Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno TN

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA
Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno
TN
Claudio Daniel Navo Nájera
Tutores: Alberto Avenoza Aznar y María del Mar Zurbano Asensio
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Curso 2011-2012
Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno TN, trabajo fin de estudios
de Claudio Daniel Navo Nájera, dirigido por Alberto Avenoza Aznar y María del Mar
Zurbano Asensio (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
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El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA
Grupo de Síntesis Química de La Rioja
U.A. – C.S.I.C.
Trabajo de investigación.
Proyecto fin de Máster.
Claudio D. Navo Nájera
Junio 2012
ALBERTO AVENOZA AZNAR, Catedrático de Química Orgánica del
Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y
MARÍA DEL MAR ZURBANO ASENSIO, Profesora Titular de
Universidad del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.
HACEN CONSTAR:
Que la memoria "Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno
Tn" ha sido realizada por el Licenciado CLAUDIO DANIEL NAVO
NÁJERA en el Departamento de Química de la Universidad de La
Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas
para conseguir los 30 créditos ECTS correspondientes al período de
investigación del Trabajo fin de Máster.
Logroño, Junio 2012
Fdo.: Alberto Avenoza Aznar
Fdo.: María del Mar Zurbano Asensio
A mis padres, mi hermana, demás familiares, mi novia y mis amigos:
sin todos ellos, hoy no sería lo que soy.
Hace ya un año y medio que comencé con mis peripecias químicas
en este grupo, y parece que fuera ayer. Este relativamente corto periodo de
tiempo me ha servido para aprender muchas cosas, tanto en el ámbito
profesional como en el personal. Y esto no hubiera sido posible sin
vosotros:
A Alberto, Pere, Héctor y Marimar, por todo lo que me han ido
enseñando y ayudando a lo largo de todos estos años, desde el día en que
empecé la carrera, y por haberme dado la oportunidad de formar parte de
este grupo. Y también a Paco, por toda la ayuda prestada tanto dentro del
laboratorio como fuera de éste, y por su paciencia, haciendo ver que la
química no es tan difícil, después de todo.
Por supuesto, a todos mis compañeros de laboratorio. De cada uno
de ellos me llevo un trocito de sabiduría. Gracias a Charlie, mi mentor, por
haberme ido enseñando los entresijos del laboratorio con tanta paciencia y
dedicación. A Eva, por echarme una mano siempre que lo he necesitado, y
siempre con una sonrisa en la cara. A Lara, por todo el apoyo y consejos
que me ha ido proporcionando desde el momento en el que entré. A Victor
S., por su gran sentido del humor tan característico y contagioso, sea la hora
del día que sea. A Victor R., por ser un gran compañero de laboratorio y
persona, siempre dispuesto a responder cualquier pregunta, por muy absurda
o tonta que fuera. A Nuria, por llenar el laboratorio de buen rollo y
optimismo. A Fer, que, desde los sótanos, me ha ayudado mucho, sobre
todo con los RMN. A Iván y David, con quienes empecé la carrera, por
todos esos buenos momentos, tanto entonces como ahora. Como no, a
Ismael y Laura, mis compañeros de fatigas durante el Máster, y ahora
también compañeros de grupo, por ese compañerismo y personalidad que
poseéis.
A los nuevos, Nuria, Iris y Victor P., espero que estéis por aquí al
año que viene con la misma ilusión y entusiasmo (o más). Y a todos los
vecinos y compañeros fotoquímicos: Alegría, Héctor, Marina, Pedro,
Miguel Ángel, Diego y Anselmo.
También a todos los demás compañeros de Máster: Laura, Jesús,
Rocío, Justo y Sábel, con quienes las clases se hicieron más amenas y
entretenidas.
Por último, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la
ayuda económica aportada para la realización de este proyecto:
x
Gobierno de La Rioja, por la concesión del proyecto
COLABORA 20010/05.
x
Ministerio de Ciencia e Innovación, por la aportación económica
al proyecto CTQ2009-13814/BQU.
x
Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y
científico idóneo para el desarrollo de este trabajo.
ÍNDICE
Abreviaturas
I
1.
Introducción
1
1.1. Aplicaciones de las glicoproteínas y glicopéptidos
3
1.2. Importancia de la C-glicosilación
11
Antecedentes y objetivos
15
2.1. Formación del enlace O-glicosídico
17
2.2. Formación del enlace C-glicosídico
22
2.3. Trabajos previos
28
2.4. Objetivos
32
Discusión de resultados
33
3.1. Introducción
35
3.2. Síntesis del producto de partida
38
3.3. Síntesis del C-glicopéptido objetivo
42
3.4. Segunda ruta sintética
44
4.
Conclusiones
53
5.
Experimental
59
6.
Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear
73
2.
3.
I
Abreviaturas
[D]xD
G
ºC
1
H RMN
13
C RMN
Ac
AcOEt
Bn
Boc
Boc2O
Bz
cat
Cbz
col.
COSY
d
dd
ddd
ESI
Et
EtOH
Et2O
eq.
Fmoc
g
GalNAc
h
HRMS
HSQC
Hz
J
LHMDS
m
rotación óptica específica
desplazamiento químico
grado Celsius
resonancia magnética nuclear de protón
resonancia magnética nuclear de carbono-13
acetilo
acetato de etilo
bencilo
terc-butoxicarbonilo
dicarbonato de di-terc-butilo
benzoilo
catalizador
benciloxicarbonilo
colaboradores
COrrelated SpectroscopY
doblete
doblete de dobletes
doblete de dobletes de dobletes
ionización por electrospray
etilo
etanol
éter dietílico
equivalente/s
9-fluorenilmetoxicarbonilo
gramo
N-Acetilgalactosamina
hora
High Resolution Mass Spectroscopy
Heteronuclear Single Quantum Correlation
hertz
constante de acoplamiento
hexametildisililamiduro de litio
multiplete
II
mg
mL
mm
mmol
m/z
M
Me
MeCN
MeOH
N
Napht
NEt3
NOESY
PDC
ppm
q
R
ref.
RMN
s
Ser
t
td
TFA
TfO
THF
Thr
TMB
TMS
p-TsOH
v.
miligramo
mililitro
milimetro
milimol
relación masa/carga
molaridad, metal
metilo
acetonitrilo
metanol
normalidad
naftalenuro
trietilamina
Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
dicromato de piridinio
partes por millón
cuatriplete
alquilo
referencia
resonancia magnética nuclear
singlete
serina
pseudotriplete, triplete, tiempo
triplete de dobletes
ácido trifluoroacético
triflato
tetrahidrofurano
treonina
tetrametoxibutano
tetrametilsilano
ácido p-toluensulfónico
versión
3
1.1Aplicacionesdelasglicoproteínasyglicopéptidos
Los aminoácidos hidroxilados, como serina y treonina, además de
formar parte de las proteínas, son fundamentales en otro tipo de
biomoléculas, como las glicoproteínas (Figura 1.1).1 Estos compuestos son
proteínas unidas a oligosacáridos mediante el grupo hidroxilo de la cadena
lateral, presente tanto en la serina como en la treonina, o mediante el N de la
amida de la cadena lateral, presente en la asparagina, formando un enlace
denominado glicosídico de tipo D o E (Figura 1.2).
