el 30% de los 75000 habitantes
de este cantón basa su economía en la comercialización del hornado, según
explica un estudio realizado por el Ministerio de Turismo en el año 2010,
donde indica además que semanalmente se preparan unos 1000 chanchos,
de cada uno se saca un promedio de 150 platos. Cada porción oscila entre
los U$D 3 y 4. La particularidad de este plato está en la elaboración.
Por tradición culinaria, la preparación y cocción demora un día. El
cerdo es aliñado con ajo, cebolla, canela, comino y se mantiene así por un
día. El proceso de asado dura toda la noche en horno de leña. Además, hay
otro detalle que identifica a este plato, es el agrio, que en contraste a su
nombre, es una salsa ligeramente dulce. Según Ivette Celi, subsecretaria de
Patrimonio del Ministerio de Cultura, “el hornado se lo halla, principalmente
en la Sierra, pero este de Sangolquí se caracteriza por su agrio dulce”. El
34
agrio también tiene un secreto: la cebolla se curte con la chicha de jora, que
lo hace una especie de vinagreta. El plato se sirve con tortillas de papa,
mote, aguacate y por supuesto el hornado con el agrio.
La ciudad de Sangolquí ubicada en el Cantón Rumiñahui (sur de la
provincia de Pichincha) es conocida como la “Capital mundial del hornado”.
Los comerciantes de hornado de Sangolquí adquieren los cerdos de los
criadores de chanchos de Quinindé, Chone, El Carmen y Santo Domingo. La
demanda de hornado en Quito y sus alrededores es superior a la capacidad
de crianza, por lo que se busca a estos animales en la Costa. Un vendedor
de hornado de Sangolquí puede vender hasta 100 chanchos por semana a
un precio que va de 40 a 120 U$D (Abad, 2000).
2.7
INTOXICACIONES PRODUCIDAS POR HORNADO EN
ECUADOR
El 1 de marzo del 2004 el diario Hoy de la ciudad de Quito, informó
que La Comisaría del Valle de Los Chillos realizó un operativo exhaustivo en
los locales donde se expende hornado en El Tingo, luego de que dos
ciudadanos denunciaron que se estaba vendiendo hornado que contenía
gusanos. La denuncia la presentaron, luego de que presenciaran que los
platos de hornado contenían gusanos vivos. El Comisario Metropolitano de
la administración se trasladó hasta el restaurante para comprobar lo
señalado, por lo que ordenó el decomiso y retiro del producto.
El 15 de Noviembre del 2007 el mismo diario publicó que “Hornado
insalubre intoxica a 400 personas”, donde se informó que la intoxicación por
la ingesta de alimentos contaminados fue lo que intoxicó alrededor de 400
personas en Calpi (provincia de Chimborazo), según fuentes médicas.
Alrededor de unas 1000 personas, procedentes de Quito, Cuenca y
Guayaquil ingirieron un plato de hornado, mote, tortillas de papa, cebolla y
tomate. Al cabo de dos horas, el malestar estomacal llevó a varios de los
35
participantes de la fiesta a pedir atención médica en varias unidades de
salud. Autoridades del servicio de emergencia del Hospital Docente de
Riobamba, informaron que el cuadro clínico que presentaron los pacientes
fue de deshidratación aguda: el vómito y diarrea dieron lugar a una grave
pérdida de líquido, calambres musculares y dolor abdominal. Todo se debió
a que los alimentos fueron preparados en condiciones antihigiénicas.
En la parroquia de Cangagua (Cayambe), en junio del 2010 se reportó
una intoxicación masiva, 260 pacientes se intoxicaron en una comunidad. Se
presume que se enfermaron por ingerir comida en mal estado. Infección
intestinal, vómitos, diarreas y fiebre, fueron los síntomas presentados. Se
informa a través de la prensa escrita que “Todo indica que se trata de una
intoxicación masiva por la ingesta de alimentos” fue el diagnóstico previo que
realizó desde la jefatura de la Unidad de Salud y Seguridad. Entre los
alimentos ingeridos, se encontraba chancho hornado.
2.8
AGRIO
El agrio es el acompañante del hornado, especias, vegetales y otros
ingredientes componen esta salsa. El agrio es característico por su sabor a
chicha de jora acompañado de cebollas, sal, trozos de ají, tomate riñón, algo
de panela, culantro y perejil.
Como se mencionó anteriormente, el agrio está compuesto por
vegetales como cebollas, tomate riñón, culantro, perejil, entre otros (Figura
2.7), los cuales son propensos a presentar contaminación, de igual forma la
presencia de panela en el agua utilizada para la elaboración del agrio puede
ser fuente de glucosa para el crecimiento de distintos tipos de bacterias.
36
Figura 2.7 Agrio.
No se han registrado datos de análisis microbiológicos realizados al
agrio, acompañante del hornado, por lo que resulta de gran importancia
identificar si presenta contaminación microbiana, debido a que en el proceso
de elaboración, transporte y conservación a temperatura ambiente durante el
momento de su expendio este producto podría ser
fuente principal de
contaminación al plato de hornado.
37
3. METODOLOGÍA
3. METODOLOGÍA
En el presente capítulo se describe la metodología utilizada para la
determinación de microorganismos indicadores de higiene y Salmonella,
estos incluyen el recuento de coliformes totales y fecales; recuento,
aislamiento e identificación de E. coli e identificación de Salmonella en
muestras de hornado expendido en cuatro locales de comida típica del
Mercado Municipal de Sangolquí.
3.1
DESCRIPCIÓN Y TOMA DE MUESTRA
Se seleccionaron al azar cuatro locales de comida típica en
Sangolquí, Cantón Rumiñahui, Provincia de Pichincha, Ecuador; con los
debidos permisos de la autoridad pertinente (Anexo 8), dos de los cuatro
locales escogidos se encuentran ubicados en el Mercado Municipal de la
Ciudad de Sangolquí en el Cantón Rumiñahui, Provincia de Pichincha
(Figura 3.1) y los otros dos locales son restaurantes de comida típica
ubicados en una avenida principal de la misma ciudad (Figura 3.2).
