EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN

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EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE
LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME
DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
Bogotá, D.C.
Junio de 2010
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE
LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME
DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar por el título de
MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
Bogotá, D.C.
Junio 2010
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE
LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME
DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
APROBADO
______________________________
Jorge Cuéllar-Anjel, D.V.M., M.Sc.
Director
___________________________
Janeth del Carmen Arias, M.Sc.
Jurado
EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE
LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei
INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME
DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO
CONDICIONES CONTROLADAS
ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ
APROBADO
______________________________
Ingrid Schuler, Ph.D.
Bióloga
Decano Académico
___________________________
Janeth del Carmen Arias, M.Sc.
Bacterióloga
Directora de Carrera
A Dios, por guiarme y llenarme de infinitas bendiciones.
A mis padres, Orlando Suárez y Elina Gómez,
por su amor incondicional, su esfuerzo y perseverancia
para formarme como persona y profesional integral.
A mi hermosa hermana, Carmen Suárez,
por brindarme todo su cariño y valiosos
consejos en momentos difíciles.
A mi cuñado, Eduardo Jaimes,
por su gran ayuda y colaboración.
A mi sobrinita Isabella, quien con su simpatía y ternura
alegró mis días.
A ellos y a toda mi familia,
por su respaldo y apoyo que hicieron posible
el alcance de mis metas.
AGRADECIMIENTOS
Especialmente al Dr. Jorge Cuéllar-Anjel, por su meritorio compromiso como
Director de Tesis, por su valioso aporte de conocimientos, por su inmensa
colaboración, paciencia y perseverancia en situaciones de dificultad. Por todo el
apoyo brindado con el cual hizo posible la conclusión satisfactoria de ésta
investigación. Además, mis más sinceros agradecimientos por todos los consejos
ofrecidos que ayudaron favorablemente en mi crecimiento como profesional integral.
A CAMACO (Camaronera de Coclé S.A), por financiar y permitir el desarrollo de
este trabajo. A su gerente el Ing. Roberto Chamorro, por su aprobación y su apoyo.
A Mario Aguirre de la empresa Schering Plough – Salud Animal, por ratificar mi
colaboración en la investigación y por su contribución a nuevos avances en
Acuicultura.
A mi compañero y amigo el Ing. Agrónomo Giancarlo Cerrud, por su calidad humana
representada en su enorme ayuda y cooperación, además agradezco el aporte de ideas
y conocimiento que hicieron posible a cabalidad el alcance de los objetivos
propuestos. Al personal de la Sala de Bioensayos de CAMACO S.A., Luis Alfredo
Quezada y Cristian Saenz quienes cooperaron arduamente en las actividades y trabajo
técnico.
A todos los integrantes de UNICAM (Unidad de Investigación del Camarón,
CAMACO S.A.), por su ayuda en gran parte de la realización del presente estudio, en
especial a su Director Darwin Zambrano y a la Licenciada Vielka Pacheco.
vi
A mis nuevos amigos Yuliana Christopher, Thelma Quintero, Edward Villanero
quienes con su afecto se convirtieron en la mejor compañía. Agradezco de corazón a
“Vilo” Ábrego por brindarme su cariño y enseñanzas que hicieron de mi estadía en
Aguadulce, Panamá una valiosa experiencia de vida.
A Janeth Arias, Bacterióloga M.Sc., Directora de las carreras de Microbiología de la
Pontificia Universidad Javeriana, por su respaldo a lo largo de mi carrera lo cual
contribuyó significativamente en mi formación profesional.
Fecha: Junio de 2010
vii
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción………………………………………………………………...
19
2. Marco Teórico………………………………………………………………
21
2.1 Generalidades de los camarones…………………………………………
21
2.1.1 Taxonomía……………………………………………………………….
21
2.1.2 Anatomía general……………………………………………………….
21
2.1.3 Ciclo de vida de los camarones…………………………………………
24
2.2 Sistema de respuesta inmune en camarones…………………………….
27
2.2.1 Inmunidad celular………………………………………………………
27
2.2.1.1 Componentes de la hemolinfa del camarón…………………………
27
2.2.1.2 Funciones de los hemocitos…………………………………………...
30
2.2.1.3 Fagocitosis……………………………………………………………..
31
2.2.1.4 Formación de nódulos………………………………………………...
32
2.2.1.5 Encapsulación…………………………………………………………
32
2.2.1.6 Coagulación……………………………………………………………
32
2.2.1.7 Melanización…………………………………………………………..
33
2.2.2 Inmunidad humoral…………………………………………………….
33
2.2.2.1 Proteínas patrón de reconocimiento…………………………………
34
2.2.2.2 Sistema profenoloxidasa (proPO)……………………………………
34
2.2.2.3 Fases iníciales del sistema proPO…………………………………….
35
2.3 Medición de parámetros inmunológicos en camarones………………...
36
2.4 Bioensayos…………………………………………………………………
37
2.4.1 Control de condiciones en Sala de Bioensayos………………………...
37
2.5 Principales enfermedades en camarones Penaeidos…………………….
38
2.5.1 Virus……………………………………………………………………..
38
2.5.2 Bacterias…………………………………………………………………
39
viii
2.5.3 Hongos…………………………………………………………………...
40
2.5.4 Protozoarios……………………………………………………………..
40
2.5.5 Toxinas…………………………………………………………………..
41
2.5.6 Factores Fisicoquímicos………………………………………………...
41
2.5.7 Etiología idiopática……………………………………………………...
41
2.6 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)……………………..
41
2.7 Inmunoestimulantes………………………………………………………
45
®
2.7.1 Inmunomodulador Comercial (AquaVac. - Ergosan )……………..
47
2.8 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)……………………………
48
3. Formulación del problema y Justificación……………………………….
50
3.1 Formulación del problema……………………………………………….
50
3.2 Justificación……………………………………………………………….
50
4. Objetivos…………………………………………………………………….
53
4.1 General…………………………………………………………………….
53
4.2 Específicos…………………………………………………………………
53
5. Materiales y Métodos………………………………………………………
55
5.1 Descripción del área de trabajo …………………………………………
55
5.2 Población analizada………………………………………………………
55
5.3 Fases experimentales……………………………………………………...
56
5.3.1 Preparación del Material de la Sala de Bioensayos (Fase 1)…………
57
5.3.1.1 Acuarios………………………………………………………………..
57
5.3.1.2 Desinfección de acuarios y tuberías de la Sala………………………
58
5.3.1.3 Tratamiento del agua…………………………………………………
58
5.3.1.4 Pruebas microbiológicas del agua……………………………………
59
5.3.2 Transferencia y Siembra de Animales en los Acuarios (Fase 2)……..
62
5.3.2.1 Control de peso de los camarones……………………………………
63
5.3.2.2 Unidades experimentales……………………………………………..
63
5.3.2.3 Mantenimiento de acuarios………………………………………….
65
5.3.2.4 Condiciones físico – químicas del agua de los acuarios…………….
66
ix
5.3.3 Dieta experimental (Fase 3)…………………………………………….
66
5.3.3.1 Tratamientos experimentales (Diseño de la Investigación)………...
68
5.3.3.2 Alimentación experimental de los camarones……………………….
69
5.3.4 Infección experimental (Fase 4)………………………………………..
71
5.3.4.1 Amplificación de cepas virales purificadas………………………….
71
5.3.4.2 Preparación de la Papilla infectante…………………………………
72
5.3.4.3 Verificación de Papilla mediante nested – PCR…………………….
73
5.3.4.4 Prueba de Virulencia de la Papilla…………………………………..
75
5.3.4.5 Suministro de Papilla infectante……………………………………..
76
5.3.5 Registro de Mortalidad (Fase 5)……………………………………….
77
5.3.5.1 Toma de muestras para pruebas confirmatorias de
laboratorio……………………………………………………………………..
77
5.4 Técnicas confirmatorias de la infección por el virus WSSV…………...
80
5.4.1 Prueba molecular……………………………………………………….
80
5.4.1.1 Extracción de ADN…………………………………………………..
80
5.4.1.2 Nested – PCR…………………………………………………………
82
5.4.1.3 Observación e interpretación de resultados
(nested-PCR)………………………………………………………………….
84
5.4.2 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)……………………….
86
5.4.3 Histopatología…………………………………………………………...
88
5.5 Extracción de Hemolinfa (prueba complementaria)……………………
90
5.5.1 Conteo de Hemocitos (Hemograma)…………………………………...
92
5.6 Análisis de la información………………………………………………..
94
6. Resultados y Discusión…………………………………………………….
95
6.1 Pruebas previas al experimento………………………………………….
95
6.2 Manifestaciones clínicas de la enfermedad en camarones
Infectados……………………………………………………………………… 96
6.3 Pruebas confirmatorias del virus WSSV………………………………...
98
6.3.1 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)……………………….
98
x
6.3.2 Nested – PCR……………………………………………………………. 100
6.3.3 Histopatología…………………………………………………………... 101
6.4 Prueba de desafío mediante infección per os con el virus
WSSV………………………………………………………………………….. 105
6.4.1 Relación de supervivencia entre los tratamientos infectados
con los no infectados……………………………………….............................. 107
6.4.2 Relación de supervivencia entre el tratamiento con la dieta
ERGOSAN® infectado y el Control infectado………………………………
109
6.5 Efecto del Inmunomodulador comercial (ERGOSAN®)
sobre el recuento de hemocitos………………………………………………. 113
6.5.1 Recuento luego de diez días de suministro de dieta
ERGOSAN®…………………………………………………………………..
113
6.5.2 Recuento 20 días después de terminado el suministro
de dieta ERGOSAN®…………………………………………………………
114
6.5.3 Recuento 30 días después del terminado el suministro
de dieta ERGOSAN®…………………………………………………………
116
7. Conclusiones………………………………………………………………... 120
8. Recomendaciones…………………………………………………………..
122
9. Referencias bibliográficas…………………………………………………. 123
10. Anexos……………………………………………………………………... 131
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Taxonomía de camarones penaeidos…………………………………
21
Tabla 2. Funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de
los camarones penaeidos……………………………………………………….
23
Tabla 3. Estadios del ciclo de vida de camarones penaeidos…………………
24
Tabla 4. Funciones de los distintos tipos de células presentes en la
hemolinfa de camarón………………………………………………………….
30
Tabla 5. Proceso de fagocitosis – reacción de defensa celular………………...
31
Tabla 6. Características alimento CAMPENT – TOP…………………………
67
Tabla 7. Diseño experimental………………………………………………….
68
Tabla 8. Diseño experimental – Hemograma………………………………….
69
Tabla 9. Diseño del suministro de papilla infectante………………………….
76
Tabla 10. Volúmenes necesarios para preparar Mix 1………………………...
82
Tabla 11. Programación del termociclador – WSSV………………………….
83
Tabla 12. Hallazgos histopatológicos…………………………………………. 102
Tabla 13. Porcentaje de Mortalidad…………………………………………… 105
Tabla 14. Media de Supervivencia……………………………………………. 108
Tabla 15. Porcentaje de supervivencia por día………………………………... 109
Tabla 16. Porcentaje de supervivencia de cada acuario infectado……………. 111
Tabla 17. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos
10 días de tratamiento con ERGOSAN®……………………………………… 113
Tabla 18. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos
20 días sin ERGOSAN®……………………………………………………….. 114
Tabla 19. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos
30 días sin ERGOSAN®………………………………………………………. 116
Tabla 20. Consolidado de hemogramas………………………………….......... 118
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfología externa de camarones penaeidos……………………...
22
Figura 2. Ciclo de vida más típico de Penaeidae tropical o
subtropical…………………………………………………………………….
26
Figura 3. Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos
asociados………………………………………………………………………
28
Figura 4. Tipo de hemocitos………………………………………………….
30
Figura 5. Respuesta inmunológica inducida en los hemocitos……………….
35
Figura 6. Signos clínicos - enfermedad IMNV………………………………
39
Figura 7. Infección por bacterias en camarón peneido - manchas negras
en la cutícula………………………………………………………………….
39
Figura 8. Lesiones melanizadas causadas por Fusarium solani en camarón
Penaeus sp…………………………………………………………………….
40
Figura 9. Caparazón de un juvenil de P. monodon con enfermedad
de la mancha blanca (WSSV)………………………………………………..
43
Figura 10. Cuatro juveniles de P. monodon mostrando signos de
infección por Virus de la Mancha Blanca (WSSV)…………………………...
44
Figura 11. Presentación del producto comercial AquaVac. –
ERGOSAN®………………………………………………………………….
47
Figura 12. Vista frontal de la “Casa de Don Popo” – Sala de
Bioensayos…………………………………………………………………….
55
Figura 13. Disposición de acuarios en Sala de Infección……………………
57
Figura 14. Recepción de agua marina………………………………………..
59
Figura 15. Microbiología de aguas…………………………………………..
60
Figura 16. Esquema descriptivo del proceso de dilución y siembra
de muestras de agua marina…………………………………………………..
61
Figura 17. Proceso de transferencia de camarones a los acuarios…………..
62
Figura 18. Unidades experimentales…………………………………………
64
Figura 19. Acuarios con camarones para extracción de hemolinfa
64
xiii
y conteo de hemocitos………………………………………………………...
Figura 20. Mantenimiento de acuarios……………………………………….
65
Figura 21. pHmetro y medición de pH en el agua de los acuarios…………...
66
Figura 22. Dietas experimentales…………………………………………….
67
Figura 23. Alimentación de los camarones en cada uno de los acuarios…….
70
Figura 24. Inoculación del virus WSSV en camarones sanos………………..
71
Figura 25. Preparación de papilla infectante…………………………………
73
Figura 26. Esquema descriptivo para evaluación semicuantitativa
de la papilla infectante………………………………………………………..
74
Figura 27. Suministro de papilla infectante a acuarios………………………
76
Figura 28. Recolección y registro de animales moribundos…………………
77
Figura 29. Proceso de toma de muestras de camarones moribundos………...
79
Figura 30. Extracción de ADN viral…………………………………………
81
Figura 31. Técnica de Nested – PCR………………………………………..
84
Figura 32. Observación e interpretación de resultados de la nested –
PCR…………………………………………………………………………..
85
Figura 33. Shrimple® diagnostic test kit procedure diagram and
potencial test results………………………………………………………….
86
Figura 34. Procesamiento de muestras para técnica de histopatología………
88
Figura 35. Observación de resultados de prueba Histopatologíca…………...
90
Figura 36. Proceso realizado para la extracción de hemolinfa
en camarones………………………………………………………………….
91
Figura 37. Comparación entre los signos clínicos presentados por
un camarón infectado a diferencia de un camarón sano……………………….
97
Figura 38. Manchas blancas en cutícula de camarón L. vannamei…………..
98
Figura 39. Resultados positivos para el virus WSSV mediante la
Prueba de Shrimple®………………………………………………………….
99
Figura 40. Electroforesis en gel de agarosa con resultados positivos
de la amplificación del ADN viral mediante nested-PCR…………………….
xiv
101
Figura 41. Microfotografía de tejido conectivo afectado por la infección
del virus WSSV……………………………………………………………….
103
Figura 42. Microfotografía de láminas histológicas observadas
bajo el microscopio (600X)…………………………………………………...
104
Figura 43. Gráfico – Curva de mortalidad…………………………………...
106
Figura 44. Gráfico - diferencia entre el porcentaje de supervivencia
de los tratamientos infectados con los no infectados………………………….
108
Figura 45. Gráfico – Curva de supervivencia………………………………...
110
Figura 46. Gráfico - Tendencia de las poblaciones sobrevivientes
por cada uno de los acuarios…………………………………………………..
112
Figura 47. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para
el recuento de hemocitos luego de diez días de suministro de la
dieta a base de ERGOSAN ®………………………………………………….
114
Figura 48. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para
el recuento de hemocitos luego de 20 días de haber culminado el
suministro de la dieta a base de
ERGOSAN®…………………………………………………………………… 115
Figura 49. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para
el recuento de hemocitos luego de 30 días de haber culminado el
suministro de la dieta a base de ERGOSAN ®…………………………………. 117
Figura 50. Gráfico – Consolidado de hemogramas ERGOSAN® vs.
Control………………………………………………………………………… 119
xv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. PCR – WSSV, IHHNV, NHP…………………………………….
131
Anexo 2. Medios de cultivo…………………………………………………
131
Anexo 3. Etiqueta alimento “CAMPENT-TOP”……………………………
134
®
Anexo 4. Etiqueta producto comercial ERGOSAN ……………………….
135
Anexo 5. PCR – Papilla infectante………………………………………….
136
Anexo 6. Resultados para prueba de virulencia de la papilla
infectante……………………………………………………………………
137
Anexo 7. Registro de mortalidad……………………………………………
138
Anexo 8. Registro de toma de muestras……………………………………..
144
®
Anexo 9. Shrimple - Manual Kit EnBioTec……………………………….
145
Anexo 10. Recuento microbiológico del agua de las unidades
experimentales………………………………………………………………
151
Anexo 11. Registro de resultados para Pruebas de Shrimple ®………………
152
Anexo 12. Registro de resultados para técnica Nested – PCR………………
153
Anexo 13. Registro lectura de láminas histopatológicas…………………….
154
Anexo 14. ANOVA y Duncan entre los cuatro tratamientos………………..
155
Anexo 15. ANOVA y Duncan para tratamientos infectados………………..
156
Anexo 16. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos luego de 10 días
con ERGOSAN®…………………………………………………………….
157
Anexo 17. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 20 días
después de haber suspendido ERGOSAN®…………………………………
160
Anexo 18. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 30 días
después de haber suspendido ERGOSAN®…………………………………
xvi
163
Resumen
Este estudio se llevo a cabo en la Sala de infecciones experimentales de la
Camaronera de Coclé S.A. ubicada en la Hacienda La Estrella, Distrito de Natá,
Provincia de Coclé, República de Panamá. Uno de los mayores problemas a los que
se enfrenta la industria camaronera es a la creciente presencia de enfermedades
infecciosas causadas principalmente por virus, generando altas tasas de mortalidad y
graves pérdidas en el sector. Por lo antes postulado, el objeto de este experimento fue
evaluar la capacidad del producto comercial ERGOSAN ® en el fortalecimiento de
sistema natural de defensa y así mismo en la reducción del índice de mortalidad del
camarón blanco (L. vannamei) frente a la infección per os del Virus del Síndrome de
la Mancha Blanca (WSSV). La fase experimental se desarrolló en 40 acuarios y el
suministro de las dietas (dieta ERGOSAN® y dieta BASE – Control) se hizo dos
veces diarias durante diez días continuos. El día 11 se llevo a cabo la infección vía
oral con el virus WSSV, continuando del día 2 en adelante con la dieta control (sin
ERGOSAN®) en todos los tratamientos. Posterior a la infección se realizó un registro
de mortalidad y se tomaron muestras para la confirmación del virus mediante
inmunocromatografía, Nested – PCR e histopatología. El grupo con ERGOSAN ®
presento una supervivencia del 11% mientras que el Control obtuvo un 6%, sin que se
presentaran diferencias significativas entre los tratamientos (P < 0.05). El hemograma
presentó diferencias significativas (P < 0.06) luego de diez días con ERGOSAN®, en
cuanto a las células semigranulares y totales a favor del Control. El recuento de
hemocitos, tanto diferencial como el total, tuvo una tendencia positiva en favor de
ERGOSAN® 20 días después de terminar el suministro del producto
inmunomodulador. Luego de transcurridos 30 días de haber suspendido el producto,
el hemograma retomo valores similares entre los valores obtenidos para el producto
como para el Control. Se concluye que incorporar ERGOSAN® en el alimento para
camarones y suministrarlo por 10 días antes de una infección con WSSV, podría
ayudar a mejorar la supervivencia de las poblaciones expuestas al virus. No es clara la
causa del incremento del hemograma tras 20 días de terminado el tratamiento con
ERGOSAN®, pero se puede considerar como un efecto tardío favorable del producto,
lo cual amerita un estudio dirigido más completo. Se recomienda realizar pruebas con
concentraciones mayores de ERGOSAN®, con el fin de lograr un menor impacto del
virus WSSV y por ende una mejor supervivencia de los camarones.
Abstract
This study was carried out in the experimental infections room of the Shrimp Factory
Coclé Inc., located in the estate “La Estrella”, Natá District, Province of Coclé, in the
Republic of Panama. One of the major problems facing for the shrimp industry is the
growing presence of infectious diseases mainly caused by viruses, generating high
mortality rates and huge losses in the sector. By the above, the object of this
experiment was to assess the ability of the commercial product called ERGOSAN ® in
the strengthening of natural defense system and also in the reduction of the mortality
rate of white shrimp (L. vatmamei) compared to per os infection of the White Spot
Syndrome Virus (WSSV). The pilot phase was developed in 40 aquariums and the
supply of the diets (ERGOSAN® diet and BASIC diet - Control) was twice daily for
10 days consecutives. The 11th day was carried out the infection orally with the
WSSV virus, continuing from the day 2 at forward with the control diet (without
ERGOSAN®) in all treatments. After the infection it was carried out a record of
mortality and samples were taken to the confirmation of the virus by
immunochromatography, Nested - PCR and histopathology. The group with
ERGOSAN®displayed a survival from 11 percent while the Control obtained a 6
percent, without significant differences were presented between the treatments (P <
0.05). The hemogram presented significant differences (P < 0.06) after 10 days with
ERGOSAN®, with regard to both the semigranulated and total cells in favour of the
control. The counting of haemocytes, both differential as total, had a positive trend in
favour of ERGOSAN® 20 days after the end of the supply of the immunomodulating
product. Thirty days after of suspending the product, the hemogram returns to similar
values between the values obtained for the product as for the control. It concludes that
incorporate ERGOSAN® in the shrimp feed and supply it by 10 days before an
infection with WSSV, could help to improve the survival of the people exposed to the
virus. It is not clear the cause of the increases of the hemogram 20 days after of
ending the treatment with ERGOSAN®, but it can be considered as a positive late
effect of the product, which warrants a guided study more comprehensive. It
recommends make tests with higher concentrations of ERGOSAN ®, in order to
achieve a lesser impact of the WSSV virus and hence a better survival of the shrimp.
1. INTRODUCCIÓN
La Acuicultura en los últimos años ha tenido grandes avances y se ha convertido en
una de las más importantes áreas comerciales. La contribución de la acuicultura al
suministro mundial, con base en datos arrojados por la F.A.O, en los tres últimos
decenios, la acuicultura ha crecido con rapidez a nivel global. En la década de 1970,
suponía alrededor del 6 % del pescado disponible para el consumo humano; en 2006,
esta cifra era del 47 %. En América Latina, la producción estimada en millones de
toneladas fue de 0,07 en 1985, luego aumento a 0,41 en 1995 y en el 2005 alcanzó un
total de 1,37. En cuanto a la camaronicultura, se estima que la producción mundial
del camarón fue de 4,00 millones de toneladas en el año 2005. Donde la variación
anual fue de un 13, 8 % entre los años 1995 al 2005. (F.A.O. – Estado Mundial de la
Pesca y la Acuicultura, 2008)
En la República de Panamá se cultivan especialmente dos especies de camarón
Litopenaeus vannamei y L. strylirostris. La principal provincia de Panamá dedicada
al cultivo de camarón es Coclé, seguida por Herrera, Panamá, Veraguas y Los Santos
(Dirección de estadística y Censo de la Contraloría General de la República de
Panamá, 2007)
A partir de los esfuerzos que se han hecho en los últimos años, se ha logrado
incrementar la producción en Panamá. Sin embargo, su desarrollo ha presentado una
serie de problemas relacionados con el crecimiento y la supervivencia en condiciones
de cultivo, generados a partir de la presencia de microorganismos patógenos para la
especie, como virus, bacterias, Protozoos y Hongos. En la actualidad la principal
amenaza para el desarrollo de la industria camaronera son las enfermedades
infecciosas especialmente las causadas por virus.
