XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico

XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
ACTIVACIÓN DEL MECANISMO DE ARN DE INTERFERENCIA PARA
SILENCIAR LA EXPRESIÓN DEL GEN RAB5 EN CAMARÓN (LITOPENAEUS
VANNAMEI) MEDIANTE ARN DE DOBLE CADENA
Guillermo Arturo Adams Quiñónez Universidad de Occidente arturito1026_22@hotmail.com,
Antonio de Jesús Rivera Loredo Universidad de Occidente loredo_35@hotmail.com. Asesor
Dr. Píndaro Álvarez Ruiz pindaroalvarez@hotmail.com
Planteamiento
Las enfermedades virales y bacterianas siguen siendo la principal amenaza para
los cultivos acuícolas en todo el mundo. Se ha demostrado que el RNA de
interferencia (RNAi) dirigido al silenciamiento de genes, es una herramienta
sumamente efectiva para contrarrestar la replicación viral. El RNAi es un
mecanismo celular que se inicia cuando un RNA de doble cadena largo (dsRNA),
es procesado a RNAs pequeños que son guiados a secuencias complementarias
en el RNA mensajero (mRNA) para degradarlo de manera específica.
En este sentido, las proteínas Rab son pequeñas GTPasas que regulan el
transporte, acoplamiento y fusión de vesículas durante la endocitosis de
partículas, incluyendo virus. En camarones, el silenciamiento de Rab7 confirió un
efecto antiviral. En otros organismos Rab5 participa antes que Rab7 en el proceso
de infección. Por lo anterior, el objetivo de este estudio es construir una molécula
de dsRNA con la secuencia del gen Rab5 de camarón y evaluar su poder de
silenciamiento.
Metodología
Se detectó la secuencia del gen Rab5 en camarón blanco (Litopenaeus vannamei)
(Por lo que la llamamos LvRab5) y se clonó en el vector de clonación pGEM-T
Easy vector (Promega). Mediante la enzima T7-RNA polimerasa se sintetizaron las
cadenas de RNA-antisentido de LvRab5 y mediante la enzima SP6-RNA
polimerasa se sintetizaron las cadenas de RNA-sentido de LvRab5. Ambas
cadenas de RNA (sentido y antisentido) fueron purificadas con TRIzol (Life
Technologies) y formados por complementariedad los dsRNAs.
Se realizó un experimento con camarones de 5 ± 1g colocados individualmente en
acuarios de 5 L con agua de mar a 30 UPS y aireación constante. Se manejaron
tres tratamientos con 24 organismos cada uno: 1) camarones inyectados con
dsRNA de LvRab5. 2) camarones inyectados con un dsRNA ajeno al camarón
(16S bacteriano). 3) camarones inyectados con Bufer PBS 1X. Se tomaron
muestras de hemolinfa y branquias de dos organismos por tratamiento a las 0, 6,
12, 24, 36, 48 y 72 horas post tratamiento y se evaluó la expresión de LvRab5
mediante RT-PCR. Se midió la expresión de β-actina como control interno de las
reacciones.
Conclusiones generales
Los resultados indicaron que la cantidad de mRNAs del gen LvRab5 en hemocitos
disminuyó significativamente a partir de las 36 horas post tratamiento. En tejido
branquial se observó una tendencia similar, sin embargo el silenciamiento fue
menos evidente. Estos resultados demuestran que es posible silenciar el gen
LvRab5 en camarón blanco, por lo tanto será necesario realizar otros
experimentos para determinar si está involucrado en el proceso de infección de
virus que afectan al camarón.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014