Figura 3.1 Locales ubicados en el Mercado
38
Figura 3.2 Restaurantes ubicados en la Avenida
Los platos fueron tomados en condiciones normales de manipulación
y venta, el hornado y sus aderezos fueron colocados en recipientes plásticos
por la vendedora (sin uso de guantes y manipulación del dinero de la venta
con las mismas manos), el hornado permanecía en bandejas de lata (Figura
3.1 y 3.2), estos platos fueron colocados en una lonchera plástica e
inmediatamente trasladados (asépticamente) al Laboratorio de Microbiología
de la Facultad de Ciencias de la Ingeniería de la Universidad Tecnológica
Equinoccial (Quito) para su análisis y se procesaron dentro de 2 horas.
Como se observa en la figura 3.3, el plato de hornado en la mayoría
de los casos consiste en: hornado (carne de cerdo), tortilla de papa, mote,
lechuga, aguacate y agrio.
Figura 3.3 Plato de Hornado
39
Se analizó específicamente el hornado (llamada así a la carne de
cerdo), el agrio (guarnición acompañante elaborada a partir de: agua, sal,
cebolla, tomate riñón, trozos de ají, panela raspada, perejil y culantro) y la
mezcla de hornado y agrio con el fin de conocer el origen de la
contaminación.
El transporte de las muestras se realizó en recipientes individuales
tanto para la carne de cerdo como para el agrio.
Cabe recalcar que el agrio es un acompañante infaltable en este plato
y está elaborado a partir de: agua, sal, cebolla, tomate riñón, trozos de ají,
panela raspada, perejil, culantro, entre otros, se puede observar en la figura
3.4 que este acompañante se coloca sobre la carne de cerdo para su
consumo.
Figura 3.4 Plato de Hornado con Agrio
Con el fin de conocer el origen de la contaminación, en caso de
haberla, de cada plato de hornado, se dividen 3 muestras: hornado (H),
agrio (A) y una mezcla de hornado y agrio (H/A), de cada unas de estas se
efectuaron dos análisis uno para E. coli y el otro para Salmonella. Los
análisis se realizaron por duplicado.
En cada análisis el período transcurrido entre la toma de muestra y el
inicio del análisis microbiológico no superó las dos horas.
40
3.2
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Con el fin de mantener la muestra y el ambiente de manipulación
estéril los ensayos se realizaron en una cámara de flujo laminar marca
Telstar. Asépticamente se homogenizó 25 gramos de cada muestra
(hornado, agrio y una mezcla de hornado/agrio) por 2 minutos utilizando una
licuadora marca Oster. A partir del homogenizado se realizaron los análisis
de E. coli y Salmonella que se detallan en las siguientes secciones.
3.3
RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y
Escherichia coli
El recuento, aislamiento e identificación de Escherichia coli se realizó
según la norma INEN (NTE INEN 1 529-8).
3.3.1 PRUEBA PRESUNTIVA
Se pesó 25 g de muestra (homogenizada) en 225 ml de solución
salina estéril (0,75%) para obtener la dilución 10-1, a partir de la cual se
realizaron 2 diluciones sucesivas.
Con el fin de realizar el recuento de coliformes totales, coliformes
fecales y E. coli, de cada dilución se inoculó 1 ml en una serie de 9 tubos de
ensayo (3 tubos para cada dilución: 10-1, 10-2 y 10-3) que contenían 9 ml de
caldo BGBL (verde brillante bilis lactosa) con una campana de Durham en
cada uno. Los tubos se incubaron a 30ºC por 24 horas en una incubadora
marca Memmert. Transcurrido el tiempo de incubación se contó el número
de tubos positivos en cada dilución para obtener una combinación numérica
que fue comparada con la tabla de NMP, según se observa en el Anexo 5.
41
Posteriormente, se tomaron los tubos con coliformes totales positivos
en gas y turbidez y de cada uno, se realizaron dos siembras, una en tubos
de ensayo con 3 mL de caldo TSB (caldo de triptona y soya) y otra en tubos
con 10 ml de caldo BGBL que contenían campanas de Durham. Los tubos
con TSB y BGBL se incubaron a 45ºC por 48 horas para realizar el recuento
de coliformes fecales. Luego del período de incubación se consideraron
como tubos positivos aquellos que dieron positiva la prueba de indol
y
produjeron gas en caldo BGBL.
3.3.2 PRUEBA CONFIRMATIVA
Se seleccionaron los tubos coliformes fecales positivos en gas e indol
(BGBL = gas, TSB = indol), de lo cuales se tomó una asada y se inoculó por
estriado en agar EMB (eosina azul de metileno) por separado a cada uno de
los tubos BGBL positivos; después se incubaron las cajas petri a 35ºC por
24 horas; a continuación de las cajas petri que presentaron colonias con el
centro negro y brillo verde metálico alrededor se tomaron colonias aisladas y
se las Inoculó por estría en tubos con agar PCA (agar conteo en placa) en
pico de flauta e inmediatamente se incubaron a 35ºC durante 24 horas. Al
término de este tiempo, con las bacterias que crecieron se efectuó la tinción
Gram con el fin de comprobar la presencia de bacilos Gram negativos (E.
coli) y saber si el cultivo presentaba un solo tipo de microorganismo.
El método de tinción Gram se lo efectúo de la siguiente manera: se
tomó una colonia del cultivo con la punta del asa y se realizó un frotis en un
portaobjetos limpio, se secó la muestra flameando en el mechero, después
se cubrió la muestra con gotas de cristal violeta durante 1 minuto, se lavó el
portaobjetos con agua destilada, luego se cubrió la muestra con gotas de
lugol por 1 minuto, se lavó con alcohol cetona, por último se cubrió la
muestra con gotas de safranina durante 30 segundos, se lavó con agua
destilada, se dejó secar al ambiente y se observaron las muestras en un
microscopio marca Olimpus CX31. Posteriormente y con las mismas
bacterias de los tubos con PCA se realizaron las pruebas IMViC.
42
3.3.3 PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (IMVIC)
Con el fin de confirmar la presencia de E. coli en las muestras de
hornado, agrio y la mezcla de hornado/agrio, se realizaron las pruebas
IMViC, que incluyen la prueba para indol, prueba de rojo de metilo, Voges
Proskauer y uso del citrato, según se detalla a continuación:
3.3.3.1
Prueba para indol. Se sembró en un tubo que contenía 3 mL
de caldo TSB (marca Scharlau) una asada de cultivo puro, se incubó
por 24 horas a 35ºC, luego de este tiempo se añadió al tubo 3 gotas
del reactivo de Kovac. La aparición de un anillo color rojo oscuro en la
superficie del reactivo indica una prueba positiva.