Figura 1.1. Parte de la glicoproteína MUC1.
1
(a) Varki, A.; Cummings, R. D.; Esko, J.; Freeze, H.; Hart, G. W.; Marth, J. Essentials of
Glycobiology, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor: New York, 1999. (b) Pratt,
M. R.; Bertozzi, R. C. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68. (c) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.;
Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998, 33, 151-208. (d) Strous,
G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57-92. (e) Dwek, R. A. Chem.
Rev. 1996, 96, 683-720. (f) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97-130. (g) Wittmann, V.
Glycopeptides and Glycoproteins: Synthesis, Structure, and Application en Topics in
Current Chemistry, Springer-Verlag, Berlín, vol. 267, 2007.
4
R1 = H (Ser)
R1 = Me (Thr)
BnO OBn
BnO OBn
BnO
O
H
N
R
AcHN
NH
O
AcHN
R1
O
N
H
O
H
N
O
O
BnO
O
O
H
N
R
R
N
H
O
H
N
O
R
Figura 1.2. O-Glicopéptido (izquierda) y N-glicopéptido (derecha).
La presencia de grupos carbohidrato unidos a una proteína altera la
estructura de ésta y, por tanto, su función. En la mayor parte de los casos, se
observa que el péptido adopta una conformación extendida, debido,
lógicamente, a las interacciones producidas entre los restos carbohidrato y el
backbone
(o
esqueleto)
del
péptido.
Por
tanto,
estos
cambios
conformacionales implican un cambio en la función biológica de las
moléculas.
Así, un alto grado de glicosilación modifica las propiedades de
estas glicoproteínas, provocando un aumento en la estabilidad proteica al
reducir su vulnerabilidad a la degradación proteolítica, tanto química como
enzimática.1c
5
Las glicoproteínas juegan un papel importante dentro de numerosos
procesos biológicos.1e,1f,2 Un tipo de glicoproteínas importantes son las
denominadas glicoproteínas anticongelantes3 (Figura 1.3), gracias a las
cuales muchos animales son capaces de soportar las bajas temperaturas de
las aguas polares, ya que evitan la congelación de los fluidos de estos
organismos inhibiendo el crecimiento de cristales de hielo en su interior.
Figura 1.3. Ejemplo de una proteína anticongelante
2
(a) Williams, D. H. Nat. Prod. Rep. 1996, 13, 469-477. (b) Wyss, D. F.; Wagner, G. Curr.
Opin. Biotechnol. 1996, 7, 409-416. (c) Bertozzi, C. R.; Kiessling, L. L. Science 2001, 291,
2357-2364. (d) Partt, M.R.; Bertozzi C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68.
3
(a) Chen, L.; Devries, A. L.; Cheng, C.-H. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 38173822. (b) Tsvetkova, N. M.; Phillips, B. L.; Krishnan, V. V.; Feeney, R. E.; Fink, W. H.;
Crowe, J. H.; Risbud, S. H.; Tablin, F.; Yeh, Y. Biophys. J. 2002, 82, 464-473. (c) Tablin,
F.; Oliver A. E.; Walker N. J.; Crowe L. M.; Crowe J. H. J. Cell Physiol. 1996, 168, 305–
313. (d) Wang J. H. Cryobiology 2000, 41, 1–9. (e) Feeney R. E.; Yeh Y. Trends Food Sci.
Technol. 1998, 9, 102–106. (f) Tachibana Y.; Fletcher G. L.; Fujitani N.; Tsuda S.; Monde
K.; Nishimura S. I. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 856–862.
6
Estas proteínas están siendo estudiadas debido a sus importantes
aplicaciones, desde la conservación de células, tejidos3c o alimentos,3d hasta
la destrucción de tumores.3e Se sabe que para que estas glicoproteínas
mantengan su actividad es necesaria la presencia de la secuencia Ala-(DGalNAc)Thr-Ala, siendo GalNAc la N-acetilgalactosamina. Además, se
conocen tres hechos estructurales que parece que juegan un papel
fundamental en dicha actividad:3f el Me en posición E de la Thr, el grupo
acetilo del GalNAc y que el enlace O-glicosídico sea D y no E. (Figura 1.4).
HO
HO
OH
O
AcHN
O
Ala
HN
Ala
O
Figura 1.4. Secuencia que forma las glicoproteínas anticongelantes, con los
hechos estructurales fundamentales marcados en verde.
Estos datos estructurales afectan a la unión entre el carbohidrato
(GalNAc) y el aminoácido (Ser o Thr). Este glicoaminoácido es conocido
como antígeno Tn, presentando siempre un enlace D-O-glicosídico, y es un
patrón común en numerosas glicoproteínas (Figura 1.5).
HO OH
O
HO
AcHN
OSer/Thr
Figura 1.5. Antígeno Tn
El antígeno Tn se descubrió que era responsable de la aglutinación
de los eritrocitos obtenidos de un paciente con una anemia hemolítica poco
7
frecuente (síndrome Tn), al observar Moreau, Dausset y sus colaboradores
que algunos glóbulos rojos se podían aglutinar por suero humano normal
independientemente del grupo sanguíneo.4 Sin embargo, su estructura no fue
descrita hasta 1975, año en el que Dahr y sus colaboradores identificaron la
estructura GalNAc-O-Ser/Thr.5
Desde que se descubrió que en el 90% de los carcinomas humanos
estaba presente esta estructura,6 ha atraído mucha atención en el mundo de
la oncología. Numerosos estudios clínico-patológicos han sido descritos
confirmando su importancia en biología de tumores y su valor para el
diagnóstico diferencial de varios tipos de cánceres.7 Además, se sabe que es
un elemento importante en el reconocimiento celular, participando como
mediador en varias interacciones intercelulares, como puede ser la
metástasis organotrópica en células tumorales. Esto lo convierte en un
potencial objetivo para la inmunoterapia contra el cáncer.
Por otro lado, se ha descubierto que el antígeno Tn se expresa por
la proteína gp120 del síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) y se ha
detectado recientemente su presencia en un amplio rango de parásitos de
tipo helmíntico, abriendo así nuevas vías de investigación en el estudio de
las interacciones parásito – huésped.
