Espectroscopia RMN 2D … …

Espectroscopia RMN 2D
• Hasta ahora hemos visto muchos pulsos pero una sola
dimension (osea, espectros 1D), pero vimos como una
secuencia de pulsos multiple nos da distintos espectros en
funcion de los periodos tD que usemos entre pulsos.
• Un experimento 2D basico seria repetir una secuencia de
pulsos 1D con una vriacion sistematica del periodo de tiempo
variable tD, y luego graficar todo encimado (stacked plot).
Un ejemplo seria variar el tiempo antes de tomar la FID (DE):
tD1
tD2
…
tD3
…
tDn
• Ahora tenemos dos dominios de tiempo, uno que aparece
durante la adquisicion como siempre, y otro que se origina a
causa del periodo variable.
Las basicas de la RMN 2D
• Tenemos que renombrar algunos de los parametros para
estar a tono con la literatura:
• A la primera perturbacion del sistema (pulso) se le
llama la preparacion del sistema de espines.
• Al tiempo variable tD lo renombramos tiempo de
evolucion, t1.
• Tenemos un evento de mezclado, en el cual informacion
de parte del sistema de espines pasa a otras partes.
• Finalmente, vamos a tener un periodo de adquisicion
(t2) como en todos los experimentos 1D (la FID).
• Esquematicamente, lo podemos dibujar asi:
Preparacion
Evolucion
t1
Mezclado
Adquisicion
t2
• t1 es el periodo variable, y t2 es el periodo de adquisicion
normal. Vemos que vamos a tener frecuencias f1 y f2…
• Este formato es basicamente el mismo para todas las
secuencias de pulsos 2D (y en realidad nD)...
Un experimento 2D rudimentario
• Vamos a ver como esto con el esqueleto de lo que va a ser
la secuencia de pulsos COSY. Imaginense estos pulsos,
donde t1 es el tiempo de preparacion:
90y
90x
t2
t1
• Lo analizamos para una singulete fuera de resonancia (ωo), y
para un monton de t1’s diferentes. Empezando luego del
primer pulso π / 2:
z
y
90x
x
x
ωo
y
z
y
90x
x
x
ωo
y
El 2D rudimentario (continuado)
z
y
90x
x
x
ωo
y
z
y
90x
x
ωo
x
y
• El segundo pulso π / 2 actua solo sobre la componente de la
magnetizacion que este en el eje y del plano <xy>.
• La componente en el eje x no es afectada, pero su amplitud
va a depender de la frecuancia del pico.
A(t1) = Ao * cos(ωo * t1 )
El 2D rudimentario (mas…)
• Si hacemos un stacked plot, nos da:
A(t1)
t1
t1
ωo
f2 (t2)
• Ahora tenemos datos en frecuencia en un eje (f2, que viene
del tiempo t2), y datos en funcion del tiempo en el otro (t1).
• Como la variacion de intensidad en t1 es tambien periodica,
podemos hacer una seudo-FID mirando a los puntos para
cada frequencia de los picos en f2.
• Una cosa que no estamos considerando durante todos
estos pulsos, esperas, puslos, etc., es que la señal tambien
va a estar afectada por relajacion T1 y T2.
El 2D rudimentario (y mas…)
• Ahora tenemos FIDs en t1, y podemos hacer una segunda
transformada de Fourier en el dominio de t1 (la primera fue
el dominio de t2), y obtenemos un espectro bi-dimensional:
ωo
• Tenemos ‘cross-peaks’
donde las dos lineas se
ωo interceptan en el mapa
2D, en este caso en la
diagonal.
f1
f2
• En un espectro real con un monton de señales mirar esto es
imposible. Lo miramos desde arriba, y tenemos un espectro
de contornos. Rebanamos los picos distintas alturas.
ωo
ωo
f1
f2
• Cada rodaja tiene un
codigo de color que
depende de la altura
del pico.
Lo mismo con datos reales
• Esto es del COSY de
la pulegona...
tiempo-tiempo
t1
t2
tiempo - frecuencia
t1
f2
frecuencia - frecuencia
f1
f2
Lo mismo con datos reales (continuado)
• El espectro de contornos con todos los cross-peaks:
f1
f2
• ¿De donde salieron todos los picos fuera de la diagonal
(off-diagonal), y que quieren decir?