3.3.3.2
Prueba del rojo de metilo (RM). Se sembró en un tubo que
contenía 3 mL de caldo MR-VP (rojo de metilo – Voges Proskauer,
marca Scharlau), con un asa de cultivo puro, se incubó por 24 horas a
35ºC, posteriormente se añadió 3 gotas de la solución de rojo de
metilo, se agitó, el cambio de color del medio a rojo indica una prueba
positiva.
3.3.3.3
Prueba de Voges -Proskauer (VP). Se sembró en un tubo con
3 mL de caldo MR-VP (marca Scharlau) una asada de cultivo puro, se
incubó por 24 horas a 35ºC, al cabo de este período se añadió 2
gotas de KOH (hidróxido de potasio) al 40% y 3 gotas de α-naftol al
6% (solución acuosa) se esperó 5 minutos. La no alteración del medio
y la formación de un anillo transparente en la superficie indica que la
prueba es negativa, caso contrario, el resultado es positivo cuando se
forma un anillo de color rosado o rojo.
3.3.3.4
Prueba para la utilización del citrato. Se sembró por estría
en la superficie de la lengüeta de agar citrato de Simmons (marca
Himedia) inclinado en un tubo, se incubó por 24 horas a 35ºC. El
43
crecimiento visible de bacterias que no cambian de color el medio
indica una prueba negativa; la reacción es positiva cuando hay
crecimiento visible y el medio cambia su color de verde a azul.
Se considera como E. coli a los microorganismos que presentan las
siguientes características: bacilos Gram negativos no esporulados que
producen gas a partir de la lactosa y reacción IMViC (Tabla 3.1).
Tabla 3.1 Clasificación de los coliformes por la pruebas “IMViC”
CLASIFICACIÓN DE LOS COLIFORMES POR LAS PRUEBAS "IMViC"
Tipo de
Gas en caldo
Prueba del
MR (rojo de
VP (voges-
Crecimiento
E. coli
BGBL 45,5ºC
indol 45,5ºC
metilo)
proskauer)
en citrato
Típico (tipo I)
+
+
+
-
-
Atípico(tipo II)
-
-
+
-
-
E. coli
(INEN, 1990)
3.4
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella
El aislamiento e identificación de Salmonella se realizó según la
norma INEN (NTE INEN 1 529-15:96).
3.4.1 PRE-ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
Se pesó 25 g de muestra en 225 ml de agua peptona tamponada y se
homogenizó, luego se tapó el frasco y se dejó a temperatura ambiente por
60 minutos, después de este tiempo se ajustó el pH a 6.8 ± 0,2 con NaOH
1N ó HCl 1N, también se agregó 2 gotas de Tritón X-100 y se incubó a 37ºC
de 16 a 20 horas.
3.4.2 ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
Transcurrido el período de incubación, se tomó una alícuota de 10 ml
de muestra y se colocó en 100 ml de caldo tetrationato (marca Difco), así
mismo se tomaron 10 ml de la misma muestra y se colocaron en 100 ml de
44
caldo selenito cistina (marca Acumedia), los tubos de ensayo se incubaron a
42,5ºC y a 37ºC por 24-48 horas para el caldo tetrationato y el caldo selenito
cistina, respectivamente.
3.4.3 AISLAMIENTO
Los caldos tetrationato y selenito cistina, por separado, fueron
sembrados en estría sobre la superficie seca de placas de BGA (agar verde
brillante, marca Scharlau), SSA (agar Salmonella Shigella, marca BBL) y
BSA (agar bismuto sulfito, marca Himedia); después se invirtieron las cajas
petri y se incubaron a 37ºC por 24 horas.
3.4.4 PURIFICACIÓN
Con el fin de obtener un cultivo axénico de Salmonella se examinaron
y se compararon las cajas incubadas, se seleccionaron las colonias típicas o
sospechosas aisladas y se inoculó por estría en la superficie seca de placas
individuales de agar MacConkey (marca Acumedia) e inmediatamente se
invirtieron las cajas petri para ser incubadas a 37ºC durante 24 horas.
Pasado este tiempo se seleccionaron colonias incoloras (lactosa negativa) y
se las sembró en agar nutritivo inclinado y se incubaron los tubos a 37ºC por
24 horas. A partir de estos tubos con agar nutritivo inclinado se realizaron
tinciones por el método de Gram para comprobar la pureza de los cultivos
bacilos Gram negativos.
3.4.5 SELECCIÓN
De cada cultivo en agar nutritivo inclinado se tomaron las colonias de
Salmonella y con una aguja se inoculó por picadura la columna del agar y
por estría la superficie inclinada de los tubos con agar TSI (tres azúcares
hierro) (marca BioCen), mientras que en los tubos con agar LIA (agar lisina
hierro) (marca Difco) se sembró con un asa por estría únicamente en la
45
superficie inclinada del medio. Los tubos se incubaron a 37ºC por 24 horas.
Al término de este período se procedió a examinar los cambios producidos
en los medios de cultivo.
Con el fin de mantener la viabilidad del cultivo, a partir de los tubos
con TSI y LIA se inocularon en tubos con agar nutritivo (marca Himedia)
inclinado, llevando estos tubos a incubación por 24 horas a 37ºC. Con estos
cultivos se realizó la confirmación bioquímica.
3.4.6 CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Con el fin de confirmar la presencia o ausencia de Salmonella en las
muestras de hornado, agrio y la mezcla de agrio y hornado, se realizaron las
pruebas bioquímicas de la ureasa, lisina-descarboxilasa, indol, voges
Proskauer y uso del citrato, según se detalla a continuación:
3.4.6.1
Prueba de la ureasa. Se inoculó en estría sobre la superficie
de agar urea inclinado (marca Himedia), se incubó entre 24 y 48
horas a 37ºC. La reacción es positiva cuando el color del medio
cambia a rosa más intenso o cereza intenso. La no alteración del
medio indica una reacción negativa. La presencia de Salmonella da
reacción negativa.
3.4.6.2
Prueba de la lisina-descarboxilasa. Se inoculó por estría en
la superficie de agar LIA inclinado, se incubó por 24 horas a 37ºC. La
reacción es positiva cuando el color del medio cambia a púrpura, el
cambio a amarillo indica una reacción negativa. La Salmonella da
reacción positiva.