Dentro de los agentes etiológicos reconocidos en el cultivo del camarón, los virus han
generado las mayores catástrofes económicas para las camaroneras en el ámbito
19
mundial. Durante los 90´s emergió una de las mayores panzootias en camarones,
causada por el virus de síndrome de la mancha blanca (White Spot Syndrome Virus –
WSSV) en áreas costeras del Sudeste y Norte de Asia, Centro y Sur América. El virus
se ha vuelto endémico en América Central y del Sur, principalmente en Ecuador,
Panamá, Colombia y Perú. En la actualidad impacta severamente la producción y ha
contribuido a la disminución, en corto tiempo, de la producción de camarón en estos
países.
El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) posee una presencia permanente
en el medio ambiente de las zonas afectadas. Esto indica que la aparición o no de la
enfermedad puede estar relacionada con el estado inmunitario de los camarones, la
resistencia genética, las condiciones generales del medio ambiente y manejo que se le
da al cultivo. Por tal razón, la mejor manera de prevenir brotes de la enfermedad es
mantener el cultivo en condiciones ambientales estables, exponiéndolos al menor
grado de estrés.
Se ha descubierto que durante los brotes de mancha blanca, se da un descenso
dramático en las defensas de los camarones y a la disminución en el conteo de
hemocitos circulantes totales. Se estima que en el camarón las reacciones de
resistencia a patógenos están basadas en el número de hemocitos circulantes en la
hemolinfa. Por tal razón, en la actualidad la inmunoestimulación es una alternativa
efectiva para manipular la respuesta inmune del camarón antes de que estos se
enfrenten a desafíos de patógenos en el cultivo.
A partir de lo anteriormente postulado este proyecto tendrá como fin evaluar la
capacidad que tiene el producto comercial ERGOSAN ® en la proliferación de
hemocitos y así mismo en la reducción del índice de mortalidad de camarones (L.
vannamei) frente a la infección per os con el virus WSSV.
20
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades de los camarones
2.1.1 Taxonomía
La ubicación taxonómica de los camarones penaeidos es la siguiente:
Tabla 1: Taxonomía de camarones penaeidos
Phylum:
Arthropoda
Clase:
Crustacea
Subclase:
Malacostraca
Serie:
Eumalacostraca
Superorden:
Eucarida
Orden:
Decápoda
Suborden:
Natantia
Sección:
Penaeidae
Familia:
Penaeidae
Subfamilia:
Penaeinae
Género:
Penaeus (Litopenaeus)
Especie:
vannamei
Adaptado de Rodríguez, 1993. En: Gómez, D. y Fajardo, D.
2003
2.1.2 Anatomía general
El camarón blanco Litopenaeus vannamei es un invertebrado marino. Posee un tronco
compuesto por 14 segmentos más el telson, de los cuales los 8 primeros forman el
tórax y los últimos 6 el abdomen. Los apéndices abdominales anteriores se llaman
pleópodos y son utilizados para nadar, mientras que los apéndices del tórax, llamados
periópodos son usados para caminar.
21
El cuerpo de los camarones presenta un abdomen y cefalotórax definido. El
cefalotórax posee un rostro aserrado. Tienen un exoesqueleto conformado por quitina
que suele ser delgado y flexible. Presenta una boca en posición ventral. (Figura 1)
El aparato digestivo se ensancha a lo largo del dorso, para formar el hepatopáncreas o
glándula digestiva que es un órgano vital involucrado en la digestión del alimento,
absorción y almacenamiento de nutrientes. El cordón nervioso se extiende a lo largo
del vientre. Sus órganos excretores son las glándulas antenales o verdes que lanzan al
medio sustancias de desecho. El sistema circulatorio es abierto y compuesto por vasos
sanguíneos que transportan la hemolinfa la cual posee cobre y acarrea el oxígeno, por
lo que desarrolla un color azuloso. El oxígeno y el dióxido de carbono son
transportados desde y hasta las branquias, que es donde se realiza el intercambio
gaseoso (Ruppert, E. E. y Barnes, R. D. 1996)
Figura 1: Morfología externa de camarones penaeidos. (En: Suárez, C. 2008)
En la siguiente tabla se resume las funciones fisiológicas de los principales órganos y
estructuras de los camarones penaeidos:
22
Tabla 2: Funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de los
camarones penaeidos
Órgano/Estructura
Función principal
Músculo estriado abdominal (cola
Movimientos rápidos de huida hacia
o abdomen del camarón)
atrás contra predadores
Antenas
Sensores táctiles (detección de
predadores)
Complejo glándula antenal
Excreción y balance osmótico
Anténulas
Quimiorrecepción
Ciegos anterior y posterior
Desconocida
Exoesqueleto
Soporte externo, barrera de defensa.
Intestino anterior (boca, esófago,
Captación, masticación y
estómago)
almacenamiento temporal de
alimento
Branquias
Respiración, excreción,
osmorregulación y fagocitosis.
Hepatopáncreas
Digestión del alimento, absorción
posterior de nutrientes y
almacenamiento de energía
Órgano linfoide
Posible reconocimiento de antígenos
y fagocitosis
23
Mandíbulas, palpos mandibulares
Sensores táctiles, captura de
y paquetes branquiales
partículas de alimento y movimiento
de agua hacia las branquias
Intestino medio
Absorción y excreción
Pereiópodos y pleópodos
Locomoción y quimiorrecepción
Adaptado de Brock y Main, 1994. En: Cuéllar-Anjel, J. et al. 1998
2.1.3 Ciclo de vida de los camarones
Los camarones penaeidos desovan en mar abierto. Las larvas a medida que avanzan
en su desarrollo se acercan a la costa, donde alcanzan la forma de postlarva. Éstas
generalmente penetran en aguas estuarinas, donde continúan su desarrollo
rápidamente a juveniles hasta llegar a veces al estado de subadulto y, finalmente,
cuando son camarones adultos, (Figura 2) regresan al mar abierto a desovar
(Mendoza, F. E. 2007).
Tabla 3: Estadios del ciclo de vida de camarones penaeidos
Huevo
El desove de la hembra ocurre
generalmente durante la noche y
cada hembra produce
aproximadamente 150.000
huevos cada 15 días, los cuales
deben mantenerse en aireación
constante y temperatura entre 26
y 28°C. La eclosión de los
huevos sucede a las 12 a 15 horas
post-cópula.
24
Larva
Este estadio se divide en tres
subestadios: nauplio (cuerpo
piriforme con sólo tres pares de
apéndices natatorios, se alimenta
de reservas vitelinas propias),
protozoea o zoea (se alimenta de
algas y microencapsulados, tiene
el cuerpo dividido en cefalotórax
y abdomen) y mysis (comienza a
ser carnívora, consume nauplios
de artemia, desarrolla
pereiópodos para su
desplazamiento).
Postlarva
En este estadio el animal presenta
hábitos nadadores y tendencia
bentónica. A partir de postlarva
10, empieza a ser comercializada.
Juvenil
En su ambiente natural según las
especies y regiones, llegan a
juvenil luego de 4 o 5 meses con
una longitud de entre 7 y 10
centímetros. Posteriormente, se
alejan de las zonas de crianza e
ingresan a mar abierto para
reproducirse, en la región de
aguas más profundas, donde
habitan unos meses más.
25
Adulto
Se da cuando el camarón logra un
peso de 20 gramos alcanzando
su madures sexual cuando tiene
un peso promedio de 25 a 30
gramos. El apareamiento se da en
aguas profundas, en esta misma
zona la hembra desova durante la
noche.
Adaptado de Carvajal, A. M. 1999.
El camarón blanco presenta los siguientes estadios en su ciclo de vida:
Figura 2: Ciclo de vida más típico de Penaeidae tropical o subtropical (Boschi, E. E. 1980)
26
2.2 Sistema de respuesta inmune en camarones
El mecanismo innato de defensa de los artrópodos está basado en la inmunidad
humoral y celular (Muñoz, M. et al., 2000); éstos, juegan un papel importante en la
detección y eliminación de microorganismos y parásitos potencialmente dañinos. Se
puede dividir la respuesta inmune de los artrópodos en diferentes fases:
- Reconocimiento de factores ajenos e inicio de actividad inmunológica
- Actividad celular y síntesis de efectores inmunitarios
- Actividad humoral del sistema inmune
La capacidad que tienen los camarones para reconocer y destruir invasores, está
basada en los componentes de la inmunidad celular y humoral del sistema circulatorio
y son expresados en varias respuestas inmunes (Vergara, F. 1999).
2.2.1 Inmunidad celular
Consiste en la activación de una gran cantidad de hemocitos, que tienen la capacidad
especial de fijarse al agente extraño y destruirlo.
2.2.1.1 Componentes de la hemolinfa del camarón
Para protegerse a sí mismos de la invasión por parte de agentes patógenos, los
camarones no generan inmunoglobulinas, pero sí moléculas efectoras que están
involucradas en la respuesta inmune. Teniendo un sistema circulatorio abierto con
fluido hemolinfático (Figura 3), los camarones poseen un inmediato, mas no
inducible, mecanismo de defensa y coagulación, para atrapar parásitos y prevenir la
pérdida de hemolinfa por una herida (Vergara, F. 1999). Estas reacciones son
realizadas por las células de la hemolinfa, las cuales son producidas por el tejido
hematopoyético.
27
Figura 3. Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos asociados. C: corazón; HP:
hepatopáncreas; OHA: órgano hematopoyético antenal; OHD: órgano hematopoyético dorsal; OHV:
órgano hematopoyético ventral; VD: vaso dorsal (Adaptado de Bachere et al., 2004; En: Morales, V. y
Cuéllar-Anjel, J. 2008)
En la hemolinfa son transportados continuamente nutrientes, excretas, oxígeno,
hormonas y otras moléculas importantes para los diferentes órganos de esos animales.
Debido a su fluidez y por la capacidad de llegar directamente a todos los tejidos de
los crustáceos, la hemolinfa contiene además todos los componentes del sistema
inmunológico.
La hemolinfa está compuesta por una fracción celular, representada por las células
circulantes o hemocitos y por una fracción líquida constituida por el plasma que
contiene diferentes factores humorales.
Las
respuestas
inmunocelulares
e
inmunohumorales actúan de forma integrada en los crustáceos, protegiéndolos contra
la invasión de microorganismos y parásitos, garantizando así su integridad corporal y
homeostática (Barraco, M. y Perazzolo L. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008)
En la mayoría de los decápodos, se han usado criterios morfológicos asociados con
ensayos bioquímicos para identificar y clasificar los diferentes tipos de hemocitos. En
el camarón se han reportado tres tipos de hemocitos distintos (Johansson, M. et al.
2000):
28
a) Células hialinas (HC): 80% de la hemolinfa. Son pequeñas con un núcleo grande
y muy poco citoplasma.
b) Células semigranulares (SGC): 10-13% de la hemolinfa. Más grandes que las
hialinas, con presencia de algunos gránulos, sus núcleos son proporcionalmente más
pequeños.
c) Células granulares (LGC): 4-10% de la hemolinfa. Son más grandes que las
semigranulares y por su gran contenido de gránulos, son más refringentes bajo el
microscopio (Le Moullac, G. et al. 1997). (Figura 4)
Las células hialinas y las semigranulares son capaces de fagocitar sustancias extrañas,
pero difieren por la presencia del sistema profenoloxidasa (proPO). Los hemocitos
semigranulares y granulares son poseedores del sistema proPO, también pueden ser
citotóxicos y causar lisis en células eucariotas, similar a la acción de las “natural
killer” en mamíferos.
Las células hialinas se mantienen listas para atacar y desplegarse extensamente para
fagocitar. Las células semigranulares son inestables, están encargadas de reconocer y
responder ante células invasoras para luego atacar desplegándose en la superficie del
invasor. Se ha observado que estas células son las únicas que reaccionan ante los
polisacáridos microbiales como los lipopolisacáridos (LPS) y β-1,3 glucanos, con una
respuesta de degranulación.
Las semigranulares son las principales células que
intervienen en la reacción de encapsulación. Se ha observado que las células
granulares son las responsables de la activación del sistema proPO (Johansson, M. et
al. 2000).
29
Figura 4. Tipos de hemocitos (A – F) y reacciones celulares de defensa en curstaceos (G – J). A, D:
hemocitos hialinos (HHs) de camarones observado al microscopio de contraste de fase y electrónico de
transición, respectivamente; B, E: hemocitos con granulos pequeños (HGPs); C, F: hemocitos con
granulos grandes (HGGs). G: fagocitosis de un levadura por un hemocito de L. vannamei; H:
encapsulamiento in vitro de nematodo Panagrellus redivirus por hemocitos de Macrobrachium
rosenbergii; I: encapsulamiento in vitro de hifas del hongo Ganoderma sp. por hemocitos de
Farfantepenaeus pulensis, con fuerte reacción de melanización; J: nódulo hemocítico en el
hepatopáncreas de L. vannamei con agregados bacterianos en el centro. (Reproducido de Covarrubias,
2004; En: Morales, V. y Cuéllar–Anjel, J. 2008)
2.2.1.2 Funciones de los hemocitos
Tabla 4: Funciones de los distintos tipos de células presentes en la hemolinfa de
camarón
Tipo de hemocito
Función en inmunidad
Células hialinas
Fagocitosis
30
Células
Encapsulación
semigranulares
Fagocitosis (limitada)
Almacenamiento y liberación del sistema proPO
Citotoxicidad
Células
Almacenamiento y liberación del sistema proPO
granulares
Citotoxicidad
Adaptado de Johansson, M. et al. 2000.
2.2.1.3 Fagocitosis
Una vez que el parásito ha superado la barrera fisicoquímica de la cutícula, la
fagocitosis constituye, junto con los componentes humorales, la primera línea de
defensa, siendo la más común de las reacciones de defensa celular (Carvajal, A. M.
1999; Vergara, F. 1999)
La quimiotaxis se considera comúnmente como el primero, entre varios eventos, que
dirigen una partícula extraña a la fagocitosis. En los artrópodos, las células de la
hemolinfa viajan por todo el cuerpo, proporcionando una amplia oportunidad para
encontrarse con los invasores y contrarrestar eventos infecciosos (Carvajal, A. M.
1999)
El proceso de la fagocitosis está dividido en las siguientes etapas:
Tabla 5: Proceso de fagocitosis – reacción de defensa celular
Aumento de la capacidad de
Opsonización
expresión de partículas foráneas.
Identificación de la partícula por
Reconocimiento
receptores de membrana.
31
Fagocitosis
Ingestión de la partícula.
Formación de fagosomas
El fagosoma es una vacuola y está
compuesto por la partícula extraña
rodeada de una envoltura, la cual
es parte de la membrana celular
del fagocito.
La partícula extraña es destruida
Destrucción y digestión
por las enzimas del fagolisosoma
y/o por un mecanismo bioquímico
conocido como choque
respiratorio.
Adaptado de Vergara F. 1999.
2.2.1.4 Formación de nódulos
Cuando la cavidad corporal es invadida por un número de microorganismos que no
pueden ser fagocitados, se presenta un agrupamiento de hemocitos que los envuelve
inmovilizándolos e impidiendo su diseminación. Se cree que los túbulos del
hepatopáncreas y las branquias son los lugares de alojamiento de los agentes extraños
eliminados (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992)
2.2.1.5 Encapsulación
Tiene el mismo principio que la formación de nódulos. La diferencia se encuentra en
que este proceso ocurre como respuesta a parásitos más grandes (Vergara, F. 1999).
2.2.1.6 Coagulación
Debido a que los artrópodos poseen un sistema circulatorio abierto, las heridas deben
ser cerradas rápidamente para prevenir la salida de grandes cantidades de hemolinfa y
la entrada de agentes patógenos (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992). Al entrar una
32
bacteria a la cavidad corporal, induce la liberación exocitotóxica de la cascada de la
coagulación dentro del plasma. Los LPS inducen, a la vez, la activación de la cascada
de la coagulación, que comprende la cascada de serino proteasas y la proteína
coagulable o cuagulógeno (Vergara, F. 1999).
2.2.1.7 Melanización
Es iniciada por la lisis de los hemocitos cerca de la superficie del parásito, seguido
por una deposición de sustancias melanoides en el área que sufrió la lisis y en la
membrana del parásito. La melanina y la esclerotina son consideradas materiales de
melanización en la respuesta inmune del camarón (Vergara, F. 1999).
Durante la formación de la melanina, se liberan metabolitos tóxicos con actividad
fungicida. La melanina y sus compuestos son altamente reactivos y están
involucrados en la prevención del crecimiento de microorganismos, inhibiendo las
proteasas y las quinasas extracelulares (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992).
2.2.2 Inmunidad humoral
Es realizada por moléculas efectoras y no por células hemolinfáticas. Resulta de
procesos generales, más que de procesos dirigidos contra organismos patógenos
específicos. Este evento incluye:
a) Resistencia de la cutícula a la invasión por parte de microorganismos.
b) Presencia de moléculas efectoras en la hemolinfa que se unen a los
microorganismos, como las proteínas de reconocimiento de microorganismos
patógenos (BG-BP y LPS-BP) (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
La primera línea de defensa entre el camarón y el medio ambiente es la cutícula,
dentro de la cual se presentan laceraciones e infecciones microbianas, que incluyen la
inhibición de la degradación de la cutícula mediante inhibidores de proteinasas,
melanización de la cutícula y síntesis de novo de moléculas antibacterianas en el
integumento (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
33
Cuando partículas extrañas penetran la cutícula del camarón hasta llegar a la cavidad
corporal, se activa un eficiente y rápido proceso de defensa en el animal: El sistema
de activación de la profenoloxidasa (sistema proPO). Lo que se puede observar
durante este proceso, es la formación de melanina, un pigmento oscuro que se
acumula alrededor de las heridas, o encapsulando e invadiendo los microorganismos
para evitar su diseminación a otros tejidos del cuerpo (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
2.2.2.1 Proteínas patrón de reconocimiento
Los artrópodos no poseen una respuesta inmune adaptativa con inmunoglobulinas.
Este mecanismo de defensa es iniciado por el reconocimiento de factores que son
liberados o están presentes en la superficie de los microorganismos o parásitos. Las
proteínas que reconocen estos factores son denominadas proteínas patrón de
reconocimiento (PRP) (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
Las PRP son macromoléculas utilizadas para el reconocimiento de los determinantes
microbianos que son liberados por el patógeno, o que se encuentran sobre su
superficie para iniciar ciertas respuestas inmunes. Estas macromoléculas son de gran
importancia para iniciar una respuesta en contra de la infección; pueden iniciar la
actividad del sistema proPO que es el principal sistema de defensa en los artrópodos,
o también pueden actuar directamente como opsoninas o aglutininas (Vergara, F.
1999).
2.2.2.2 Sistema profenoloxidasa (proPO)
A través de heridas o alimentos contaminados, pueden ingresar microbios y parásitos
al sistema del artrópodo y algunos hongos pueden penetrar la cutícula (quitina y
Calcio) por medio del uso de quitinasas u otros mecanismos. La respuesta se puede
observar como manchas oscuras en la cutícula de los animales afectados.
La fenoloxidasa (PO) es el último componente de activación en el sistema proPO,
siendo la responsable también de la reacción de melanización (Söderhäll, K. y
Cerenius, L. 1992). El sistema proPO puede ser activado por lipopolisacáridos y
peptidoglicanos.
34
2.2.2.3 Fases iníciales del sistema proPO
El sistema proPO puede activarse por acción de polisacáridos microbiales; las
proteínas recubren en primer lugar los carbohidratos y luego inician la activación del
sistema, pero los detalles bioquímicos de este proceso son poco conocidos (Söderhäll,
K. y Cerenius, L. 1992).
Figura 5. Respuesta inmunológica inducida en los hemocitos, después del reconocimiento del
patógeno, vía PRPs plasmática o celulares y subsecuente activación (1) degranulación, con liberación
de diferentes inmunoefectores e inmoreguladores; (2) inducción y/o represión de genes inmunológicos;
(3) activación de respuestas celulares como fagocitosis y formación de nódulos y cápsulas. (Imagen
tomada a partir de la publicación de Morales, V. y Cuéllar – Anjel, J. 2008)
Cuando se hallan presentes los polisacáridos o β-1,3 glucanos, la degranulación o
exocitosis de los hemocitos (granulares y semigranulares) produce la liberación del
sistema proPO, que comienza aquí su activación (Carvajal, A. M. 1999).
Las
proteínas se unen primero a estos carbohidratos para luego comenzar la activación,
provocando la formación de melanina en la superficie afectada por el patógeno
(Vergara, F. 1999). En los gránulos secretores de los hemocitos granulares y
semigranulares, se encuentran almacenadas la proPO y la ppA. Estos gránulos son
liberados en el proceso de degranulación celular luego de una estimulación con
antígenos.
35
Los mecanismos encargados de activar el sistema proPO son aquellos que estimulan
las diferentes reacciones de defensa celular: a) fagocitosis, b) formación de nódulos,
c) encapsulación y d) quimiotaxis de los hemocitos.
2.3 Medición de parámetros inmunológicos en camarones
La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite evaluar
y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo de animales
o de una población en un sistema comercial de cultivo. Estos parámetros están
relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a la
invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que
entran en contacto con los animales. Los principales parámetros inmunes de los
camarones que se pueden medir son: hemograma, concentración de proteínas
plasmáticas, capacidad de hemoaglutinación, actividad de la fenoloxidasa, capacidad
antibacteriana del plasma, entre otros. (Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
El hemograma consiste en realizar un conteo total o diferencial de los hemocitos de la
hemolinfa, para establecer una relación entre los valores obtenidos y las condiciones
de salud de los camarones examinados (o de sus poblaciones de origen). (Morales V.
y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
En investigaciones realizadas se han tenido conteos totales de hemocitos que van
desde 21.000/mm3 (con citómetro de flujo) a 23.300 (con hematocitómetro) en
camarones sanos (Owens, L. y O’Neill, A. 1997).
Para realizar el conteo de hemocitos generalmente se extrae hemolinfa, del seno
ventral de los camarones con una jeringa de 1 mL, la cual contiene anticoagulante en
igual volumen al de la hemolinfa extraída. El anticoagulante puede ser solución de
Alsever modificada con 10% de formol, cuando se requiere hacer fijación y
preservación de los hemocitos (Le Moullac, G. y Haffner, P. 2000)
36
2.4 Bioensayos
Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este caso,
durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones de
una población determinada, utilizando como organismos “blanco” camarones sanos y
susceptibles a dicha enfermedad. Éstos pueden ser “libres de patógenos específicos”
(SPF por sus siglas en inglés) o simplemente libres de la enfermedad que se pretende
reproducir. (Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
El objeto de los bioensayos es determinar si el agente causal de una enfermedad es de
origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.) tóxico (toxinas químicas o
biológicas), o descartando lo anterior, de origen ambiental o por manejo. También se
utilizan los bioensayos para evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana
inyectada o suministrada vía oral a camarones libres de dichos agentes patógenos.
(Morales, V y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.4.1 Control de condiciones en Sala de Bioensayos
El control de la calidad del agua (parámetros físico - químicos y nutrientes) del
estanque y el conocimiento de los límites de tolerancia de las especies son
requerimientos indispensables en todo el sistema de cultivo, e influyen decisivamente
en el éxito o fracaso de ésta actividad productiva (Spotte, S. 1970; Kinne, O. 1976).