• Voy a tratar de explicarlo, pero esto es algo para lo cual
necesitariamos de un tratamiento matematico riguroso
para entenderlo bien.
Correlacion homonuclear - COSY
• COSY significa COrrelation SpectroscopY, y en este caso
en particular en que lidiamos con acoples homonucleares,
espectroscopia de correlacion homonuclear.
• Cuando desarrollamos la idea del espectro 2D consideramos
un espin aislado sin acoples a nada mas. Obviamente, esto
no es muy util.
• El COSY es util para averiguar que espin esta acoplado con
otros espines. Los picos fuera de la diagonal indican esto,
osea, que los dos picos en la diagonal estan acoplados.
• Con esta idea basica vamos a tratar de ver el efecto de la
secuencia de pulsos COSY 90y - t1- 90y - t2 en un par de
espines acoplados. Si recordamos el diagrma de energia
de este sistema:
J (Hz)
βI β S
α I βS • •
I
S
••
S
I
•••• αα
I S
βI α S
I
S
• Si miramos al nucleo I y aplicamos los dos pulsos π / 2 (un
seudo-pulso π), invertimos parte de la poblacion del espin S,
y esto tiene un efecto en I (transferencia de polarizacion ).
Correlacion homonuclear (continuado)
• Como la tranferencia de polarizacion de I a S o de S a I es lo
mismo, lo explicamos de I a S y asumimos que nos da lo
mismo de S a I. Perturbamos I y vemos lo que pasa con S.
• Despues del primer π / 2, tenemos dos vectores de I en el eje
x, uno moviendose a ωI + J / 2 y el otro a ωI - J / 2. El
del segundo pulso va a poner componentes de la magnetizacion alineada con +y en el eje -z, lo que quiere decir que
tenemos una inversion parcial de las poblaciones de I.
• Para t1 = 0, tenemos inversion completa de los espines I (es
un pulso π) y la intensidad de la señal de S no cambia. Para
todos los otros tiempos va a haber un cambio en la inensidad
de S que depende periodicamente de la frecuencia de
resonancia de I.
• La variacion en la inversion de poblacion de I depende del
coseno (o el seno) de su frecuencia de resonancia.
Considerando que estamos en resonancia con una de las
lineas y que t1 = 1 / 4 J:
z
y
90y
x
x
J/2
y
Correlacion homonuclear (mas…)
• Para el caso general (nada en resonancia), llegariamos a
esta relacion para el cambio de la intensidad de la señal de S
(depues del pulso π / 2) en funcion de la frecuencia del espin
I y el acople JIS:
AS(t1,t2) = Ao * sin( ωI * t1 ) * sin (JIS * t1 )
* sin( ωS * t2 ) * sin (JIS * t2 )
• Despues de la transformada de Fourier en t1 y t2, y teniendo
en cuenta tambien al espin I, nos da:
ωS
ωI
ωI
ωS
f1
f2
• Esta es la ‘huella’ tipica de un doblete en un COSY con
fase sensitiva (phase-sensitive COSY). Los senos hacen
que las señales sean dispersivas en f1 y f2.
Correlacion heteronuclear - HETCOR
• El COSY (o experimento de Jenner) fue uno de los
primeros 2D (1971), y es una de las secuencias de pulso
2D mas utiles para elucidacion estructural. Tiene miles
de variaciones y mejoras (DQF-COSY, E-COSY, etc.).
• De manera similar podemos hacer un experimento 2D para
determinar conectividad heteronuclear, osea, que 1H esta
conectado a que 13C. Se le llama espectroscopia de
correlacion heteronuclear (HETeronuclear CORrelation
spectroscopy, o HETCOR).
• En este caso, la secuencia involucra tanto 13C como 1H, ya
que de alguna manera tenemos que marcar las intensidades
de los 13C con lo que le hacemos a las poblaciones de 1H.
La secuencia basica es:
90
13C:
90
1H:
90
t1
{1H}
HETCOR (continuado)
• Analizamos primero lo que le pasa a los 1H’s en un CH
(osea, vamos a ver como afectamos a las poblaciones de 1H),
y despues vemos como afectamos a la señal de 13C. Para
diferentes valores de t1 tenemos:
z
y
90, t1 = 0
90
x
x
y
z
y
90, t1 = J / 4
90
x
x
y
z
y
90, t1 = 3J / 4
90
x
x
y
HETCOR (mas…)
• Como en el COSY, vemos que dependiendo del tiempo t1
que usemos, tenemos una variacion periodica en la
inversion de poblacion de los 1H. Podemos ver claramente
que la inversion depende del acople JCH.