4
(a) Moreau, R.; Dausset, J.; Bernard, J.; Moullec, J. Bull. Soc. Méd. Hôp. 1957, 73, 569587. (b) Dausset, J.; Moullec, J.; Bernard J. Blood 1959, 14, 1079-93.
5
Dahr, W.; Uhlenbruck, G.; Gunson, H.; van der Hart, M. Vox Sang 1975, 29, 36-50.
6
Springer, G. Science, 1984, 224, 1198-206.
7
Hanisch, F. G.; Baldus, S. E. Histol. Histopathol. 1997, 12, 263-281.
8
Otro tipo de O-glicoproteínas importantes son, sin duda, las
mucinas,8 que se localizan en la membrana de muchas células epiteliales.
Estas glicoproteínas actúan en procesos como la inflamación, la respuesta
inmunológica, la comunicación célula-célula, el crecimiento celular, la
adherencia celular y la actividad anticongelante, entre otros.1c,3f,9
Además, las mucinas son moléculas de gran interés desde el punto
de vista terapéutico,10 especialmente en el desarrollo de vacunas para el
tratamiento del cáncer.11
En las mucinas, el primer residuo de carbohidrato unido a la cadena
peptídica es el GalNac, y se une a través de un enlace D-O-glicosídico a
serina o treonina. De nuevo, aparece la estructura del antígeno Tn (Figura
1.5) en otro tipo de O-glicoproteína.
Actualmente se sabe que las mucinas están sobreexpresadas en las
células tumorales, ocurriendo con frecuencia cambios en la glicosilación.
8
Strous, G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57–92.
Lowe, J. B. Cell 2001, 104, 809-812.
10
(a) Davis, B. G. Chem. Rev. 2002, 102, 579-601. (b) Watt, G. M.; Lund, J.; Levens, M.;
Kolli, V. S. K.; Jefferis, R.; Boons, G.-J. Chem. Biol. 2003, 10, 807-814. (c) Lui, H.; Wang,
L.; Brock, A.; Wong, C.-H.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1702-1703. (d)
Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G.
Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 116, 827-833. (e) Davis, B. G. Science 2004, 303, 480-482.
11
(a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200-205. (b) Moingeon, P.
Vaccine 2001, 19, 1305-1326. (c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem., Int. Ed.
2000, 39, 836-863. (d) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem.
2005, 13, 5043-5054. (e) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int.
Ed. 2005, 44, 7630-7635. (f) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Glycobiology 2006, 16,
113R-136R. (g) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nature Rev. 2005, 4, 477-488. (h)
Hollingsworth, M. A.; Swanson, B. J. Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 45-60. (i) Brocke, C.;
Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112. (j) Kim, Y. J.; Varki, A.
Glycoconjugate J. 1997, 14, 569-576. (k) Trap, M. A.; Clausen H. Biochim. Biophys. Acta
2008, 1780, 546-563.
9
9
Como consecuencia del mal funcionamiento de algunas glicosiltransferasas,
las células cancerosas presentan glicoproteínas parcialmente glicosiladas y
con glicanos más cortos y menos complejos de lo normal (Figura 1.6).
Figura 1.6. Mucina sana y mucina con errores de glicosilación.
Esto determina que algunos antígenos, que en las células normales
se encuentran enmascarados por la presencia de carbohidratos más externos,
queden expuestos en la superficie,12 resultando la formación de nuevos
antígenos asociados al cáncer. Este hecho convierte a los glicopéptidos
derivados de mucinas parcialmente glicosilados en prometedores candidatos
para la terapia contra el cáncer (vacunas basadas en carbohidratos).13 En este
12
(a) Sell, S. Human Path. 1990, 21, 1003–1019. (b) Hakomori, S.; Zhang, Y. Chem. Biol.
1997, 4, 97-104. (c) Taylor-Papadimitriou, J.; Epenetos, A. A. Trends Biotech. 1994, 12,
227–233. (d) Gabius, H. J. Angew. Chem. 1988, 27, 1267–1276.
13
(a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112. (b) Dziadek, S.;
Kunz, H. The Chem. Rec. 2004, 3, 308-321. (c) Jaracz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.;
Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054. (d) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R.
Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 836-863. (e) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.;
Olkiewicz, K.; Verbel, D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.;
Livingston, P. O.; Scher, H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292-4298. (f) Chen, X.; Lee, G. S.;
Zettl, A.; Bertozzi, C. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, 6111-6116. (g) Galonic, D. P.;
10
contexto, el grupo de Danishefsky14 ha desarrollado algunas vacunas que
contienen diferentes estructuras de glicanos.
A modo de ejemplo se muestra una vacuna sintética desarrollada
por el grupo de Boons15 constituida por los mínimos requerimientos
estructurales para provocar una respuesta inmune. Consta de tres partes: el
antígeno Tn, el péptido epítopo T, constituido por una secuencia de 20
aminoácidos, denominado YAF, y un lipopéptido abreviado como Pam3Cys
(Figura 1.7).
HO
HO
OH
O
AcHN
O
Me
O
H
N
AcHN
O
H
N
3
GLFLEFANRGVNAHRAYKFAY N
H
O
S
NH
O
O
O
O
14
Antígeno Tn
Espaciador
Péptido YAF
(epítopo T)
O
14
14
Lipopéptido Pam3Cys
Figura 1.7. Estructura de la vacuna de Boons.
Gin, D. Y. Nature 2007, 446, 1000-1007. (h) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med.
Chem. 2005, 13, 5021-5034. (i) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nat. Rev. Drug Discovery
2005, 4, 477-488.
14
Ragupathi, G.; Coltart, D.M.; Williams, L. J.; Koide, F.; Kagan, E.; Allen, J.; Harris, C.;
Glunz, P. W.; Livingston, P.O.; Danishefsky, S. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99,
13699-13704
15
Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Angew. Chem., Int. Ed. 2005, 44, 5985-5988.
11
1.2ImportanciadelaCǦglicosilación
La C-glicosilación, la formación de un enlace carbono-carbono en
el centro anomérico de un carbohidrato, ha atraído una gran atención debido
a la importancia de los compuestos que presentan este tipo de enlace en su
estructura, como pueden ser los C-glicósidos miméticos de glicolípidos,
oligosacáridos o glicoproteínas.
En 1993 se logró aislar y determinar la estructura de las
agelasfinas, unos novedosos esfingolípidos anticancerosos extraidos de una
esponja marina, Agelas mauritianus (Figura 1.8, izquierda). Ya que son los
primeros ejemplos de D-galactosil ceramidas encontrados en la naturaleza, y
que se espera un nuevo modelo de acción dada su actividad anticancerígena,
el desarrollo de fármacos antitumorales basados en agelasfinas conduce
hasta el KRN7000 (Figura 1.8, centro), un esfingolípido sintético que ha
demostrado ser un efectivo antitumoral.