3.4.6.3
Prueba de voges-proskauer. El cultivo en análisis se sembró
en un tubo con caldo MR-VP, se incubó a 37ºC durante 24 horas,
después de este período se añadió 2 gotas de KOH al 40% y 3 gotas
de α-naftol al 6%, se esperó 5 minutos. La no alteración del medio y la
46
formación de un anillo transparente en la superficie indica que la
prueba es negativa; el resultado es positivo cuando se forma un anillo
de color rosado o rojo en la superficie del caldo de cultivo. La
Salmonella da reacción negativa.
3.4.6.4
Prueba del indol. El cultivo en análisis se sembró en un tubo
con caldo TSB, se incubó por 24 horas a 37ºC, luego de este tiempo
se añadió al tubo 3 gotas del reactivo de Kovac. La aparición de un
anillo color rojo oscuro en la superficie del reactivo indica una prueba
positiva y la formación de una anillo transparente o amarillo en la
superficie indica una reacción negativa. La Salmonella es indol
negativa.
3.4.6.5
Prueba de la utilización del citrato. Se sembró en estría
sobre la superficie inclinada de agar citrato de Simmons, se incubó
por 24 horas a 37ºC. El
crecimiento visible de bacterias que no
cambian de color del medio indica una prueba negativa; la reacción es
positiva cuando hay crecimiento visible y el medio cambia su
coloración de verde a azul fuerte. La mayoría de las Salmonella dan
una reacción positiva, pero a veces es variable dependiendo de la
región y del alimento analizado, de manera que la Salmonella puede
dar también una reacción negativa.
3.5
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
En todas las experiencias se empleó un Diseño factorial AxB. Los
resultados fueron procesados mediante un análisis de varianza (ANOVA) y
las medias comparadas por la DMS (Diferencia Mínima Significativa) o por
sus siglas en inglés LSD (Least Significant Difference) con una significancia
de 0,05 usando el software STATGRAPHICS Plus versión 5.1
47
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente capítulo se describen los resultados y la discusión del
recuento, aislamiento e identificación de coliformes totales, coliformes
fecales, E. coli y Salmonella en muestras de hornado, agrio y una mezcla de
hornado y agrio de cuatro locales de venta de comida típica de Sangolquí
(cantón Rumiñahui). Los locales se designaron numéricamente del 1 al 4.
4.1
RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y
Escherichia coli
El análisis de E. coli comprende el recuento de coliformes totales y
coliformes fecales, también conocidas como; prueba presuntiva, prueba
confirmativa y prueba complementaria.
Coliformes totales:
El recuento de coliformes totales se expresó como el número más
probable por gramo de muestra (NMP/g de muestra) (hornado, agrio y la
mezcla hornado y agrio), según la combinación numérica obtenida en los
tubos de BGBL luego de la incubación de 48 h a 35°C ± 1ºC (Figura 4.1).
Figura 4.1 Tubos con campana de Durham y caldo BGBL
48
Como se puede observar en la figura 4.2, la muestra de hornado del
local 4 presentó mayor población de coliformes totales que los locales 1, 2 y
3 (columna azul). Mientras que el agrio presentó mayor población en los
locales 1, 3 y 4 (columna roja). La mezcla de hornado y agrio presentó
NMP (coliformes totales/g)
mayor población de coliformes totales en el local 3 (columna verde).
Hornado
Agrio
Hornado/Agrio
2600
2400
2200
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
b
b
ab
a
L1
L2
L3
L4
Locales
Figura 4.2 NMP de coliformes totales por gramo de muestra analizada
(hornado, agrio y hornado/agrio.)
Coliformes totales en muestras de hornado (H), agrio (A) y una mezcla de hornado/agrio
(H/A) en 4 locales de comida típica de Sangolquí. LSD = 726
Letras distintas indican diferencia significativa entre los locales analizados.
En el Ecuador no existen normas que indiquen los valores permisibles
máximos de coliformes totales en el hornado, por lo tanto el análisis de
resultados
no
podrá
realizarse
para
verificar
el
cumplimiento
o
incumplimiento de un criterio microbiológico sino más bien como un
indicador de la aplicación de buenas prácticas de higiene durante la
elaboración de este alimento.
Entonces, al comparar las muestras de agrio y hornado, es el agrio el
que presenta mayor población de coliformes totales, siendo éste el que
produce la contaminación del producto, como se puede observar en el
recuento de la mezcla de las dos. El local 4 presentó la mayor contaminación
49
con coliformes totales tanto en el hornado como en el agrio y en la mezcla
de ambas.
Los coliformes son microorganismos que comúnmente se encuentran
en las plantas, el suelo, agua y los animales incluyendo el hombre, por lo
tanto, podría decirse que el local que presentó mayor contaminación (local 4)
probablemente presenta falencias en la aplicación de buenas prácticas de
higiene durante la elaboración de alimentos lo que provocaría que sus
productos se contaminen con este tipo de microorganismos, sin embargo
estos microorganismos no necesariamente constituyen un riesgo para el
consumidor, debiendo considerarse también la posibilidad de contaminación
del producto posterior a la cocción, es decir durante el almacenamiento
previo a la venta.
Además debe tomarse en cuenta la preparación del agrio, ya que
presenta la mayor presencia de contaminación por coliformes totales. Este
sería el componente del plato que contribuye a la contaminación del
hornado, debido probablemente a una contaminación procedente de las
materias primas para su elaboración (agua, sal, cebolla, tomate riñón, trozos
de ají, panela raspada, perejil, culantro, entre otros), su incorrecta
manipulación al momento de utilizarlos en la elaboración de este
acompañante del plato de hornado o por la deficiente higiene del
manipulador. Además, cuando un producto presenta alta actividad de agua
(Aw), como el agrio, es más propenso a la proliferación de contaminación
microbiana, además de conservarse a temperatura ambiente durante su
comercialización.
Como se mencionó anteriormente la presencia de bacterias
coliformes en los alimentos no significa necesariamente que hay
contaminación de origen fecal o que hay patógenos entéricos presentes. Las
bacterias coliformes son particularmente útiles como componentes de
criterios microbiológicos para indicar contaminación postproceso térmico.
Estos organismos se eliminan fácilmente por tratamiento térmico, por lo cual
50
su presencia en alimentos sometidos al calor sugiere una contaminación
posterior al tratamiento térmico o que éste ha sido deficiente. El análisis de
coliformes totales en una muestra como el agrio cobra importancia, debido a
que éste no sufre ningún tratamiento térmico que elimine las bacterias
presente en él.
