Capitulo 4. Ingeniería genética 1.1.1. Propiedades y

Capitulo 4. Ingeniería genética
1.1.1. Propiedades y características del material genético.
1.1.2. Replicación, trascripción y traducción.
1.1.3. Regulación de la expresión génica.
1.1.4. Técnicas en biología molecular
1.1.4.1.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
1.1.4.2.Secuenciación de ácidos nucleicos
1.1.4.3.Recombinación
1.1.4.4.Clonación
1.1.4.5.Mutación
1.1.4.6.Transgénesis
Propiedades y características del material genético
El ADN (ácido desoxirribonucleico) junto con el ARN (ácido ribonucleico) son las
macromoléculas orgánicas responsables de transmitir las diversas y variadas
características genéticas a través de los ciclos reproductivos o hereditarios.
El ADN es una macromolécula orgánica, polimérica constituidas por unidades llamadas
nucleótidos, por su estructura (descubierta por James D. Watson y Francis Crick en
1953) y disposición espacial es una molécula bicatenaria, de tal manera que una cadena
es complementaria a la otra. El ARN difiere del ADN en cuanto al contenido del azúcar
en sus nucleótidos mientras que en el ADN contiene desoxirribosa el ARN contiene
ribosa; a demás es monocatenario (una sola hebra).
Los nucleótidos están compuestos de (i) una base nitrogenada A (adenina), G (guanina),
C (citosina), T(timina) y U (uracilo), de los cuales la A, T, C y G están presentes en el
ADN, mientras que en el ARN la timina es reemplazada por uracilo. Estas bases se
clasifican en purinas (con dos anillos, uno de cinco y otro de seis átomos como la
Adenina y la Guanina) y las pirimidinas (con un solo anillo de seis átomos, las cuales
son: Timina, Uracilo y Citosina).
Figura 1. Bases nitrogenadas Adenina A, Guanina G, Timina T, Citosina C, y Uracilo
U, uno de los componentes de los ácidos nucleicos. Tomado de:
http://payala.mayo.uson.mx/Programa/biomoleculas,proteinas.htm
Figura 2. Molecula de ADN, mostrando sus bases apareadas A-T y G-C, igualmente los
surcos mayores y menores. Tomado de:
http://payala.mayo.uson.mx/Programa/biomoleculas,proteinas.htm
Nucleótidos
Los nucleótidos son moléculas orgánicas formadas por la unión covalente de un
monosacárido de cinco carbonos (pentosa: ribosa o 2-desoxirribosa), una base
nitrogenada (A, T, G, C o U) y un grupo fosfato (H3PO4, cada nucleótido puede
contener uno (nucleótidos-monofosfato, como el AMP), dos (nucleótidos-difosfato,
como el ADP) o tres (nucleótidos-trifosfato, como el ATP) grupos fosfato. El
nucleósido es la parte del nucleótido formado únicamente por la base nitrogenada y la
pentosa.
Nucleósidos
Un nucleósido es una molécula monomérica orgánica que integra las macromoléculas
de ácidos nucleicos que resultan de la unión covalente entre una base heterocíclica con
una pentosa que puede ser ribosa o desoxirribosa. Ejemplos de nucleósidos son la
citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina y la inosina.
Replicación, trascripción y traducción en procariotas y eucariotas
La replicación es el proceso biológico mediante el cual la célula realiza copias exactas
de su ADN, como una forma de duplicar la información y expresarla.
En 1957 los doctores Matthew Meselson y Franklin W. Stahl diseñaron un experimento
para determinar el método de la replicación del ADN; pues tres modelos de replicación
era plausibles: (i) conservativo, (ii) semiconservativo y el (iii) dispersivo.
El modelo conservativo se basa en que una de las dos moléculas bicatenarias de ADN
producidas en la replicación conserva las dos cadenas madre (viejas) mientras que la
otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis. El semiconservativo (el cual es
el modelo comprobado por Meselson y Stahl comprobando la hipótesis de Watson y
Crick ) sugiere que el ADN separa sus dos hebras y cada una sirve de molde para
sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas de complementariadad de las bases
nitrogenadas. El dispersivo implicaba que el momento de la replicación se originan dos
dobles hélices, cada una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva
síntesis en diferentes proporciones.
En la replicación entran diversos tipos de componentes y procesos para la duplicación
del material génico, entre estas la holoenzima ADN polimerasa.
El primer paso, implica la síntesis del DNA copiando la información de DNA a DNA,
este proceso implementan un conjunto de enzimas conocidas como DNA polimerasas
(DNApol), las cuales se caracterizan entre otras cosas por ser dependientes de DNA.
En procariotes se han descubierto tres clases de DNA polimerasas: (i) DNApol I, (ii)
DNApol II y (iii) DNApol III; mientras que en eucariotes existen cinco tipos conocidas
como: (i) DNApol A(α), (ii) DNApol B (β), (iii) DNApol C (γ), (iv) DNApol D (δ) y
(v) DNApol E (ε); todas estas holoenzimas requieren un molde de ADN para ser
copiado introduciendo desoxinucleótidos trifosfato, para ello es indispensable y
dependiente para iniciar esta síntesis un oligonucleótido iniciador con un extremo 3’
libre (también llamado: primers, iniciador o cebador). A partir de este extremo 3’ del
oligonucleótido iniciador estas enzimas avanzan en dirección 3’→5’ (leen en esta
dirección) y sintetizan las nuevas cadenas uniendo al extremo 3’-OH libre del iniciador,
el fosfato en 5’ de un nuevo nucleótido mediante un enlace éster, sintetizando en
dirección 5’→3’.
La replicación se inicia con la separación de las dos hebras monocatenarias
complementarias de DNA, proceso mediado por la enzima DNA helicasa, la cual rompe
los enlaces hidrógeno de ambas cadenas formados por las bases nitrogenadas (dos para
A-T y tres para G-C) consumiendo ATP. El desenrrollamiento de la doble hélice
generado por la tención se elimina gracias a un grupo de enzimas llamadas
topoisomerasas (Topo), de las cuales intervienen la Topo I y la II, esta ultima actúa,
cortando un enlace ester de una cadena y volviendo a formarlo. Las dos hebras simples
del DNA abierto, se mantienen separadas por acción de “proteínas estabilizadoras del
DNA de cadena simple” llamadas SSB (single strand DNA bindig proteins por sus
siglas en ingles).
A las cadenas simples de DNA se une la RNA polimerasa iniciadora llamada Primasa,
una RNApol dependiente de ADN, la cual es capaz de iniciar la síntesis de novo. Esta
enzima sintetiza sobre la cadena simple de ADN un pequeño fragmento de nucleótidos
(en procariotes tiene una extensión entre 50 y 100 nucleótidos y en eucariotes alrededor
de 10) como cebador. Inmediatamente sintetizado el RNA entra en acción la polimerasa
DNApol III en procariotes y en eucariotes la DNApol α, podría iniciar la síntesis de un
fragmento de 10 a 15 desoxinucleótidos y pasado este punto, su lugar lo ocupa la
DNApol D ó d, que se encarga de la mayor parte de la síntesis, se ha propuesto que la
DNApol γ sustituye a la DNApol α para sintetizar todo el DNA, después de que esta a
sintetizado el RNA iniciador. De esta forma se producen la hebra discontinua con
dirección 5’→3’y la hebra continua con dirección 3’→5’. la primera (la hebra
discontinua) está formada por los llamados fragmentos de Okazaky, que son
oligonucleótidos con RNA en el extremo 5’ y DNA en el 3’. Ambas enzimas copian el
DNA molde en dirección 3’→5’ y unen al extremo 3’-OH libre de la cadena en
crecimiento, el fosfato en 5’ de un nuevo desoxinucleótido mediante un enlace éster. La
eliminación de los fragmentos de Okazaky y completar la síntesis de la cadena de DNA
se requiere la DNApol I en procariotes y la DNApol α de eucariotes; las cuales actúan
como exonucleasas hidrolizando el enlace 3’-fosfato y liberando nucléosidos-5’monofosfato, luego actuando con su actividad polimérica, a partir del extremo 3’ libre
más cercano, llenan el hueco en la cadena con desoxirribonucleótidos; para unir los dos
fragmentos se necesita la enzima DNA ligasa que toma el AMP del NAD en procariotes o del ATP en eucariotes, uniéndolo a un resto de Lisina y liberando un
mononucleótido de nicotinamida en procariotes y pirofosfato en eucariotes.