Diez años más tarde, Franck y sus colaboradores16 publicaron la
síntesis de un C-glicósido análogo del KRN7000 (Figura 1.8, derecha), el
cual, sorprendentemente, mostró una actividad cien veces superior al
KRN7000 en un modelo de melanoma de ratón.
16
Franck, R. W.; Tsuji, M. Acc. Chem. Res. 2006, 39, 692-701.
12
HO OH
O
HN
HO
HO
O
HO OH
OH
(CH2)21CH 3
OH
HN
HO
HO
OH
(CH 2 )23CH3
OH
(CH 2 )13CHMe 2
(CH2)11CHMe2
OH
OH
agelasfina
O
HO OH
O
HN
HO
HO
O
OH
(CH2 )23CH3
OH
C-glicósido del KRN7000
(CH2 )13CHMe2
OH
KRN7000
Figura 1.8
Este ejemplo demuestra la importancia de los C-glicósidos
análogos de glicoconjugados biológicamente activos en ámbitos como la
biología o la farmacia.
Estas uniones C-glicosidicas están presentes en multitud de
productos naturales biológicamente importantes como pueden ser toxinas
marinas naturales o antibióticos (Figura 1.9)
Debido a que la síntesis de estas estructuras complejas ha sido
objetivo en los últimos años de la química orgánica sintética, las reacciones
de C-glicosilación estereoselectivas han sido estudiadas de forma extensiva.
Para ello se utilizan carbohidratos como compuestos quirales de partida, ya
que son fácilmente accesibles de la naturaleza.17
17
(a) Isobe, M.; Ichikawa, Y.; Bai, D. L.; Masaki, H.; Goto, T. Tetrahedron 1986, 27,
4767-4776. (b) Ley, S. V.; Humphries, A. C.; Eick, H.; Downham, R.; Ross, A. R.; Boyce,
R. J.; Pavey, J. B. J.; Pietruszka, J. J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1998, 1, 3907-3912. (c)
Forsyth, C. J.; Sabes, S. F.; Urbanek, R. A. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8381-8382. (d)
Nicolaou, K. C.; Yang, Z.; Shi, G. Q.; Gunzner, J. L.; Agrios, K. A.; Gärtner, P. Nature
1998, 392, 264-269.
13
O
H
O
O
HO
O
OH
H
OH
H
H
OH
O
O
H
O
H
H
OH
O
ácido okadaico
OH
O
HO
HO
OH
HO
H HO O H
O
H
O
OH
O
CO2H
OH
O
OH O
vineomycinone B2
OH
Cl
H
O
HO
H
O
O
O
O H
H
O
H
O
H
AcO
OAc
H
O
OMe
OH
espongistatina
O
H
HO
H
brevetoxina A
H
OH
H
O
H
HO
H
H
O
H
O
H
H
OH
H
O
O
Figura 1.9. Compuestos naturales que presentan enlaces C-glicosidicos
(marcados en rojo).
17
En el presente capítulo se describen los procedimientos sintéticos
más habituales para la formación de enlaces O y C-glicosídicos. Además se
recoge un breve resumen de los trabajos previos realizados y las
conclusiones más importantes obtenidas por nuestro grupo de investigación
en este campo.
2.1FormacióndelenlaceOǦglicosídico
En la mayoría de las glicoproteínas, la unión entre los restos
carbohidrato con la cadena peptídica es mediante un enlace O-glicosídico.
La incorporación de la parte carbohidrato a un péptido es el paso clave en la
obtención de glicopéptidos, la cual se lleva a cabo a través de la síntesis de
un building block: un glicoaminoácido que, posteriormente se incorpora en
un péptido mediante síntesis en fase sólida (SPSS). Otra opción es la
formación del enlace glicosídico directamente sobre un aminoácido que
forme ya parte de una cadena peptídica, aunque ésta suele darse con bajos
rendimientos.
El enlace O-glicosídico entre el grupo hidroxilo de Ser o Thr y el
GalNAc muestra generalmente configuración D. A pesar de que en la
bibliografía se pueden encontrar diversas revisiones acerca de la formación
de enlaces O-glicosídicos,1 se describirán a continuación algunas de las
metodologías más habituales para la formación del enlace D-O-glicosídico,
utilizando GalNAc como resto carbohidrato.
1
(a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362. (b) Boons, G. J., Tetrahedron
1996, 52, 1095-1121. (c) Davis, B. G. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 2000, 2137-2160. (d)
Arsequell, G.; Valencia, G. Tetrahedron-Asymmetry. 1997, 8, 2839-2876. (e) Brocke, C.;
Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112. (f) Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz,
M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537.
18
MÉTODO DEL TRICLOROACETIMIDATO
Este método, desarrollado por Wong y colaboradores,2 proporciona
de forma mayoritaria el anómero D frente al E. Se utiliza el grupo
tricloroacetimidato como activador para la glicosilación en un derivado de
Thr y, en dos pasos, se genera el enlace D-O-glicosídico, obteniendo los
anómeros D y E en proporción 2:1, respectivamente (Esquema 2.1).
AcO OAc
AcO OAc
CCl3CN, K2CO3, CH2Cl2
O
AcO
AcO
OH
N3
CCl3
O
N3
O
NH
AcO OAc
AcO OAc
CCl3
O
AcO
N3
O
NH
+
Me
CO2Allyl
TMSOTf, CH2Cl2, éter
HO
NHFmoc
55% (Dos etapas)
O
AcO
N3
O
Me
CO2Allyl
NHFmoc
Esquema 2.1
El grupo de Toyokuni describió un ejemplo utilizando Ser
debidamente protegida a través de esta misma metodología, obteniendo de
forma mayoritaria el anómero D, donde la mezcla de anómeros se separa
utilizando cromatografía flash (Esquema 2.2).3
2
Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y-Y.; Case D.A.; Wong C-H. J. Am. Chem.
Soc. 2007, 129, 13527-13536.
3
Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673-2676.
19
AcO OAc
O
AcO OAc
CCl3
O
AcO
O
N3
CO2Bn
+
NH
HO
NHCbz
TMSOTf
(68%)
AcO
N3
O
CO2Bn
NHCbz
Esquema 2.2
METODOLOGÍA DE SCHMIDT
Esta metodología, una de las más extendidas, fue desarrollada por
Schmidt y colaboradores4 para la obtención de un enlace D-O-glicosídico
con el GalNAc.4c,5
La metodología se basa en una adición de tipo O-Michael, en
medio básico, de un alcohol al 2-nitro-D-glucal o 2-nitro-D-galactal
convenientemente protegidos, con formación de los correspondientes
productos de O-glicosilación (Esquema 2.3).