Los factores físico-químicos directa o indirectamente afectan a los animales a través
del impacto que tienen sobre el crecimiento y consumo de alimento. Es importante
reconocer que estos factores están relacionados entre sí, y que cuando están bien
balanceados, pueden contribuir significativamente a un ecosistema de componentes
bióticos y abióticos con un buen funcionamiento. El monitoreo diario y cuidadoso de
parámetros como la temperatura, pH, OD, entre otros permite anticipar problemas
potenciales y evitar la aparición de condiciones estresantes que pueden afectar
seriamente el rendimiento optimo. (S.A.D.P.A. 2006; Rodríguez, H. 1993)
37
Estudios previos realizados en el análisis de los parámetros que influyen en la
infección del WSSV indican que la temperatura del agua (32 – 33°C) reduce la
mortalidad de los camarones infectados por el virus. (Rahman, M. M. y Escobedo –
Bonilla, C. M. 2006). En este contexto, la temperatura del agua está considerada
como uno de los factores ambientales más importantes en el desarrollo de los
camarones, ya que influye en el metabolismo, el consumo de oxigeno, tipo de
alimentación, crecimiento, muda, la supervivencia y la tolerancia a los metabolitos
tóxicos. (Rahman, M. M. y Escobedo – Bonilla, C. M. 2006)
Además, en otras publicaciones se ha reportado la influencia marcada de la
temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad. Camarones infectados
con WSSV pueden permanecer asintomáticos a temperaturas arriba de 27ºC, pero la
enfermedad se hace evidente si la temperatura del agua disminuye (Vidal, O.M. et
al., 2001; Granja, C.B. et al., 2003 En: Morales, V. y Cuellar-Anjel, J. 2008).
2.5 Principales enfermedades en camarones Penaeidos
Las enfermedades se consideran como una de las principales causas de pérdidas de
poblaciones de camarones de cultivo y por ende económicas, debido a mortalidades
masivas de curso agudo o crónico producidas por agentes bióticos o abióticos
(Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
Los camarones de cultivo con frecuencia se ven afectados por enfermedades que
varían en cuanto a severidad, patogénesis, agente etiológico y manejo/tratamiento de
la afección. Las principales causas de estas enfermedades son virus, microorganismos
intracelulares, bacterias, hongos, protozoarios internos y externos, organismos
epicomensales, toxinas, factores fisicoquímicos y causas de etiología idiopática
(Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.5.1 Virus
Los más frecuentes son: WSSV virus del síndrome de la mancha blanca, IHHNV
virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética, TSV virus del
38
síndrome de Taura, BP Baculovirus penaei,HPV parvovirus hepatopancreatico y
YHV virus de la cabeza amarilla. (Lightner, D.V. 1999; Cuéllar-Anjel, J. 2002;
Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
Figura 6. Signos clínicos - enfermedad IMNV (Pantoja y Lightner. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel,
J. et al. 2008)
2.5.2 Bacterias
Son causadas principalmente por especies de los géneros Vibrio, Pseudomonas,
Aeromonas, Flavobacterium, Plesiomonas y Serratia. Así como estas bacterias
extracelulares causan enfermedad en camarones, también existen microorganismos
intracelulares como rickettsias y una alfa Proteobacteria, esta ultima causante de la
hepatopancreatitis necrosante (NHP) (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y CuéllarAnjel, J. 2008)
Figura 7. Camarón peneido con manchas negras en la cutícula causadas por bacterias quitinolíticas
(Covarrubias, M. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al. 2008)
39
2.5.3 Hongos
Son de poca importancia en camarones de cultivo, debido a que no son muy
frecuentes y además son poco severas. Los principales géneros de hongos patógenos
se presentan en larvas y postlarvas produciendo la “micosis larval” y son especies de
Lagebidium spp. y Sicolpidium spp. En reproductores se presenta la fusariosis que es
causada por el género Fusarium, principalmente F. solani (Lightner, D. V. 1996;
Cuéllar-Anjel, J. 1998; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
Figura 8. Lesiones melanizadas (negras) dentro de la cámara branquial de un camarón Penaeus sp.
causadas por infestación con Fusarium solani (Pantoja, C. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al.
2008)
2.5.4 Protozoarios
En el contenido intestinal se pueden encontrar gregarias (Nematopsis sp.), las cuales
compiten por el alimento, pudiendo causar obstrucción mecánica y lesiones en las
paredes entéricas por deterioro del epitelio intestinal. También pueden observarse
microsporidios dentro del músculo abdominal (Nosema sp.) que causa la enfermedad
del camarón algodonoso. Externamente están los epicomensales que se adhieren a la
cutícula del camarón principalmente en las branquias y compiten por el oxigeno con
el camarón. Los principales géneros son: Zoothamnium, Epistylis, Vorticella y
Acineta (Cuéllar-Anjel, J. 1998; Morales V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
40
2.5.5 Toxinas
Son poco frecuentes. En algunos casos estas se asocian con pesticidas o substancias
químicas. Existen toxicosis causadas por algas verde-azules y afectan principalmente
la pared del intestino medio de los camarones, produciéndose enteritis hemocítica en
los animales (Cuéllar-Anjel, J. 1998).
2.5.6 Factores Fisicoquímicos
Cambios súbitos o condiciones extremas de los factores físicos (oxigeno disuelto,
temperatura, turbidez) y químicos (salinidad, amonio, nitritos, sulfuros) en un
estanque de producción, alteran la calidad del agua y pueden ser causas de estrés, el
cual dispara enfermedades que se encuentran latentes en los camarones.
Adicionalmente, niveles bajos de oxigeno disuelto crean una condición de hipoxia
critica para los camarones. (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Le Moullac, G. 2000; Morales, V.
y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.5.7 Etiología idiopática
Existen pocas condiciones que afectan la salud de los camarones que sean
desconocidas. La más frecuente, aun sin ser muy común en la naturaleza, es la
necrosis muscular idiopática (NMI), que consiste en el deterioro de una zona de
músculo abdominal, con inflamación e infiltración hemocítica abundante. (CuéllarAnjel, J. 1998; Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
2.6 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV – por sus siglas en inglés)
En el año de 1999, la Enfermedad de la Mancha Blanca apareció en Centro y
Sudamérica, golpeando fuertemente la industria acuícola de Panamá, la cual está
centrada principalmente en el cultivo del camarón, y se lleva a cabo en fincas
especialmente desarrolladas para esta actividad. En 1998, la industria camaronera
panameña estaba constituida por más de 9000 hectáreas de estanques en producción.
Generó más de 8.000 empleos directos y exportó un estimado de 10.300 toneladas de
41
camarón de cultivo por valor de 100 millones de dólares (Cuéllar-Anjel, J. 2000;
Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008).
El agente causante de la enfermedad de la mancha blanca, es un virus DNA de doble
cadena, que es considerado potencialmente letal para todas las especies cultivadas de
camarones penaeidos. Los viriones son circulares a elípticos con una envoltura
trilaminar y son grandes (80-129 x 250-380 nm), también poseen un apéndice único
en forma de cola (Itami, T. 1998a; O.I.E. 2000).
El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) es un patógeno que causó y causa
devastaciones en la industria de la cría de camarones en varios países (Lightner et al.,
1998; Jiang et al., 2006; En: Esparza – Leal, H. M. 2009), actualmente es uno de los
más graves patógenos virales en el mundo (Soto y Lotz, 2001; Flegel, 2006; Sánchez
– Martínez .et al. 2007. En: Esparza – Leal, H. M. 2009). En México, el WSSV
apareció por primera vez en 1999 y pronto causo graves pérdidas, en primer lugar
afectó el cultivo de Penaeus (también llamado Litopenaeus) stilyrostris y más tarde a
la especie de P. vannamei (Galaviz-Silva et al., 2004; Peinado-Guevara y LópezMeyer, 2006. En: Esparza – Leal, A .M. 2009).
El virus tiene un período de incubación de 3 a 7 días dentro del organismo del
camarón. La transmisión ocurre a través de diversos vectores que incluyen: materia
fecal o tejidos en descomposición, canibalismo y fluidos de hembras afectadas
(Maldonado, M. y Rodríguez, J. 2004). Se puede dar una transmisión indirecta a
través de agua contaminada, comida contaminada, entre otros (Johnson, S. K. 1996).
Éste se encuentra presente en el medio ambiente y es portado por los camarones en
baja intensidad. Puede no desarrollarse la enfermedad por mucho tiempo en
condiciones libres de estrés (Meng – Feng, T. 1999).
La única alternativa para reducir el riesgo de entrada del WSSV a instalaciones de
producción comercial de camarones es la aplicación de técnicas de bioseguridad o las
medidas de exclusión, como la desinfección (Clifford, 1999; Lightner, 2005. En:
Esparza – Leal, H. M. 2009). Es de vital importancia mantener restringido la entrada
42
de de estanques o aguas vertidas en el medio adyacente (lagunas costeras o estuarios)
donde habitan otras especies de crustáceos que pueden servir como huésped del virus.
Muchos crustáceos son potencialmente susceptibles a la infección por WSSV
(Escobedo-Bonilla et al., 2008. En: Esparza – Leal, H. M. 2009).
La enfermedad de la mancha blanca en los camarones penaeidos está caracterizada
por una mortalidad rápida y alta, acompañada por la aparición de manchas blancas,
inicialmente circulares en la cutícula, que vistas al microscopio tienen un centro
oscuro (Itami, T. 1998). Algunas veces estas manchas se encuentran acompañadas de
una coloración roja en toda la superficie del cuerpo. Los puntos blancos, son
depósitos de calcio que también pueden ser provocados por causas ambientales
relacionadas con la concentración de Ca++ y el pH del estanque. Para verlos más
fácilmente, se arranca la cutícula de la cabeza y con la uña del pulgar se rasca hasta
retirar la epidermis. (Alday, V. 1999)
Figura 9. Caparazón de un juvenil de P. monodon con enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Las
manchas blancas son depósitos calcáreos localizados en la porción interna del exoesqueleto. Fotografía
cortesía de P. Saibaba (S.K.B.R College, Amalapuram, India). En: Morales, V. y Cuéllar–Anjel, J.
2008).
El progreso de la enfermedad está caracterizado por el cese del consumo de alimento,
unos días después se presenta la aparición de camarones moribundos nadando cerca
de la superficie, en el borde de los estanques de cultivo (O.I.E. 2000).
43
En la fase aguda, sufren un episodio de letargia caracterizado por pocos movimientos
corporales y aislamiento, cambian su color a rojizo-café oscuro, pierden del reflejo de
huida, suspenden el consumo de alimento. Además efectúan una evacuación total del
tracto intestinal y mueren a las pocas horas, sin haber consumido significativamente
sus reservas del hepatopáncreas. Las inclusiones cuticulares van desde pequeños
puntos hasta manchas de varios milímetros de diámetro, que pueden llegar a unirse
entre ellas y formar zonas blanquecinas de gran tamaño. Éstas son más fáciles de
observar separando la cutícula de la región del cefalotórax del camarón, removiendo
los tejidos que puedan estar adheridos a ella y luego colocándolas a contraluz (O.I.E.
2000).
Figura 10. Cuatro juveniles de P. monodon mostrando signos de infección por Virus de la Mancha
Blanca (WSSV). El camarón de la parte superior y el de la derecha casi no muestran manchas blancas,
pero se puede distinguir una coloración rosada a café – rojiza causada por la expansión de los
cromatóforos subcuticulares. Es posible que esta coloración sea más aparente durante la etapa aguda de
la enfermedad. El camarón de la izquierda y de la parte inferior muestran las manchas blancas que
característicamente aparecen en esta especie al pasar la etapa aguda de la infección. (Fotografía tomada
a partir de la publicación de Morales, V. y Cuéllar – Anjel, J. 2008)
Las poblaciones de camarones que muestran estos signos, tienen grandes tasas de
mortalidad, que pueden llegar a ser de 100% entre los 3 y 10 días después de la
aparición de los signos clínicos (Lightner, D. V. 1996).
44
2.7 Inmunoestimulantes
La llegada al continente americano del virus del Síndrome de la Mancha Blanca
(WSSV- por sus siglas en ingles) ha creado la necesidad de explorar todas las vías
posibles para su control. En este sentido, la inmunomodulación del camarón se
presenta como una alternativa. Un aspecto fundamental de la inmunomodulación
concierne a la inmunoestimulación, entendiéndose como tal, a la excitación del
sistema inmune en animales sin carencias nutricionales (Rodríguez, J. y Le Moullac,
G. 2000).
Sustancias inmunoestimulantes están siendo obtenidas a partir de varias fuentes
naturales y también por síntesis química con base en la estructura molecular de los
propios productos naturales. Entre estos compuestos, se encuentran muchos derivados
de microorganismos o de algas, destacándose los componentes de la pared celular de
diferentes bacterias, hongos, microalgas y macroalgas. Los principales principios
activos de estos componentes capaces de generar una inmunoestimulación son:
fragmentos de peptidoglucanos (PGs), lipopolisácaridos (LPS), lipopéptidos,
polisácaridos sulfatados, β – glucanos, acil – oligopéptidos y péptidos bacterianos
específicos (revisión de Song y Huang, 2000, En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J.
2008).
Los β-glucanos están involucrados en el incremento de la actividad fagocítica de los
hemocitos (Sung et al., 1994; Cheng – Fang, C. 2000), adhesión celular y producción
de aniónsuperóxido en reproductores (Cheng – Fang C. 2000). En la publicación
realizada por Rodríguez, J. (2000) se evaluaron cuatro dosis de β – glucanos
encontrándose las mejores dosis en 75 y 100 ppm. En cuanto a los animales que
recibieron 75 ppm se observó menor carga del virus WSSV que en aquellos donde se
suministró dieta control. Se concluye en este trabajo que una ligera excitación del
sistema inmune acompañada de los requerimientos nutricionales necesarios, puede
ser capaz de alertar el sistema inmune de los camarones sin desgastar a los animales,
limitando la multiplicación del WSSV.
45
Además de la publicación mencionada anteriormente Cheng – Fang, C. (1999) realizó
un ensayo donde se hizo una infección con WSSV en camarones que fueron
inmunoestimulados con β-1,3-glucano por 20 días y obtuvieron supervivencias del
20% y 12% en juveniles y postlarvas respectivamente, al sexto día de infección a
diferencia del control que llegó con supervivencia de 0% al cuarto día de infección.
Los peptidoglucanos derivados de Bifidobacterium thermophilum, también mejoran la
actividad fagocítica de los hemocitos granulosos en animales desafiados
experimentalmente con WSSV, incrementando la resistencia y supervivencia de los
animales al virus. (Itami, T, 1998a). En camarones desafiados con el Vibrio
penaeicida, que es un patógeno altamente virulento en los camarones. La tasa de
supervivencia fue significativamente mayor que los animales dispuestos para control.
Confirmando el refuerzo sobre el mecanismo de defensa a través de la administración
de peptidoglicanos, aumentando la actividad fagocítica de los granulocitos y aumenta
la resistencia a las enfermedades. (Itami, T. 1998b)
Una forma de evaluar la eficacia de inmunoestimulantes y otras moléculas
inmunomoduladoras, además de la supervivencia, sería mediante la cuantificación de
parámetros inmunitarios. Estudios sobre parámetros celulares y humorales, tales
como generación de radicales de oxígeno, actividad fenoloxidasa, hemoaglutinación,
etc. se están realizando como indicadores de salud. (Rodríguez, J. y Le Moullac, G.
2000).
Igualmente en distintos trabajos se han hecho evaluaciones de la respuesta inmune de
familias resistentes y sensibles al virus de la mancha blanca (WSSV), en el curso de
una infección, donde se estudió el comportamiento de los hemocitos circulantes a
partir de hemogramas e infiltrantes por histología. Igualmente, para obtener
información relacionada al manejo de familias resistentes, se estudió también si esta
resistencia puede ser incrementada adicionando inmunoestimulantes como los ya
mencionados β-1,3 glucanos a la dieta de los camarones juveniles antes de ser
desafiados con el patógeno. (Maldonado, M. 2003).
46
2.7.1 Inmunomodulador Comercial (AquaVac. - Ergosan®)
Aqua Vac. Ergosan® es un inmunomodulador basado en alginatos extraídos de algas
marinas. Los ingredientes, incluidos los alginatos y polisacáridos, fortalecen el
sistema natural de defensa en camarones. Es un producto completamente natural y
como tal es un ingrediente aceptado en los alimentos. Los inmunomoduladores o
inmunoestimulantes pueden jugar un papel importante en la acuicultura, su uso
incluye la mejora de la respuesta inmune ante un amplio rango de agentes patógenos
y al mismo tiempo el fortalecimiento en animales con un sistema débil
o en
desarrollo (ejemplo: larvas de camarón).
Los ingredientes activos del ERGOSAN ® son los alginatos – polisacáridos derivados
de macroalgas y microalgas Laminaria digitata (99%) y Ascofillum nodosum (1%).
(Schering – Plough Animal Health, Aquaculture)
Figura 11. Presentación del producto comercial AquaVac. - ERGOSAN®. (Schering – Plough Animal
Health, Aquaculture)
Los alginatos, son polisacáridos de algas, que se utilizan ampliamente en la industria
alimentaria como un estabilizador o agente emulsionante. Dicho polisacárido es no
digerible y también puede ser visto como una fuente de fibra en la dieta, pueden
47
proteger contra el desarrollo de enfermedades. Existen investigaciones en la
actualidad que tienen como objeto evaluar el uso potencial de alginatos, como un
suplemento dietético para estabilizar la salud normal del animal, o el alivio de ciertas
enfermedades. (Brownlee, I. A. 2005).
Se ha demostrado que estos polisacáridos mejoran la transferencia de oxígeno a
través de la membrana celular y aumenta la actividad metabólica de las mismas, lo
que influye sobre la resistencia a la infección por patógenos y a una mejor reparación
de tejidos dañados a causa de estas enfermedades. (Nüssler y Thompson, 1992). En el
caso de los crustáceos en el estudio realizado por Cheng W. (2005) se evaluó el
recuento de hemocitos, la actividad fagocítica, entre otros parámetros inmunitarios en
camarón blanco Litopenaeus vannamei alimentados con una dieta a base de alginatos
por cinco meses y su reacción frente a la infección con Vibrio alginolyticus. En esta
investigación se obtuvo que la supervivencia de los camarones alimentados con la
dieta que contenía alginatos aumentó significativamente, en comparación con la de
camarones alimentados con la dieta control. Se concluyó que la administración de
alginato de sodio en la dieta puede mejorar la capacidad inmune de L. vannamei y
aumentar su resistencia a la infección por V. alginolyticus.
2.8 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés –
polymerase chain reaction)
Esta reacción es un método enzimático de amplificación de secuencias específicas de
ADN, que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en
cada ciclo del proceso, se duplica el número de moléculas. De esta manera, se utiliza
para la detección genómica de ciertos microorganismos patógenos como virus (ADN
y ARN) y bacterias, en muestras de camarones o de organismos relacionados. El
principio de la PCR consiste en determinar la secuencia de interés y seleccionar
pequeños segmentos de nucleótidos llamados iniciadores o cebadores (“primers” en
inglés), complementarios con la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de
48
las cadenas que flaquean a dicha secuencia, a partir de los cuales se inicia la
elongación.
En esta técnica se consideran importantes los siguientes parámetros: un suministro
abundante de iniciadores y de deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs); una fuente
renovada de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas
complementarias) y los ciclos periódicos de cambios de temperatura.
La reacción tiene lugar en tres fases:
1) Desnaturalización: el fragmento original de ADN se calienta hasta una
temperatura de 90 a 95°C durante 30 segundos; esto provoca la separación de
las dos cadenas.
2) Anillaje: la temperatura de la mezcla se baja hasta 55°C durante 20 segundos
para que los cebadores se enlacen con el ADN escindido.
3) Polimerización: la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la
polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. (Morales V. y CuéllarAnjel, J. 2008)
A partir del manual de pruebas de diagnóstico de enfermedades para los animales
acuáticos (O.I.E. 2006), se recomienda en primer lugar, el uso de esta técnica para la
comprobación de casos sospechosos de la enfermedad. Actualmente esta técnica se
encuentra reconocida por la O.I.E. (por sus siglas en ingles) y es utilizada por todos
los laboratorios de referencia para la detección de WSSV. En algunos casos puede
que el animal no presente signos externos de la enfermedad, lo cual no significa que
no pueda estar infectado. Lo anterior indica que se deben detectar niveles muy bajos
de la infección, por ello es que las técnicas de biología molecular son las indicadas
para la detección y amplificación del ADN viral.
49
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
La Industria del cultivo de camarón en el mundo y en América Latina ha surgido
como una de las fuentes de mayor generación de divisas, con lo que en el transcurso
de los años ha generado altos niveles de producción y grandes ganancias. Sin
embargo, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta esta industria es a la
presencia de enfermedades infecciosas. En la década de los 90’, hubo una reducción
dramática en la producción del camarón de cultivo debido principalmente a
enfermedades de origen viral, causando altas tasas de mortalidad (hasta del 100%).
El Síndrome de la Mancha Blanca provocado por el WSSV (White Spot Syndrome
Virus, por sus siglas en inglés), luego de su aparición en los años 98 y 99, se ha
convertido en una de las enfermedades virales más devastadoras para el camarón de
cultivo, afectando la producción y dando como resultado el cierre de empresas y la
pérdida de muchos empleos.
Durante los brotes de la enfermedad se producen altos episodios de estrés en el
camarón debilitando su mecanismo de defensa. Parte esencial de la inmunidad es el
estado de alerta por el cual un organismo puede detectar moléculas extrañas; un buen
sistema de reconocimiento es lo ideal para expulsión adecuada del virus. Cuando
existen fallas en dichas funciones se afectan las actividades de diferenciación y
eliminación de patógenos en el animal; comprometiéndose así su salud y estabilidad
generando mortalidades en los camarones infectados y por ende grandes pérdidas a
nivel económico.
3.2 Justificación
Debido a las bajas producciones de camarón reportadas en los últimos años en
América Latina, por la presencia del virus del Síndrome de la Mancha Blanca WSSV,
la Industria camaronera con el objeto de frenar al máximo los brotes y disminuir las
pérdidas; ha ensayado varias opciones para atenuar su impacto. En la actualidad las
50
estrategias para el control de la enfermedad han sido directamente enfocadas en la
mejora de la salud animal con el fin de prevenir infecciones por el virus.
Es importante resaltar que al momento de enfrentarnos con problemas virales hay
escases en cuanto a la aplicación de tratamientos, como lo son los antibióticos cuando
la infección es bacteriana, por tal razón en estos casos el interés está encaminado
hacia una prevención antes de que se presenten brotes de la enfermedad. Una nueva
alternativa
para
ello
es
la
inmunoestimulación.
En años
recientes,
los
inmunoestimulantes han sido usados para aumentar la resistencia de camarones
contra infecciones virales. Las sustancias inmunoestimulantes tienen la cualidad de
alertar el sistema inmune no especifico, desarrollando así una mejor respuesta ante
posibles microorganismos patógenos.
Al mismo tiempo es de vital importancia para una prevención mantener el cultivo de
camarón en condiciones ambientales que mejoren la estabilidad de los camarones, ya
que está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en estos,
depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, que incluyen buena calidad
del agua, densidad poblacional, nutrición y control de factores ambientales
potencialmente estresantes (variaciones bruscas de salinidad, temperatura y oxigeno)
en este caso es relevante el manejo de la salinidad, la temperatura y el oxigeno, ya
que la dinámica de ocurrencia de los patógenos en los sistemas acuáticos está
probablemente modulada por los parámetros ya mencionados. Se ha reportado la
influencia marcada de la temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad.
(Vidal, O.M. et al., 2001; Granja et al., 2003, En: Morales y Cuéllar–Anjel, 2008).
Existen ocasiones en las que los organismos son portadores de diferentes agentes
patógenos y no manifiestan características externas de la enfermedad, mientras las
condiciones de cultivo sean las optimas para su desarrollo; si estas condiciones se
tornan desfavorables, el sistema de defensa que los mantenía protegidos, se suprime y
la multiplicación del patógeno se desarrolla de tal manera que sobrepasa los
mecanismos de defensa, causando en la mayoría de las ocasiones mortalidad en el
hospedero. (Morales-Covarrubias, 2008. En: Morales y Cuéllar-Anjel, 2008).