Transcripción
La síntesis de RNA la llevan a cabo las enzimas llamadas RNA polimerasas (RNApol).
En procariotes tan solo existe una RNApol, mientras que en eucariotes hay 3,
nombradas como: RNApol 1, RNApol 2 y RNApol 3. La primera es encargada de
sintetizar el rRNA y el RNA heterogéneo nuclear (nhRNA). La RNApol 2 sintetiza
principalmente el mRNA y la RNApol 3 sintetiza el tRNA y la fracción 5s de rRNA.
Debido a que todos los RNA de las células son cadenas sencillas, mientras que el DNA
tiene doble cadena, resulta claro que solo una de las dos cadenas del DNA se transcribe,
a esta cadena se le conoce como cadena molde y a la otra como cadena codificadora o
codificante.
En procariotes la RNApol requiere de un factor de iniciación, la proteína sigma (σ), que
reconoce el sitio de iniciación de la transcripción y una vez iniciada esta, se separa. Las
RNApol de eucario- tes no tienen este requerimiento, Todas las RNApol requieren
ribonucleótidos trifosfato y una cadena doble de DNA; todas copian la cadena de DNA
leyendo en dirección 3’→5’ y sintetizan el RNA en dirección 5’→3’.
La transcripción termina cuando se llega a una secuencia de terminación. En procariotes
estas secuencias son reconocidas por otra proteína, el factor rho (r), en eucariotes no
requieren factores.
Traducción
La síntesis de proteínas o Traducción, es uno de los procesos más complejos que
realizan las células, esta complejidad es necesaria para asegurar la lectura fiel de las
secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos a secuencias de aminoácidos en las
proteínas. La traducción requiere de una conjunto de reglas que permita interpretar las
secuencias de nucleótidos, y colocar los aminoácidos en el orden correcto. El organelo
encargado de traducir la secuencia del ARNm a proteínas es el ribosoma, pare ello
requiere del Código Genético.
Figura 3. Código genético. Tomado de: http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/codgen/
beltramini.gif
Dogma central de la biología molecular
Consiste en las interacciones lógicas y vías conocidas que conducen la transferencia de
la información genética en un organismo, contenida en el ADN hasta su producto final:
proteína.
ADN
REPLICACIÓN
Enzima: ADNpol
ADN
TRANSCRIPCION
Enzima: ARNpol
ARN
TRANSCRIPCION
INVERSA
Enzima: ARNpol reversa
TRADUCCIÓN
Proteína
Figura 4. Dogma central de la biología molecular.
Regulación de la expresión génica
Introducción
Los procariotas como organismos unicelulares, poseen una gran capacidad de
adaptación, regulando la expresión de sus genes para ajustarse al medio, de esta manera
aumentan la eficiencia de la economía energética. La unidad fundamental de la
información génica es regulada fundamentalmente en el inicio de la transcripción,
interviniendo factores que transcriben productos difusibles o no. La actuación de estos
controladores pueden ser tanto de tipo trans como cis. La regulación puede ser de tipo
negativo y positivo, algunas veces llamado este último como regulación metabólica. El
modelo del operón lac, es uno de los más estudiados y sirve como base para la
regulación génica en bacterias.
El gen como concepto general
Desde sus primeros indicios con la teoría propuesta por G. Mendel en 1865 a cerca de la
transmisión de los caracteres hereditarios, pasando por la primera definición conocida
por T. H. Morgan en su trabajo “teoría del gen” en 1926 [1] hasta los mas recientes
planteamientos; la definición del concepto de gen no es estático sino evolutivo,
resultando cada vez mas complicado hacer una definición molecular de aplicación
general [2]. Se han establecido tres conceptos de gen a través de la historia: clásico,
neoclásico y moderno. El concepto clásico define el gen como “la unidad indivisible de
la transmisión genética”, concepto que condujo al planteamiento a comienzos de los
años 40s de “un gen una enzima”; gracias a los trabajos de George Beadle y Eduar
Tatum con Neurospora crassa, y corroborados por Vernon Ingram en 1956 con células
falciformes, que ratificó la relación completa de los genes con la producción de un
enzima [3]. Los descubrimientos de la recombinación por Avery, la estructura de la
doble hélice del ADN por Watson y Crick [4,5], los mecanismos de la síntesis de
proteínas y nuevas metodologías para el análisis genético, cambió el concepto clásico al
neoclasico de: “un cistrón un polipeptido”, en los años 60s. Posteriores descubrimientos
de genes repetidos, jerarquizados, traslapados, transposones, promotores etc, que poseen
una base bioquímica para su análisis, han establecido definiciones de gen modernas [6].
Todas las definiciones de gen requieren criterios operacionales, basadas en la
transmisión, mutación, recombinación y funcionalidad en el desarrollo del fenotipo.
Una de estas definiciones expresadas por Miller y Reznikoff [7] es: “el gene es una
combinación de segmentos de DNA que constituye una unidad expresable, que conduce
a la formación de uno o más productos funcionales específicos, que pueden ser
moléculas de RNA o polipéptidos”. Esta es una definición de carácter molecular, pero
variadas definiciones son posibles con diversos niveles de profundidad dependiendo el
sistema genético, analítico y los métodos empleados. El gen comprende toda la región
transcrita, incluyendo las secuencias codificadoras contenidas en los exones
(eucariotes), todos los intrones y las regiones flanqueantes de la región codificadora, las
secuencias reguladoras tanto las próximas como las situadas a miles de pares de base
(secuencias de intensificación) de la región transcrita, se pueden considerar como partes
integrales del gen [2]. Igualmente existen diferentes clases de genes como: simples,
repetidos, traslapados, jerarquizados, procesados, montados y móviles.
Organización y elementos reguladores genéticos
Los organismos vivos no necesitan todos sus productos génicos simultáneamente ni en
la misma cantidad; la actividad metabólica de una célula puede regularse mediante el
control de la síntesis de enzimas y de otras macromoléculas, a este control se le conoce
globalmente como Regulación de la expresión génica. La velocidad de formación de
cualquier producto génico, puede regularse en cualquier fase de la ruta del flujo de
información biológica, pues depende de diversos factores como: (i) en la frecuencia en
la iniciación de la transcripción, (ii) la cantidad de una proteína depende de la cantidad
de RNAm formado, (iii) la frecuencia con la que se produce la iniciación de la
traducción, (iv) la velocidad de la elongación de la cadena, (v) la eficacia de la
terminación de la transcripción, (vi) la modificación postraducional, (vii) la secuencia
de los promotores, entre otros.[8]
En pocos años, muchas investigaciones han sido dirigidas hacia la aclaración y
evaluación de los mecanismos de control y regulación de la expresión génica [9].