BnO
OTBDPS
O
BnO
+
R
CO2 tBu
HO
NHBoc
t
BuOK
tolueno
NO2
BnO OTBDPS
O
BnO
O2 N
O
CO2 tBu
NHBoc
R: H
R: Me
R
R: H (97%)
R: Me (97%)
Esquema 2.3
4
(a) Winterfeld, G. A.; Ito, Y.; Ogawa, T.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1999, 11671171. (b) Winterfeld. G. A.; Schmidt, R. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2654-2657.
(c) Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609-1613. (d) Schmidt, R. R.;
Vankar, Y.D. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1059-1073.
5
Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706-707.
20
Este método permite, en general, obtener de forma mayoritaria el
anómero D, aunque la selectividad se puede controlar mediante la base
utilizada. De esta forma, con bases fuertes como tBuOK, se obtiene una
elevada selectividad D, mientras que utilizando bases de tipo amina, como
puede ser NEt3, la selectividad favorecida es la E.
METODOLOGÍA DE KOENIGS-KNORR
Este método es uno de los más antiguos y sencillos de
glicosilación.6 Se basa en el empleo de haluros derivados de carbohidratos,
como grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo aceptor.
Esta metodología fue la utilizada por Liebe y Kunz en la síntesis del
antígeno Tn (Esquema 2.4).7
6
7
Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981.
Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.
21
AcO OAc
AcO OAc
Me
O
+
AcO
N3
Br
HO
AgClO4/Ag2CO3 (1:11)
CH2Cl2/tolueno (10:9)
47%
NHFmoc
CO2tBu
O
AcO
N3
O
CO2tBu
NHFmoc
Me
HO OH
O
HO
AcHN
O
Me
CO2H
NH2
Antígeno Tn
Esquema 2.4
22
2.2FormacióndelenlaceCǦglicosídico
Ya se ha comentado en el capítulo de Introducción la importancia
que tiene sobre la estructura de una glicoproteína, y por tanto sobre su
función, el tipo de enlace, O o C-glicosídico, que se forma entre el resto
carbohidrato y la cadena peptídica. Aunque también se pueden encontrar
diversas revisiones acerca de la formación de enlaces C-glicosídicos,1a,8 se
describirán a continuación algunas de las metodologías más habituales para
la formación del enlace D-C-glicosídico.
ADICIÓN NUCLEÓFILA SOBRE DERIVADOS CARBOHIDRATO ELECTRÓFILOS
Esta estrategia es una de las más utilizadas para la C-glicosilación.
Uno de los métodos más clásicos es por adición de un reactivo de Grignard
a un haluro de glicosilo. Así, la reacción entre yoduro de galactosilo y
bromuro de vinilmagnesio en presencia de TBAI (n-Bu4NI) en tolueno a
110 ºC da, de forma estereoselectiva, el D-vinil-C-galactósido (Esquema
2.5).9
8
Fraser-Reid, B. O.; Tatsuta, K.; Thiem, J. Glycoscience, Springer-Verlag, Berlín, vol. 1,
2008.
9
Kulkarni, S. S.; Gervay-Hague, J. Org. Lett. 2006, 8, 5765
23
BnO OBn
O
BnO
BnO OBn
BnO OBn
BnO
MgBr
O
BnO
I
BnO
I
TBAI
tolueno
110 ºC
O
BnO
BnO
79% (D/E = 12/1)
Esquema 2.5
En estas condiciones, ambos anómeros del yoduro de galactosilo, D y E,
se encuentran bajo un equilibrio de anomerización y el bromuro de vinilmagnesio
reacciona preferentemente con el anómero E, que es más reactivo, dando el
producto via SN2. Éste producto es un intermedio de la síntesis del glicolípido
antitumoral KRN7000.
REACCIONES RADICALARIAS
Las reacciones radicalarias han sido empleadas en la síntesis de DC-glicósidos de 2-aminoazúcares.10 El bromuro de GalNAc, D o E, se hace
reaccionar con alilfenilsulfona en presencia de (Bu3Sn)2 disuelto en benceno
y activación por luz, para formar el D-alil-C-GalNAc (Esquema 2.6).9a
AcO OAc
O
AcO
AcHN
SO2Ph
(Bu3Sn)2, hQ,
benceno
Br
AcO OAc
O
AcO
AcHN
42 %
Esquema 2.6
10
(a) Bouvet V. R.; Ben, R. N. J. Org. Chem. 2006, 71, 3619-3622. (b) Roe, B. A.;
Boojamra, C. G.; Griggs, J. L.; Bertozzi, C. R. J. Org. Chem. 1996, 61, 6442-6445. (c)
Grant, L.; Liu, Y.; Walsh, K. E.; Walter, D. S., Galagher, T. Org. Lett. 2002, 4, 4623-4625.
(d) San Martin, R.; Tavassoli, B.; Walsh, K. E.; Walter, D. S.; Galagher, T. Org. Lett. 2000,
2, 4051-4054. (e) Abel, S.; Linker, T.; Giese, B. Synlett 1991, 1, 171-172.
24
GENERACIÓN DE UN ANIÓN ANOMÉRICO
Al contrario que en la C-glicosilación por adición nucleófila a un
carbohidrato electrófilo, el uso de un anión anomérico ha estado muy
limitado, debido a su inestabilidad. Aun así, se puede utilizar esta
metodología
en
C-glicosilación
estereoselectiva,
ya
que
a
bajas
temperaturas, los aniones son configuracionalmente estables, y pueden
reaccionar con una gran variedad de electrófilos.
Un ejemplo típico es el de la N-acetilglucosamina. Partiendo del
cloruro de N-acetilglucosamina, se trata con n-BuLi y se reduce a
continuación con naftalenuro de litio a -78 ºC. De esta forma se genera un
dianión, con retención de la configuración en el carbono anomérico. Este
anión anómerico reacciona con aldehídos, CO2 y yoduros de alquilo,
formando los correspondientes D-glicósidos (Esquema 2.7)11.
OBn
BnO
BnO
1) n-BuLi, THF,
-90 ºC, 1 min
O
AcHN
Cl
2) Li-Napht,
-78 ºC, 10 min
OBn
OBn
BnO
BnO
O
AcN
Li
Li
i-Pr-CHO
BnO
BnO
64% (D/E = 17/1)
O
AcHN
HO
i-Pr
Esquema 2.7
11
(a) Hoffmann, M.; Kessler, H. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 6067-6070. (b) Burkhart, F.;
Kessler, H. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 255-256.
25
TRANSPOSICIÓN SIGMATRÓPICA
La reacción más importante dentro de las transposiciones
sigmatrópicas para la C-glicosilación es la transposición de Claisen. Ireland
y Fraser-Reid publicaron una transposición de este tipo del éster del glical y
sus derivados,12 en la que se propone un estado de transición tipo bote.