51
La sostenibilidad de la producción del camarón radica en un buen control y manejo
de las enfermedades que se presentan en los cultivos. Dentro de la búsqueda de
programas de prevención y estrategias innovadoras, se han intensificado
investigaciones en distintas ramas del conocimiento científico, la aplicación de
conocimientos fundamentales en inmunología de crustáceos ha permitido elaborar
medidas profilácticas inmunomodulatorias, (Rodríguez J. y Cedeño R., 2000)
obteniendo resultados favorables que han ayudado a atenuar las consecuencias
causadas por la infección del virus WSSV en camarones.
A pesar de los avances que se han alcanzado en la industria camaronera, este sector
cuenta con pocas herramientas para identificar y enfrentar los problemas
epidemiológicos que lo afectan, recurriendo generalmente a soluciones de emergencia
cuando la infección se hace presente, por tal motivo está investigación pretende
evaluar nuevas alternativas, en este caso los inmunoestimulantes, como una
herramienta útil en las practicas de manejo; con el fin de confirmar los particulares
del producto en cuanto al fortalecimiento del sistema inmune de los camarones L.
vannamei ante una infección con el virus del Síndrome de la Mancha Blanca y que
este proyecto sea como herramienta útil para la mejora en lo referente al cultivo de
estos animales y en el aumento de la producción.
52
4. OBJETIVOS
4.1 General
Evaluar la capacidad del producto comercial ERGOSAN ® en el fortalecimiento de
sistema natural de defensa y así mismo en la reducción del índice de mortalidad del
camarón blanco (L. vannamei) frente a la infección per os del Virus del Síndrome de
la Mancha Blanca (WSSV).
4.2 Específicos
1. Determinar la tasa promedio de supervivencia en los camarones del tratamiento
con Ergosan® y del Control luego de ser infectados con el virus WSSV y buscar
diferencias significativas en estos resultados mediante las pruebas de ANOVA y
Duncan.
2. Establecer a partir de un conteo diferencial de hemocitos, si existe un aumento en
la proliferación de los mismos, en camarones alimentados con la dieta Ergosan®
respecto a la dieta Control.
3. Identificar mediante un examen clínico los camarones infectados y moribundos por
acuario (con el virus WSSV), seleccionados por presentar manifestaciones propias de
la enfermedad.
4. Determinar el efecto citopático causado por el virus WSSV en las células blanco de
camarones infectados y moribundos, a partir de cortes histológicos procesados
mediante inclusión en parafina y teñidos con Hematoxilina y Eosina
5. Confirmar mediante la técnica de PCR, si los animales infectados y moribundos
son positivos para el virus (WSSV), mediante la amplificación de secuencias
especificas del DNA de este microorganismo patógeno (prueba de nested-PCR).
53
6. Valorar de forma semicuantitativa la presencia del virus (WSSV) por
inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®) en muestras de camarones (L.
vannamei) muertos luego de la infección.
7. Cumplir los postulados de Koch a partir del aislamiento e identificación molecular
del virus WSSV en camarones sanos, infectados artificialmente con este virus y en
los cuales se logre reproducir la enfermedad con todos sus signos clínicos
característicos, aislando de nuevo en éstos al agente etiológico (WSSV).
8. Mantener los parámetros físicos–químicos (pH, salinidad, oxígeno disuelto y
temperatura), estables durante el transcurso del bioensayo.
54
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Descripción del área de trabajo
El proyecto se llevó a cabo en la sala de Infección Experimental de la empresa
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO), ubicada en la Hacienda La Estrella, Distrito
de Natá, Provincia de Coclé, República de Panamá. La sala está distribuida en dos
áreas: una Sala de No – infección y una Sala de infección. El montaje del
experimento se distribuyó dependiendo del tipo de actividad realizada.
Figura 12: Vista frontal de la “Casa de Don Popo” donde se encuentra la Sala de Bioensayos.
5.2 Población analizada
Los animales utilizados en el experimento eran procedentes del Centro de Producción
Larval “C.P.L. San Carlos” (CAMACO), los cuales llegaron a la sala de Bioensayos
con un peso promedio de 0.6 g. Éstos se mantuvieron por 15 días en Tanques
cilíndricos de fibra de vidrio, alcanzado un peso promedio aproximado de 1.2 g.
Fueron luego recolectados para realizar el experimento pasando a los Tanques de la
Sala de No – infección, donde se mantuvieron en aclimatación y crecimiento hasta
alcanzar la talla experimenta, habiéndoseles hecho el respectivo mantenimiento
diario.
55
De manera complementaria, se dispuso una población de camarones para la
realización de hemogramas, con el objeto de determinar el posible efecto del producto
comercial ERGOSAN® sobre el conteo total y diferencial de los hemocitos y su
eventual relación con la supervivencia de los camarones luego de la infección con el
virus WSSV.
Se tomó una muestra al azar de los camarones que se utilizaron para el ensayo, esto
con el fin de detectar WSSV, virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y
hematopoyética (IHHNV) y la bacteria intracelular causante de la hepatopancreatitis
necrotizante (NHP), todas mediante la prueba de nested-PCR. (ANEXO 1) Con lo
anterior, se buscó descartar la presencia de estos patógenos y que en un futuro
pudieran interferir en los resultados de la investigación. Los análisis moleculares se
realizaron en UNICAM. Ninguno de los tres patógenos fue detectado en ninguna de
las muestras examinadas para este estudio.
5.3 Fases experimentales
Las actividades de este ensayo se realizaron básicamente en cinco fases. La primera
estuvo determinada por la preparación de los distintos materiales y las pruebas de
laboratorio previas al experimento. La segunda fase consistió en la transferencia y
siembra de los camarones en los acuarios. Luego de ello se suministró por diez días
una dieta experimental a base del producto (ERGOSAN®), correspondiente a la fase
tres. En la fase cuatro se realizó la preparación de la papilla infectiva y
posteriormente la infección per os de los camarones con el virus WSSV. Por último
en la fase cinco se llevaron a cabo, el registro de las mortalidades en cada uno de los
acuarios y las pruebas de laboratorio confirmatorias posteriores a la infección
experimental.
En el trascurso del experimento se realizó el muestreo de hemolinfa de los animales
dispuestos para conteos de hemocitos, habiéndose realizado tres extracciones con sus
respectivos recuentos durante 30 días.
56
5.3.1 Preparación del Material de la Sala de Bioensayos (Fase 1)
5.3.1.1 Acuarios
Fueron utilizados acuarios de vidrio con capacidad para 30 L (30 cm de ancho por 60
cm de largo y 30 cm de alto). De los 30 litros que caben en cada unidad, se utilizó el
86% que equivalen a 26 litros por razones de operación hídrica del sistema. Estos
acuarios estuvieron bajo condiciones controladas de temperatura, oxígeno y salinidad.
Además, la entrada de luz a la sala se bloqueó con plástico negro y se manejó luz
artificial las 24 h.
A
B
.
C
Figura 13: A. Ubicación de acuarios en la sala B. Llenado de unidades experimentales. C. Control de
salida de aire en cada uno de los acuarios.
57
5.3.1.2 Desinfección de acuarios y tuberías de la Sala
Para la desinfección y limpieza de los acuarios se utilizó cloro granulado al 65%,
diluyendo 2.2 g de cloro comercial en 30 litros de agua, obteniendo así una
concentración de 7.4% p/v (concentración estándar – Sala de Bioensayos), durante 24
horas. Transcurrido este tiempo, se neutralizó el Cloro con 1.1 g Tiosulfato de Sodio
Comercial (Na2SO3) en 30 litros de agua (3.7 % p/v). Se eliminó el Tiosulfato de
Sodio de los acuarios lavándolos con agua dulce y se dejaron secar. Al igual que en
los acuarios, se hicieron pases de Cloro por las tuberías, el cual fue neutralizado con
Tiosulfato de Sodio lavando luego con agua dulce para eliminar el exceso, antes de
dejar pasar el agua marina. Todo lo anterior se hizo con el fin de disminuir la posible
población bacteriana en las tuberías, que pudiera interferir en la salud de los animales
y por ende en los resultados del experimento.
5.3.1.3 Tratamiento del agua
El agua marina que se utilizó para el llenado de los acuarios, fue procedente del canal
reservorio en las instalaciones de la finca CAMACO. Cada viaje de agua en tanques,
fue registrado y sometido a tratamiento de rutina para la sala de bioensayos. El
tratamiento consistió en pasar el agua por una tubería a un Tanque de reserva (TQ 4);
al momento de su utilización el agua se dirigió a Tanques de desinfección (TQ 3 y
TQ 2), en donde se trató con Cloro granulado al 65%, a una concentración del 7.4 %
p/v (400 g en un TQ de 5400 litros) por 24 h. Después de cumplir este tiempo, se
transfirió a un Tanque de neutralización (TQ1), donde se trató con Tiosulfato de
Sodio Comercial a una concentración de 3.7 % p/v (200 g en un TQ de 5400 litros)
por 60 minutos en recirculación constante. Antes de ser utilizada el agua para
recambio de los acuarios, constantemente se hizo comprobación de la neutralización
del cloro residual con una solución OTO (ortotoloidina) para asegurarse que estuviera
libre del mismo y apta para su uso con camarones vivos.
58
A
B
.
.
C
.
Figura 14: Recepción y tratamiento de agua marina. A. Toma de muestra de agua para microbiología
antes del tratamiento químico. B. Conexión de manguera del agua de llegada hasta el complejo de
desinfección. C. Tanques de reserva para tratamiento de agua marina.
5.3.1.4 Pruebas microbiológicas del agua
Para evaluar el efecto del tratamiento sobre la acción microbiana presente en el agua
marina, se realizaron distintos recuentos de bacterias (UFC/ml) que evidenciaron el
efecto inhibitorio del Cloro sobre la población bacteriana. Para ello, se tomó una
muestra de agua en tubos plásticos de 1.5 ml estériles, antes del tratamiento y luego
del llenado de los acuarios; estas muestras se llevaron a UNICAM donde fueron
procesadas.
59
En este ensayo los datos obtenidos para las pruebas microbiológicas del agua, sólo se
realizaron a fin de obtener información complementaria con relación a la eficacia del
tratamiento utilizado.
Para el crecimiento de la población bacteriana se utilizó Agar Marino, medio no
selectivo usado para el aislamiento de bacterias totales presentes en camarones y
Agar TCBS (Tiosulfato Citrato Bilis Sal Sacarosa), el cual es un medio selectivo
principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (ANEXO 2)
A
B
.
.
C
.
Figura 15: Microbiología de aguas A. Laboratorio de Microbiología – UNICAM. B. Cabina para
procesamiento de muestras microbiológicas. C. Siembra de diluciones en Agar Marino y TCBS.
El procesamiento de las muestras en el laboratorio se hizo de la siguiente manera:
1. A partir del agua inicial (antes y después del tratamiento) se hicieron
diluciones seriadas, para ello se tomaron 100 μl de la muestra y se
transfirieron a un tubo de 1.5 ml estéril, que contenía 900 μl de Solución
Salina al 2 % (SSN 2%), esto se realizó sucesivamente hasta obtener una
dilución de 10-3.
60
2. Se sembraron 10 μl de la muestra inicial en una parte media de caja la caja de
petri y 10 μl de la dilución 10 -1 en la otra mitad. Al igual que lo anterior se
hicieron las siembras con las diluciones 10-2 y 10-3. Luego se esparció el
inoculo de forma homogénea sobre el Agar. La siembra se hizo sobre Agar
Marino y TCBS por duplicado.
3. Las cajas de petri inoculadas se incubaron a 28 - 30°C y se realizó el recuento
a las 24 horas. A continuación se resume el proceso de siembra:
1)
100 μl
100 μl
10
1.5 ml agua
marina
100 μl
-1
900 μl de
SSN (2%)
10
900 μl de
SSN (2%)
-2
10
-3
900 μl de
SSN (2%)
2)
Muestra
inicial
10
Directo
10
-1
1
10
-2
10
10 μl
10
Siembra en Agar Marino y TCBS
por duplicado
2
10
-3
3
Siembra en Agar Marino y TCBS
por duplicado
Figura 16: Esquema descriptivo del proceso de dilución y siembra de muestras de agua marina.
61
5.3.2 Transferencia y Siembra de Animales en los Acuarios (Fase 2)
Los acuarios se ordenaron sobre mesones en la Sala de Infección, cada uno
debidamente marcado. Para mantener las condiciones de aireación, se les colocó una
manguera con su respectivo aireador y se conectó a una tubería de aire; todos los
materiales utilizados se desinfectaron previamente.
A partir de los animales dispuestos en los Tanques cilíndricos de la Sala de No –
infección, se tomaron con la ayuda de un chayo desinfectado, 400 camarones. Al
momento de chayar se bajó el nivel del agua para facilitar la recolección. En la
selección de los camarones se tuvo en cuenta que estuvieran dentro de un rango de
peso similar, con el fin de obtener una biomasa homogénea para cada uno de los
acuarios.
A
B
.
.
C
.
Figura 17: Proceso de transferencia de camarones a los acuarios. A. Recolección de animales. B.
Selección de camarones para obtener biomasa homogénea. C. Pesaje sobre balanza.
62
5.3.2.1 Control de peso de los camarones
Para el pesaje de los camarones se contó con una balanza electrónica Mettler Toledo
Ref. B3001 – 5 (Monobloc inside – weidhing technology) con un mínimo de medida
de 0,0 g y un máximo de 31,0 g.
Durante cada labor de pesaje, se bajó el nivel del agua y se recolectaron los
camarones de forma individual, luego fueron colocados en un recipiente plástico que
contenía agua marina para evitar estrés en los animales. Del valor total registrado
luego del pesaje, se calculó el peso promedio por camarón tanto por acuario como por
tratamiento.
En el desarrollo de este bioensayo se realizaron cuatro mediciones del peso de los
camarones por acuario. La primera se hizo al momento de la siembra, el segundo
pesaje se realizó el día en el que se comenzaron las dietas experimentales, recién
culminó la aclimatación en los acuarios. Posteriormente se hizo una tercera medición
del peso previa a la infección experimental y por último al momento del registro de
las mortalidades.
5.3.2.2 Unidades experimentales
Luego de pesados los 400 animales se transfirieron diez camarones por cada uno de
los 40 acuarios utilizados para el experimento. Al momento de introducir los animales
a los acuarios en la Sala de Infección, estos se aclimataron, comparando el agua de
salida con la de entrada para evitar estrés en los animales, cabe resaltar que no hubo
diferencias en cuanto a la salinidad o temperatura entre el agua de origen y la destino,
al momento de la siembra los acuarios ya se encontraban con aireación desde 24
horas antes.
En resumen, como unidades experimentales se utilizaron diez acuarios (réplicas) por
cada tratamiento, con diez animales en cada uno de ellos. De los acuarios utilizados,
20 fueron dispuestos para evaluar ERGOSAN® y los otros 20 fueron utilizados como
Control; diez positivos y diez negativos para cada caso.
63
A
A
B
.
.
C
.
Figura 18: Unidades experimentales A. Disposición de acuarios en la sala de Infección. B. Acuario de
vidrio con capacidad para 30 L (30 cm de ancho por 60 cm de largo y 30 cm de alto), con 10
camarones cada uno. C. Rotulación de acuarios por cada tratamiento.
Además se utilizaron seis acuarios, que se mantuvieron en las mismas condiciones,
con diez camarones en cada uno; para la extracción de hemolinfa y la evaluación de
los hemocitos. En total se utilizaron 60 camarones para esta prueba complementaria.
Figura 19: Acuarios con camarones para extracción de hemolinfa y conteo de hemocitos.
Como medida de prevención y para posibles reposiciones de camarones muertos
antes de la infección, se dispuso de dos acuarios con 15 camarones cada uno, uno
alimentado con dieta ERGOSAN® y el otro con dieta control.
64
5.3.2.3 Mantenimiento de acuarios
Luego de la transferencia y en todo el desarrollo del experimento, la limpieza de los
acuarios se realizó tomando cuidadosamente del fondo los residuos y/o detritos
orgánicos como mudas, heces fecales, residuos alimenticios entre otros, con la técnica
de sifoneo a partir de una bomba eléctrica, la boca de la tubería estaba sellada con una
malla para evitar la entrada de los camarones.
A
B
C
D
Figura 20: Mantenimiento de acuarios. A. Reducción de nivel del agua con la motobomba. B.
Recambio a razón del 90%. C. Bomba eléctrica. D. Manguera sellada con malla para evitar la entrada
de animales.
Se hizo recambio diario del agua a razón de 90%, sin haber suspendido la aireación.
Los acuarios se llenaron nuevamente con agua salada previamente tratada. Además,
se revisó el estado de los acuarios dos veces al día con el fin de evitar el deterioro de
la calidad del agua.
65
5.3.2.4 Condiciones físico – químicas del agua de los acuarios
Los parámetros físico – químicos se mantuvieron en todo el desarrollo del ensayo
bajo condiciones controladas, se realizaron mediciones constantes del agua, donde la
temperatura osciló entre 27ºC y 28.2ºC; el oxigeno disuelto estuvo en el rango de 4.6
a 5.5 mg/l y la salinidad fue de 30 a 32 ppt.
Figura 21: pHmetro y medición de pH en el agua de los acuarios
Asimismo, se tomaron muestras de agua antes del vaciado y luego del llenado de los
acuarios, que fueron enviadas al Laboratorio de Química de aguas de la Camaronera
de Coclé S.A. (CAMACO). Como resultado del análisis de nitritos, nitratos y amonio,
los datos obtenidos estuvieron bajo el rango permitido para la condición del agua en
Salas de Bioensayos.
5.3.3 Dieta experimental (Fase 3)
En el experimento se utilizó una dieta experimental (ERGOSAN ®) y una dieta
control. Las dos dietas fueron preparadas usando el mismo núcleo del alimento
“CAMPENT-TOP” de CAMACO, a base de pellets con 25% de proteína, dicho
alimento es elaborado por LARRO – Industrias de Natá S.A. (INASA) en la
República de Panamá. (ANEXO 3)
66
La siguiente tabla muestra las características específicas del alimento utilizado en este
experimento:
Tabla 6: Características alimento CAMPENT –
TOP - LARRO
Características
Cantidad (%)
Humedad (máx.)
11
Proteína cruda (min.)
25
Grasa cruda (máx.)
10
Fibra cruda (máx.)
3
Cenizas (máx.)
8
Proteína animal (min.)
65
La dieta en la que se incluyó el producto comercial ERGOSAN ®, fue formulada con
base a las indicaciones sugeridas por el fabricante. Donde, la mezcla para este caso se
realizó a razón de 5 kg/Ton. Fue fabricado un batch de 30 quintales (3,000 lb de 454
g cada una). Tomando un quintal al azar se obtuvieron 5 kg de alimento tratado con
ERGOSAN®, los cuales fueron divididos en 5 bolsas plásticas con sello hermético, de
1 kg cada una y preservados en refrigeración a 5ºC. El tamaño de los pellets
experimentales tanto para el tratamiento con ERGOSAN ® como para el tratamiento
Control fue de 2 mm aproximadamente. (ANEXO 4)
A
B
Figura 22: Dietas experimentales A. Pellets de dieta BASE. B. Pellets de dieta ERGOSAN®
67
En adelante, y para efectos prácticos, se hará referencia a dieta ERGOSAN ® (dieta
base + ERGOSAN®) y dieta BASE (sin ERGOSAN®).
5.3.3.1 Tratamientos experimentales (Diseño de la Investigación)
El experimento se hizo a partir de cuatro tratamientos. El tratamiento uno (T1)
consistió en el suministro de la dieta ERGOSAN®, donde los camarones no fueron
infectados. Los animales tratados con el tratamiento dos (T2) también se les
suministró dieta ERGOSAN®, pero a diferencia del T1 estos se infectaron con el
virus WSSV.
Se utilizaron diez acuarios para el Control negativo y otros diez para el Control
positivo. En el primer caso, los camarones fueron alimentados con la dieta BASE (sin
ERGOSAN®) pero estos no fueron infectados, lo anterior correspondió al tratamiento
tres (T3). En cuanto al Control positivo que corresponde al tratamiento cuatro (T4),
los animales también fueron alimentados con la dieta BASE (sin ERGOSAN®) pero
estos camarones a diferencia de lo anterior si se infectaron con el virus WSSV.
La siguiente tabla presenta de forma resumida el diseño experimental utilizado en
este ensayo:
Tabla 7: Diseño experimental utilizado para el suministro de dieta ERGOSAN® y
dieta Control (Base)
Tratamiento
1
2
Tipo de
Infección con
Nombre
Alimento
WSSV
No. De acuario
ERGOSAN® no
Dieta base +
infectado
ERGOSAN®
No
21 - 30
ERGOSAN®
Dieta base +
infectado
ERGOSAN®
Sí
1 - 10
Dieta BASE
No
31 - 40
Dieta BASE
Sí
11 - 20
Control no
3
infectado
Control
4
infectado
68
El control negativo tuvo como objeto verificar que la mortalidad fuera
exclusivamente causada por el virus WSSV y no por otro agente biótico o abiótico
externo al experimento. El Control positivo tuvo la finalidad de servir como
referencia para establecer si la supervivencia de los tratamientos con dietas
medicadas, era superior o no a la dieta sin aditivos.
Para los animales a los cuales se les realizó extracción de hemolinfa, se utilizaron tres
acuarios los cuales se alimentaron con dieta a partir de ERGOSAN ® y tres acuarios se
alimentaron con dieta BASE. Cabe resaltar, que los animales para este estudio de
hemocitos, no fueron infectados con el virus WSSV y sus valores de supervivencia no
se incluyeron en el análisis del experimento.
A continuación se describe el diseño que se llevó a cabo para esta prueba:
Tabla 8: Diseño utilizado para la dieta experimental de animales dispuestos para
extracción de hemolinfa y conteo de hemocitos
Tratamiento
5
Tipo de
Infección con
Nombre
alimento
WSSV
No. de acuario
Hemocitos con
Dieta base +
ERGOSAN®
ERGOSAN®
No
41 - 43
Dieta BASE
No
44 - 46
Hemocitos sin
6
ERGOSAN®
5.3.3.2 Alimentación experimental de los camarones
El suministro de la dieta experimental se hizo luego de transcurridos ocho días desde
de la transferencia de los animales a los distintos acuarios (fase de aclimatación y
reposición). La dosis de alimento utilizada en el estudio fue ad libitum (consumo
libre). Con el manejo del alimento se procuró que no sobraran demasiados pellets de
un día para otro, esto con el fin de mantener buena calidad del agua de los acuarios.
El alimento fue distribuido de forma manual sobre la superficie de cada uno de los
acuarios, los cuales estaban numerados y caracterizados con colores que diferenciaba
69
el tipo de tratamiento al cual se sometían los camarones. Esto, con el objeto de evitar
confusiones al momento de depositar el alimento. El suministro de las dietas se hizo
dos veces al día: 8:30 a.m. y 4:30 p.m.; esta frecuencia permitió que todos los
camarones se alimentaran completamente.
Figura 23: Alimentación de los camarones en cada uno de los acuarios
Las dietas se aplicaron con base en el 10% de la biomasa de cada acuario. Al
momento de esta fase de dieta experimental, la biomasa por acuario se encontraba en
13 g aproximadamente, esto indica que el 10% de alimento suministrado fue de 1.3 g
por día, los cuales se dividieron en dos dosis cada una de 0.65 g (1.3 g 2 dosis/día ≈
0.65 g/dosis/acuario). Como el suministro del alimento se hizo por la misma persona
durante todo el experimento, la dosis necesaria por acuario se ajustó dependiendo de
la cantidad de residuos que se observaron al término de cada jornada diaria.