Coliformes fecales:
Por otro lado, las muestras analizadas presentaron coliformes
fecales, su presencia se comprobó debido a la producción de gas resultante
de la fermentación de la lactosa a las 48 horas de incubación en el medio
BGBL (Figura 4.3) y debido a que se produjo indol a partir de triptófano en el
medio TSB (Figura 4.4).
Figura 4.3 Recuento de coliformes fecales.
Figura 4.4 Prueba de indol en caldo TSB.
a) Resultado (-) anillo amarillo, y b) Resultado (+) anillo rojo. Luego de la adición del reactivo
Kovac posterior a la incubación a 35°C a 24 h.
51
En la tabla 4.1 se observan los valores de NMP de coliformes fecales
por gramo de muestra en relación con los 4 locales (L1, L2, L3 y L4) y las
muestras de Hornado (H), Agrio (A) y Hornado/Agrio (H/A). El local 3
presentó mayor incidencia de contaminación por coliformes fecales seguido
en menor proporción por el local 4, luego por el local 1 y el local que tuvo
menos contaminación fue el número 2. Por otro lado, las muestras que
presentaron mayor incidencia de contaminación fecal fueron las de
Hornado/Agrio (H/A) (especialmente en el local 3) seguidas por las de Agrio
(A) (con menor incidencia en el local 2); las muestras de Hornado (H) son las
que presentaron en todos los locales menor incidencia de contaminación por
coliformes fecales.
Tabla 4.1 NMP de coliformes fecales por gramo de muestra analizada.
NMP DE COLIFORMES FECALES / g DE MUESTRA
L1
L2
L3
L4
H
N/D
29.25
25.75
4.5
A
406.5
N/D
1375.25
357.5
H/A
108.5
146
1883.5
870
H = hornado, A = agrio, H/A = hornado/agrio
L1, L2, L3, L4 = locales analizados.
ND = no detectable
Como se puede observar en la tabla 4.1 el local 3 (L3) presentó mayor
contaminación con coliformes fecales en las muestras analizadas, seguido
del local 4 (L4), 1 (L1) y 2 (L2).
Determinar la presencia y cuantificar la población de coliformes
fecales en productos alimenticios de este tipo es muy importante para saber
si existe un déficit en la inocuidad e higiene en el expendio del producto en
estos establecimientos, representando un riesgo para la salud de las
personas que lo consumen ya que hay la posibilidad de contraer
enfermedades. Hay que tener en cuenta que el consumo de alimentos
inocuos variará dependiendo de los establecimientos y lugares donde se
elabora, procesa y vende este producto, los resultados obtenidos en el
52
análisis del hornado, agrio y hornado/agrio de los cuatro locales analizados
demuestran deficiencia higiénica en alguna o todas las partes del proceso.
La sola presencia de coliformes fecales en alimentos indica contaminación
de origen fecal.
La presencia de coliformes fecales indica una clara deficiencia
higiénica tanto de las personas que manipulan los alimentos, utensilios o
equipos o del ambiente del local donde se comercializa. Los resultados
obtenidos (Tabla 4.1) representan un riesgo para la salud ya que la sola
presencia de estas bacterias es un indicador de la mala calidad del alimento
y de su deficiente inocuidad.
En muchos de los casos los alimentos consumidos no causan daño a
las personas, pero en algunas ocasiones sí puede ser perjudicial
ocasionando malestar estomacal, diarreas, entre otras. Es el caso del agrio,
donde el producto no tiene un proceso previo de cocción y se lo consume
crudo, hay que tomar en cuenta la cantidad consumida y el tiempo que se lo
conserva al ambiente, tiempo en el cual la población de bacterias pudiera
aumentar. Por otro lado, el hornado se somete a un proceso de cocción por
lo cual la carga microbiológica se anula y el producto final muestra un nivel
mínimo o casi nulo de contaminación.
Escherichia coli:
Los análisis realizados a las diferentes muestras demostraron la
presencia de E. coli. Las colonias en agar EMB mostraron brillo metálico
verdoso (+) (Figura 4.5). La presencia de E. coli fue confirmada con tinción
Gram (Figura 4.6).
53
Figura 4.5 Cultivo de E. coli en agar EMB
Figura 4.6 Tinción Gram de E. coli: bacilos Gram negativos
Una vez comprobado los resultados de las pruebas complementarias
(IMViC) se identificó la presencia de la bacteria Escherichia coli en 28
muestras de un total de 48, en donde, 13 de éstas corresponden a muestras
de hornado y agrio (H/A), mientras que de las muestras de Agrio (A) 10
muestran fueron positivas y en cuanto al Hornado (H) se encontraron 5
muestras positivas.
En la figura 4.7 se presenta el análisis global del número de muestras
con la presencia de la bacteria Escherichia coli, donde las muestras positivas
fueron mayores en número que las muestras negativas.
54
Figura 4.7 Presencia de E. coli en las muestras de hornado, agrio y la
mezcla de hornado/agrio.
El local 3, como se observa en la figura 4.8, fue el que presentó
mayor porcentaje de casos positivos de E. coli en relación a los demás
locales que expenden comida típica en la ciudad de Sangolquí.
Figura 4.8 Presencia de E. coli en los locales analizados.
La presencia de la bacteria Escherichia coli en más del 50% de
muestras
analizadas
indica
mala
manipulación,
deficiencia
en
el
procesamiento y una defectuosa práctica higiénica de las personas que
están involucradas con la elaboración, producción, distribución, conservación
55
y manipulación del producto. Por tal razón la inocuidad alimentaria está
totalmente afectada con lo que respecta al expendio de hornado en locales
de comida típica de la zona.
Lo anteriormente expuesto representa un riesgo para la salud de los
consumidores, ya que E. coli es el mejor indicador de contaminación fecal y
al estar está presente en alimentos demuestra claramente que el producto
examinado no es de buena calidad y se revelan las deficiencias en la
limpieza y desinfección del lugar de expendio y del manejo del producto por
parte de las personas que laboran en estos locales. La validación del
proceso térmico por el cual pasa el hornado beneficia en la eliminación de
esta bacteria, sin embargo, el agrio al no pasar por un proceso térmico es
una fuente para la proliferación de estos microorganismos en el caso de que
exista un foco de contaminación fecal en el proceso o en la materia prima
utilizada.
4.2
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella
En la identificación de Salmonella los cambios y las reacciones típicas
que se produjeron en los medios de cultivo específicos indicaron la posible
presencia de este microorganismo. Cabe recalcar que como indicador de
inocuidad e higiene alimentaria la sola presencia de esta bacteria indica un
riesgo para la salud.