• A pesar de que lo hicimos en resonancia para simplificar,
podemos ver que esta variacion tambien va a depender de la
frecuencia de los 1H (δ).
• De lo que sabemos de IPS e INEPT, podemos predecir que
la variacion en las poblaciones de 1H va a tener el mismo
efecto periodico en la transferencia de polarizacion a 13C. En
este caso, el diagrama de energia para dos espines (1H y13C)
seria:
13C
α C βH
••
4
2
1,2
βC β H
3,4
1H
1H
αC αH
•••••
•••••
1
••••
• • • • β α 1,3 2,4
C H
13C
3
I
S
• Ahora, como la intesidad de la señal de 13C que detectamos
en t2 esta modulada por la frecuencia del 1H acoplado, la FID
de 13C tiene informacion sobre las frecuencias de 13C y de 1H.
HETCOR (y mas…)
• De nuevo, la intensidad de las lineas de 13C’s va a depender
de la inversion de poblacion de 1H’s, osea, de ω1H. Si
graficamos a distintos t1’s, nos da:
• La intensidad de las dos
lineas de 13C va a variar
con ω1H y JCH entre +5
y -3 como en el caso de
la secuencia INEPT.
t1 (ω1H)
ω13C
f2 (t2)
• Matematicamente, la intensidad de una de las lineas de 13C
del multiplete va a ser una ecuacion que depende de ω13C en
t2, de ω1H en t1, y de JCH en las dos dimensiones:
A13C(t1, t2) ∝ trig(ω1Ht1) * trig(ω13Ct2 ) * trig(JCHt1) * trig(JCHt2)
HETCOR (y mas…)
• Una transformada de Fourier en las dos dimensiones nos da
es espectro de correlacion 2D (como contornos):
ω13C
JCH
ω1H
f1
f2
• La diferencia principal con el COSY es que el espectro 2D no
es simetrico, porque un eje tiene frecuencias de 13C y el otro
de 1H.
• Barbaro, pero todavia tenemos acople JCH en todas las
señales del espectro 2D que aparecen como cuadrados. El
rango de JCH es 50 - 250 Hz, y por lo tanto vamos a tener
un monton de superposicion de cross-peaks de distintos
sistemas de espines CH.
• Vamos a ver como eliminamos esto sin desacoplar (si
desacoplamos todo el tiempo eliminamos la transferencia de
polarizacion de 1H a 13C...).
HETCOR sin acople JCH
• La idea es basicamente hacer lo mismo que hicimos en el
experimento INEPT reenfocado.
180
t1 / 2
90
t1 / 2
13C:
90
1H:
90
t1
Δ1
Δ2
{1H}
• El pulso de π en 13C es para reenfocar la magnetizacion
de 1H, y los dos periodos variables estan para maximizar la
transferencia de polarizacion de 1H a 13C y para tener
reenfoque de los vectores de 13C antes de desacoplar.
• Como en el INEPT, la efectividad de la transferencia va a
depender del periodo Δ y del tipo de carbono. Usamos un
valor promedio.
• Analizamos el caso de un carbono CH...
HETCOR sin acople JCH (continuado)
• Para cierto valor de t1, el comportamiento de la magnetizacion
de 1H es:
z
y
α (ω1H - J / 2)
90
t1 / 2
x
β (ω1H + J / 2)
y
β
y
α
y
18013C
t1 / 2
α
β
x
x
β
α
• Si hacemos que Δ1 sea 1 / 2J, los dos vectores de 1H van a
desfasarse exactamente 180 grados. Aca es que tenemos la
mayor inversion de poblacion para este t1 en particular, y
ningun efecto JCH:
z
y
β
90
Δ1
β
α
x
x
y
α
x
HETCOR sin acople JCH (mas…)
• ¿Que pasa con la magnetizacion de 13C? Despues del π / 2
en 1H vamos a tener dos vectores de 13C separados en un
radio 5 / 3 en el eje z. Despues del segundo periodo Δ2 (que
lo hacemos 1 / 2J) se van a reenfocar:
z
y
5
y
90
Δ2
x
y
5
3
x
5
x
3
3
• Ahora podemos desacoplar 1H porque la magnetizacion de
13C esta reenfocada. El espectro 2D no tiene acoples J
CH
(pero aun tiene informacion de corrimientos quimicos), y lo
vemos como un solo cross-peak centrado en los corrimientos
quimicos de 1H y 13C:
ω1H
f1
f2
ω13C
HETCOR de larga distancia
• Los periodos Δ1 y Δ2 estan seleccionados de forma de
maximizar la magnetizacion en antifase de 13C para acoples
1J . Osea, Δ y Δ estan en el rango de 2 a 5 ms (el 1J
CH
1
2
CH
promedio es ~ 150 Hz, y los periodos Δ1 y Δ2 eran 1 / 2J).