La alimentación con la dieta experimental ERGOSAN® se realizó por diez días luego
de la transferencia, culminando un día antes de la infección con WSSV. Durante este
tiempo se asume que el producto fue completamente incorporado al organismo de los
camarones, en concentraciones suficientes para actuar como coadyuvante contra la
infección del virus WSSV.
70
5.3.4 Infección experimental (Fase 4)
Al día siguiente de haber culminado las dietas experimentales se hizo la infección
experimental vía oral (per os) con tejido infectante (“papilla positiva”) para el virus
WSSV.
5.3.4.1 Amplificación de cepas virales purificadas
La papilla se preparó en base a la cepa original del virus del síndrome de la mancha
blanca (WSSV) presente en la República de Panamá, la cual fue asilada en el año
2000 por CAMACO S.A. Dicha cepa fue criopreservada pura desde entonces a –
196ºC en nitrógeno líquido. La concentración de cada μl de purificado establecida
con PCR en tiempo real, es de aproximadamente 10 millones de viriones.
Para la realización de la papilla se utilizaron aproximadamente tres criotubos de 1.8
ml, los cuales se descongelaron a temperatura ambiente durante un tiempo
determinado antes de ser utilizados.
Figura 24: Inoculación de camarón libre de patogenos con el virus de WSSV. (Inyección sobre el
tercer segmento abdominal con jeringa de 1 ml)
Con la ayuda de una micropipeta, se tomaron 10 μl de los criotubos; la cantidad de
criopreservado utilizada para la infección está determinada bajo el protocolo de
CAMACO S.A. para la amplificación de cepas virales purificadas, donde se utiliza 1
μl por gramos de peso vivo del camarón. Los 10 μl de la cepa viral (hemolinfa
71
infectada + buffer T.E.N.) se colocaron cuidadosamente sobre papel PARAFILM de
manera organizada, con el fin de facilitar la extracción. Las agujas que se utilizaron
fueron de 1 ml (insulina).
A partir de una población de 300 camarones libres de patógenos, con un peso
promedio de 10 g. dispuestos en un tanque cilíndrico de fibra de vidrio previamente
desinfectado, se recolectaron de manera individual cada uno de ellos con la ayuda de
un chayo.
Por cada camarón, se ubicó el tercer segmento abdominal donde ser realizó la
punción con los 10 μl de la cepa viral, de manera cuidadosa para evitar daños en el
tejido. Posteriormente, se fueron colocando uno por uno los animales inoculados en
un RW (raceway).
5.3.4.2 Preparación de la Papilla infectante
Los animales inoculados se mantuvieron bajo observación constante, con el fin de
determinar las primeras mortalidades. Transcurridas 24 horas se presentó una
mortalidad del 21%, para confirmar que las muertes estaban causadas por la infección
del virus WSSV, se tomo una muestra de cinco camarones a los cuales se les realizó
la técnica de inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®), se obtuvieron resultados
negativos para la presencia del virus, lo que indica que la mortalidad para esta
población fue causada por el manejo y estrés de los camarones debido a la punción.
Luego de pasadas cuatro horas (28 h después de la infección) la mortalidad aumento
de forma significativa y la mayoría de la población presentó signos de infección por
el virus de WSSV. Por tal razón, se tomo una muestra de los camarones muertos y se
les realizó la Prueba de Shrimple®, todos los animales analizados fueron positivos
para el virus WSSV.
De allí en adelante se recolectaron los camarones, se colocaron en bolsas plásticas
selladas debidamente rotuladas y se llevaron a refrigerar a -10°C. La mortalidad cesó
a las 36 horas luego de la infección.
72
Los camarones refrigerados se picaron completamente con la ayuda de bisturís
estériles, en pedazos pequeños. Se mezclaron homogéneamente y se colocaron en un
recipiente debidamente rotulado. Está papilla se mantuvo en refrigeración hasta el
momento de su utilización.
A
B
C
Figura 25: Preparación de papilla infectante. A. camarones congelados positivos para WSSV. B.
Cortes pequeños de camarón infectado. C. mezcla homogénea y envasado en recipiente para
refrigeración
5.3.4.3 Verificación de Papilla mediante nested – PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa)
La evaluación de la papilla se hizo de manera semicuantitativa, realizando diluciones
seriadas desde 10-1 hasta 10-7. A partir de la papilla congelada se tomo muestra la cual
fue llevada a la Unidad de Investigación del Camarón (UNICAM) de CAMACO S.A.
para ser analizada.
El siguiente esquema muestra de manera resumida el procedimiento que se siguió
para la evaluación de la papilla infectante:
73
Extracción de
ADN
50 mg
papilla
Pellet de ADN + TE
5 μl
Pellet de
ADN + TE
5 μl
45 μl
-1
TE 10
5 μl
45 μl
-2
TE 10
5 μl
45 μl
-3
TE 10
5μl
45 μl
-4
TE 10
5μl
5 μl
45 μl
-5
TE 10
45 μl
-6
TE 10
45 μl
-7
TE 10
103
102
101
nested – PRC
108
107
106
105
104
Figura 26: Esquema descriptivo para evaluación semicuantitativa de la papilla infectante (PCR con
diluciones)
En el laboratorio se pesaron 50 mg de la papilla, a los cuales se les realizó extracción
de ADN. Posterior a la extracción se tomaron 5 μl del ADN resuspendido (ADN +
TE) y se realizaron diluciones seriadas, es decir, de la dilución base (10 -1) se tomaron
5 μl que se pasaron a otro microtubo con 45 μl de solución TE, obteniendo la dilución
10-2 y así sucesivamente hasta alcanzar la dilución 10-7. Luego de tener cada
microtubo con su respectiva dilución se les realizó nested – PCR con el fin de
amplificar el ADN y observar hasta cual de las diluciones puede haber presencia de
partículas virales.
74
Posterior a la verificación de la papilla infectante, se obtuvo como resultado que todas
las diluciones fueron positivas para el virus WSSV (ANEXO 5). Si la sensibilidad del
protocolo de nested-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la detección
viral es de por lo menos 10 partículas virales (positivo), se sugiere que cada 50 mg de
papilla tiene por lo menos 100 millones (108) de viriones infectantes, que pasarán a
los tejidos de los camarones experimentales por vía oral.
5.3.4.4 Prueba de Virulencia de la Papilla
Con el fin de analizar la capacidad infectiva y de virulencia de la papilla preparada en
camarones sanos, se realizó una prueba previa a la infección experimental.
Para el montaje se utilizaron dos acuarios antes desinfectados, donde se colocaron
diez camarones por cada uno de ellos. Uno de los acuarios se utilizó para infección y
el otro como Control negativo. La papilla se suministró al 10% de la biomasa, la cual
se encontraba para cada acuario en 15 g aproximadamente, es decir, que los
camarones a infectar se alimentaron con 1.5 g de la papilla vía oral. Los camarones
del acuario Control se alimentaron con una dieta BASE.
Las primeras muertes de los camarones se dieron transcurridas las 40 horas
posteriores a la infección, alcanzando una mortalidad del 90% en menos de 14 horas
después de la primera mortalidad (54 horas). Se tomo muestra de un camarón al cual
se le realizó la Prueba de Shrimple®, para determinar que las muertes se dieron por la
infección del virus WSSV, el resultado que se obtuvo fue positivo. (ANEXO 6)
Debido a que la cepa viral utilizada en este experimento es altamente virulenta, no se
ha establecido la DL-50 ya que muere entre el 90 y 100% antes de 7 días postinoculación (vía oral). Utilizar una concentración baja del virus para inocular
camarones sanos, hará que la incubación sea más lenta y la mortalidad tome más
tiempo, pero finalmente los camarones susceptibles morirán. Por consiguiente, el uso
de concentraciones altas o bajas del virus solamente cambiará el tiempo de
mortalidad total de la población expuesta y no la proporción de camarones muertos
75
5.3.4.5 Suministro de Papilla infectante
Antes de la infección se realizó un pesaje de los camarones, con lo cual se obtuvo una
biomasa de 20 g por acuario, dando un peso promedio de 2 g por camarón. El
suministro de la papilla se hizo a razón de 4 g por acuario; es decir, la cantidad de
papilla suministrada por acuario fue el 20% de la biomasa de cada uno.
Tabla 9 : Diseño del suministro de papilla infectante
Cantidad
Tratamiento
Nombre
Suministro
No. De
por acuario
Cantidad por
de Papilla
acuario
(g)
tratamiento (g)
Sí
1 - 10
4
40
Sí
11 - 20
4
40
Total
80 gramos
ERGOSAN®
2
infectado
Control
4
infectado
A
B
.
.
C
D
.
.
Figura 27: Suministro de papilla infectante a acuarios destinados para este fin. A. Corte de papilla
congelada. B. Pesaje de la cantidad necesaria por acuario. C. Suministro a cada uno de los acuarios. D.
Esparcimiento de la papilla por todo el àrea de superficie
Un día después de la infección (día 12), se hizo sifoneo de todos los acuarios para
extraer los residuos de la papilla y se reinició nuevamente el suministro de los pellets,
76
utilizando de aquí en adelante y en todos los tratamientos la dieta BASE (sin
ERGOSAN®), hasta terminar el experimento.
5.3.5 Registro de Mortalidad (Fase 5)
Esta fase consistió en el control y registro diario de las mortalidades que se
presentaron luego de la infección con el virus WSSV, mediante observación diaria sin
descuidar el estado de los animales infectados. La evaluación fue de manera
detallada, minuciosa y frecuente, para evitar el deterioro de la calidad del agua y la
sobreinfección por canibalismo de los animales sobrevivientes.
Los camarones que iban muriendo se retiraron de los acuarios, registrando luego las
bajas diarias en un formato diseñado para este fin. Se procuró hacer la recolección de
los animales muertos de forma cuidadosa y con instrumentos específicos para cada
tratamiento, esto con el fin de evitar contaminación cruzada entre los acuarios
infectados y los no infectados (ANEXO 7)
A
B
.
.
Figura 28: A. Recolección de animales moribundos. B. Registro de mortalidades en formato (No. de
acuario, hora y fecha de recolección)
5.3.5.1 Toma de muestras para pruebas confirmatorias de laboratorio
Durante esta fase de mortalidad, se tomaron 20 muestras de camarones moribundos,
es decir, un camarón por cada acuario infectado (10 camarones ERGOSAN® +
77
infección y 10 camarones Control + infección); para luego ser procesadas por tres
técnicas específicas. Lo anterior se hizo con el objeto de comprobar la infección de
los camarones por el virus WSSV. Los animales sintomáticos para estas pruebas,
fueron capturados entre las 36 h y las 62 h post-infección (ANEXO 8)
Las pruebas realizadas en cada uno de los 20 camarones infectados y moribundos de
los 2 tratamientos, fueron las siguientes:
1. Prueba Molecular: nested-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
2. Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)
3. Histopatología
A continuación se describen los métodos que se utilizaron para cada técnica en cuanto
a la recolección y toma de muestras:
Para la recolección de animales se trato en lo posible de escoger camarones
sintomáticos, además que presentaran letargia y pérdida del reflejo de huida, lo
último hace referencia a la ausencia de respuesta al momento de la captura. Luego de
capturado el camarón se le realizó un pesaje rápido, el cual fue registrado en el
formato de mortalidad. Posteriormente, se extrajeron asépticamente dos pleópodos
(primer par), los cuales se colocaron con la ayuda de una pinza desinfectada en un
microtubo que contenía 95% de etanol con el fin de fijar los tejidos. Los tubos
sellados se colocaron en bolsas plásticas debidamente rotuladas y enviadas al
laboratorio para realizarle la prueba de nested – PCR (Reacción en cadena de la
polimerasa).
Inmediatamente, se tomó el segundo par de pleópodos los cuales se utilizaron para la
prueba de inmunocromatografía. Esta técnica se realizó de manera inmediata con el
kit comercial Shrimple® (Fujikura Kasei Co., Ltd, Japón) en la Sala de Bioensayos.
Seguidamente y con los camarones aún vivos, se realizó fijación de los tejidos del
camarón con solución de Davidson (AFA) mediante inyección, estos se colocaron en
78
recipientes plásticos con tapa rosca que contenían este fijador. La muestra se dejo
sumergida por 48 horas en estos tarros y luego fueron transferidos a Etanol al 70%.
Las muestras fueron llevadas al laboratorio para su procesamiento histológico
mediante inclusión en parafina y tinción de Hematoxilina y Eosina de Harris
(modificada).
El procedimiento anterior se realizó para cada una de las muestras recolectadas (20);
cada vez que se inició el proceso, el material para la toma de muestras fue esterilizado
y/o desinfectado pasándolo por alcohol industrial, cloro y por último agua destilada.
Las muestras para nested – PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) e
histopatología se procesaron en UNICAM.
A
C
B
D
Figura 29: Proceso de toma de muestras de camarones moribundos infectados con WSSV. A.
Desinfección de material. B. Extracción aséptica de pleópodos para prueba molecular y de
inmunocromatogafía. C. Rotulacion de frascos tapa rosca con solución Davidson (AFA). D. Fijación
mediante inyección
79
5.4 Técnicas confirmatorias de la infección por el virus WSSV
Como se mencionó anteriormente, estas pruebas se realizaron con el fin de confirmar
que las muertes que se presentaron luego de la infección per os corresponden
exclusivamente al virus WSSV y no estuvieron determinadas por otro agente
patógeno ajeno al estudio.
5.4.1 Prueba molecular para la amplificación y detección del ADN viral (WSSV)
5.4.1.1 Extracción de ADN
Para esta técnica se siguió el protocolo utilizado por el laboratorio de UNICAM
(Unidad de investigación del Camarón, CAMACO S.A. Panamá), dicha extracción se
llevó a cabo por medio un método sencillo que se basa en el uso de un buffer de
lisis ( SDS-detergente no iónico), seguido de un choque mecánico y térmico.
Como las muestras para esta técnica se encontraban fijadas en etanol al 95% se pasó
la muestra a nuevos microtubos de 1.5 ml estériles. Luego se agregó por cada tubo
500 µl de solución salina estéril (NaCl 2%), y se invirtió el microtubo varias veces.
Este lavado se hizo por triplicado, lo que permitió eliminar el exceso de etanol de las
muestras de los tejidos.
De aquí se tomaron 50 mg y se colocaron en microtubos de 1,5 ml. Luego se
agregaron 400 µl del reactivo R1 (SDS 1% + NaOH 0,2 N – buffer de lisis) y con la
ayuda de un macerador se maceraron cuidadosamente los tejidos. Para cada muestra
se utilizaron maceradores distintos, previamente esterilizados.
Los microtubos se llevaron a incubar en baño seco a 95ºC por diez minutos, sobre
estos se colocaron seguros o cabaliers sobre la tapa, con el fin de prevenir que estas se
destaparan por causa de la presión. Finalizado este tiempo, se retiraron los microtubos
y se centrifugaron por diez minutos a 13000 rpm. separando de este modo la
impurezas.
80
Se transfirieron 200 µl del sobrenadante, donde se encontraba el ADN extraído, a un
nuevo microtubo de 1,5 ml. A este se le agregaron 400 µl de R2a (etanol al 99%) y se
homogenizó invirtiendo el tubo varias veces. Seguidamente se centrifugó por 5
minutos a 13000 rpm. logrando así precipitar el ADN al fondo del microtubo.
Luego se eliminó el sobrenadante cuidadosamente, para evitar la salida del pellet de
DNA y se agregaron 150 µl de R2b (etanol al 70%), el cual se homogenizó y se llevo
posteriormente a centrifugar por cinco minutos a 13000 rpm. lo anterior con el objeto
de purificar el DNA y lavar los residuos químicos.
Se sacaron los microtubos de la centrifuga y se eliminó en su totalidad el
sobrenadante, se dejó secar el microtubo en posición invertida por 15 minutos a
temperatura ambiente.
Transcurrido este tiempo, se resuspendió el pellet de DNA con 50 µl de R3 (TE =
Tris 10 mM + EDTA 1 mM), previamente calentado a 65ºC. Los tubos se llevaron a
refrigeración (4ºC).
A
B
.
.
C
D
.
.
Figura 30: Extracción de ADN. A. Lavado de muestras con solución salina estéril. B. Maceración de
tejidos. C. Incubación en baño seco. D. Precipitación de ADN en el fondo del microtubo
81
5.4.1.2 Nested – PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)
Para la preparación tanto de la primera como de la segunda reacción, el manejo de las
muestras se realizó sobre un recipiente congelado. Se utilizaron puntas con filtro
nuevas y guantes libres de RNasas.
En esta prueba se incluyó un control positivo C (+) que sirvió como testigo del buen
funcionamiento de la reacción y un control negativo C (-) que permitió confirmar que
los reactivos utilizados no estaban contaminados.
- Preparación de la primera reacción de PCR (Mix1)
Para la preparación del Mix de PCR se tomo en cuenta el número de muestras a
analizar más el control positivo C (+) y el negativo C (-) y una reacción adicional.
Para ello se remplazó la siguiente ecuación:
N= No. de muestras + C (+) + C (-) + 1
N = 20 + 1 C (+) + 1 C (-) +1
N= 23
La siguiente tabla indica el volumen de solución necesario para un tubo de la primera
reacción de PCR (Mix1), estos datos se usaron como base para hallar el volumen total
requerido para el análisis de las 23 muestras:
Tabla 10: Volúmenes necesarios para preparar Mix 1
Mix 1
Volumen (µl)
Premix
46,8
PWF1
1
PWR1
1
Taq DNA polimerasa
0,2
Volumen final
82
49 µl/ tubos
Donde, el Premix estaba constituido por una mezcla de 10 µL de Buffer 5X Colorless
(Promega cat. M792A), 3 mM de Cloruro de Magnesio MgCl2, 1 µL de
Desoxinucleotidos trifosfatados dNTPs (Promega cat. U151B), 32.8 µL de agua
destilada ultrapura (GIBCO cat. 10977-015) y los PWF1 – PWR1 (Concepto Azul,
Ecuador) corresponden a los primers o iniciadores específicos para el virus WSSV.
Luego de obtener el Mix1 se colocaron 49,0 µl en cada uno los 23 microtubos de 0.2
ml y se les adicionó 1 µl del ADN extraído. Se homogenizaron cuidadosamente y se
colocaron en el termociclador (MWC-Biotech Primus 96 plus), para así comenzar la
amplificación de secuencias especificas de ADN viral.
A continuación se resume el programa del termociclador y la actividad que se ejecuta
dependiendo de los cambios de temperatura:
Tabla 11: Programación del termociclador para la amplificación de secuencias
especificas del genoma viral (WSSV)
Ciclos
Temperatura (°C)
Tiempo (seg.)
Acción
Denaturación del
1 ciclo (inicial)
94
180 (3min.)
DNA
Denaturación del
30 ciclos
1 ciclo (final)
94
30
DNA
47
45
Anillaje
72
45
Extensión inicial
72
300 (5 min.)
Polimerización
4
indefinido
Conservación
- Preparación de la segunda reacción de PCR (Mix 2)
Para la segunda reacción se siguió el mismo procedimiento utilizado para la
preparación Mix1 (Tabla 10), a diferencia de este se hizo variación en los primers
83
(PWF2 y PWR2 - Concepto Azul, Ecuador). En este caso se tomo 1 µl de cada
microtubo de la primera reacción y se adicionaron a nuevos microtubos debidamente
marcados con el número de cada muestra, estos contenían 49,0 µl del Mix 2
previamente realizado. Las microtubos de 0.2 ml se colocaron en el termociclador
programado de igual forma que en la primera reacción (Tabla 11)
A
B
.
.
C
D
.
.
Figura 31: Técnica de nested-PCR A. Laboratorio de Biología Molecular – UNICAM. B. Preparación
de reactivos para PCR C. Adición de 1 µl de ADN extraído en microtubos. D. Termociclador
5.4.1.3 Observación e interpretación de resultados (nested-PCR)
La observación e interpretación de los resultados se hizo mediante Electroforesis en
gel de agarosa al 1.5%.
84
Para la preparación del gel se pesaron 1.5 g de agarosa, se colocaron en un
erlenmeyer con 240 ml de solución buffer (TAE = Tri Base + Acido acético +
EDTA), se mezclo bien y se puso a calentar por cinco minutos o hasta punto de
ebullición. Posteriormente se le adicionaron 12 µl de Bromuro de Etidio, se
homogenizó y se sirvió sobre la caja de pozos. Se dejó enfriar hasta gelificar,
aproximadamente durante un tiempo de 15 minutos.
Listo el gel se colocó sobre la cámara de electroforesis, para el llenado de los pozos
se depositaron 10 µl del producto de nested – PCR más 4 µl de azul de bromofenol
aproximadamente. Para la migración electroforética se programó el sistema con 90 v.
50 mA por 15 minutos. Luego de transcurrido el tiempo de migración se observaron
los resultados en el transiluminador (luz U.V.).
A
B
.
.
C
D
.
.
Figura 32: Observación e interpretación de resultados de la nested – PCR. A. Cámara para migración
electroforética y transiluminador. B. Mezcla del producto de la nested – PCR más azul de bromofenol.
C. Siembra sobre gel de agarosa. D. Observación de resultados en el transiluminador (Luz U.V.)
85
Para la interpretación se tubo en cuenta que: toda muestra que presente una banda al
mismo nivel de la banda observada para el control positivo C (+) se consideraron
como positivas. Y para el control negativa (-) debe estar ausente la banda.
5.4.2 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)
A partir del segundo par de pleópodos extraído de cada camarón, se realizó la técnica
de inmunocromatografía en la sala de Bioensayos. Para ello, se llevó a cabo la Prueba
de Shrimple® con el kit comercial.
A continuación se muestra un esquema que describe el procedimiento que se utilizó
para el procesamiento de los pleópodos de animales moribundos:
Figura 33: Shrimple® diagnostic test kit procedure diagram and potencial test results. Reprinted whith
permission from EnBioTec Laboratories Co., Ltd. Shrimple® Product Gruide, En Bio Shrimple virus
detection kit manual. (Figura tomada de: Powel James, 2006).
86
Al momento de colocar la muestra sobre el pozo, la membrana contiene en primera
instancia anticuerpos conjugados (gold labeled anti-WSSV) los cuales reconocen los
antígenos específicos de WSSV. Luego la membrana se divide en dos zonas, una
recubierta con anticuerpos monoclonales anti – WSSV (zona T) y anticuerpos
inmunoglobulinas G (IgG) (zona C). Los anticuerpos conjugados movilizan los
antígenos hasta la zona T, aquí son inmovilizados por los anti-WSSV produciéndose
una reacción colorimétrica sobre dicha zona. Los anticuerpos conjugados corren por
capilaridad y bloquean los anti – IgG, donde se produce una segunda reacción que
corresponde a la zona control. Si al final de la prueba aparecen dos bandas rosas tanto
en la zona T como en la zona C, está es considerada positiva para la presencia del
virus de la mancha blanca (WSSV), a diferencia de esto si la banda solo aparece en la
zona control esta es considerada como negativa. (ANEXO 9)
Las herramientas de diagnóstico molecular han hecho más precisa la detección del
virus WSSV, sin embargo, estas técnicas a menudo no son accesibles o no están
disponibles para el diagnóstico rápido en campo o en instalaciones de producción de
camarones. Por ello, es que esta técnica de inmunocromatografía esta diseñada
específicamente para el uso donde se necesitan resultados rápidos, ya que en
ocasiones el proceso para el análisis de muestras mediante biología molecular puede
tardar días.
Esencialmente, esta prueba de inmunoensayo está basada en fundamento de ELISA
(sándwich). Donde, se da una reacción de anticuerpos monoclonales con proteínas
estructurales del virus sobre una membrana de flujo lateral (Poulos et al., 2001; y.