Centrándose la mayoría en la regulación de la síntesis de proteínas en bacterias [10].
Los elementos reguladores más relevantes de la expresión génica en procariotes, como
el operón se resumen a continuación: La definición de operon fue propuesta
inicialmente por Jacob y Monod [11,12] en 1960 por su trabajo con mutantes de
Escherichia coli K 12, en la regulación del operón de la lactosa [13]. El operón se
define como: Un grupo continuo de genes estructurales (transcriben y traducen a
proteínas) que implica una expresión coordinada y regulada por sitios de control, que
determinan la expresión de estos genes. La mayor parte de los operones presentes en
procariotas son multicistrónicos, lo que implica que mas de un gen estructural es
transcrito en tandem, regulado por un solo sistema, como el operón de la lactosa (Lac)
[14], algunos poseen mas de un sistema de control como el operón del triptófano,
regulado positivamente y por atenuación [15,16]. Otros sistemas regulan a la vez más de
un operón, como los genes que intervienen en el metabolismo de la maltosa, estos
mecanismos son llamados regulones [3]. La mayor parte de los operones son
controlados por moléculas llamadas reguladoras, ya sean proteínas y/o moléculas de
ARN, producidas por diversos genes reguladores; como ejemplo de esta ultima llamada
regulación transcripcional tenemos los operones del triptófano (trp), fenilalanina (phe),
histidina (his) [17], treonina (thr) y leusina (leu) entre otros [18]. La secuencia de ácidos
nucleicos, que implica el sitio de acción de estas moléculas reguladoras se le conoce con
el nombre de operador, e incluyen regiones implicadas en la iniciación de la
transcripción y traducción [10], siendo estos los dos mecanismos alternativos
principales de la regulación en bacterias. Los cambios en el ambiente celular inciden en
la regulación de la expresión génica; generalmente pequeñas moléculas que actúan
como señales fisiológicas alteran la síntesis específica de los genes estructurales,
ensamblándose con las proteínas reguladoras, afectando su actividad, induciendo
(inducción) o reprimiendo (represión) la síntesis de las enzimas; estas moléculas son
llamadas efectores. Otro término utilizado para referirse a la secuencia que sirve para
iniciar la transcripción de un operón es el promotor, en estas secuencias se ensamblan
los complejos de transcripción [19], ubicados en los extremos 5´ terminales de los
genes. Los promotores contienen secuencias específicas inducibles a iniciar la
transcripción, como las secuencias consenso de las cajas TATA, donde ocurre la
preiniciación de la transcripción [20].
RNA polimerasa
Dirección de la
transcripción
Pr
Gr
O
P
a
b
Transcripción
RNA m
5`
3`
3`
5`
E
Traducción
Proteína represora
Proteínas resultantes
Figura 5. Esquema general de la unidad de la expression y regulación genética bacteriana
(operón). El operón incluye secuencias de genes estructurales (b) y elementos de control en el
ADN (a). Gen estructural de la proteína represora (Gr); promotor del gen represor (Pr); y de
genes estructurales (P); secuencia de unión de la proteína represora, operador (O); molécula
efectora, efector (E). La molécula efectora se une a la proteína alostérica represora provocando
un cambio conformacional, induciendo que esta favorezca la formación de los complejos
transcripcionales (regulación positiva), o desestabilizándolos evitando que la RNA polimerasa
transcriba (regulación de tipo negativo).
Control positivo y negativo, el operón lac.
El control de la transcripción de los genes regulables, está mediado en su mayoría por
proteínas reguladoras, las cuales disminuyen o estimulan la interacción de la maquinaria
de transcripción. El modelo inducible del operon de lactosa, fue propuesto por primera
vez por Jacob y Monod en 1961 [11,13]. Los pasos iniciales del metabolismo de la
lactosa (o los β-galactósidos) involucran tres compuestos proteicos: (i) la lactosa
permeasa codificada por el gen lacY, que es responsable del transporte de la lactosa
dentro de la célula bacteriana, (ii) la β-galactosidasa (lacZ) que hidroliza la lactosa a los
monosacáridos: galactosa y glucosa, y (iii) la tiogalactosido-transacetilasa (lacA),
responsable de la acetilación de los β-galactósidos que no pueden ser hidrolizados por la
β-galactosidasa [3]. En ausencia de algún tipo de regulación, la expresión de los tres
genes estructurales, (lacZ, lacY y lacA) (figura 2.) involucra la transcripción de un solo
ARNm multicistrónico, traduciéndose en las tres enzimas anteriores. La síntesis de este
RNAm se inicia en el promotor Plac cuya secuencia se solapa con uno de los dos
operadores O1, ubicado en la parte cercana del gen lacZ. Existe otro operador O2 de
aproximadamente 15 pb asolapado dentro del gen lacZ [21,22]. El control de la
expresión de los tres genes estructurales, es regulado por una proteína represora llamada
represor lac, proveniente de un gen llamado lacI, junto a su promotor asociado P, dicho
gen se transcribe independientemente y se encuentra localizado al extremo 5` del
operon lac [14]. La trasncripción independiente del gen lacI, garantiza la producción
constante del represor lac. La unión del represor lac a los dos operadores incrementa la
asociación de la RNA polimerasa, pero a su vez impide la transcripción bloqueando la
holoenzima; esto implica, que el complejo transcripcional se encuentra acoplado y listo
reduciendo el tiempo inicial de la transcripción, cuando se presente la inducción al
acoplarse el inductor al represor lac [23].
Las proteínas represoras que al unirse al ADN, disminuyen la transcripción de un gen
ejercen un control de tipo negativo; inversamente cuando se estimula la transcripción
estas ejercen un control de tipo positivo [2]. El operón lac, presenta estos dos tipos de
regulación. El control negativo ocurre cuando el represor lac, unido a los operadores O1
y O2, bloquea la transcripción de la RNA polimerasa ubicada en el promotor; Mediante
la interacción del represor lac con las moléculas efectoras, su estructura cuaternaria se
ve alterada junto a su afinidad al ADN, desestabilizándose y permitiendo la
transcripción y expresión de los genes estructurales lacZ, lacY y lacA. Los efectores que
permiten la expresión de genes regulados por represores reciben el nombre de
inductores. Los inductores del operón lac son variados, desde la alolactosa (β-Dgalactopiranosil-(1→6)-β-D-glucopiranosa), hasta uno de los mas efectivos el βgalactosil glierol.
a
Dirección de la
transcripción
P
lacI
b
Plac
O1 O2
lac Z
lac Y
lac A
Transcripción
RNA m
5`
3`
5`
3`
Traducción
Represor lac
β-galactosidasa
lactosa
permeasa
Tiogalactósido
transacetilasa
Figura 6. Regulación negativa del operón lac. (a) El represor lac se une a los
operadores O1 y O2 impidiendo la transcripción de los genes estructurales lacZ, lacY y
lacA . (b) La molécula inductora desestabiliza el represor lac, permitiendo la
transcripción.