4.2.1 AISLAMIENTO
A partir de los cultivos de pre-enriquecimiento y enriquecimiento
selectivo se aislaron las colonias de Salmonella.
A continuación se describe el aspecto de las colonias de Salmonella
en los medios utilizados de agar selectivo:
56
En BGA las colonias de Salmonella se presentaron opacas o
translúcidas de color rosa, rojo o de color del medio (Figura 4.9).
A. BGA negativo (-)
B. BGA positivo (+)
Figura 4.9 Colonias de Salmonella en BGA luego de 24 horas de incubación
a 37ºC. a) Resultado negativo. b) Resultado positivo.
.
En SSA la mayoría de las colonias típicas de Salmonella fueron
transparentes e incoloras con o sin centro negro (Figura 4.10).
A. SSA negativo (-)
B. SSA positivo (+)
Figura 4.10 Colonias de Salmonella en SSA luego de 24 horas de
incubación a 37ºC. a) Resultado negativo. b) Resultado positivo.
En BSA las colonias típicas de Salmonella presentaron un centro
negro, borde claro con brillo metálico alrededor formando el “ojo de pez”
(Figura 4.11).
57
A. BSA negativo (-)
B. BSA positivo (+)
Figura 4.11 Colonias de Salmonella en BSA luego de 24 horas de
incubación a 37ºC. a) Resultado negativo. b) Resultado positivo.
4.2.2 SELECCIÓN
A partir de las colonias sospechosas de Salmonella en los medios de
cultivo BGA, SSA y BSA se seleccionaron aquellas colonias que en los
medios TSI y LIA presentaron los siguientes cambios (Figura 4.12):

TSI: la lengüeta presentó un color rojo y la columna cambió a color
negro y amarillo.

LIA: la lengüeta presentó color violeta y la columna presentó color
negro y amarillo.
Figura 4.12 Crecimiento positivo de Salmonella en a) TSI y b) LIA.
58
4.2.3 CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Los resultados en la identificación bioquímica mostraron que varias
colonias aisladas no eran positivas para la presencia de Salmonella mientras
que otras sí. Salmonella responde a las pruebas de identificación bioquímica
de la forma siguiente (Figura 4.13):
Urea =
negativo (-)
Lisina-descarboxilasa =
positivo (+).
Voges-Proskauer =
negativo (-).
Indol =
negativa (-).
Citrato =
positivo (+).
Figura 4.13 Resultados positivos para Salmonella luego de 24 h de
incubación a 37°C en a) agar urea, b) LIA, c) voges-proskauer, d)
Indol y e) agar citrato.
Según las normas de requisitos microbiológicos de huevo, carnes
crudas y productos lácteos de queso no pasteurizados se determina la
presencia y ausencia de Salmonella. El análisis de Salmonella en muestras
como el hornado y el agrio es de gran importancia ya que permite valorar la
59
inocuidad del producto, porque la sola presencia de este microorganismo es
perjudicial para la salud del consumidor.
Se analizaron 48 muestras entre Hornado (H), Agrio (A) y
Hornado/Agrio (H/A), en cuatro locales; se identificó la bacteria Salmonella
en 2 de las 48 muestras (4% del total) como se observa en la figura 4.14,
donde la presencia de esta bacteria tuvo incidencia en la muestra de Agrio
(A) precisamente en un plato del local 1 y en la de Hornado/Agrio (H/A) en
un plato del local 2; cabe recalcar que ninguna de las muestras de Hornado
(H) tuvo presencia de Salmonella. Los locales 1 y 2, fueron los que
mostraron en igual porcentaje presencia de Salmonella y los locales 3 y 4 se
los registró con ausencia de esta bacteria ya que no presentaron ningún
resultado positivo en su análisis.
Figura 4.14 Presencia de Salmonella en locales analizados.
Encontrar Salmonella en los alimentos indica una deficiencia en la
práctica higiénica de las personas que están en contacto con el producto y
del lugar donde se lo comercializa, constituyendo el consumo del producto
un riesgo para la salud ya que como se mencionó anteriormente, esta
bacteria produce enfermedades de gravedad como salmonelosis y
gastroenteritis (Bravo y col., 2007).
60
Las muestras de hornado, agrio y la mezcla de ambas, presentaron
mayor contaminación con coliformes totales y fecales (presencia de E. coli)
en el local 3, mientras que la presencia de Salmonella se dio en los locales
1 y 2 en muestras de agrio y hornado/agrio.
En el Ecuador, no existe una norma microbiológica que indique los
niveles máximos permisibles de microorganismos coliformes totales,
coliformes fecales, Escherichia coli y Salmonella en hornado, siendo un plato
típico de consumo masivo que atrae turismo en muchos lugares del Ecuador
debería poseer criterios microbiológicos de calidad, de forma que se pueda
controlar la inocuidad del producto.
61
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1
CONCLUSIONES
El análisis global de resultados indica que los locales analizados
presentaron contaminación con E.coli y coliformes en muestras de hornado,
agrio y hornado/agrio. Y en menor proporción con Salmonella.

De los 4 locales de expendio de hornado, el local 4 presentó mayor
población de
coliformes totales (expresado como NMP/g) tanto en
muestras de hornado, agrio y la mezcla de ambas, seguido por los
locales designados con los números 3, 1 y 2. Estos resultados indicarían
bajo nivel de aplicación de buenas prácticas de higiene durante la
elaboración de alimentos en los locales analizados.

Se determinó que el 58% de las muestras analizadas fueron positivas
para E. coli. Los porcentajes de presencia de contaminación de E.coli por
local fueron: 25% para el local 1, 18% para el local 2, 36% para el local 3
y 21% para el local 4.

E. coli es un indicador de contaminación fecal, la sola presencia de éste
microorganismo indica deficiencia de higiene tanto en la elaboración,
almacenamiento, y distribución del plato de hornado. De las muestras
analizadas, la que mayor índice de contaminación por E. coli presentó fue
la combinación de hornado y agrio, siendo el agrio la principal fuente de
contaminación de este plato típico probablemente debido a las
características de los ingredientes y al carecer de proceso térmico que
elimine a los microorganismos.