Takahashi et al., 2003. En: Morales, V. y Cuéllar Anjel, J. 2008). En la prueba de
Shrimple® se utilizan anticuerpos específicos para antígenos específicos del virus
WSSV, que al unirse producen una reacción colorimétrica observándose así las
bandas de color rosa.
87
5.4.3 Histopatología
A partir de las muestras recibidas en frascos con etanol al 70%, se extrajeron los
camarones fijados y se sometieron a cortes longitudinales y transversales de
cefalotórax, branquias y abdomen (3er segmento). Las muestras fueron codificadas y
colocadas en un cassette histológico.
A
B
C
E
D
F
Figura 34: Procesamiento de muestras para técnica de histopatología. A. tejido conservado en etanol
al 70%. B. Corte de cefalotórax. C. Ubicación de cortes de tejidos en el cassette. D. Procesador de
tejidos. F. Colocación de casset en el primer envase. E. Inclusión de tejido en parafina
Para el procesamiento de las muestras se colocaron en una canastilla de metal, dentro
de un procesador de tejidos. Posteriormente se pasaron por recipientes que contenían:
etanol al 70% (dos envases),
etanol al 80% (dos envases), etanol al 95% (dos
envases), etanol al 100% (dos envases), Hemo De (o Xilol) (dos envases) y Parafina
88
derretida termostatada (dos envases). El procesador fue programado para que cada
muestra permaneciera por una hora en cada uno de los envases en un tiempo de 12 h
y durante este proceso ocurrió la correspondiente deshidratación y aclaración de los
tejidos.
Una vez procesadas las muestras se llevo a cabo la inclusión o penetración de la
parafina en el tejido, de esta forma se produjo el endurecimiento por congelación,
formando bloques sólidos denominados “tacos” y esos pasaron a ser cortados en el
micrótomo.
Se realizaron cortes a los bloques con un espesor de 3 µm. El ángulo del micrótomo
estaba ajustado a 5º y 6º. Para montar el tejido en el portaobjetos se utilizó el flotador
de tejido, que tiene como función extender el corte y eliminar pliegues. Este contenía
una mezcla de agua destilada, albúmina y gelatina para la adhesión del tejido a la
lámina portaobjetos y se encontraba a una temperatura de 60°C. Con el fin de
desparafinar las láminas estas se colocaron en un incubador a una temperatura de
65ºC – 70ºC por media hora.
Para la teñir las láminas se utilizó la Tinción con Hematoxilina y Eosina de Harris
(modificada). Al momento de la tinción se suspendieron las láminas en la siguiente
secuencia sobre los distintos reactivos:
1: Hemo De (5 min.), 2: Hemo De (5 min.), 3: Etanol 100% (2min.), 4: Etanol 100%
(2 min.) 5: Etanol 95% (10 inmenrsiones), 6: Etanol 95% (10 inmersiones), 7: Etanol
80% (10 inmersiones), 9: Agua destilada ( 2 – 3 inmersiones, con cambio de H2O por
cada baño), 10: Hematoxilina (4 – 6 min.) 11: Agua corriente (2- 3 min.), 12: Eosina (
1 inmersión), 13: Etanol 95% (10 inmersiones), 14: Etanol 95% (10 inmersiones), 15:
Etanol 100% ( 10 inmersiones), 16: Etanol 100% (10 inmersiones), 17: Hemo De (10
inmersiones), 18: Hemo De (10 inmersiones), 19: Hemo De (10 inmersiones), 20:
Hemo De (10 inmersiones)
89
Una vez realizada la tinción, las muestras se pasaron a una cámara de extracción
donde se limpiaron y se colocó sobre ellas un cubreobjetos con una gota de permount
(medio de montaje), de forma cuidadosa y evitando la formación de burbujas. Luego
se rotularon cada una de las láminas con el código correspondiente. Las láminas
histológicas fueron examinadas bajo el microscopio por el Dr. Jorge Cuéllar-Anjel,
Director de la Tesis y se registró el resultado obtenido por cada una de las muestras.
A
B
.
.
C
.
Figura 35: Observación de resultados de prueba Histopatologíca. A. Lámina portaobjetos con cortes
histológicos teñidos. B. Caja de 20 láminas histológicas debidamente rotuladas. C. Observación bajo el
microscopio de cada lámina analizada por el Dr. J. Cuéllar-Anjel.
5.5 Extracción de Hemolinfa (prueba complementaria)
En el ensayo se realizaron tres extracciones de hemolinfa en total, las muestras se
tomaron al cabo de 10 días de estar suministrando el producto comercial
90
ERGOSAN®, así como los días 20 y 30 luego de haberlo terminado de usar (Tabla
8). Luego de cada extracción, se hizo conteo de hemocitos en cada muestra.
Para la extracción de hemolinfa se colocó el camarón en posición ventro-dorsal
(“boca arriba”) dejando expuesta la zona de unión entre cefalotórax y abdomen (seno
hemolinfático ventral), luego se desinfectó la superficie con alcohol al 90% y
mediante una jeringa de insulina estéril nueva con aguja hipodérmica (1 mL) y
cargada con 100 L de anticoagulante (solución Alsever + formol 10%) se extrajeron
100 L de hemolinfa (relación hemolinfa anticoagulante de 1:1).
A
B
C
Figura 36: Proceso realizado para la extracción de hemolinfa en camarones. A. Ubicación del seno
hemolinfático ventral e introducción de aguja con bisel boca arriba. B. Extracción de hemolinfa. C.
Colocación de hemolinfa coagulada en cada uno de los microtubos de 1.5 ml, debidamente rotulados.
Se introdujo con cuidado el bisel de la aguja hacia arriba y al mismo tiempo se
succionó, extrayendo aproximadamente 100 µL de hemolinfa por cada camarón;
inmediatamente se homogenizó para evitar la coagulación de la hemolinfa. La
91
relación entre anticoagulante y hemolinfa fue de 1:1. (Cuéllar-Anjel, 2008. En:
Morales y Cuéllar-Anjel, 2008).
La muestra extraída en cada jeringa se colocó en microtubos estériles de 1.5 mL,
debidamente rotulados con cada número de camarón, estos se colocaron en bolsas
plásticas selladas marcadas con el rango de los números de los camarones analizados
por cada tratamiento.
5.5.1 Conteo de Hemocitos (Hemograma)
A cada una de las 60 muestras extraídas se les realizó conteo total y diferencial de
hemocitos, que corresponden a 30 camarones alimentados con dieta ERGOSAN ® y
30 camarones con dieta BASE.
Como el volumen de hemolinfa que contenían los microtubos no era exacto y
homogéneo, se tuvo en cuenta el factor de dilución al momento de hacer el conteo y
registrar los resultados. Para determinar el factor de dilución y partiendo de 100 L
de anticoagulante en todos los microtubos, se extrajo y registró la cantidad total de
hemolinfa anticoagulada con la ayuda de jeringas de 1 mL nuevas. (hemolinfa +
solución de Alsever). Para hallar el factor de dilución se realizó un cálculo entre el
volumen de hemolinfa coagulada entre el volumen de hemolinfa total. Los datos
obtenidos se registraron en un formato diseñado para tal fin.
FD= Vol. Ha (µL) /Vol. H (µL)
Donde,
FD = Factor de dilución
Vol. Ha = volumen de hemolinfa anticoagulada (extracción inicial de hemolinfa más
solución de Alsever)
Vol. H= volumen de hemolinfa extraído (Vol. Ha – 100)
92
5.5.1.1 Montaje en Cámara de Neubauer (Hematocitómetro)
Para el montaje de la cámara primero se hizo una limpieza con la ayuda de toallas de
papel humedecidas en agua destilada, se trató en lo posible de eliminar todos los
residuos tanto de la superficie de la cámara como de la laminilla de cuarzo.
Posteriormente, se colocó con mucho cuidado la laminilla sobre la cámara cubriendo
las cuadriculas. Con la ayuda de una micropipeta (1-200 µL) se tomaron 20 µL del
contenido de hemolinfa anticoagulada y se depositaron sobre el pozo de la cámara,
dejando que se esparciera lentamente el contenido por capilaridad. Para el análisis de
cada muestra se utilizaron puntas estériles diferentes y se llenaron los dos pozos
(inferior y superior) simultáneamente con muestras de hemolinfa diferentes.
De manera inmediata, se colocó la cámara de Neubauer en un microscopio de
contraste de fase y se observó con el objetivo 40X (y oculares 10X= 400X). Se
ubicaron los 5 cuadrantes pequeños de la cámara y el recuento se hizo con base en los
4 cuadros de las equinas y el central. Para llevar la cuenta de los hemocitos totales y
diferencial se utilizó un contador celular mecánico rotulado.
Para determinar el recuento total de hemocitos para cada muestra analizada se realizó
la siguiente ecuación:
THC: HC x 400 x 10 x 2/80
Donde,
THC = conteo de hemocitos totales
HC = número de hemocitos contados en los 5 cuadrantes
400 = cuadrículas pequeñas contenidas en la cámara (16 x 25 cuadrantes)
10 = ajuste por profundidad de la cámara (0.1 mm x 10 = 1 mm)
2 = factor de dilución del anticoagulante (1:1)
80 = total de cuadriculas por los 5 cuadrantes contados (16 x 5)
93
5.6 Análisis de la información
Los resultados de supervivencia obtenidos para cada tratamiento luego de la infección
con el virus WSSV, fueron registrados y analizados estadísticamente en formato
Excel®. Debido a que los resultados obtenidos estaban determinados en porcentaje y
hubo datos con valores desde “0” hasta “100”, los valores se sometieron a
transformaciones con raíz cuadrada de (X + 1), siendo en este caso “X” cada uno de
los resultados de supervivencia por acuario. Los resultados de las transformaciones
fueron sometidos a las pruebas estadísticas de ANOVA y Duncan, mediante el
programa estadístico SAS; con el objeto de hallar diferencias significativas entre los
tratamientos. En cuanto a la variable de supervivencia, las diferencias se consideraron
significativas cuando P ≤ 0.05.
En cuanto a los valores obtenidos para el recuento total y diferencial de hemocitos
(hemograma), estos también fueron sometidos a transformación pero en este caso se
utilizó logaritmo de (X + 1), siendo “X” el número de hemocitos por mm3 para cada
caso. De igual forma se les corrió análisis estadístico para buscar diferencias
significativas con el programa SAS y mediante ANOVA y Duncan, considerando
significativas las diferencias cuando P ≤ 0.06.
94
6. RESUTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Pruebas previas al experimento
Con relación a la población de camarones utilizada para el experimento, todos los
resultados fueron negativos mediante la técnica de nested – PCR para el virus WSSV,
la alfa Proteobacteria causante de la Hepatopancreatitis necrotizante (NHP) y el virus
de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoiética (por sus siglas en ingles IHHNV). Esto indica que los animales se encontraban libres de estos patógenos
específicos para camarones.
En cuanto a las condiciones del agua de las unidades experimentales y de la sala de
bioensayos, la temperatura del agua osciló entre 27ºC y 28.2 ºC, el oxígeno disuelto
estuvo en el rango de 4.6 a 5.5 mg/L y la salinidad estuvo entre 30 y 32 ppt (partes
por mil). Es de vital importancia mantener estas condiciones bajo control, ya que su
cambio drástico puede causar variaciones en la replicación del virus en los
camarones, obteniendo así resultados distintos a los esperados.
Con referencia al estado microbiológico del agua, se obtuvieron resultados
satisfactorios luego del tratamiento realizado con cloro. De todas las muestras
analizadas se realizó un promedio tanto del recuento total en Agar Marino como en
TCBS, antes y después del tratamiento. Las muestras sembradas en Agar marino
tuvieron como resultado antes del tratamiento, 2.7 x 10 6 UFC/mL y en Agar TCBS
2.3 x 103 UFC/mL. Posterior al tratamiento desinfectante, en Agar Marino se obtuvo
un crecimiento de 8.6 x 105 UFC/mL y no hubo crecimiento en Agar TCBS. Aunque
en Agar marino no hubo una reducción de crecimiento microbiano considerable luego
del tratamiento, este medio se usó para el aislamiento de bacterias totales en el agua
marina, siendo este no selectivo para las bacterias patógenas de camarones. Como
resultado favorable para las condiciones del agua de las unidades experimentales, no
se presentó crecimiento en Agar TCBS, el cual es un medio selectivo principalmente
para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae, muchas de las cuales son
patógenas para camarones. Lo anterior se considera importante dentro del desarrollo
95
del experimento, ya que hubo una reducción de la población patógena para los
animales, lo cual podría haber interferido con la salud de los camarones y por ende
con los resultados del estudio. (ANEXO 10)
En cuanto a las características morfológicas evidenciadas en el crecimiento sobre
Agar Marino, predominaron las colonias de un tamaño aproximado menor de 2mm,
borde liso y color crema. Como este medio proporciona a las bacterias condiciones
óptimas y ofrece nutrimentos similares al ambiente marino permitió el crecimiento
elevado y con colonias variadas. Las siembras en placa sobre TCBS, mostraron que
las colonias predominantes fueron sucrosa positiva (colonias amarillas) con relación a
las sucrosa negativa (colonias verdes). La bibliografía reporta que las colonias verdes
son las mas relacionadas con patogenicidad en camarones, mas aún si son
luminiscentes (Gómez-Gil, 1998).
Las bacterias principalmente las del género Vibrio, son consideradas como
patógenos oportunistas, ya que en presencia de otros factores estresantes, pueden
desencadenar el desarrollo de infecciones en los organismos (Gómez B., 2000).
Este tipo de bacterias causa infecciones letales al interactuar con factores
nutricionales, bióticos, abióticos, genéticos e inmunológicos. Las especies causantes
de altas mortalidades en las granjas camaronícolas son: Vibrio parahaemolyticus,
V. alginolyticus, V. harveyi,
y Photobacterium daunselae y las especies que
tienen cepas patógenas reportadas en los laboratorios causantes de mortalidades
en larvas y postlarvas son: V. harveyi, V. splendidus y Vibrio sp. Aunque
también son reportadas pero de manera ocasional en laboratorios y granjas de
camarón Photobacterium damsela, V. fuvialis y Vibrio sp. (Morales V., y Cuéllar –
Anjel J., 2008)
6.2 Manifestaciones clínicas de la enfermedad en camarones infectados
La prueba de desafío realizada mediante infección experimental, permitió observar
las manifestaciones clínicas que presentan los camarones al ser infectados por el virus
WSSV. Los principales signos clínicos que se observaron en la población infectada
96
fueron principalmente tracto intestinal vacío, dado la disminución del consumo de
alimento o al cese completo del mismo (OIE, 2000). Además, el exoesqueleto de los
camarones presentó una textura blanda, cromatóforos expandidos y una coloración
pálida generalizada, en algunos casos los animales tomaron una coloración rojiza
muy leve (OIE, 2000). Al momento de la captura de los animales moribundos, estos
se observaron letárgicos y con pérdida del reflejo de huída. También se visualizó en
los camarones ausencia de respuesta ante el ataque de otros camarones. Estos son los
signos clínicos característicos de la enfermedad de la mancha blanca en fase aguda,
que se observan en poblaciones de cultivo de camarón blanco en Centroamérica y
Sudamérica (Cuéllar-Anjel, com. pers.).
Como las mortalidades se dieron prácticamente en una fase muy aguda de la
infección, las manchas blancas bajo la cutícula fueron difíciles de discernir, solo en
algunos casos se observaron las inclusiones pero muy pequeñas. (OIE, 2000).
A
B
Figura 37: Comparación entre los signos clínicos presentados por un camarón infectado a diferencia
de un camarón sano. A. camarón con signos de la enfermedad por WSSV, coloración pálida y
levemente rojiza hacia los uropodos y pleópodos, cutícula flacida. B. cloración normal (animal
transparente) con cutícula rigida.
97
A
B
Figura 38: (A – B) Fotografías donde se puede observar a simple vista a partir de la separación
cuidadosa de la cutícula de los tejidos y sostenida hacia la luz, los pequeños puntos blancos que trata
de disposiciones anormales de sales de calcio. Foto “B” cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel.
Los signos externos pueden ser de gran ayuda como indicativos de una anomalía, en
cuanto al diagnóstico del virus WSSV (Alday, V. 1999), pero en este caso la
evaluación de signos clínicos solo se realizó para la obtención de resultados
presuntivos ya que estos no se pueden utilizar como único medio de diagnóstico, por
este motivo como se mencionó previamente, se decidió realizar las distintas pruebas
de análisis de mayor sensibilidad que nos permitieron confirmar la presencia del virus
en cada una de las muestras analizadas.
6.3 Pruebas confirmatorias del virus WSSV
Para corroborar que la alta mortalidad presentada en los acuarios infectados
corresponde a la infección por el virus WSSV, se realizaron tres tipos de análisis que
ratificaron la presencia del mismo y su efecto sobre los tejidos del camarón. Para los
tres casos se obtuvieron los resultados esperados, cada una de estas técnicas mostró
como positiva la presencia del virus.
6.3.1 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)
De forma inmediata, al momento de la recolección de muestras para la confirmación
de la presencia del virus en los camarones moribundos que presentaron uno o más
signos de esta enfermedad, se les realizó una prueba de inmunocromatografía en la
98
sala de bioensayos. Esta técnica logró corroborar en primera instancia el diagnóstico
presuntivo de la enfermedad causada por el virus WSSV. Luego de procesadas las 20
muestras estas arrojaron como resultado positivo a WSSV en todos los casos
sometidos a confirmación. (ANEXO 11)
A
B
Figura 39: (A) Fotografía que indica resultados positivos para el virus WSSV mediante la Prueba de
Shrimple®. (B) Zona C y Zona T con bandas color rosa. La muestra corresponde a un camarón
recolectado de un acuario sometido al tratamiento de la dieta BASE más infección con el virus WSSV
(Acu. 16 - CONTINF).
Para las 20 muestras analizadas mediante inmunocromatografía, todos los resultados
arrojados fueron positivos. Como la toma de muestras se realizó dentro de las 36 h y
las 62 h post-infección, esto favoreció la eficacia del kit (Shrimple®) en cuanto a la
detección del virus. Para la interpretación de los resultados se tuvo en cuenta lo
descrito por Powel James (2006) y el manual para el uso del kit comercial (EnBioTec
Laboratories Co., Ltd.) donde se debe considerar positivo para el virus WSSV cuando
99
la prueba da lugar a dos bandas de color rosa en la zona T y C, como se observa en la
Figura 39.
En la investigación realizada por Powel, J. (2006), donde se infectaron camarones
con el virus WSSV, se determinó el rango de sensibilidad en la que el kit de
diagnóstico es capaz de detectar el virus y el rendimiento del mismo en comparación
con las técnicas de PCR convencional y Real Time – PCR. Dentro de los resultados
se obtuvo que los resultados del test de Shrimple ® se correlacionan con los arrojados
por PCR convencional, en cuanto a los obtenidos por Real Time- PCR está técnica
posee una mayor especificidad y sensibilidad en comparación con las otras dos.
Aunque mucho menos sensible que la Real Time -PCR, los kits de la prueba de
Shrimple® proporcionan una herramienta útil para la detección de la infección
causada por el virus WSSV antes el desarrollo de signos graves de la enfermedad
aguda (12 horas post – infección) (Powel, J. 2006)
6.3.2 Nested – PCR (Reacción en cadena de la polimerasa anidada)
La Figura 40 revela los resultados obtenidos, luego de procesar las 20 muestras
tomadas al momento del registro de mortalidad. Como se observa en la fotografía del
gel de agarosa, todas las muestras son positivas, es decir, que el ADN del virus
WSSV fue amplificado satisfactoriamente, obteniendo así la debida confirmación.
Para la interpretación de los resultados se debe tener en cuenta que todas las muestras
que se encuentran en los carriles del 1 al 20 son consideradas como positivas ya que
presentan una banda al mismo nivel de la banda observada para el control positivo (C
+). En cuanto al control negativo (C-), no se observa ninguna banda lo que indica que
no hubo contaminación cruzada entre las muestras y tampoco hubo contaminación de
ADN en ninguno de los reactivos utilizados para la PCR. (Morales, M. 2009)
(ANEXO 12)
100
Figura40: Electroforesis en gel de agarosa que permite la observación de los resultados de la
amplificación del ADN viral mediante nested-PCR para cada una de las muestras procesadas. Los
controles están definidos de la siguiente forma: CP, control sin DNA (control negativo de PCR); CE,
control sin DNA (control negativo de extracción); Carriles del 1 al 20 son los productos de PCR. C (-),
control negativo y C (+) control positivo.
Estudios realizados por Hossain (2001) y Esparza–Leal (2009) demuestran que para
el análisis experimental de la inefectividad del virus sobre el camarón L. vannamei y
otras especies de crustáceos, se obtuvieron resultados de mayor sensibilidad
utilizando nested–PCR que PCR convencional.
A pesar de que está técnica tiene un alto grado de sensibilidad, existen inconvenientes
dentro de los cuales puede estar un elevado costo, requiere de personal y equipos
altamente
especializados
y,
en
ocasiones
pueden
existir
inhibiciones
y
contaminaciones que pueden dar resultados falsos positivos. Por lo anterior, se debe
tener conocimiento de la existencia de otras pruebas que nos permitan detectar la
presencia del virus.
6.3.3 Histopatología
Está técnica a parte de que nos confirmó la presencia del virus en las 20 muestras
analizadas, también nos permitió observar el daño que genera la infección del
101
patógeno viral sobre los tejidos del camarón. Las láminas con los cortes histológicos
fueron observadas y analizadas bajo en microscopio (400X y 600X) por el director de
la Tesis, Dr. Jorge Cuéllar–Anjel, Patólogo Veterinario especialista en organismos
acuáticos. Para esta prueba todos los resultados fueron positivos, donde se
encontraron hallazgos relacionados con el virus WSSV, clasificados dependiendo el
grado de severidad 0 – 4, siendo el 4 el más severo. (ANEXO 13)
Tabla 12: Hallazgos relacionados con la infección del virus WSSV en láminas
histológicas
No. muestra
No. Acu
Tratamiento
VAC
WSSV
1
5
ERGINF
1
4
2
2
ERGINF
1
3
3
14
CONTINF
2
3
4
9
ERGINF
3
4
5
7
ERGINF
3
4
6
11
CONTINF
3
3
7
1
ERGINF
4
4
8
8
ERGINF
1
4
9
18
CONTINF
3
4
10
12
CONTINF
1
4
11
13
CONTINF
3
4
12
10
ERGINF
0
4
13
15
CONTINF
2
4
14
20
CONTINF
3
4
15
4
ERGINF
2
3
16
6
ERGINF
3
4
17
3
ERGINF
1
4
18
17
CONTINF
2
4
19
16
CONTINF
2
3
20
19
CONTINF
2
1
VAC= nivel de vacuolas lipidícas en HP
WSSV= Lesiones causadas por el virus WSSV
HP= hepatopáncreas
0 - 4 = clasificación de grados de severidad siendo el 4 lo más severo
Como se observa en la Tabla 12 no hubo diferencias relevantes en la prevalencia de
hallazgos causados por el virus WSSV sobre los tejidos de camarones pertenecientes
tanto al tratamiento de la dieta con ERGOSAN® como la dieta BASE (control).
En general, los organismos infectados por WSSV presentaron cuerpos de inclusión
bastante prominentes, de tinción principalmente basofílica, los cuales son
102
aproximadamente 2-3 veces más grandes que el tamaño normal del núcleo
(forma variable de circular a irregular) y muy numerosos. (Morales V., y Cuellar–
Anjel J., 2008)
Figura 41: Microfotografía de tejido conectivo afectado por la infección del virus WSSV en una de las
muestras analizadas, donde se observa los núcleos hipertrofiados y con cuerpos de inclusión
basofílicos (600X). Foto cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel.