• Esto funciona para protones y carbonos directamente
enlazados (1JCH). Si tomamos como ejemplo parte de lo que
seria el HETCOR del alcanfor:
CH3
H3C
H
b
a
H3C
O
• Una expansion del espectro para los carbonos a y b seria
mas o menos asi :
f2 (13C)
Hb
f1
(1H)
Ha
Hc
Ca
Cb
HETCOR de larga distancia (continuado)
• El problema es que los carbonos a y b son muy parecidos
quimica y magneticamente: Solo con esta informacion no
podemos determinar cual es cual.
• Seria bueno poder determinar cual de los dos carbonos esta
mas cerca al proton en Cc, ya que de esa forma podriamos
asignar inequivocamente los dos carbonos en el alcanfor:
H3C
CH3
Hb
H
b
Ha
c
a
Hc
H3C
O
Ca
Cb
• ¿Como podemos hacer esto? Hay, en principio, una
experimento muy simple que se basa en acoples C-H de
larga distancia.
• Aparte de los acoples 1JCH, los carbonos y protones van a
and tener acoples de larga distancia, que van a ser de dos
o tres enlaces (2JCH o 3JCH). Las magnitudes son mucho mas
chicas que las de los acoples directos, pero igual son
considerables, entre 5 y 20 Hz.
• ¿Podemos modificar el HETCOR para que nos muestre
nucleos correlacionados por acoples de larga distancia?
HETCOR de larga distancia (mas…)
• La clave esta en entender lo que hacen los periodos
variables en la secuencia, en particular Δ1 y Δ2. Estos
se usaban para reenfocar magnetizacion de 13C en antifase.
Para la parte de la secuencia en 1H:
z
y
β
90
Δ1
β
α
x
x
y
α
• Para la parte en 13C:
z
y
5
y
90
x
y
3
Δ2
3
5
x
5
x
3
• Para reenfocar, osea, para obtener los vectores ‘-3’ y ‘+5’
alineados, y en el caso de un CH, los periodos Δ1 y Δ2 tienen
que ser 1 / 2 * 1JCH. ¿Que pasaria si cambiamos los periodos
Δ1 y Δ2 a 1 / 2 * 2JCH?
HETCOR de larga distancia (y mas…)
• Para empezar, Δ1 y Δ2 van a ser ~50 ms, mucho mas largos
que antes (~5 ms). Lo que va a pasar ahora es que la
magnetizacion de 13C que este en antifase debido a acoples
1J
CH no se va a reenfocar, y va a tender a cancelarse. Para la
parte del reenfoque de 1H:
z
y
β
90
α
Δ1
x
x
β
y
α
• Los periodos variables no tienen nada que ver con 1JCH, y
no tenemos inversion completa de las poblaciones de 1H.
Ahora, para la parte de 13C:
z
y
<5
<5
90
<3
x
y
<3
Δ2
x
y
• Cuando desacoplemos 1H, vamos a eliminar casi toda la
señal de 13C que evoluciono bajo efectos de 1JCH…
x
HETCOR de larga distancia (y mas…)
• Al final, vemos que la mayor parte de la magnetizacion
que eveoluciono bajo efectos de 1JCH’s (tanto 1H o 13C) va a
desaparecer. En cambio, la magentizacion de 13C en antifase
que se origino debido a 2JCH’s a tener los Δ1 and Δ2
correctos, y se va a comportar como vimos antes. Para 1H:
z
y
β
90
Δ1
(1 / 2 2JCH)
β
x
x
α
y
α
• Para 13C:
z
y
5
y
90
x
y
3
3
5
x
Δ2
(1 / 2 2JCH)
5
3
• El resultado es que solo los 13C con acoples 2JCH van a dar
correlaciones en el HETCOR y podemos ver los enlaces
de larga distancia.
x
HETCOR de larga distancia (...y mas)
• Considerando que todo esta en nuestro favor, obtenemos:
H3C
CH3
Hb
H
b
Ha
c
Hc
a
H3C
O
Ca
Cb
• Barbaro. Ahora vemos el acople de larga distancia, y
podemos determinar cual CH2 es cual en el alcanfor. La
explicacion la hicimos para CH’s, pero eso lo mismo para
CH2’s y CH3’s.
