Instrucciones para hacer graficas y estadisticas en el programa

Instrucciones para hacer las graficas y estadísticas de los datos de RT-­‐PCR en el programa “Graph Pad Prism” con un diseño de 2 variables independientes 1. Abrir el “Excel Spreadsheet” que tiene los datos con el calculo de “Fold Change”. 2. Abrir el programa Prism y seleccionar los siguientes parametros: a. En “New Table & Graph” escoge “Grouped” b. En “Enter/import data:” escoge la 2da opción y entra el numero de replicas biológicas del grupo con mayor cantidad de muestras; c. En “Use sample data” , no escoger nada. d. Terminar esta parte seleccionando “Create” 3. En el “Spreedsheet” , nombra las filas y columnas separando cada variable independiente de la siguiente manera: a. En las filas 1 y 2 escribe “Control” y “Pum RNAi” respectivamente. b. En la 1ra columna (Group A) escribe “No Deprivación de sueno”. c. En la 2da columna (Group B) escribe “Deprivación de sueno”. 4. Ve al programa Excel y copia los valores de “Fold change” del grupo control. 5. Vuelve al programa GraphPad Prism, pon el cursor en primera celda de la izquierda (A:Y1) y selecciona “Paste Transpose” bajo “Edit” para pegar los datos en la fila 1 “ Control”, y la columna 1 “No Deprivación de sueno” . 6. Repite el paso # 5 hasta que tengas los 4 grupos en sus respectivas filas y columnas. 7. Para hacer análisis estadístico utilizando “Two-­‐Way ANOVA” comienza presionando el botón de “Analyze”. Una vez lo presiones, saldrá una ventana, y por la forma en que están arreglados los datos, la opción de Two-­‐Way ANOVA ya estará seleccionada 8. Presiona “OK” y en la ventana que sale selecciona los siguientes parámetros: a. En “Experimental design”, escoge la opción #1. b. En “Factor names” escribe el nombre de tus variables independientes según el arreglo de tus datos: Columnas=Deprivación de sueno, Filas (rows)= Pum RNAi c. Sigue al próximo paso antes de darle a “OK” 9. Selecciona el Tab de “Multiple comparisons" y escoge la 3ra opción. Todavía no presiones “OK”. 10. Presiona el tab de “Options” y escoge los siguientes parámetros (ver imagen): 11. Al presionar “OK’, 3 reportes sobre las estadísticas de sus datos serán generados: 1) Tabular results; 2)Multiple comparisons and ; 3) Narrative results. 12. Ahora, bajo el tab de “Graphs” presiona “Data 1” para ver la grafica de tus datos. En la ventana que se abrirá, selecciona el tipo de grafica deseado (barra, línea, etc), asegúrate que “Mean with SEM” este seleccionado y presiona “OK”. 13. En la grafica, póngale nombre a los ejes, titulo con el nombre del gen asignado, escoja los colores que desee y todos los detalles estéticos que prefieran. Este programa provee gran flexibilidad de cambiar las graficas a su estilo. Toque botones y explore que puede hacer para cambiar lo que quiera. El siguiente es un ejemplo básico: 14. Estadística sobre el efecto de la deprivación de sueno en la exprecion del gen asignado: a. Primero valla al Post hoc analysis o “Multiple comparsisons” para ver el efecto de deprivación de sueño en cada grupo. En este ejemplo la deprivación no afecto significativamente la expresión del gen de interés en el control, ni en las mocas con Pum RNAi. b. Añada “brackets” encima de las barras comparando el efecto de la deprivación de sueño y póngale “ns” encima al bracket si no es significativo, y asterisco * si la diferencia es significativa. Los círculos rojos señalan las teclas necesarias para añadir el bracket y el texto. En este ejemplo hay “ns” en cada comparación ya que no hubo significancia. 15. Estadística sobre la interacción entre el efecto de la deprivación de sueño y el Pum RNAi en la expresión del gen asignado: a. Valla a los “Tabular results” y verifique el p-­‐value de la interaccion para ver si la combinación de deprivación de sueno y el Pum RNAi tiene efectos diferentes de cada factor por individual. En este ejemplo, la interacción tampoco es significativa. b. Añada un “bracket” encima de las barras tal como en la imagen a continuación y y póngale “ns” encima al bracket si no hay significancia, y asterisco * si hay significancia. Esta es la grafica que utilizara en su presentación. 16. Lea los “Narrative results” generados durante el análisis estadístico para que pueda entender mejor la estadística y la interpretación del Two-­‐Way ANOVA.