El control positivo del operón lac es mucho más complejo que el negativo. Existen seis
criterios para determinar la presencia de un control de tipo positivo: (i) aislamiento de
mutantes que posean cambios en los genes reguladores propuestos que induzcan la
producción de genes estructurales. (ii) demostración que el gen regulador no forma
parte del operón. (iii) aislamiento de mutantes constitutivos Rc. (iv) test de dominancia:
los alelos R+ (tipo salvaje inducible) y Rc deben ser dominantes a R-.(v) la demostración
de los dominios de tipo cis en el operón, que afectan la expresión de los alelos Rc y R+,
en la regulación del gen. (vi) la búsqueda de regiones cis dominantes en el control de los
operones [24]. En la regulación positiva del gen lac, depende no solo la presencia de
lactosa, sino también de la concentración de glucosa en el medio; la disminución de
transcripción del operon lac (unas 50 veces) por presencia de glucosa en el medio, se
conoce como represión catabólica, la cual representa un estado fisiológico de la célula
sobre la velocidad de síntesis de proteinas [10]. Este tipo de represión es mediada por la
proteína alostérica receptora de cAMP (CRP). Los niveles de cAMP en la célula son
bajos cuando la concentración de glucosa en el medio es alta. Bajo estas condiciones la
proteína CRP posee una baja afinidad en la unión con el ADN. En ausencia de glucosa
aumentan los niveles de cAMP formando un complejo con la CRP (CRP:cAMP),
aumentando su afinidad al ADN. Este complejo se une a una secuencia específica
cercana localizada justo al extremo 5`del promotor lac, facilitando la unión de la RNA
polimerasa al promotor lac Plac, induciendo la transcripción.
Actividad cis/trans
En la regulación de la expresión génica, se distinguen dos tipos de secuencias de ADN:
las secuencias que codifican los productos que actúan en trans, y las secuencias de
actuación en cis. Cualquier producto génico que es libre de difundir para encontrar su
diana se describe como actuación en trans, como las proteínas represoras. La actuación
en cis se aplica a cualquier secuencia de ADN que no es convertida en otra forma,
funcionando in situ afectando al ADN al cual está físicamente ligado [25], los
promotores, terminadores y operadores son ejemplos de actuación en cis.
Mediante mutaciones en el operón lac [11], el promotor Plac (mutante Plac-) y los
operadores O1 y O2 (Oc), son identificados como secuencias de actuación en cis, lo que
implica que son secuencias funcionales que intervienen en la expresión génica sin
transcribir un producto difusible. El gen lacI, codifica la proteína represora de actuación
en trans, mutaciones en este gen (I-) elimina el producto de actuación en trans, debido a
la perdida en la afinidad de unión al ADN del represor lac. Los mutantes que no
expresan los productos de los genes regulados, se conocen como no inducibles, mientras
que los mutantes constitutivos, expresan continuamente estos productos. Una mutación
en un sitio de actuación en cis, no puede ser reemplazada o complementada; esta
propiedad es propia de los productos difusibles de actuación en trans. Para el análisis
de este tipo de valoración existe el test cis/trans, el cual puede distinguir entre
complementación intergénica e intragénica. Muestra si las mutaciones realizadas a y b
pertenecen al mismo gen o no. Si son comparados el heterocigoto-cis a b/+ +, y el
heterocigoto-trans a +/b +, si ambos son fenotipicamente similares (generalmente del
tipo salvaje) las mutaciones corresponden a diferentes cistrones. Si son fenotipicamente
diferentes, el heterocigoto-trans usualmente es mutante y el heterocigoto-cis (de tipo
salvaje), ambas mutaciones pertenecen al mismo cistrón [6,26].
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocida como P.C.R por sus siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en
1983 por Kary Mullis que permite la síntesis “in Vitro” de secuencias especificas de
ácido desoxirribonucleico (ADN).
La enzima DNA polimerasa realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN
en sentido 5’→3’ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de
doble cadena. Para crear esta región de doble cadena, se utilizan los denominados
iniciadores (primers). Estos son una pareja de oligonucleótidos diseñados de tal manera
que sean complementarios a cada uno de los extremos del fragmento de ADN que se
quiere amplificar.
Este proceso se lleva a cabo mediante ciclos alternados de temperaturas altas y bajas, lo
cual permiten separar las hebras de ADN formadas entre si tras cada fase de replicación
y, la unión nuevamente de estas hebras con la polimerasa para que vuelvan a duplicarse.
Los componentes de la PCR son: (i) Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): es una
mezcla de deoxinucleótidos que sirve de sustrato para la síntesis de nuevo ADN. (ii)
Iniciadores (primers): dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una
de las dos hebras del ADN. (iii) ADN polimerasa: estable a altas temperaturas,
permaneciendo activa hasta después de la desnaturalización del ADN. (iv) ADN molde:
molécula que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
Las etapas del proceso consisten en una serie de cambios repetidos de temperatura
llamados ciclos. Por lo general el número de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en
tres cambios de temperatura. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada
ciclo, dependen de algunos parámetros en los que se incluye, la enzima usada para la
síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción así como
la temperatura de unión de los iniciadores.
La primera etapa llamada desnaturalización consiste en llevar a una t emperatura de 9496oC y se mantiene entre 30 segundos y un minuto. Esto permite la separación de las
dos hebras de ADN que lo constituyen.
Luego tenemos la hibridación, como segunda etapa en la cual los iniciadores se unen a
las regiones 3`complementarias que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.
Para ello, es necesario bajar la temperatura a 50-65 0C durante 20-40 segundos,
permitiendo así el alineamiento. La tercera etapa es llamada Extensión ó Elongación de
la cadena en la cual una nueva hebra de ADN complementario es polimerizada a la
hebra molde, añadiendo los nucleótidos NTPs complementarios en dirección 5’→3’.La
temperatura en esta etapa depende de la ADN polimerasa que se utilice. Para la Taq
polimerasa, la temperatura de máxima actividad está entre 74-80 0C, aunque por lo
general se usa 74 0C. Una cuarta parte es la elongación final en la cual la temperatura es
regulada de 70-74 0C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR, con el objeto de
asegurar que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.
Secuenciación de ácidos nucleicos
Existen dos métodos específicos para determinar la secuencia de nucleótidos de
cualquier fragmento de ADN purificado: el método químico y el enzimático. El método
químico de secuenciación se inicia con la obtención de un conjunto de moléculas de
ADN de doble cadena marcadas en un extremo 5 ́ mediante la acción de la
polinucleótido quinasa y ATP marcado con 32P. Luego, las cadenas de la doble hélice
de ADN se disocian y se someten a un tratamiento suave con un agente químico que
destruye una de las cuatro bases nitrogenadas. Debido a la suavidad del tratamiento,
sólo se rompe, al azar, una base por molécula. Este tratamiento genera una suma de
2 fragmentos de ADN de diferentes longitudes, que reflejan los lugares donde se
encontraban las bases que fueron eliminadas. Los fragmentos son separados mediante la
utilización de un gel y se detectan por autorradiografía.
En el método enzimático de secuenciación, el ADN es utilizado como molde de la ADN
polimerasa para obtener una serie de replicas parciales, que comienzan siempre en el
mismo sitio pero que terminan en diferentes puntos a lo largo de la cadena de ADN.
Este método se basa en la utilización de didesoxirribonucleótidos trifosfatados que, al
carecer del grupo oxidrilo en el extremo 3 ́, impiden el correspondiente agregado de más
nucleótidos a la cadena de ADN en formación; este método es llamado secuenciación
Sanger, por su creador.
Recombinación
La recombinación genética es el proceso mediante el cual los elementos genéticos
contenidos en el genoma de diferentes individuos se combina. Esto permite que el
individuo origine alguna nueva función que pueda dar como resultado una adaptación a
los cambios en el medio ambiente.
Estos mecanismos son llamados transformación, transducción y conjugación.
La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas competentes),
son capaces de incorporar ADN exógeno proveniente de otras bacterias, que esta libre
en el medio. La capacidad de captar el ADN exógeno, conservarlo en forma estable e
interaccionar con el, se denomina competencia.
La transducción es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un
bacteriófago. La conjugación se basa en el intercambio unidireccional de información
genética desde una bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real.