• En realidad, nada funciona como queremos (Murphy). Esta
secuencia tiene varios problemas. Primero, seleccionar los
Δ1 y Δ2 para ver 2JCH en vez de 1JCH es un centro al area.
• Segundo, aparte del periodo de evolucion (que es del orden
de 10 a 20 ms), los periodos Δ1 y Δ2 son bastante mas
largos. Vamos a tener un monton de relajacion de los 13C’s, y
las señales van a ser petizas.
• Mas importante aun, como los 1H’s se relajan mucho mas
que los 13C’s, la transferencia de polarizacion va a ser
minima, y por lo tanto no vamos a ver correlaciones fuertes.
HETCOR-COLOC
• ¿Como solucionamos esto? Si queremos usar la misma idea
que hasta ahora, i.e., reenfocar la magnetizacion de 13C
asociada con 2JCH, tenemos que mantener a Δ1 y Δ2.
• El unico periodo que podemos acortar, en principio, es el
periodo de evolucion variable, t1. ¿Como hacemos esto si
necesitamos que este periodo crezca de experimento a
experimento para obtener la segunda dimension?
• La solucion es hacer un experimento de tiempo constante.
Esto involucra tener un tiempo de evolucion t1 que en total
es constante e igual a Δ1, pero poner pulsos de 180 dentro
del periodo de evolucion y que ‘avanzen’ durante este
tiempo. Un ejemplo de este tipo de secuencia es llamado
COrrelations via LOng-range Couplings, o COLOC:
180
90
t1 / 2
Δ1 - t1 / 2
Δ2
13C:
90
90
180
t1 / 2
1H:
Δ1 - t1 / 2
Δ1
Δ2
{1H}
HETCOR-COLOC (continuado)
• Como se ve en la secuencia, el periodo Δ1 queda igual, asi
como tambien el periodo t1 total. En cambio, logramos la
evolucion en t1 avanzando de forma constante los dos pulsos
de 180 durante el periodo t1 de experimento a experimento.
• Podemos analizar como funciona la secuencia de la misma
forma en que analizamos el HETCOR comun. Hacemos el
analisis para un C-C-H. El primer pulso de 90 en 1H pone a
la magnetizacion de 1H en el plano <xy>, donde evoluciona
bajo el efecto de JCH (2JCH en el caso de C-C-H) por un
periodo t1 / 2, que es variable.
• La combinacion de pulsos de 180 en 1H y 13C invierte la
magnetizacion de 1H y las marcas de los vectores de 1H:
y
y
...
18013C
t1 / 2
β
α
x 1801H
β
x
α
HETCOR-COLOC (mas...)
• Despues de Δ1 - t1 / 2, la magnetizacion continua
desfasandose. Pero como el tiempo total es Δ1, vamos a
tener inversion completa de la magnetizacion de 1H, y por lo
el maximo de transferencia de polarizacion de 1H a 13C.
Ademas, marcamos la magnetizacion de 13C con la
frecuencia de 1H (que nos da la correlacion…).
• Como siempre vamos a tener inversion completa de la
magnetizacion de 1H y reenfoque, no tenemos acoples 2JCH
en la dimension de 13C (f1).
• Finalmente, en el periodo Δ2 tenemos renfoque de la
magnetizacion 13C en antifase, de la misma forma que en el
HETCOR reenfocado, y podemos desacoplar durante la
adquisicion para eliminar 2JCH en la dimension f2:
z
y
5
y
90
x
y
3
Δ2
3
5
x
5
x
3
• La ventaja de esta secuencia es que hacemos lo mismo que
en un HETCOR pero en mucho menos tiempo porque el
periodo Δ1 esta incluido en la evolucion durante t1. Es mas,
en vez de aumentar t1 de experimento a experimento,
movemos sistematicamente los pulsos de 180 para obtener
transferencia de polarizacion y marcado por frecuencias.