(Esquema 2.8). Dado que se trata de un proceso concertado, la quiralidad se
conserva a lo largo de la reacción.
O
O
O
O
O X
O
H
X
O
OH
X
Esquema 2.8
En el ámbito de los glicoaminoácidos, la transposición de un
oxazol, derivado del éster de la alanina, conduce, tras otros pasos de
reacción, a C-manosil-alanina (Esquema 2.9).13
12
(a) Fraser-Reid, B.; Dawe, R. D.; Tulshian, D. B. Can. J. Chem. 1979, 57, 1746-1748. (b)
Ireland, R. E.; Wilcox, C. S.; Thaisrivongs, S.; Vanier, N. R. Can. J. Chem. 1979, 57, 17431745.
13
Colombo, L.; Di Giacomo, M.; Ciceri, P. Tetrahedron 2002, 58, 9381-9386.
26
O
O
O
O
PPh3, CCl4
Et3N, t.a.
O
N
O
O
O
Ph
(2.6/1)
N
NHBz
O
O
O
O
O
86%
O
O
Ph
NH2
HO
O
HO
CO2H
OH
OH
Esquema 2.9
REACCIONES CATALIZADAS POR METALES DE TRANSICIÓN
Desde que se ha empezado a estudiar de forma extensiva la
formación de enlaces C-C catalizada por metales de transición, un gran
número de reacciones con catalizadores como Ni o Pd han sido publicadas
para la generación de enlaces C-glicosídicos, debido a la alta compatibilidad
con diversos grupos funcionales.
La reacción de un complejo S-alil-paladio con un anión
estabilizado (reacción de Tsuji-Trost) se ha ampliado para la C-glicosilación
de azúcares insaturados. En concreto, azúcares 2,3-insaturados se tratan con
un nucleófilo carbonado en presencia del catalizador de Pd(0) con migración
del doble enlace. La estereoquímica depende generalmente de la naturaleza
del nucleófilo: cuando se emplea un anión estable (nucleófilo blando), el
nucleófilo ataca al carbono anomérico por la cara contraria a donde se sitúa
el complejo de paladio (ataque anti), reteniendo por completo la
27
configuración. Si se trata de un anión no estabilizado (nucleófilo duro), el
anión atacará al Pd y se transferirá al carbono anomérico por la misma cara
(ataque sin), transcurriendo la reacción con inversión de la configuración
(Esquema 2.10).14
OMe
O
CO2Me
CO2Me
NHAc
OMe
O
CO2Me
CO2Me
NHAc
DMF, 70 ºC
OMe
O
OAc
Pd OAc
nucleófilo
Pd(PPh3)4
90%
OMe
OMe
O
PhZnCl
O
OMe
O
Ph
THF, t.a.
Pd OAc
Pd Ph
94%
Esquema 2.10
14
(a) Dunkerton, L. V.; Serino, A. J. J. Org. Chem. 1982, 47, 2814. (b) Moineau, C.; Bolitt,
V.; Sinou, D. J. Org. Chem. 1998, 63, 582.
28
2.3Trabajosprevios
Es conocido que la D-O-glicosilación de proteínas tiene un enorme
efecto de organización sobre la cadena peptídica, forzándola a una
conformación extendida.15,16 Diversas investigaciones han intentado
encontrar una explicación para este hecho, ya que para discernir cómo las
glicoproteínas interaccionan con sus blancos biológicos, es esencial mejorar
nuestra comprensión acerca de los mecanismos que permiten que el
carbohidrato modifique el equilibrio conformacional del esqueleto
peptídico. Actualmente, esta conformación extendida se explica mediante la
formación de un enlace de hidrógeno, el cual tiene lugar entre el NH del
GalNAc y el oxígeno carboxílico del aminoácido al que está unido, tal y
como se propone en el estudio llevado a cabo por Danishefsky y col.14
(Figura 2.1). Este enlace de hidrógeno “bloquea” la orientación del
carbohidrato con respecto al esqueleto peptídico.17
15
Coltart, D. M.; Royyuru, A. K.; Williams, L. J.; Glunz, P. W.; Sames, D.; Kuduk, S.;
Schwarz, J. B.; Chen, X.-T.; Danishefsky, S. J.; Live, D. H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124,
9833-9844.
16
Pratt, M. R.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68.
17
(a) Mimura, Y.; Inoue, Y.; Maeji, N. J.; Chûjô, R. Int. J. Pept. Protein Res. 1989, 34,
363-368; (b) Shuman, J.; Qiu, D.; Koganty, R. R.; Longenecker, B. M.; Campbell, A. P.
Glycoconjugate J. 2000, 17, 835-848. (c) Tachibana, Y.; Monde, K.; Nishimura, S.-I.
Macromolecules 2004, 37, 6771-6779.
29
a
b
Figura 2.1. a) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de treonina de la
cadena peptídica a través de enlaces de hidrógeno. b) Interacciones entre el
GalNAc y el residuo de serina de la cadena peptídica a través de moléculas
de agua.
Sin embargo, y atendiendo a la geometría, el enlace de hidrógeno
propuesto entre el GalNAc y el aminoácido al que está unido presenta
valores fuera del intervalo de un enlace de hidrógeno convencional.18
En el mismo estudio los autores han observado que los derivados
con un enlace E-O-glicosídico no inducen ningún cambio conformacional en
el péptido, debido a que no presentan los enlaces de hidrógeno comentados
anteriormente. Otros autores achacan estos cambios en la estructura del
péptido a impedimentos estéricos, ya que la glicosilación se da,
generalmente, en varios puntos contiguos del péptido.19
18
Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J.;
Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 14640-14648.
19
Schuman, J.; Qiu, D.; Koganty, R. R.; Longenecker, B. M.; Campbell, A. P.
Glycoconjugate J. 2000, 17, 835-848.
30
Debido a esta controversia, nuestro grupo de investigación se
planteó demostrar si esta interacción es la responsable o no de la
conformación extendida del esqueleto peptídico. Para ello se estudiaron
diversos glicoaminoácidos, con Ser, Thr o D-MeSer unida por enlace
glicosídico a GalNAc, en sus formas D y E. Los resultados experimentales y
teóricos obtenidos en este estudio señalan la existencia de una molécula de
agua puente entre las partes carbohidrato y peptídica e indican que las
moléculas de agua circundantes son también esenciales para mantener la
conformación bien definida (Figura 2.1b). A pesar de que estos resultados
son para el glicopéptido modelo más pequeño, la existencia de tales
interacciones carbohidrato-péptido a través de moléculas de agua puente
podría explicar las características particulares de las glicoproteínas tipo
mucina.