Se identificó la presencia de Salmonella en el 4% de las muestras
analizadas (2 de las 48 muestras analizadas fueron positivas) y fue
identificada en muestras de Agrio (A) de local 1 y en la de Hornado/Agrio
(H/A) en el local 2. Cabe recalcar que en ninguna de las muestras de
62
Hornado se detectó la presencia de Salmonella, debido al tratamiento
térmico al cual la carne fue sometida. Estos resultados indicarían que
probablemente las muestras pudieron haber sido contaminadas por
diversas causas, como la mala higiene de los manipuladores directos
(personas que expenden este plato), la calidad sanitaria de las materias
primas usadas para la elaboración de este plato o por contaminación
cruzada de los utensilios utilizados o de los espacios físicos donde se
procesó este alimento.
5.2
RECOMENDACIONES
Las recomendaciones del presente trabajo de investigación se han
dividido en tres partes:
Con
respecto
a
los
ensayos
de
identificación
de
microorganismos indicadores de higiene en alimentos:
Uno de los principales procesos que garantizan la calidad alimentaria
y que hacen que los alimentos sean seguros para el consumo humano son
la Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), las cuales se aplican en el
proceso de producción de los alimentos para disminuir la contaminación
durante su elaboración, esto se lleva a cabo a través del control sanitario del
personal, limpieza de equipos, utensilios, instalaciones físicas y sanitarias,
limpieza y desinfección y control de plagas. La implementación o el
conocimiento de estas normas son necesarios para la elaboración de
cualquier tipo de alimento. Se debe capacitar al personal que trabaja en
expendio de alimentos con estos conocimientos.
Se recomienda el monitoreo continuo de cualquier establecimiento de
expendio de comidas de consumo público, este monitoreo debe estar a
cargo de entidades competentes del Municipio, así mismo deben estar
dirigidas a establecer mecanismos de control y prevención respecto al
63
expendio de alimentos en especial de productos o comida típica ecuatoriana
expendida en mercados municipales.
Es necesario realizar análisis sobre contaminación microbiana y
parasitaria en alimentos que se expenden en el Mercado Municipal de
Sangolquí a través de un estudio que a largo plazo permita determinar la
calidad sanitaria de los locales del Mercado Municipal que expenden comida
típica y con el fin de establecer las causas de la contaminación de alimentos
e implantar medidas de control.
Estas medidas incluyen:
1) Tomar las debidas precauciones al momento de conservar las
muestras en el transcurso de tiempo desde el lugar de la toma de la muestra
hasta el inicio del análisis en el laboratorio, se debe tener en cuenta el
tiempo de traslado y la temperatura del producto y del ambiente;
2) Los materiales y utensilios a usarse en el análisis deben estar
totalmente asépticos para evitar contaminación cruzada de las muestras y
obtención de falsos positivos; y
3) Documentar cada uno de los procesos realizados y la forma en los
que se realizó para verificar si no existen fallos en las técnicas realizadas.
64
GLOSARIO
FDA:
Food and drug administration
SIRVETA:
Sistema de información para la vigilancia de las enfermedades
transmitidas por los alimentos.
FAO:
Food and agriculture organization.
ETA’s:
Enfermedades trasmitidas por alimentos.
BPM:
Buenas prácticas de manufactura.
ICMSP:
International commission on microbiological specifications for
foods
OPS:
Organización panamericana de la salud
UFC:
Unidades formadoras de colonias.
NMP:
Número más probable.
CDC:
Centro para el control y prevención de enfermedades
USDA:
United States department of agriculture
BAM:
Bacteriological analytical manual
BGA:
Brilliant green agar – Agar de verde brillante
SSA:
Salmonella shigela agar
BSA:
Bismuto sulfito agar
LIA:
Lisina and iron agar – Agar hierro y lisina.
TSI:
Triple sugra iron – Agar tres azucares y hierro
65
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72
ANEXOS
ANEXO 1
BROTES DE ETA EN AMÉRICA LATINA SEGÚN
ALIMENTO IMPLICADO
BROTES DE ETA EN AMERICA SEGUN ALIMENTO IMPLICADO
(1995-1999)
Frutas
Hongos
1,3
1,4
Farináceos
1,7
Bebidas
1,7
Postres
Hortalizas-legumbres
2
4,5
Huevo-mayonesa
4,7
Carne de aves
6,3
Otros
Lácteos
Mixtos
Carnes rojas
(FAO, 2002)
Agua
Pescado
Alimentos Identificados
0,6
Porcentaje (%)
0
5
9
9,2
12,6
16,6
28,4
10
15
20
25
30
(FAO, 2002)
73
ANEXO 2
TABLA DE ENFERMEDADES COMUNES TRANSMITIDAS A
TRAVÉS DE LOS ALIMENTOS, CAUSADAS POR BACTERIAS
Enfermedad
Periodo de
(agente causante) Latencia
Síntomas
alimentos
Modo de
Prevención de
Principales
Típicos
Contaminación la Enfermedad
(duración)
(Bacillus cereus)
8-16 hrs.
Diarrea, cólicos, productos
intoxicación
(12-24 hrs.)
vómitos
cárnicos, sopas, polvo
enfriando
ocasionales
salsas,
rápidamente los
vegetales
alimentos
alimentaria,
diarreico
(Bacillus cereus)
1-5 hrs.
Náuseas,
intoxicación
(6-24 hrs.)
vómitos, a veces cocidos
alimentaria,
Arroz y pasta
De la tierra o del Calentando o
De la tierra o del Calentando o
polvo
diarrea y cólicos
enfriando
rápidamente los
emético
alimentos
Botulismo;
12-36 hrs.
Fatiga,
Tipos A y B:
intoxicación
(meses)
debilidad, visión vegetales;
Tipos A y B: de
Calentando o
la tierra o del
enfriando
alimentaria (toxina
doble, habla
frutas; productos polvo; Tipo E:
rápidamente los
de Clostridium
arrastrada,
cárnicos, avícola del agua y
alimentos
botulinum lábil al
insuficiencia
y de pescado;
calor)
respiratoria, a
condimentos;
sedimentos
veces la muerte Tipo E: pescado
Botulismo;
No conocida
Estreñimiento,
Miel, de la tierra Esporas
No se de miel a
intoxicación
debilidad,
ingeridas de la
alimentaria,
insuficiencia
tierra, del polvo, se va a prevenir
los bebés –no
infección infantil
respiratoria, a
o de la miel;
veces la muerte
coloniza el
todo
intestino
Campilobacteriosis
3-5 días
Diarrea, dolores alimentos de
Pollo, leche
Cocinando muy
(Campylobacter
(2-10 días)
abdominales,
cruda (no
bien el pollo;
pasteurizada)
evitar la
jejuni)
origen animal,
fiebre, náuseas, infectados
vómitos
contaminación
cruzada;
irradiando los
pollos;
pasteurizando la
leche
Cholera (Vibrio
2-3 días de
Heces líquidas
Mariscos crudos Heces humanas Cocinando muy
cholera)
horas a días
profusas; a
o mal cocinados en el entorno
veces vómitos,
deshidratación;
marino
bien los
mariscos;
higiene general
si no se trata
74
puede ser
mortal
(Clostridium
8-22 hrs.