Clonación
Clonación es producir copias exactas de una macromolécula o individuo; en bacterias
esto implica introducir un fragmento de ADN en un vector (elementos de clonación
vehículos que permitan el clonado de cualquier secuencia de ADN). Los vectores de
clonación deben permitir la inserción de un fragmento de ADN extraño y ser capaces de
replicarse normalmente dentro de la bacteria.
Mutación
Una mutación es una alteración en la secuencia de ADN. Puede implicar desde un
pequeño evento como la alteración de un solo par de bases nucleotidicas hasta la
ganancia o perdida de cromosomas enteros. Puede ser causada por daños producidos por
químicos, por radiación o por errores durante la replicación y la reparación del ADN.
Existen diversos tipos de mutación como son: mutación puntual, inserciones,
translocaciones y perdida de un cromosoma completo.
Transgénesis
La transgénesis consiste en la inserción de genes, o secuencias de genes en el genoma
de células o individuos, mediante tecnologías moleculares y celulares, in vitro e in vivo,
para su explotación potencial con diversas finalidades. Gracias a estas tecnologías de
ingeniería genética se pueden aislar segmentos del ADN (el material genético) de un ser
vivo (virus, bacteria, vegetal, animal e incluso humano) e introducirlos en el material
hereditario de otro. se pueden obtener diversos tipos de productos como los llamados
organismos manipulados genéticamente (OMG); en estos se encuentran los polémicos
alimentos transgénicos.
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1.2. Capitulo 5. Tecnología enzimática
1.2.1. Nomenclatura y clasificación.
1.2.2. Extracción, purificación y caracterización de proteínas
1.2.3. Cinética enzimática
1.2.4. Inmovilización
1.2.5. Enzimas industriales, usos frecuentes y mercado
2.2. capitulo 5. Tecnología enzimática.
La tecnología de enzimas involucra la producción (optención de extractos con actividad
catalítica), aislamiento, purificación (separación de otras macromoléculas orgánicas),
uso en forma soluble y finalmente, la inmovilización de las enzimas para su utilización
en gran variedad de biorreactores.
Biocatalizadores
Los biocatalizadores son proteínas con actividad catalítica (enzimas) o pueden ser ácidos
nucleicos (ribosimas) estos últimos descubiertos en la década de los 80´s.
Hoy en día, sabemos que las enzimas son necesarias en todos los sistemas vivos, para
catalizar todas química reacciones necesarias para su supervivencia y reproducción rápidamente, de forma selectiva y eficientemente. Enzimas aisladas también pueden
catalizar estas reacciones. En el caso de las enzimas sin embargo, la cuestión de si
también pueden actuar como catalizadores que viven fuera
sistemas ha sido un punto de controversia entre los bioquímicos en el comienzo de la
siglo XX. Se ha demostrado en una etapa temprana sin embargo que las enzimas podría
de hecho ser utilizados como catalizadores fuera de las células vivas, y varios procesos
en que se
se aplicaron como biocatalizadores han sido patentados (ver sección 1.3).
Estas excelentes propiedades de las enzimas se utilizan en la tecnología de enzimas. Por
ejemplo,
se pueden utilizar como biocatalizadores para catalizar reacciones químicas en una
industrial
escala de manera sostenible. Su aplicación abarca la producción del deseado
productos para todas las necesidades materiales humanas (por ejemplo, alimentos,
alimentos para animales, productos farmacéuticos,
productos químicos finos a granel, fibras, la higiene, y la tecnología del medio
ambiente), así como los
en una amplia gama de propósitos analíticos, especialmente en el diagnóstico. De
hecho, durante la
durante los últimos 50 años, el rápido aumento en el conocimiento de las enzimas -, así
como su biosíntesis
2.2.1. Nomenclatura y clasificación
En la medida que se iban descubriendo nuevas clases de enzimas, los nombres
asignados a estas estaban relacionados con el tipo de sustrato añadiéndoles la
terminación “asa”, tenemos como ejemplo la amilasa, celulasa, pectinasa, entre otras;
algunas veces su nombre no corresponde al sustrato ni al tipo de reacción que estas
catalizan como: bromelina, pepsina, renina, catalasa entre otras; cierto tipo de ellas
llevan el nombre de la fuente de producción como el caso de la proteasa papaína. Este
tipo de terminología, es confusa y desordenada, igualmente no da información básica de
ella; por este motivo era imperioso crear una clasificación sistemática que las clasificara
y ordenara. En agosto de 1955, la Asamblea General de la Unión de Bioquímica y
Biología Molecular, IUBMB (por sus siglas en ingles), crea la Comisión Internacional
de Enzimas (Enzymes Commission, EC) que aborda el estudio, los criterios y reglas
para la clasificación de enzimas; junto con la Comisión de Nomenclatura de la IUPAC,
establecen los parámetros y reglas para nombrar una enzima.
Clasificación enzimática
Para la clasificación de las mismas la EC establece los siguientes criterios: (i) El
nombre de una enzima debe ser exclusivamente individual y este, estar estrechamente
relacionado con su clasificación y actividad catalítica (ii) Si en una reacción catalítica
intervienen mas de una enzima, a esta se le debe agregar el nombre de “complejo”.
Desde 1964 la Comisión Internacional de Enzimas clasifica los diversos tipos de
enzimas en seis grandes grupos, así:
Grupo 1. Oxidoreductasas: son enzimas que catalizan reacciones de óxido-reducción,
empleando coenzimas, tales como NAD+ y NADP+, como aceptor de hidrógenos.
AH2 + B ⇔ A+ BH2
ARed + BOx ⇔ AOx+ BRed
Grupo 2. Transferasas: Catalizan la transferencia de grupos de una molécula a otra.
AB + C ⇔ A+ BC
Grupo 3. Hidrolasas: Catalizan reacciones que implican la ruptura hidrolítica de
enlaces químicos.
AB + H2O ⇔ AH+ BOH
Grupo 4. Liasas: Catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo
enlaces peptídicos), pero a diferencia de las hidrolasas no lo hacen por hidrólisis.
AB ⇔ A+ B
Grupo 5. Isomerasas: Cumplen la función de transformar substratos de una forma
isomérica en otra.
A ⇔ BIsom
Grupo 6. Ligasas: Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultanea de un
nucleótido trifosfato (ATP,GTP, entre otros).
A + B + XTP ⇔ AB+ XDP + Pi
Toda enzima esta nominada con un número de cuatro cifras, los cuales se refieren a:
Primer número: Se puntualiza el grupo al cual pertenece la enzima. Así por ejemplo la
glucosiltransferasa pertenece al grupo de las transferasas, por tal motivo su primer
número es el 2. El segundo número: corresponde a la subclases (ver tabla 1), y hace
referencia al grupo funcional que interviene en la reacción, el tercer número: define la
subsubclase implicando el tipo de sustrato que interviene en la reacción; y el cuarto
número: es el orden aleatorio de clasificación dentro de la subsubclase.
Tabla 1. Subclases de los diversos tipos de enzimas.
Subclases
EC 1
EC 1.1
EC 1.2
EC 1.3
EC 1.4
EC 1.5
EC 1.6
EC 1.7
EC 1.8
EC 1.9
EC 1.10
EC 1.11
EC 1.12
EC 1.13
EC 1.14
EC 1.15
EC 1.16
EC 1.17
EC 1.18
EC 1.19
EC 1.20
EC 1.21
EC 1.22
EC 1.97
EC 2
EC 2.1
EC 2.2
EC 2.3
EC 2.4
EC 2.5
EC 2.6
EC 2.7
EC 2.8
EC 2.9
EC 2.10
EC 3
EC 3.1
EC 3.2
EC 3.3
EC 3.4
Nombre de la enzima y tipo
Oxidoreductasas
Actúa sobre el grupo CH-OH como donador
Actúa sobre el grupo aldehído o oxo.