Por otro lado, la limitación en la flexibilidad conformacional en
glicopéptidos es campo de interés para los investigadores, con el fin de
encontrar conformaciones bioactivas. Una de las estrategias más
importantes consiste en sustituir alguno de los aminoácidos naturales
glicosilados (Ser o Thr) por uno no natural análogo estructuralmente, pero
que presente cierta rigidez conformacional. En este campo, nuestro grupo de
investigación tiene una amplia experiencia en la síntesis de hidroxiaminoácidos no naturales con rigidez conformacional análogos de Ser y Thr.
De entre las metodologías desarrolladas por nuestro grupo para añadir una
restricción al aminoácido, nos centraremos en la estrategia que implica la
síntesis de un N,O-acetal bicíclico,20 que puede ser alquilado estereo20
(a) Jiménez-Oses, G.; Aydillo, C.; Busto, J. H.; Zurbano, M. M.; Peregrina, J. M.;
Avenoza, A. J. Org. Chem. 2007, 72, 5399-5402. (b) Aydillo, C.; Jiménez-Osés, G.;
Avenoza, A.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. J. Org. Chem. 2011, 76, 6990–
31
selectivamente, obteniéndose diversas D-alquilserinas enantioméricamente
puras de forma rápida, sencilla y en escala multigramo (Esquema 2.11). Esta
alquilación tiene lugar con una diastereoselectividad superior al 95% y con
retención de la configuración original. Con electrófilos como ésteres D,Einsaturados en adiciones de Michael, también se lograron buenos
rendimientos y elevadas diastereoselectividades.
MeO
HO
O
O
RX
H 2N
N
R
O
R
CO 2Me
MeO
CO2H
a-alquilserinas
O
O
N
CO2Me
O
O
CO2Me
1
O
HO
N
O
H2 N
CO2 Me
MeO2 C
CO2H
MeO 2C
ácido (R)-(hidroximetil)glutámico
Esquema 2.11
Como continuación lógica a nuestra investigación, se decidió
emprender una rama paralela de investigación a la O-glicosilación: la Cglicosilación,
utilizando
nuestra
metodología
de
síntesis
de
hidroxiaminoácidos.
6996. (c) Aydillo, C.; Jiménez-Osés, G.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M.;
Avenoza, A. Chem. Eur. J. 2007, 13, 4840-4848.
32
2.4Objetivos
De entre todas las rutas sintéticas comentadas anteriormente para la
formación de enlaces C-glicosídicos, la más sencilla y directa es la adición
nucleófila sobre derivados carbohidrato electrófilos, y más aún, teniendo en
cuenta los excelentes resultados obtenidos en nuestro grupo de investigación
en la alquilación del N,O-acetal bicíclico 1. De esta forma se pretende en el
presente trabajo sintetizar el C-glicopéptido, análogo del antígeno Tn, que se
muestra en la figura 2.2.
HO OH
OH
HO
AcHN
AcHN
CONHMe
Figura 2.2
Una vez sintetizado el glicopéptido, y ya fuera de este trabajo, se
realizará un estudio estructural tanto experimental (RMN) como
teóricamente (dinámica molecular y cálculos DFT) en disolución acuosa y
se compararán con los obtenidos anteriormente para la diamida de D-O-DGalNAc-L-Ser.
35
3.1.Introducción
En nuestro grupo de investigación, contamos con una gran
experiencia tanto en síntesis como en análisis conformacional de Oglicopéptidos.1 Como ya se ha comentado en el capítulo de Antecedentes y
objetivos, el método de Schmidt permite la glicosilación de los aminoácidos
hidroxilados. A través del tri-O-bencil-2-nitro-D-galactal (Esquema 3.1),
mediante una reacción de tipo O-Michael del aminoácido protegido, se logra
la unión con el carbohidrato (Esquema 3.2).
BnO
O
BnO
BnO
OBn
O
1) HNO3, Ac2O, -50 ºC
2) NEt3, CH2Cl2, t.a.
OBn
BnO
NO2
Esquema 3.1
1
(a) Corzana, F.; Busto, J. H.; Engelsen, S. B.; Jiménez-Barbero, J.; Asensio, J. L.;
Peregrina, J. M.; Avenoza, A. Chem. Eur, J. 2006, 12, 7864-7871. (b) Corzana, F.; Busto, J.
H.; Jiménez-Osés, G.; Asensio, J.L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J.
Am. Chem, Soc. 2006, 128, 14640-14648. (c) Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.;
De Luis, M. G.; Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am.
Chem. Soc. 2007, 129, 9458-9467.
36
BnO
BnO
OBn
OH
O
R
BnO
NO2
NHAc
t BuOK,
THF, t.a.
BnO
OBn
O
NHAc
O2N
O
CONHMe
CONHMe
R
HO
HO
OH
O
NHAc
AcHN
O
CONHMe
R
Esquema 3.2
Tras algunas etapas de transformación de grupo funcional, se
obtiene la D-N-acetilgalactosamina unida a un aminoácido mediante enlace
O-glicosídico. Por los extremos amino y ácido se pueden unir otros
aminoácidos y formar así glicopéptidos más complejos.2
Partiendo de esta base, para la formación de un enlace de tipo Cglicosídico (Figura 3.1) y a la vista de los excelentes resultados que
demostraron los N,O-acetales bicíclicos actuando como nucleófilos sobre
acrilatos en reacciones de tipo Michael (ver Antecedentes y objetivos,
esquema 2.11), nos planteamos relizar una modificación en el método de
Schmidt: emplear nuestro N,O-acetal bicíclico como nucleófilo, en lugar del
derivado de serina, dando de esta forma una reacción tipo C-Michael
(Esquema 3.3).
2
(a) Corzana, F.; Busto, J. H.; De Luis, M. G.; Fernández-Tejada, A.; Rodríguez, F.;
Jiménez-Barbero, J.; Avenoza, A.; Peregrina, J. M. Eur. J. Org. Chem. 2010, 3525-3542.
(b) Corzana, F.; Busto, J. H.; De Luis, M. G.; Jiménez-Barbero, J.; Avenoza, A.; Peregrina,
J. M. Chem Eur. J. 2009, 15, 3863-3874.
37
HO
OH
OH
HO
O
HO
NH 2
AcHN
O
O
HO
OH
AcHN
CO 2H
H2 N
D-O-GalNAc-Ser
CO2 H
D-C-GalNAc-Ser
Figura 3.1. N-Acetilgalactosamina unida mediante un enlace O-glicosídico
(antígeno Tn) y mediante un enlace C-glicosídico a la serina (análogo del
antígeno Tn).
Bajo nuestro punto de vista, éste sería el primer ejemplo de
reacción de tipo C-Michael en la metodología de Schmidt para la formación
de D-C-glicopéptidos.