Diarrea, cólicos, Pollo y carne de De la tierra ,
Calentando o
perfringens)
(12-24 hrs.)
rara vez
alimentos
enfriando
crudos
rápidamente los
intoxicación
náuseas y
alimentaria
vómitos
res cocidos
alimentos
(Escherichia coli)
12-60 hrs.
Diarrea líquida,
carne de res
Ganado
Cocinando muy
infecciones
(2-9 días)
sanguinolenta
cruda o mal
infectado
bien la carne de
enterohemorrágicas
cocida, leche
res,
transmitidas por los
cruda
pasteurizando la
alimentos
leche
(Escherichia coli)
por lo menos
Cólicos, diarrea, alimentos
Contaminación
Cocinando muy
infecciones
18 hrs.
fiebre, disentería crudos
fecal humana,
bien los
enteroinvasoras
(incierta)
directa o a
alimentos
través del agua
higiene general
transmitidas por los
alimentos
(Escherichia coli)
10-72 hrs.
Diarrea líquida
Contaminación
Cocinando muy
infecciones
(3-5 días)
profusa; a veces crudos
fecal humana,
bien los
cólicos, vómitos
directa o a
alimentos
través del agua
higiene general
enterotoxigénicas
alimentos
transmitidas por los
alimentos
Listeriosis (Listeria
3-70 días
monocytogenes)
Meningo-
Leche, queso y
De la tierra o de Pasteurizando la
encefalitis;
vegetales
animales
leche;
mortinatos;
crudos
infectados,
cocinando los
septicemia o
directamente o
alimentos
meningitis en
por estiércol
neonatos
Salmonelosis
5-72 hrs.
Diarrea, dolores Huevos crudos,
alimentos de
Cocinando muy
(Salmonella
abdominales,
mal cocinados:
origen animal,
bien los huevos,
especies)
escalofríos,
leche, carne y
infectados;
la carne y el
fiebre, vómitos,
pollos crudos
heces humanas pollo;
deshidratación
pasteurizando la
leche; irradiando
los pollos
alimentos
higiene general
Shigelosis (Shigella 12-96 hrs.
Diarrea, fiebre,
alimentos
Contaminación
Higiene general;
especies)
náuseas, a
crudos
fecal humana,
cocinando muy
veces vómitos y
directa o a
bien los
cólicos
través del agua
alimentos
Operarios con
Calentando o
resfríos, dolor
enfriando
(4-7 días)
Intoxicación
1-6 hrs.
Náuseas,
Jamón,
alimentaria por
(6-24 hrs.)
vómitos, diarrea productos
75
estafilococos
cárnicos y
de garganta o
rápidamente los
(enterotoxina de
y cólicos
avícola,
cortadas que
alimentos
Staphylococcus
pastelería
están
aureus estable al
rellena de
infectadas,
calor
crema,
rebanadoras de
mantequilla
carne
batida, queso
Infección por
1-3 días
Diversos,
Leche cruda,
Operarios con ,
Higiene general,
estreptococos
(varía)
incluso dolor de
huevos
dolor de
pasteurizando la
transmitidos por los
garganta,
"endiablados"
garganta y otro
leche
alimentos
erisipela,
tipo de
(Streptococcus
escarlatina
infecciones por
pyogenes)
estreptococos
Infección por Vibrio 12-24 hrs.
Diarrea, cólicos, Pescado y
Entorno marino
Cocinando muy
parahemolyticus
a veces
de la costa
bien el pescado
(4-7 días)
mariscos
transmitidos por los
náuseas,
alimentos
vómitos, fiebre,
y mariscos
dolor de cabeza
Infección por Vibrio En personas
Escalofríos,
Ostiones y
Entorno marino
Cocinando muy
almejas crudas
de la costa
bien los
vulnificus
que tienen alto postración, a
transmitida por los
hierro sérico: 1 menudo la
alimentos
día
muerte
Yersiniosis
3-7 días
Diarrea, dolores carne de res y
Animales
Cocinando muy
(Yersinia
(2-3 semanas)
imitando
puerco cruda o
infectados,
bien la carne,
apendicitis,
mal cocida, tofu
especialmente
clorinando el
fiebre, vómitos,
empacado en
cerdos; aguas
agua
etc.
agua de
contaminadas
enterocolítica)
mariscos
manantial
(Cliver, 1993).
76
ANEXO 3
PROCEDIMIENTO
RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
E. coli
PESADO DE LA MUESTRA
HOMOGENIZADO
DILUCIONES DECIMALES
RECUENTO DE COLIFORMES
SIEMBRA EN PLACAS
77
LECTURA DE PLACAS EMB
TINCIÓN GRAM
PRUEBAS IMVIC
PURIFICACION EN TUBOS PCA
CONFIRMACIÓN BACILOS GRAM (-)
RESULTADOS IMVIC (E. coli positivo)
78
ANEXO 4
PROCEDIMIENTO
IDENTIFICACIÓN DE Salmonella
PESADO
PRE-ENRIQUECIMIENTO
AISLAMIENTO
HOMOGENIZADO
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
PURIFICACIÓN
79
SELECCIÓN
IDENTIFICACIÓN
80
ANEXO 5
(Pascual y Calderón, 2000)
81
ANEXO 6
ESQUEMA DE DETERMINACIÓN DE COLIFORMES
TOTALES, FECALES Y E. coli
82
ANEXO 7
ESQUEMA DE MÉTODO DE DETECCIÓN DE
Salmonella
83
84
85
ANEXO 8
AUTORIZACION DEL MUNICIPIO DE RUMIÑAHUI
PARA LA SELECCIÓN DE LOCALES
86
ANEXO 9
INFORME ENTREGADO AL MUNICIPIO DEL CANTÓN
RUMIÑAHUI
87
88
89
90
91