Actúa sobre el grupo CH-CH.
Actúa sobre el grupo CH-NH2.
Actúa sobre el grupo CH-NH.
Actúa sobre el grupo NADH o NADPH
Actúa sobre el grupo de oros componentes nitrogenados.
Actúa sobre el grupo azufre.
Actúa sobre el grupo hemo.
Actúa sobre el grupo difenol y sustancias relacionadas.
Actúa sobre el grupo peróxido como aceptor.
Actúa sobre el grupo hidrogeno como donador.
Actúa sobre un donador simple con incorporación de una molécula de oxigeno.
Actúa sobre un par de donadores con incorporación o la reducción de una
molécula de oxígeno.
Actúa sobre radicales peróxido como aceptor.
Actúa oxidando iones metálicos.
Actúa sobre el grupo CH o CH2.
Actúa sobre los grupos sulfuro y hierro de las proteínas como donadores.
Actúa sobre los grupos flavonoides.
Actúa sobre los grupos fosfatos como los del arsénico como donadores.
Actúa sobre el grupo X-H y Y-H para formar un enlace X-Y.
Actúa sobre el grupo halogenoide.
Otras oxidoreductasas.
Transferasas
Transfieren grupos a una molecula de carbono.
Transfieren aldehídos o grupos cetónicos.
Aciltransferasas.
Glicosiltransferasas
Transfieren grupos alkilo y metilos.
Transfieren nitrógenos.
Transfieren grupos que contienen fosfatos.
Transfieren grupos que contienen azufre
Transfieren grupos que contienen selenio
Transfieren grupos que contienen molibdeno, tungsteno
Hidrolasas
Actúa sobre enlaces ester
Glicosilasas
Actúa sobre enlaces eter
Actúa sobre enlaces peptidicos
EC 3.5
EC 3.6
EC 3.7
EC 3.8
EC 3.9
EC 3.10
EC 3.11
EC 3.12
EC 3.13
EC 4
EC 4.1
EC 4.2
EC 4.3
EC 4.4
EC 4.5
EC 4.6
EC 4.99
EC 5
EC 5.1
EC 5.2
EC 5.3
EC 5.4
EC 5.5
EC 5.99
EC 6
EC 6.1
EC 6.2
EC 6.3
EC 6.4
EC 6.5
EC 6.6
Actúa sobre enlaces carbón nitrógeno.
Actúa sobre acidos anhídridos
Actúa sobre enlaces carbón – carbón
Actúa sobre enlaces haluros
Actúa sobre enlaces fosfonitrogenados
Actúa sobre enlaces azufre – nitrógeno.
Actúa sobre enlaces fosfato – carbón.
Actúa sobre enlaces azufre – azufre.
Actúa sobre enlaces azufre – carbón.
Liasas
Liasas carbón - carbón
Liasas Carbón – oxigeno.
Liasas carbón – niyrógeno.
liasas carbón – azufre.
Liasas carbón – haluros.
Liasas fosforo – oxigeno.
Otras liasas.
Isomerasas
Racemasas y epimerasas
Cis-trans-Isomerasas
Isomerasas intramolecular
Transferasas intramolecular (mutasas)
Liasas intramolecular.
Otras isomerasas.
Ligasas
Forman enlaces Carbón – oxigeno.
Forman enlaces Carbón —azufre.
Forman enlaces Carbón — nitrógeno.
Forman enlaces Carbón —carbón.
Forman enlaces ester fosfóricos.
Otras ligasas
Tomado de: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
Composición de las enzimas
Todas las enzimas son de composición proteica (cuya unidad fundamental son
aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos), pero están estructuradas en dos partes
bien definidas: la proteína llamada Apoenzima y un grupo prosteico (fracción no
proteica) llamado Coenzima, la cual forma parte estructural de la enzima. La
combinación de la apoenzima con la coenzima, recibe el nombre de holoenzima. Los
cofactores son moléculas que aumentan o disminuyen la actividad de un enzima. La
diferencia entre un coenzima y un cofactor radica que el primero hace parte integral, no
es disociable y le brinda estabilidad a la enzima; mientras que el cofactor son grupos
transitorios, disociables y se pueden unir tanto a la enzima como al sustrato.
Como generalidades de las enzimas podemos decir lo siguiente (i) no sufren
modificación al final de la reacción (ii) no cambian la constante de equilibrio de una
reacción química (iii) son muy específicas (iv) aceleran varios ordenes de magnitud
mayor con respecto a la reacción no catalizada y (v) actúan en condiciones moderadas
de presión y temperatura.
Figura 1. Clasificación de las proteínas.
Tabla 2. Nomenclatura de aminoácidos, el sistema clásico de tres letras fue remplazado
por el sistema actual de una letra, lo cual facilita su utilización en bioinformática,
desarrollado principalmente para biología molecular.
Código de aminoácido
Aminoácido
Tres letras Una letra
Clásico
Actual
Alanina
Ala
A
Arginina
Arg
R
Asparagina
Asn
N
Ácido aspártico
Asp
D
Cisteína
Cys
C
Glutamina
Gln
Q
Ácido glutámico
Glu
E
Glicina
Gly
G
Histidina
His
H
Isoleucina
Ile
I
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptófano
Tirosina
Valina
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Actividad enzimática (U)
La actividad enzimática se define como la medida de la velocidad en la cual un enzima
cataliza una reacción, midiendo cuantitativamente el consumo de sustrato o el
incremento en la concentración de producto, en unas condiciones de temperatura, pH y
concentración de sustrato optimas.
La actividad enzimática es el parámetro cuantificable mas importante del trabajo con
enzimas; saber medirla es clave y fundamental para todos y cada uno de los
procedimientos realizados en enzimología.
V= -d[S] = d[P]
dt
dt
donde V: es la velocidad;
[S]: concentración de sustrato.
[P]: concentración de producto.
dt: periodo de tiempo.
La definición de actividad enzimática (U) según el Sistema Internacional de unidades
(SI) la define como: la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de
sustrato en un minuto.
La actividad específica: es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína
(U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).
Recientemente se ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de
enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat).
Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a
60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los
submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
Ejemplo:
Se requiere medir la actividad enzimática de una invertasa extracelular, proveniente del
extracto crudo de una fermentación del microorganismo Aspergillus niger. La reacción
enzimática se realizó bajo las siguientes condiciones: Concentración se sustrato
(sacarosa): 190 mM, pH: 5.6, temperatura: 40 C, Agitación magnética constante,
relación volumétrica enzima-sustrato: (1:1). Se tomaron alícuotas de 200 microlitros en
los siguientes tiempos: 0, 2, 4, 8, 16, 32 y 64 min, inactivando la enzima por
calentamiento (5 minutos en un baño a ebullición). Posteriormente dichas muestras se
analizaron para cuantificar la concentración de azucares reductores totales mediante el
método de DNS (acido dinitrosalicilico). Los resultados son los siguientes:
Tabla 2. Concentración de azucares reductores totales
Concentración de azucares
Tiempo (min)
reductores totales (mg/ml)a
0
0
2
0.03
4
0.26
8
0.48
16
0.92
32
1.23
64
1.54
ión de azúcares
res (mg/ml)
a: La curva de calibración utilizada relaciona Absorbancia (540 nm) y concentración (mg/ml) de
azucares expresado en glucosa
1,8
1,6
1,4
1,2
1
ab
Grafico 1. Relación entre la concentración de azucares reductores totales como
producto de la reacción enzimática en función del tiempo, gráfica a: aumento en la
concentración de azucares reductores totales a través del tiempo, b: zona roja: puntos
tomados para la regresión lineal y el calculo de la actividad enzimática.