En todas las muestras analizadas se evidenció lo publicado por la OIE (2000), donde
los principales tejidos afectados son de origen ectodermal y mesodermal, en
particular el epitelio cuticular y tejidos subcuticulares del estómago, del cefalotórax y
de las branquias. Como se mencionó con anterioridad, estos presentan células con
núcleos hipertrofiados con inclusiones basofílicas centrales rodeadas de cromatina.
103
Figura 42: Microfotografía de láminas histológicas observadas bajo el microscopio (600X). A.
Epitelio cuticular que presenta células con núcleos hipertrofiados con inclusiones basofílicas. B.
Epitelio subcuticular de las branquias, donde se observan los cuerpos de inclusión característicos para
la enfermedad por WSSV. Fotos cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel.
Estudios realizados por Yoganandhan (2003) donde se evaluó detección temprana en
tejidos afectados por WSSV en camarones L. linicus mediante los métodos de
diagnóstico histopatología y PCR, permitieron determinar su sensibilidad para la
detección temprana de este virus y al igual que el bioensayo del que es objeto el
presente trabajo, las observaciones histopatológicas revelaron la presencia de cuerpos
de inclusión intracelulares en branquias, tejido blando, apéndice y tejido conectivo
después de 36 horas post – infección. El análisis mediante PCR en dicho estudio
reveló que el virus pudo ser detectado a las 6 horas post – infección en muestras de
hemolinfa y a las 12 horas post- infección en el resto de los órganos analizados. Lo
anterior, indica que la técnica molecular es de mayor sensibilidad pero cabe resaltar
que las dos técnicas utilizadas permiten la detección temprana del virus, sirviendo
como herramienta útil antes de que se alcancen mortalidades significativas en los
estanques de cultivo.
La ventaja de la histopatología es que nos permite observar detalladamente los
cambios a nivel celular que puede producir la infección del virus WSSV, es decir, que
esta técnica puede ser de tipo cualitativa.
104
6.4 Prueba de desafío mediante infección per os con el virus WSSV
Luego de la prueba de desafío mediante la infección per os con papilla positiva para
el virus WSSV, se produjo una mortalidad masiva de la población de los acuarios
infectados. (T2= dieta ERGOSAN ® + infección y T4= dieta BASE + infección). En
cuanto a los acuarios sometidos a los tratamientos T1 y T3 donde no hubo infección
(dieta ERGOSAN® sin infección y dieta BASE sin infección, respectivamente) no se
presentaron mortalidades. Los 20 acuarios de estos dos tratamientos a los cuales no se les
administró papilla infectante, se encontraban en cercanías a los acuarios infectados y bajo las
mismas condiciones. Lo anterior demuestra que durante la infección y toma de muestras se
realizó una buena manipulación que evitó la contaminación cruzada durante el experimento.
La infección de los camarones se realizó el día 10/12/09 a las 10:00 a.m., las
mortalidades se empezaron a presentar luego de transcurridas 28 horas post –
infección y este período culminó a las 192 horas post – infección. La primera
mortalidad se dio el día 11/12/09 a la 1:45 p.m. y la última muerte se registró el día
18/12/09 a las 11:20 a.m., es decir, siete días después. El registro de la mortalidad
acabó cuando se observó el cese de las mismas luego de transcurridas 48 horas
posteriores a la última mortalidad registrada. (ANEXO 7)
Tabla 13: Animales muertos y mortalidad (%) que se presentó en los acuarios
infectados
No. acuario
Tratamiento
No. CAM muertos
Mortalidad (%)
1
ERGINF
10
100
2
ERGINF
5
50
3
ERGINF
9
90
4
ERGINF
7
70
5
ERGINF
10
100
6
ERGINF
10
100
7
ERGINF
10
100
8
ERGINF
10
100
9
ERGINF
10
100
10
ERGINF
8
80
11
CONTINF
10
100
12
CONTINF
9
90
13
CONTINF
9
90
14
CONTINF
10
100
105
15
CONTINF
7
70
16
CONTINF
10
100
17
CONTINF
10
100
18
CONTINF
9
90
19
CONTINF
10
100
20
CONTINF
10
100
Como indica la Tabla 13 tanto en los acuarios tratados con la dieta BASE (T4) y la
dieta con ERGOSAN® (T2) se obtuvieron mortalidades del 100% transcurridos los 8
días post – infección. Esto demuestra la gran susceptibilidad de la especie
Litopenaeus vannamei (OIE, 2006) utilizada en el bioensayo, ante la infección del
virus de la mancha blanca WSSV. Este alto porcentaje de mortalidad se relaciona por
lo descrito en la publicación de Morales y Cuéllar–Anjel (2008) donde se afirma que
los animales que presentan signos clínicos característicos de la enfermedad pueden
exhibir altas tasas de mortalidad, alcanzando hasta el 100% de tres a diez días luego
de la infección.
Figura 43: Curva de mortalidad que se presentó luego de la infección per os con el virus WSSV a los
dos tratamientos infectados (T2 y T4). (D1 – D8 días de mortalidad post-infección)
106
Se puede observar en la gráfica anterior (Figura 43), que al finalizar la prueba de
desafío los animales sometidos a inmunoestimulación presentaron un porcentaje
menor de mortalidad, 89% dieta ERGOSAN ® contra un 94% para la dieta control.
Estos datos fueron analizados estadísticamente y no presentaron diferencias
significativas, sin embargo, esta diferencia puede ser de interés si el producto se
emplea como tratamiento preventivo, en condiciones de cultivo y en periodos de
tiempo prolongados.
El alto porcentaje de mortalidad obtenido para los dos tratamientos que se sometieron
a la infección con el virus WSSV, puede estar directamente relacionado con el efecto
causado por el la papilla infectante suministrada vía oral (per os). En este caso la
acción de la misma está determinada por la alta carga viral presente en la papilla (10 8
partículas virales en 50 mg), dicha virulencia de la papilla fue capaz de producir
mortalidades masivas según lo previsto para está prueba de desafío.
6.4.1 Relación de supervivencia entre los tratamientos infectados (T2 y T4) con
los no infectados (T1 y T3)
Con relación a la transformación de los resultados obtenidos para la supervivencia de
cada tratamiento, se obtuvo mediante la prueba de ANOVA y Duncan (P < 0.001)
que la supervivencia de los acuarios infectados es significativamente inferior a la
supervivencia obtenida para los acuarios no infectados. Como se mencionó con
anterioridad esto evidencia la capacidad infectante del virus sobre la supervivencia de
los camarones y el buen manejo de las fases en el bioensayo que evitó la
contaminación cruzada entre los acuarios. (ANEXO 14)
A partir de los datos transformados se realizó estadística descriptiva entre los cuatro
tratamientos. Donde, el coeficiente de variación fue de 22.8% y la desviación
estándar fue de 1.42.
107
Tabla 14: Camarones supervivientes y medias de supervivencia para cada uno de los
cuatro tratamientos
n final
Media de
Tratamiento
n inicial
(sobrevivientes)
supervivencia (%)
ERGOSAN® infectado (T2)
100
11
11a
Control Infectado (T4)
100
6
6a
ERGOSAN® no infectado (T1)
100
100
100b
Control no infectado (T3)
100
100
100b
La Tabla 14 presenta las medias de supervivencia por tratamiento, así como las
diferencias que se presentaron entre ellos. Las medias con igual letra, no presentan
diferencias significativas. Dicha significancia fue obtenida a partir del análisis
estadístico con valores transformados.
Figura 44: Gráfico de barras que muestra la diferencia entre el porcentaje de supervivencia de los
tratamientos infectados con los no infectados.
108
6.4.2 Relación de supervivencia entre el tratamiento con la dieta ERGOSAN ®
(T2) y el Control (T4) luego de la infección con el virus WSSV.
Con base en las transformaciones de los resultados obtenidos para la supervivencia de
los acuarios infectados, mediante la prueba de ANOVA y Duncan no se presentaron
diferencias significativas (Tabla 14) entre T2 y T4 (dieta ERGOSAN ® + infección y
dieta BASE + infección) P < 0.5786. (ANEXO 15)
En la práctica, el tratamiento con ERGOSAN ® infectado (T2) tuvo una supervivencia
promedio de 11% mientras que el Control (T4) obtuvo una supervivencia de 6%. A
pesar de que no se obtuvieron variaciones significativas a partir de la estadística
realizada, ésta diferencia podría considerarse interesante en condiciones de cultivo en
estanques o a gran escala, si se presenta de manera consistente en todas las unidades
de producción de una camaronera y a lo largo de los dos ciclos de cultivo del año
(estación seca, estación lluviosa y las respectivas fases de transición entre las dos
estaciones). Más aún, considerando que la carga viral utilizada para las infecciones en
este estudio, fueron por lo menos 1000 veces mayores a las que suceden en el medio
natural (105 viriones/50 mg en un estanque de cultivo contra 10 8 viriones/50 mg en
este estudio).
Tabla 15: Porcentaje de supervivencia por cada uno de los tratamientos infectados
durante 8 días luego de la infección per os con el virus WSSV.
Supervivencia (%)
Dia Post-infección
ERGOSAN
CONTROL
Día 1
81
80
Día 2
38
47
Día 3
32
37
Día 4
22
20
Día 5
15
13
Día 6
12
9
Día 7
11
7
Día 8
11
6
El coeficiente de variación (CV) de las medias de supervivencia transformadas para
los dos tratamientos infectados fue de 83.6% y una desviación estándar de 2.01. El
109
CV se considera elevado y fue debido a la amplia distancia entre los datos
transformados (1 a 10), estando esto relacionado con el control del error
experimental.
Figura 45: Curva de supervivencia obtenida para los dos tratamientos infectados con el virus WSSV.
Como se observa en el gráfico anterior (Figura 45) durante los primeros seis días, la
supervivencia de los camarones disminuye prácticamente al mismo ritmo, tanto para
el tratamiento con ERGOSAN® y el control. La diferencia, no tan notoria se da al
séptimo día en la cual se observa una estabilidad en el porcentaje de supervivencia en
los animales tratados con el inmuestimulante, mientras que en el control continúa
decreciendo hasta el día ocho, luego de esto la supervivencia se estabiliza, cuando la
supervivencia no es superior al 11%. Es importante resaltar que a pesar de que las
diferencias no fueron significativas en el análisis de los dos tratamientos, se sugiere
que al finalizar la prueba los resultados a favor del producto inmunoestimulante
pueden estar determinados a que una parte de la población responde positivamente al
producto o a un efecto tardío del mismo, lo que estabilizó la pendiente de
supervivencia en los últimos días del experimento.
110
Tabla 16: Sobrevivencia de cada uno de los acuarios por cada tratamiento infectado con WSSV
Tratamiento/ Acu.
Sobrevivencia por acuario (%)
ERGINF - 1
ERGINF - 2
ERGINF - 3
ERGINF - 4
ERGINF - 5
ERGINF - 6
ERGINF - 7
ERGINF - 8
ERGINF - 9
ERGINF - 10
Media
CONTINF - 11
CONTINF - 12
CONTINF - 13
CONTINF - 14
CONTINF - 15
CONTINF - 16
CONTINF - 17
CONTINF - 18
CONTINF - 19
CONTINF - 20
Media
0
50
10
30
0
0
0
0
0
20
11
0
10
10
0
30
0
0
10
0
0
6
El siguiente gráfico (Figura 46) demuestra el pocentaje de supervivencia alcanzado
por cada uno de los acuarios de los dos tratamientos analizados. Como se puede
observar el acuario que alcanzó la mayor supervivencia corresponde a animales
tratados con el producto inmunoestimulador, con un 50% de supervivencia. A pesar
de que luego de la infección per os con el virus se observó similaridad en el
comportamiento de los animales y en la frecuencia de las muertes, los acuarios
tratados con ERGOSAN® quedaron con mayoría de animales sobrevivientes a
diferencia de los acuarios tratados con dieta BASE.
111
Figura 46: Gráfico que muestra la tendencia de las poblaciones sobreviventes por cada uno de los
acuarios.
No obstante, haber obtenido datos que no mostraron resultados con diferencias
significativas, no se debe dejar a un lado la idea de la búsqueda de nuevas estrategias
y alternativas, que se conviertan en medidas preventivas cuando los camarones se
enfrenten a infecciones severas como la del virus WSSV. La inmunoestimulación en
la actualidad pese a que todavía es un tema controversial, se ha convertido en fuente
de estudio por muchos investigadores que pretenden aumentar la resistencia natural
de estos animales, dado la imposibilidad de ser vacunados.
Está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en los cultivos
de camarones, depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, (buena
calidad del agua, adecuada densidad poblacional, buena nutrición y reducción
de los factores ambientales potencialmente estresantes. El uso de sustancias
capaces de aumentar la inmunocompetencia de los camarones, en paralelo a un buen
manejo del cultivo, apunta ciertamente como una herramienta promisoria en la
búsqueda de una mayor protección inmunológica contra el desarrollo de infecciones.
112
Existen
en
nuestros
días
muchas
sustancias
que
son
utilizadas
como
inmunoestimulantes, Entre los compuestos más utilizados en los cultivos se destacan
los β-1,3/1,6-glucanos de hongos o algas, PGs de bacterias Gram-positivas, LPS de
bacterias Gram-negativas, polisacáridos sulfatados de algas y algunas proteínas
virales. Entre estos inmunoestimulantes, los β-glucanos son tal vez los más
ampliamente utilizados para camarones y los presumiblemente más inmuno efectivos
y compatibles con la práctica de la camarinocultura (revisión de Smith et al., 2003
En: Morales V., y Cuéllar Anjel J., 2008)
6.5 Efecto del Inmunomodulador comercial (ERGOSAN®) sobre el recuento de
hemocitos
6.5.1 Recuento luego de diez días de suministro de dieta ERGOSAN ®
Luego del hemograma realizado después de haber suministrado el producto por 10
días, se observaron diferencias significativas en los hemocitos semigranulares
(P<0.01) y en los hemocitos totales (P<0.02), a favor del tratamiento Control. No se
presentaron diferencias significativas en el recuento de hemocitos granulares y los
hialinos entre el tratamiento ERGOSAN® y el tratamiento Control. (ANEXO 16)
Tabla 17: Datos promedio de los conteos de hemocitos diferenciales y totales luego de
transcurridos 10 días de tratamiento con ERGOSAN®
Granulares
Semi.
Hialinos
Totales
ERGOSAN
1018a
7557a
1274a
9849a
Control
1453a
12848b
1130a
15431b
Diferencia
-29,90%
-41,20%
+12,70%
-36,20%
®
113
Figura 47: Gráfico que demuestra las diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de
hemocitos luego de diez días de suministro de la dieta a base del producto comercial ERGOSAN®
6.5.2 Recuento 20 días después de terminado el suministro de dieta ERGOSAN ®
El conteo de hemocitos hecho 20 días después de terminado el suministro de dieta
con ERGOSAN®, arrojó valores muy distintos a los obtenidos en el recuento luego de
diez días con el producto. En este último caso se observó una tendencia positiva en
favor del producto. A partir del análisis estadístico de los datos, se obtuvieron
diferencias significativas en los hemocitos hialinos (P<0.006) y en los totales
(P<0.06). En el recuento de los hemocitos granulares y semigranulares aunque no se
presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, se observó una ganancia
del 56.5% y 58.8% respectivamente, favorable para el tratamiento donde se utilizó la
dieta ERGOSAN®. (ANEXO 17)
Tabla 18: Datos promedio de los conteos de hemocitos diferenciales y totales
luego de transcurridos 20 luego del tratamiento con ERGOSAN®
Granulares
Semi.
Hialinos
Totales
Control
3621a
2313a
20804a
13097a
4486a
1727b
28912a
17137b
Diferencia
+56,50%
+58,80%
+159,80%
+68,70%
®
ERGOSAN
114
Figura 48: Gráfico que demuestra las diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de
hemocitos luego de 20 días de haber culminado el suministro de la dieta a base del producto comercial
ERGOSAN®
Como se observa en la gráfica (Figura 48) luego del recuento de los hemocitos totales
se nota una diferencia marcada entre el tratamiento con ERGOSAN® y el control.
Aunque no es clara la causa del incremento del hemograma tras 20 días de terminado
el tratamiento con el inmunoestimulante, esto se podría considerar como un efecto
favorable tardío del producto, lo cual amerita estudios específicos y dirigidos en
especial a los mecanismos de acción directa de los alginatos extraídos de microalgas
y macroalgas marinas, de los cuales está compuesto este inmunoestimulante.
Con base en la publicación de Cheng–Fang C. (2000), donde se analizó el efecto de
una dieta a base de β-1,3 glucanos sobre la supervivencia de camarones Penaeus
monodon y parámetros inmunológicos (actividad fagocítica de los hemocitos y la
producción de aniones superóxido). Los resultados que se obtuvieron demostraron
que los animales alimentados con la dieta a base de β-1,3 glucanos presentaron mayor
supervivencia
(P<0.001)
con respecto
al
grupo
control.
Los
camarones
inmunoestimulados revelaron además un aumento en la actividad fagocítica de los
hemocitos y la producción de anión superóxido. Los resultados a favor del
115
inmunoestimulante se alcanzaron 24 días después de iniciar la exposición alimentaria.
Lo anterior, confirma la hipótesis de que el aumento de los hemocitos pudo darse por
un efecto tardío del producto diez días después de haber finalizado la dieta
experimental. Posiblemente si se realizan experimentos con dosis más elevadas de
ERGOSAN® y en tiempos más prolongados, se pueden obtener mejores resultados en
cuanto al fortalecimiento del sistema inmunitario, reflejándose en una mayor
supervivencia de los camarones al momento de enfrentarse a infecciones del virus
(WSSV), minimizando así el impacto causado por la enfermedad.
6.5.3 Recuento 30 días después del suministro de dieta ERGOSAN ®
Treinta días después de terminado el suministro de la dieta con ERGOSAN®, se
realizó el último recuento de hemocitos en el experimento. El conteo a los 30 días
disminuyó retomando a valores similares con respecto a los obtenidos para el
tratamiento control. En este caso no se registraron diferencias significativas en
ninguno de
los dos tratamientos entre las células hemáticas. Sin embargo, se
mantuvo una leve tendencia en el recuento de los hemocitos totales en favor del
producto comercial ERGOSAN®. (ANEXO 18)
Tabla 19: Datos promedio de los conteos de hemocitos diferenciales y totales luego
de transcurridos 30 días de haber culminado el tratamiento con ERGOSAN®
Granulares
Semi.
Hialinos
Totales
®
1919a
15435a
1650a
19003a
ERGOSAN
1965a
14366a
1395a
17726a
Control
-2,30%
+7,40%
+18,30%
+7,20%
Diferencia
116
Figura 49: Gráfico que demuestra las diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de
hemocitos luego de 30 días de haber culminado el suministro de la dieta a base del producto comercial
ERGOSAN®
ERGOSAN® es un producto que contiene alginatos provenientes de algas, se usa en
acuicultura ya que al parecer posee actividad inmunoestimulante. En la publicación
de Montero–Rocha (2000) se evaluó este producto a partir del suministro vía oral en
camarones L. vannamei durante 15 días. Para determinar la actividad del producto se
realizó un examen de las proteínas de la hemolinfa, las cuales no revelaron ninguna
diferencia entre el control y los camarones tratados con ERGOSAN®. Del mismo
modo, el total de los recuentos de hemocitos resultó ser más o menos equivalente
tanto para el control como para las muestras experimentales. Sin embargo, el análisis
diferencial de hemocitos revelaron cambios marcados en términos de conteo de
hemocitos granulares, hialinos y semigranulares. Donde, los hemocitos granulares
fueron más altos en los animales control con respecto a los tratados. En cuanto a los
hemocitos hialinos y semigranulares el recuento fue significativamente mayor a
diferencia del recuento para los animales control. En este estudio se determinó que
los niveles bajos de hemocitos granulares en los animales con la dieta ERGOSAN®
pudo haber surgido por la degranulación de dichos hemocitos como respuesta a la
117
acción del inmunoestimulante, lo que tiene como resultado la liberación de sustancias
antimicrobianas en la hemolinfa.
A continuación en la Tabla 20, se muestra un consolidado en cuanto al promedio de
los tres recuentos realizados transcurridos 30 días luego del suministro del producto
ERGOSAN® y su respectivo control negativo.
Tabla 20: Consolidado de hemogramas en cada uno de los
recuentos realizados durante el experimento con el
producto comercial ERGOSAN®
HEMOCITOS
ERGOSAN
CONTROL
Gra10con
1018
1453
Gra20sin
3621
2313
Gra30sin
1919
1965
Semi10con
7557
12848
Semi20sin
20804
13097
Semi30sin
15435
14366
Hial10con
1274
1130
Hial20sin
4486
1727
Hial30sin
1650
1395
Total10con
9849
15431
Total20sin
28912
17137
Total30sin
19003
17726
Donde, Gra = granulares, Semi= semigranulares, Hial= hialinas, Total= totales,
10con= 10 días con ERGOSAN®, 20sin= 20 días después de terminar el tratamiento
con ERGOSAN®, 30sin= 30 días después de terminar el tratamiento con
ERGOSAN®.
118
Figura 50: Gráfico que muestra consolidado de hemogramas realizado para el recuento de hemocitos a
camarones tratados con ERGOSAN® con respecto a los dispuestos para Control (dieta BASE)
En la gráfica anterior (Figura 50), se observa que para el recuento diferencial y total
(granulares, semigranulares, hialinos y totales) de los hemocitos, existe una marcada
diferencia en el conteo luego de 20 días sin el tratamiento con el inmunoestimulante
(ERGOSAN®), las barras indican claramente que existe un aumento significativo a
favor del tratamiento ERGOSAN®, como se mencionó anteriormente esto puede estar
determinado por un efecto tardío del producto. Es necesario realizar estudios más
detallados y encaminados específicamente al efecto que pueden estar produciendo los
alginatos y polisacáridos de micro y macroalgas (compuestos inmunoestimulantes del
producto ERGOSAN®) sobre la viabilidad y proliferación de los hemocitos de
camarones.
119
7. CONCLUSIONES
1.
La mortalidad fue inferior en los animales inmunoestimulados (89%) que en el
Control (94%).
2.
La virulencia del virus WSSV presente en la papilla fue capaz de producir
mortalidades masivas según se esperaba para esta prueba de desafío.
3.
El comportamiento de los Controles negativos (dieta ERGOSAN ® y dieta BASE,
sin infección con WSSV) fue el esperado, con una supervivencia de 100% en
ambos casos; esto demuestra adecuada manipulación durante el estudio y
ausencia de contaminación cruzada entre los acuarios infectados y los no
infectados.
4.
La supervivencia de los camarones tratados con ERGOSAN ® (11%) fue superior
a la de los animales Control (6%), aunque no se presentaron diferencias
significativas (P<0.05).
5.
Los conteos de hemocitos no fueron superiores con el producto ERGOSAN ®
luego de diez días con respecto al Control, pero sí aumentaron significativamente
(P<0.06) 20 días después de terminada la aplicación del producto, retornando a
los niveles originales 10 días más tarde.
6.
Se cumplieron los postulados de Koch en este estudio, al aislar e identificar
molecularmente el virus WSSV, infectando artificialmente camarones sanos y
logrando así reproducir la enfermedad con manifestación de signos clínicos
característicos de la enfermedad y aislando de éstos nuevamente el agente
etiológico (WSSV).
7.
Las tres técnicas de diagnóstico utilizadas para detectar presencia del virus
WSSV en 20 camarones moribundos de los 20 acuarios sometidos a infección
experimental (histopatología, inmunocromatografía y nested–PCR) permitieron
120
detectar en los 20 organismos el agente patógeno (WSSV), así como las lesiones
celulares producidas por este tras la infección vía oral.