Graficando los valores establecidos: y = 0,0595x - 0,019
Los valores tomados son aquellos que se encuentran en los primeros instantes de la
determinación de los productos(puntos rojos de la gráfica b), cuya pendiente sea mas
cercana a la unidad, igual mente se descartan los valores cuya pendiente sea cero (0) o
incidan de forma significativa en la disminución del valor de la pendiente. En este caso
se tomarían los valores: (0,0); (2, 0.03); (4, 0.26); (8, 0.48); (16, 0.92) y se descartarían:
(32, 1.23) y (64, 1.64); la línea de tendencia central con una pendiente de 0.06
(mg/ml)/min implica la actividad enzimática (U).
Producción y extracción enzimática
La biotecnología ofrece un potencial para aumentar la producción de bienes para la
satisfacción de variadas necesidades humanas; un sub-campo de esta es la tecnología de
enzimas, la cual novedosos y variados procesos están siendo desarrollados para la
fabricación a granel de alimentos de alto valor añadido utilizando enzimas como
biocatalizadores (por ejemplo, pan, queso, cerveza, vinagre entre otros), productos
químicos como: aminoácidos y vitaminas y productos farmacéuticos. Las enzimas son
también utilizados para prestar servicios, como en el lavado en procesos ambientales, o
para fines analíticos y de diagnóstico. El sustento de la tecnología enzimática tanto en el
mundo académico como en el industrial, se basa en dos corrientes: (i) Diseño de
productos: El desarrollo de nuevos y mejores productos, procesos y servicios para
satisfacer las necesidades humanas y (ii) Procesos innovadores: la mejora de procesos
para la obtención de nuevos productos con materias primas existentes. Ambos deben
cumplir con dos criterios: ser competitivos y sostenibles.
La producción de enzimas implica la fuente de obtención de las mismas, así, existen
tres orígenes principales que son: (i) animal, (ii) vegetal y (iii) microbiano. Tanto la
animal como la vegetal son limitadas por las inclemencias externas como el clima, la
fuente de alimentación, variedad de los suelos, entre otras; lo cual la producción
microbiana brinda ventajas de índole biotecnológico como: la obtención rápida y
controlada en reactores enzimáticos.
Las enzimas en cuanto a su extracción las podemos clasificar en dos grandes grupos:
intracelulares y extracelulares. En las primeras es obligatorio el rompimiento celular,
para lo cual existen diversos métodos químicos, físicos y enzimáticos, para la lisis
celular y la extracción de enzimas intracelulares como son:
Formas físicas:
Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio,
mortero, licuadora, a veces con ayuda de abrasivos como alúmina, arena o
bolitas de vidrio; las células son suspendidas en un solvente isotónico (sacarosa
0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico junto con un buffer
para mantener controlado el pH. La homogenización a altas presiones es una
practica muy común en el rompimiento de células y en el estudio sobre la
actividad de enzimas. (Alline; et al, 2012).
Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca
cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa
generalmente para bacterias y levaduras y a veces, para determinados tejidos
animales como el bazo, riñón o eritrocitos. La sonicación puede causar efectos
en la estabilidad enzimática cuando las células se rompen por este método, dicho
cambio varia dependiendo de factores asociados como el pH, temperatura, tipo
de Buffer, tiempo, entre otros; por ejemplo se ha reportado una disminución del
70% de la estabilidad enzimática de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH) y un 15% de la Alcohol deshidrogenasa (ADH) por la extracción con
sonicación. (Belma, et al 2000)
Desintegración térmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y
repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación
se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al
descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia de
agua pura y se libera su contenido.
Formas químicas:
Se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, éter de petróleo,
isopentanol, entre otros.
Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas
por solventes orgánicos. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza
acetona en frío.
Formas enzimáticas
Se utilizan enzimas capaces de hidrolizar las paredes bacterianas permitiendo la
salida del contenido intracelular; la enzima mas utilizada es la lisozima la cual
cataliza de forma específica la hidrólisis de enlaces β (1-4) del ácido Nacetilmuránico presentes en los mucopéptidos de las paredes celulares de las
células bacterianas; de estas, las Gram-positivas son las que presentar mayor
sensibilidad a la lisozima, mientras que las Gram-negativas se consigue con la
adición de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) como agente quelante, lo que
facilita su roptura.
Purificación de enzimas
Existen variados métodos para la purificación de enzimas entre los mas utilizados
tenemos las separaciones cromatográficas, las cuales se basan en las diferencias de
carga, tamaño o afinidad de las diferentes proteínas. La cromatografía utilizada en la
separación de enzimas puede ser de dos tipos: (i) preparativa y (ii) analítica; la
diferencia radica en el volumen de muestra y la recuperación de fracciones que permitan
obtener proteínas para su posterior utilización, esta es la preparativa a diferencia de la
analítica que no permite esto último.
La columna en su interior posee un material sólido con las características químicas
adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada se hace pasar a través de la
columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va
poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. Cada proteína migrará a distinta
velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria.
Existen distintos tipos de cromatografías en tres ellos: (i) cromatografía por filtración o
exclusión molecular (ii) cromatografía de intercambio iónico (iii) cromatografía
hidrofóbica y (iv) cromatografía de afinidad.
Parámetros de purificación
Existen tres parámetros que permiten cuantificar y comparar los diversos métodos de
purificación; estos son: el porcentaje de rendimiento, el factor de purificación y la
actividad enzimática.
El porcentaje de rendimiento: es la relación entre la actividad enzimática total del paso
“n” de purificación y el extracto inicial.
%Rendimiento= (U)n X 100%
(U)extracto inicial
El factor de purificación: es la relación entre la actividad específica del paso “n” de
purificación y la actividad específica del extracto inicial.
Factor de purificación= (U/mg)n
(U/mg)extracto inicial
Actividad específica: Es la relación entre la actividad total (U) sobre el contenido de
proteína en mg.
Actividad específica= (U)/mg de proteína.
Como una forma de comprobación de la purificación enzimática, se utiliza la
electroforesis de proteínas la cual consiste en la separación por peso molecular en una
matriz en la cual las proteínas migran en un campo eléctrico.
Figura 2. Electroforesis de proteínas; purificación de un enzima levansacarosa, tomado
de: Ursula Hettwer, Michael Gross, y Klaus Rudolph; Purification and Characterization
of an Extracellular Levansucrase from Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola; journal
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Caracterización enzimática
La caracterización enzimática se refiere al conocimiento de parámetros específicos de
una enzima como su peso molecular, su punto isoeléctrico, Vmax , Km entre otros.
Tabla 3. Algunos parámetros para el análisis e identificación de enzimas.
Parámetro de
un enzima
Punto isoeléctrico
Peso molecular
Subunidades proteicas
Km, Vmax
Secuencia
pH, Temp, [S] óptimos
Estabilidad a la temp, pH etc
Análisis para su identificación
Isoelectroenfoque
Electroforesis SDS–PAGE
Combinación entre electroforesis SDS –PAGE desnaturalizantes y
reductoras.
Ensayos cinéticos
Espectrometria de masas
Ensayos cinéticos
Ensayos cinéticos
Cinética enzimática
Uno de las medidas mas importantes en los trabajos con enzimas son los parámetros
cinéticos cuyos mas representativos son: la constante de michaelis (Km) y la velocidad
máxima (Vmax ).