8.
Mediante la técnica histopatológica se identificaron las lesiones celulares severas
en los tejidos susceptibles al virus (branquias, tejido conectivo, epitelio cuticular,
entre otros), donde en todos los casos se observaron los cuerpos de inclusión
intracelulares característicos de la infección por WSSV.
9.
No fueron detectados histopatológicamente, lesiones o agentes patógenos
distintos a WSSV, capaces de causar enfermedad y mortalidad en camarones
penaeidos (ej.: otros virus como TSV, bacterias extracelulares, bacterias
intracelulares, hongos o protozoarios).
10. Se mantuvieron las condiciones bajo control en la Sala de Infecciones
Experimentales durante todo el desarrollo del ensayo, lo que evitó que causas
ajenas al experimento pudieran intervenir en los resultados del estudio.
121
8. RECOMENDACIONES
1. Realizar pruebas del desafío con el virus WSSV en salas experimentales, donde se
evalúen nuevos productos inmunoestimulantes, probióticos, bloqueadores virales
entre otros, que sirvan en un futuro como herramientas preventivas contra la infección
causada por el virus de la mancha blanca (WSSV) en camarones Litopenaeus
vannamei .
2. Con base en los resultados obtenidos en este estudio, se recomienda realizar
pruebas con dosis más elevadas de ERGOSAN ® y un suministro más prolongado en
el tiempo, con el objeto de buscar mejores resultados de supervivencia en función de
minimizar el impacto del virus WSSV sobre camarones infectados de forma
experimental.
3. Para que lo anterior se cumpla, es necesario realizar estudios más detallados y
encaminados específicamente al efecto que pueden estar produciendo los alginatos y
polisacáridos de micro y macroalgas (compuestos inmunoestimulantes del producto
ERGOSAN®) sobre la viabilidad y proliferación de los hemocitos de camarones.
4. Realizar pruebas de campo tendientes a obtener supervivencias más altas en
estanques tratados con ERGOSAN® respecto a estanques Control, tanto en la estación
seca como en la estación lluviosa de CAMACO, a partir de las dosis utilizadas en el
presente bioensayo y esperando una separación importante de los resultados de
supervivencia en favor del ERGOSAN ® bajo condiciones de cultivo.
122
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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129
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130
10. ANEXOS
Anexo 1. Nested - PCR para WSSV, IHHNV, NHP
Anexo. 2 Medios de cultivo
Agar Marino
Agar Difco™ Marine (BD, ref. 212185, lot. 5333528): Medio para aislamiento,
cultivo y enumeración de bacterias heterótrofas marinas.
131
Composición (g/L):
Peptona
5.0 g
Extracto de levadura
1.0 g
Citrato ferrico
0.1 g
Cloruro de sodio
19.45 g
Cloruro de Magnesio
8.8 g
Sulfato de Sodio
3.24 g
Cloruro de Clacio
1.8 g
Cloruro de Potasio
0.55 g
Bicarbonato de sodio
0.16 g
Bromide Potasio
0.08 g
Chloruro Strontium
34.0 mg
Acido bórico
22.0 mg
Silicado sódico
4.0 mg
Floruro de sodio
2.4 mg
Nitrato de Amonio
1.6 mg
Fosfato disodio
8.0 mg
Agar
15.0 g
Preparación:
1.Suspender 55.1 g de polvo en 1 L de agua.
2. Agitar frecuentemente durante 1 minuto hasta dislover completo el polvo
3. Autoclave a121°C po 15 minutos.
Modo de Acción: la Peptona y el extracto de levadura proporcionan el nitrógeno,
vitaminas y minerales. El volumen de sal alto ayuda simular el agua del mar.
Numerosos minerales también son incluidos para simular lo mayor posible la
composición de agua del mar. El Agar es el agente solidificante.
132
Agar TCBS (Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa)
Difco™ TCBS Agar (BD, ref. 265020, lot. 8021353): Medio selectivo para vibrio sp.
Composición (g/L):
Extracto de levadura
5.0 g
Peptona Proteosa No. 3
10.0 g
Citrato de Sodio
10.0 g
Thiosulfato de Sodio
10.0 g
Oxgall
8.0 g
Sacarosa
20.0 g
Cloruro de Sodio
10.0 g
Citrato de Amonio Ferrico
1.0 g
Azul de Bromotimol
0.04 g
Azul de timol
0.04 g
Agar
15.0 g
Preparación:
1. Suspender 89 g del polvo en 1 L de agua purificada. Mezclar fuertemente
2. Calentar con frecuente agitacion hasta disolver el polvo.
3. Enfriar a 45-50 ºC y servir inmediatamente. No autoclavar.
Modo de acción: Las concentraciones altas de tiosulfato y citrato y
la fuerte
alcalinidad de este medio inhiben ampliamente el crecimiento de Enterobacterias. La
bilis de buey y el colato suprimen enterococos principalmente. Cualquier bacteria del
coliforme que puede crecer no puede metabolizar la sucrosa. Sólo unas cepas de
Proteus sucrosa-positivas pueden crecer y formar color amarillo. El timol e indicador
mixto azul-bromothymol produce el cambio a color amarillo cuando el ácido se
forma, incluso en este medio fuertemente alcalino.
133
Anexo 3. Etiqueta alimento “CAMPENT-TOP”
134
Anexo. 4 Etiqueta producto comercial ERGOSAN®
135
Anexo 5. PCR – Papilla infectante
136
Anexo 6. Resultados para prueba de virulencia de la papilla infectante
Sala de Infección experimental - Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Bioensayo - Efecto del producto ERGOSAN sobre la sobrevivencia de camarones Litopenaeus vannamei
PRUEBA DE VIRULENCIA - PAPILLA INFECTANTE (10E+8 viriones/50 mg)
Tratamiento
Total CAM.
Exp.
Fecha
DPI
Hora
Peso (g)
CAMINF
1
09/12/2009
2
07:00 a.m.
1,3
CAMINF
2
09/12/2009
2
07:15 a.m.
1,3
CAMINF
3
09/12/2009
2
11:00 a.m.
1,2
CAMINF
4
09/12/2009
2
11:15 a.m.
1,2
CAMINF
5
09/12/2009
2
11:30 a.m.
1,6
CAMINF
6
09/12/2009
2
04:00 p.m.
1,1
CAMINF
7
09/12/2009
2
04:45 p.m.
1,1
CAMINF
8
10/12/2009
3
07:00 a.m.
1,1
CAMINF
9
10/12/2009
3
01:00 p.m.
1,6
CAMINF
10
SOBRE.
ND
ND
ND
Día de infección 07/12/09 6:00 p.m. DPI= Día post - infección, CAMINF= Camarones
infectados con papilla - WSSV
Primera mortalidad (37 horas post - infección)
Última mortalidad (66 horas post - infección)
SOBRE.= Animal sobreviviente ND= no hay datos de mortalidad
137
Anexo 7. Registro de Mortalidad
No.
Acuario
No.
CAM
Total CAM
INF.
Tratamiento
Fecha
DPI
Hora
Peso (g)
1
1
1
ERGINF
11/12/2009
1
03:30 p.m.
2.3
1
2
2
ERGINF
12/12/2009
2
02:26 a.m.
1.6
1
3
3
ERGINF
12/12/2009
2
01:30 p.m.
1.5
1
4
4
ERGINF
12/12/2009
2
02:35 p.m.
1.7
1
5
5
ERGINF
12/12/2009
2
04:45 p.m.
1.4
1
6
6
ERGINF
12/12/2009
2
04:45 p.m.
1.0
1
7
7
ERGINF
12/12/2009
2
08:30 p.m.
1.5
1
8
8
ERGINF
14/12/2009
4
05:00 a.m.
2.4
1
9
9
ERGINF
14/12/2009
4
09:35 a.m.
1.6
1
10
10
ERGINF
14/12/2009
4
01:30 p.m.
2.9
2
1
11
ERGINF
11/12/2009
1
11:15 p.m.
1.3
2
2
12
ERGINF
12/12/2009
2
07:07 a.m.
2.0
2
3
13
ERGINF
12/12/2009
2
11:30 a.m.
1.5
2
4
14
ERGINF
12/12/2009
2
12:12 p.m.
2.5
2
5
15
ERGINF
14/12/2009
4
10:50 a.m.
1.2
2
6
16
ERGINF
SOBREV.
ND
ND
ND
2
7
17
ERGINF
SOBREV.
ND
ND
ND
2
8
18
ERGINF
SOBREV.
ND
ND
ND
2
9
19
ERGINF
SOBREV.
ND
ND
ND
2
10
20
ERGINF
SOBREV.
ND
ND
ND
138
3
1
21
ERGINF
11/12/2009
1
01:45 p.m.
1.5
3
2
22
ERGINF
11/12/2009
1
08:00 p.m.
1.5
3
3
23
ERGINF
11/12/2009
1
09:40 p.m.
1.5
3
4
24
ERGINF
12/12/2009
2
06:15 a.m.
1.4
3
5
25
ERGINF
12/12/2009
2
06:42 a.m.
1.6
3
6
26
ERGINF
12/12/2009
2
09:57 p.m.
1.7
3
7
27
ERGINF
13/12/2009
3
07:25 p.m.
1.6
3
8
28
ERGINF
14/12/2009
4
09:08 a.m.
2.1
3
9
29
ERGINF
15/12/2009
5
07:20 a.m.
1.5
3
10
30
ERGINF
SOBREV.
ND
ND
ND
4
1
31
ERGINF
11/12/2009
1
01:45 p.m.
1.5
4
2
32
ERGINF
11/12/2009
1
11:57 p.m.
2.7
4
3
33
ERGINF
12/12/2009
2
06:16 a.m.
1.8
4
4
34
ERGINF
12/12/2009
2
06:36 a.m.
2.7
4
5
35
ERGINF
12/12/2009
2
12:45 p.m.
1.8
4
6
36
ERGINF
14/12/2009
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11/12/2009
1
06:20 p.m.
1.7
20
3
193
CONTINF
11/12/2009
1
10:50 p.m.
1.7
20
4
194
CONTINF
11/12/2009
1
10:50 p.m.
1.5
20
5
195
CONTINF
12/12/2009
2
11:47 a.m.
2.2
20
6
196
CONTINF
13/12/2009
3
06:00 a.m.
2.7
20
7
197
CONTINF
13/12/2009
3
06:20 a.m.
2.4
20
8
198
CONTINF
13/12/2009
3
12:50 p.m.
2.1
20
9
199
CONTINF
14/12/2009
4
07:15 a.m.
1.5
10
200
CONTINF
15/12/2009
5
12:45 a.m.
1.0
20
Día de infección Fecha: 10/12/09 Hora: 10:00 a.m.
Animales sobrevivientes
Primera mortalidad de camarones infectados (28 horas post - infección)
Última mortalidad de camarones infectados (192 horas - 8 días post - infección)
No.
Número
DPI
Día post - infección
SOBRE. Sobreviviente
ND.
No hay dato de mortalidad
143
Anexo 8. Registro de toma de muestras
No.
muestras
No.
Acuario
Tratamiento
DPI
Peso (g)
1
5
ERGINF
11/12/2009 09:50 p.m.
1
1,3
2
2
ERGINF
11/12/2009 11:15 p.m.
1
1,3
3
14
CONTINF
11/12/2009 11:40 p.m.
1
1,8
4
9
ERGINF
12/12/2009 12:47 a.m.
2
1,3
5
7
ERGINF
12/12/2009 12:53 a.m.
2
1,8
6
11
CONTINF
12/12/2009 01:03 a.m.
2
1,3
7
1
ERGINF
12/12/2009 02:26 a.m.
2
1,6
8
8
ERGINF
12/12/2009 06:22 a.m.
2
1,5
9
18
CONTINF
12/12/2009 06:40 a.m.
2
2
10
12
CONTINF
12/12/2009 06:54 a.m.
2
2,1
11
13
CONTINF
12/12/2009 06:56 a.m.
2
2,2
12
10
ERGINF
12/12/2009 07:43 a.m.
2
2,9
13
15
CONTINF
12/12/2009 08:20 a.m.
2
1,8
14
20
CONTINF
12/12/2009 11:47 a.m.
2
2,2
15
4
ERGINF
12/12/2009 12:45 p.m.
2
1,8
16
6
ERGINF
12/12/2009 05:16 p.m.
2
1,6
17
3
ERGINF
12/12/2009 09:57 p.m.
2
1,7
18
17
CONTINF
12/12/2009 10:17 p.m.
2
1,8
19
16
CONTINF
12/12/2009 10:43 p.m.
2
1,5
20
19
CONTINF
12/12/2009 11:30 p.m.
2
1,5
Fecha
144
Hora
Anexo 9. Shrimple® - Manual Kit EnBioTec
145
Anexo 10. Recuento microbiológico de agua marina
151
Anexo 11. Registro de resultados para Pruebas de Shrimple®
152
Anexo 12. Registro de resultados para técnica Nested – PCR
153
Anexo 13. Registro lectura de láminas histopatológicas
154
Anexo 14. ANOVA y Duncan entre los cuatro tratamientos
ANOVA Y DUNCAN DE SUPERVIVENCIA TRANSFORMADA CON RAÍZ DE (X+1)
The SAS System
10:39 Wednesday, January 14, 1998
1
Analysis of Variance Procedure
Class Level Information
Class
Levels
TRATAM
Values
4
CONTINF CONTNOIN ERGINF ERGNOINF
Number of observations in data set = 40
Analysis of Variance Procedure
Dependent Variable: SUP
Source
F
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr >
Model
0.0001
3
585.53802701
195.17934234
96.39
Error
36
72.89846306
Corrected Total
39
658.43649007
R-Square
C.V.
0.889286
22.84826
Source
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
Pr > F
TRATAM
3
585.53802701
195.17934234
96.39
0.0001
2.02495731
Root MSE
SUP Mean
1.42300995
6.22808861
Duncan's Multiple Range Test for variable: SUP
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05
df= 36
MSE= 2.024957
Number of Means
2
3
4
Critical Range 1.291 1.357 1.400
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
A
A
A
10.0499
10
CONTNOIN
10.0499
10
ERGNOINF
B
B
B
2.6608
10
ERGINF
2.1518
10
CONTINF
155
TRATAM
Anexo 15. ANOVA y Duncan para tratamientos infectados
ANOVA y Duncan para supervivencia de INFECTADOS transformada con raíz
(X+1)
Bioensayo con ERGOSAN – Noviembre y Diciembre de 2009
The SAS System
10:59 Wednesday, January 14, 1998
1
Analysis of Variance Procedure
Class Level Information
Class
Levels
TRATAM
Values
2
CONTINF ERGINF
Number of observations in data set = 20
Analysis of Variance Procedure
Dependent Variable: SUPINF
Source
F
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Model
0.5786
1
1.29578909
1.29578909
0.32
Error
18
72.89846306
4.04991461
Corrected Total
19
74.19425215
R-Square
C.V.
0.017465
83.63208
Source
DF
TRATAM
1
Root MSE
SUPINF Mean
2.01243997
Anova SS
Mean Square
1.29578909
2.40630160
F Value
Pr > F
0.32
0.5786
1.29578909
Duncan's Multiple Range Test for variable: SUPINF
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05
df= 18
MSE= 4.049915
Number of Means
2
Critical Range 1.891
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
2.6608
10
ERGINF
2.1518
10
CONTINF
156
Pr >
Anexo 16. ANOVA y Duncan para recuento luego de 10 días con ERGOSAN®
Experimento ERGOSAN -BIOENSAYO-2009
Hemograma tras 10 d con el producto
Analysis of Variance Procedure
Class Level Information
Class
TRATAM
Levels
Values
2
Control ERGOSAN
Number of observations in data set = 60
Dependent Variable: GRA
Source
F
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Model
0.0717
1
0.52029223
0.52029223
3.37
Error
58
8.96693820
0.15460238
Corrected Total
59
9.48723043
R-Square
C.V.
0.054841
Source
TRATAM
Pr >
Root MSE
GRA Mean
13.52834
0.39319510
2.90645524
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
Pr > F
1
0.52029223
0.52029223
3.37
0.0717
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
1
0.80995592
0.80995592
Error
58
7.10609279
0.12251884
Corrected Total
59
7.91604871
R-Square
C.V.
Root MSE
SEMI Mean
0.102318
9.098185
0.35002691
3.84721704
Source
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
TRATAM
1
0.80995592
0.80995592
6.61
Dependent Variable: SEMI
157
6.61
0.0127
Pr > F
0.0127
Dependent Variable: HIAL
Source
DF
Sum of Squares
Model
1
Error
58
9.61953923
Corrected Total
59
9.64510284
R-Square
C.V.
Root MSE
HIAL Mean
0.002650
14.02139
0.40725192
2.90450438
Source
DF
Anova SS
TRATAM
1
0.02556361
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
1
0.60497350
0.60497350
5.55
0.0219
Error
58
6.31975850
0.10896135
Corrected Total
59
6.92473199
R-Square
C.V.
0.087364
Source
TRATAM
0.02556361
Mean Square
F Value
0.02556361
0.15
Pr > F
0.6961
0.16585412
Mean Square
F Value
0.02556361
0.15
Pr > F
0.6961
Dependent Variable: TOT
Root MSE
TOT Mean
8.338134
0.33009295
3.95883465
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.60497350
0.60497350
5.55
Pr > F
0.0219
Duncan's Multiple Range Test for variable: GRA
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05
df= 58
MSE= 0.154602
Number of Means
2
Critical Range .2032
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
2.9996
30
Control
2.8133
30
ERGOSAN
158
Duncan's Multiple Range Test for variable: SEMI
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05
df= 58
MSE= 0.122519
Number of Means
2
Critical Range .1809
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
3.96340
30
Control
B
3.73103
30
ERGOSAN
Duncan's Multiple Range Test for variable: HIAL
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05
df= 58
MSE= 0.165854
Number of Means
2
Critical Range .2105
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
2.9251
30
Control
2.8839
30
ERGOSAN
Duncan's Multiple Range Test for variable: TOT
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05
df= 58
MSE= 0.108961
Number of Means
2
Critical Range .1706
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
4.05925
30
Control
B
3.85842
30
ERGOSAN
159
Anexo 17. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 20 días de haber
suspendido ERGOSAN®
Experimento ERGOSAN -BIOENSAYO-2009
Hemograma tras 20 d sin el producto
Analysis of Variance Procedure
Class Level Information
Class
Levels
TRATAM
Values
2
Control ERGOSAN
Number of observations in data set = 59
Dependent Variable: GRA
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Model
1
0.28872705
0.28872705
2.11
Error
57
7.78186476
0.13652394
Corrected Total
58
8.07059182
R-Square
C.V.
0.035775
Source
TRATAM
Pr > F
0.1514
Root MSE
GRA Mean
11.09255
0.36949147
3.33098893
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.28872705
0.28872705
2.11
Source
DF
Sum of Squares
Model
1
0.25747537
0.25747537
Error
57
5.75165067
0.10090615
Corrected Total
58
6.00912604
R-Square
C.V.
0.042847
Source
TRATAM
Pr > F
0.1514
Dependent Variable: SEMI
Mean Square
F Value
2.55
Pr > F
0.1157
Root MSE
SEMI Mean
7.709845
0.31765729
4.12015142
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.25747537
0.25747537
2.55
160
Pr > F
0.1157
Dependent Variable: HIAL
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Model
1
Error
Corrected Total
Pr > F
1.19081774
1.19081774
7.91
57
8.57933043
0.15051457
58
9.77014818
R-Square
C.V.
0.121883
11.82068
0.38796207
Source
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
TRATAM
1
1.19081774
1.19081774
7.91
0.0067
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
1
0.33887137
0.33887137
3.60
Error
57
5.35834781
0.09400610
Corrected Total
58
5.69721918
R-Square
C.V.
0.059480
Source
TRATAM
0.0067
Root MSE
HIAL Mean
3.28206179
Pr > F
Dependent Variable: TOT
0.0627
Root MSE
TOT Mean
7.207116
0.30660415
4.25418649
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.33887137
0.33887137
3.60
Pr > F
0.0627
Duncan's Multiple Range Test for variable: GRA
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.136524
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153
Number of Means
2
Critical Range .1927
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
3.39977
30
ERGOSAN
3.25984
29
Control
Duncan's Multiple Range Test for variable: SEMI
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error
rate
Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.100906
WARNING: Cell sizes are not equal.
161
Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153
Number of Means
2
Critical Range .1656
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
4.18510
30
ERGOSAN
4.05296
29
Control
Duncan's Multiple Range Test for variable: HIAL
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error
rate
Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.150515
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153
Number of Means
2
Critical Range .2023
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
3.4217
30
ERGOSAN
B
3.1376
29
Control
Duncan's Multiple Range Test for variable: TOT
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error
rate
Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.094006
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153
Number of Means
2
Critical Range .1599
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
4.32870
30
ERGOSAN
4.17710
29
Control
162
Anexo 18. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 30 días de haber
suspendido ERGOSAN®
Experimento ERGOSAN -BIOENSAYO-2009
Hemograma tras 30 d sin el producto
Analysis of Variance Procedure
Class Level Information
Class
TRATAM
Levels
Values
2
Control ERGOSAN
Number of observations in data set = 55
Dependent Variable: GRA
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Model
1
0.00228230
0.00228230
0.02
Error
53
6.28409114
0.11856776
Corrected Total
54
6.28637344
R-Square
C.V.
0.000363
Source
TRATAM
Pr > F
0.8902
Root MSE
GRA Mean
10.87269
0.34433669
3.16698609
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.00228230
0.00228230
0.02
0.8902
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
1
0.00037849
0.00037849
0.00
0.9535
Error
53
5.84790691
0.11033787
Corrected Total
54
5.84828540
R-Square
C.V.
0.000065
Source
TRATAM
Pr > F
Dependent Variable: SEMI
Root MSE
SEMI Mean
8.181038
0.33217144
4.06026056
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.00037849
0.00037849
0.00
0.9535
Source
DF
Sum of Squares
Mean Square
F Value
Pr > F
Model
1
0.04094603
0.04094603
Error
53
5.72037309
0.10793157
Pr > F
Dependent Variable: HIAL
163
0.38
0.5406
Corrected Total
54
5.76131912
R-Square
C.V.
0.007107
Source
TRATAM
Root MSE
HIAL Mean
10.71991
0.32852940
3.06466558
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
1
0.04094603
0.04094603
0.38
Source
DF
Sum of Squares
Model
1
Error
Corrected Total
Pr > F
0.5406
Dependent Variable: TOT
Mean Square
F Value
Pr > F
0.00030473
0.00030473
0.00
53
5.09533158
0.09613833
54
5.09563631
R-Square
C.V.
Root MSE
TOT Mean
0.000060
7.450564
0.31006182
4.16158856
Source
DF
Anova SS
Mean Square
F Value
TRATAM
1
0.00030473
0.00030473
0.00
0.9553
Pr > F
0.9553
Duncan's Multiple Range Test for variable: GRA
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate
Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.118568
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091
Number of Means
2
Critical Range .1863
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
3.17331
28 ERGOSAN
A
A
3.16043
27 Control
Duncan's Multiple Range Test for variable: SEMI
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error
rate
Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.110338
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091
Number of Means
2
Critical Range .1797
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
164
N
TRATAM
A
A
A
4.06293
27
Control
4.05768
28
ERGOSAN
Duncan's Multiple Range Test for variable: HIAL
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error
rate
Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.107932
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091
Number of Means
2
Critical Range .1777
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
3.09146
28
ERGOSAN
3.03688
27
Control
Duncan's Multiple Range Test for variable: TOT
NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error
rate
Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.096138
WARNING: Cell sizes are not equal.
Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091
Number of Means
2
Critical Range .1677
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping
Mean
N
TRATAM
A
A
A
4.16399
27
Control
4.15928
28
ERGOSAN
165
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