Para determinar estos parámetros se relaciona la concentración de sustrato [S] junto con
la actividad enzimática (U). La linealización de la gráfica se puede realizar por medio
de tres formas: (i) Lineweaver Burk (ii) Eadie Hofstee y (iii) Langmuir, siendo la mas
utilizada la primera de ellas.
Linealización con Lineweaver Burk:
1/V= (1/Vmax)+ (Km/Vmax)*(1/S)
Linealización con Eadie Hofstee:
V= Vmax - Km(V/S)
Linealización con Langmuir:
S/V = (1/Vmax)*S + (Km/Vmax)
Ejemplo: Determine la velocidad máxima y el Km de las dos enzimas reportadas en la
tabla 4. Establezca cual de ellas tiene mayor afinidad por el sustrato.
Tabla 4. Variación de la actividad enzimática con respecto a la concentración de
sustrato de dos enzimas invertasas.
Sustrato
(M)a
0
0,11
0,22
0,33
0,44
0,55
0,66
0,77
0,88
Enzima 1
Actividad
(U)
0
1,5
1,9
2,3
2,5
2,8
3
3
3,2
Enzima 2
Actividad
(U)
0
1
1,5
2
2,3
2,5
2,8
2,8
2,9
1,1
1,32
3,2
3,2
2,8
2,8
a) Concentración molar de sacarosa en buffer fosfatos 50 mM a pH: 5.5.
la representación grafica es la siguiente:
Actividad enzimática (U)
3,5
3
2,5
2
1,5
Enzima 1
1
Enzima 2
0,5
0
0
0,5
1
Sustrato (S)
1,5
Grafico 2. Relación actividad enzimática (U) con respecto a la variación de sustrato S.
realizando la linealización por Lineweaver Burk tenemos:
Enzima 1
0,85
1/V
y = 0,0447x + 0,2824
0,75
0,65
0,55
0,45
0,35
0,25
0,15
0,05
-0,05-0,01
1,99
3,99
5,99
7,99
9,99
11,99
1/S
Enzima 2
1,35
1/V
1,15
y = 0,0843x + 0,2473
0,95
0,75
0,55
0,35
0,15
-0,05-0,01
1,99
3,99
5,99
7,99
9,99
11,99
1/S
Grafico 3. Linealización de la curva micheliana utilizando el método de Lineweaver
Burk. El intercepto es: 1/Vmax, en el caso de la enzima 1: su valor es: 0,28; y la enzima
2 es: 0,24; despejando, los valores de Vmax son: 3,57 U enzima 1 y 4,16 U enzima 2.
La pendiente es: Km/Vmax; despejando tenemos: Km enzima 1: 0,15 M y 0,34 M,
para la enzima 2. Debido a esto la enzima 1 posee mayor afinidad por el sustrato toda
ves que presenta una Km menor que la enzima 2.
Inmovilización
La inmovilización enzimática es el proceso por el cual el movimiento de las enzimas, en
el espacio, se ve restringido total o Parcialmente, dando lugar a una forma de enzima
insoluble en agua. Los enzimas inmovilizados son enzimas unidos, insolubilizados,
soportados o ligados a una matriz.
Las enzimas inmovilizadas se dividen en dos grandes grupos: atrapadas y ligadas, ver
figura 3.
Figura 3. Clasificación de enzimas inmovilizadas.
Características de las enzimas inmovilizadas
Son características de las enzimas inmovilizadas las siguientes:
1. Permiten reutilización
2. Se obtienen productos más puros
3. Posibilidad de implementar procesos continuos
4. Requieren control de Temperatura y pH
5. Posibilidad de contaminación
6. Requieren planta especial
Figura 4. Aplicación de enzimas inmovilizadas en la fabricación de jarabes glucosados
a partir del almidón de maíz. 1: Tanque de mezcla. 2: Reactor de tanque agitado y
recuperación por filtración. 3: Intercambiador de calor. 4: Reactor de tanque agitado y
recuperación por filtración. 5: Ultrafiltración. 6: Evaporador.
Aplicaciones de las enzimas
Existen tres tipos de aplicaciones básicas: (i) Procesos industriales, (ii) procesos
analíticos y (iii) uso clínico.
En los procesos industriales muchas enzimas se utilizan en diversas partes ya sea en
proceso o como producto terminado, entre ellas encontramos:
1. Industria de Alimentos
2. Industria Farmacéutica
3. Industria Textil
4. Industria de Detergentes
5. Industria del Cuero
6. Biorremediación y tratamiento de efluentes
las características de este tipo de enzimas son: (i) Uso masivo, (ii) Estructura simple,
(iii) preferiblemente extracelulares, (iv) estables y (v) sin requerimientos de cofactores
disociables.
Tabla 5. Algunas enzimas y sus aplicaciones industriales.
Enzima
Fuente
Usos frecuentes
Glucoamilasa
Extraido del género
Aspergillus.
Fabricación de cerveza y producción de
alcohol
Aminoacilasa
Riñon Porcino
Preparación de L-aminoácidos
extraída de la piña
(Ananas camosus)
Ablandamiento de carnes y preparación de
jugos
Alfaamilasa
Bromelina
obtenida del
fruto inmaduro de la
papaya (familia
caricácea)
Obtenida a partir del
látex de árboles
tropicales del género
Ficus (familia
moreáceas)
Papaina
Ficina
Catalasa
Glucosa oxidasa
Celulasa
Glucosa isomerasa
Lactasa
Renina
Proteasas
Extraido del género
Aspergillus.
Extraida a partir del
hongo Pleurotus
ostreatus
Proveniente de
Streptomyces
lividens
Extraida a partir del
hongo Aspergillus
oryzae.
derivada del
páncreas, estómago e
hígado de los
animales
Ablandamiento de carnes y preparación de
jugos
Ablandamiento de carnes y preparación de
jugos
Antioxidantes en alimentos preparados
Producción de glucosa y alcohol
Manufactura de jarabes fructosados
Utilización en suero de leche e hidrólisis de
lactosa
Manufactura de quesos y saborizantes
Detergentes y producción de alcohol
En aplicaciones clínicas se utilizan por incorporación en línea del reactor enzimático
con un aparato analítico convencional o por inclusión del sistema enzimático como
parte del sistema analítico; sus características son: (i) alta especificidad, (ii) alta
sensibilidad, (iii) alta pureza, (iv) baja estabilidad en condiciones operacionales y (v)
alto costo.
En cuanto a las aplicaciones clínicas: algunas se utilizan para ayudas convencionales
como:
(i) ayuda digestivos (Diastasa pancreática, (ii) antiinflamatorios (Papaína -
Bromelina) y antimicrobianos (Lisozima); otras enzimas son utilizadas en el tratamiento
de enfermedades como: Enfermedades congénitas hereditarias (suministro exógeno de
la enzima deficitaria), remoción de metabolitos potencialmente tóxicos (ureasa en
riñones artificiales) y tratamiento de ciertos tipos de cancer (asparaginasa en ciertos
cánceres sanguíneos) entre otras.
Bibliografia
Belma Özbek, Kutlu Ö Ülgen. The stability of enzymes after sonication. Process
Biochemistry, Volume 35, Issue 9, May 2000, Pages 1037-1043.
Alline Artigiani Lima Tribst, Marcelo Cristianini. High pressure homogenization of
a fungi α-amylase. Innovative Food Science & Emerging Technologies, Volume 13,
January 2012, Pages 107-111.