HO
HO
BnO
OH
O
OH
AcHN
AcHN
CONHMe
BnO
OBn
O
O2N
MeO2 C
BnO OBn
O
O
N
MeO2 C
O
N
O
O
OMe
2
O
O
BnO
OMe
NO2
1
Esquema 3.3
Con estas premisas, el primer producto necesario para la obtención
de nuestro objetivo será la síntesis del compuesto 2 (Figura 3.2).
38
OBn
BnO
O
BnO
O
O2N
MeO2 C
N
O
O
OMe
2
Figura 3.2
3.2Síntesisdelproductodepartida
La síntesis del producto de partida 2 se llevó a cabo siguiendo la
metodología que ya se había empleado anteriormente en nuestro grupo de
investigación. A partir de serina comercial, tras la protección de los grupos
amino con terc-butoxicarbonil (Boc) y ácido, en forma de éster metílico, se
obtiene el N,O-acetal bicíclico 1 por reacción con tetrametoxibutano (TMB).
Posteriormente, se lleva a cabo una adición de Michael con tri-O-bencil-2nitro-D-galactal (Esquema 3.4), que hubo que sintetizar previamente
mediante la metodología de Schmidt descrita en el esquema 3.1.
MeO2 C
O
H
(S) NHBoc
TMB, TsOH·H2 O cat, Tolueno
Reflujo, 3 h, 75%
OH
O
MeO2 C
(S)
N
(S)
O
O
(R)
(S)
N
O
(R)
(S)
O
1
OMe
BnO
BnO OBn
(R)
(R)
O
BnO
OMe
MeO2 C
(R)
1) THF, -78 ºC
2) LHMDS, 45 min, 44%
(S)
NO2
OBn
(R) O
(S) O
(S)
(R)
O2 N (R) N
O
(R)
MeO 2C
(S)
BnO
O
2
1
Esquema 3.4
OMe
39
Se observa la aparición del aducto de Michael 2,3 el cual se obtiene
con una elevada diastereoselectividad, ya que únicamente se obtiene ese
diastereómero de los ocho posibles, al generarse tres nuevos estereocentros.
La estereoquímica se pudo confirmar mediante su análisis de difracción de
rayos X (Figura 3.3).
Figura 3.3. Diagrama ORTEP3 obtenido mediante difracción de rayos X
del compuesto 2.
3
Tesis Doctoral de Carlos Aydillo Miguel, 2011, Universidad de La Rioja.
40
La estereoquímica obtenida es la predicha por la aproximación en
el estado de transición análoga a otros acrilatos4, tal y como se puede
apreciar en el esquema 3.5.
O
MeO
OMe
O (R)
N (S)
O
O
H
MeO
O
(R)
O
(R)
O 2N
O OMe
( R)
N
(R) (S)
O
O
( R)
(S)
OBn
H
O 2N
(S)
BnO
OBn
TS2
O
(S)
( R)
OBn
(S)
BnO
OBn
2
Esquema 3.5
Hay que señalar que el CD del N,O-acetal retiene su configuración,
pero es R debido al cambio de prioridad en el grupo introducido en el
estereocentro. Con este método se obtiene el anómero D, aunque en este
caso no se puede hablar en esta nomenclatura ya que el resto carbohidrato
no presenta una estructura de tipo silla (al menos en estado sólido) ni
posiciones axiales ni ecuatoriales. Lo que se observa es que, curiosamente,
el esqueleto de galactosa adopta una conformación de tipo bote (Figura 3.4),
energéticamente desfavorable frente a las típicas sillas que se observan en
O-glicósidos.
4
Aydillo, C.; Jiménez-Osés, G.; Avenoza, A.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M.
M. J. Org. Chem. 2011, 76, 6990–6996.
41
Figura 3.4. Conformación de tipo bote de la galactosa en el compuesto 2.
Se han eliminado los bencilos para una mayor claridad.
42
3.3.SíntesisdelCǦglicopéptidoobjetivo
Como primer objetivo se planteó la obtención del C-glicósido
análogo del antígeno Tn a partir del compuesto 2 (Esquema 3.6).
OBn
BnO
O
BnO
OH
HO
O
O2N
MeO2 C
O
HO
AcHN
MeHNOC
O
N
NHAc
OMe
O
OH
2
Esquema 3.6
El primer paso en la ruta sintética fue la hidrólisis ácida del
compuesto 2, en HCl 4 N a 40 ºC. El clorhidrato obtenido se acetila
utilizando Ac2O y piridina en proporción 1:2 para dar el compuesto 3
(Esquema 3.7).
BnO
(R)
BnO
(R)
OBn
(R)
O
( S)
O2N
BnO
(S)
(R)
O
N
MeO2C
(S)
O
(R)
1) HCl 4N, 40 ºC, 12 h
O
(R)
2) Ac2O, Py, 3h, 52%
OBn
(R)
O
(S)
(R) (S)
O2N (R)NHAc
BnO
MeO2C
OMe
OAc
2
3
Esquema 3.7
Aunque se esperaba que la reacción de acetilación transcurriera con
un rendimiento elevado, se observó que, prácticamente en la misma
proporción que el compuesto 3, aparece un producto secundario 4. La
43
formación de este producto secundario se puede explicar por el mecanismo
mostrado en el esquema 3.8. Inicialmente, la piridina arranca el protón ácido
marcado en rojo. El carbanión generado ataca al carbonilo de la acetamida
y, posteriormente, pierde una molécula de agua, formando así el compuesto
4.
BnO OBn
H
O
BnO
O2N
OBn
NO2
O
BnO
BnO
NHAc
MeO2C
OAc
+
-H
OAc
BnO
N
H
O
BnO
CO2Me
OBn
NO2
O
O N
H
OAc
CO2Me
3
BnO
BnO
OBn
NO2
O
O N
H
BnO
+ H+
BnO
OAc
CO2Me
OBn
NO2
O
HO N
H
BnO
(R)
OAc
CO2Me
- H2O
BnO
(R)
OBn
NO
( R) 2
O
( R) (R)
N
(R)
OAc
CO2Me
4
Esquema 3.8
Se observa un cambio de configuración en el carbono donde se
forma el carbanión, ya que es la única que permite el ataque al grupo
carbonilo y la formación de un ciclo estable. A pesar de que este nuevo
compuesto obtenido atrae cierto interés debido a las posibilidades sintéticas
que abre, hemos preferido cambiar la ruta sintética, con el fin de obtener un
mayor rendimiento. Por esto, en un futuro se trabajará en la optimización de
la reacción de acetilación.
44
3.4Segundarutasintética
En vistas de que la ruta sintética propuesta anteriormente no resultó
ser lo efectiva que se esperaba, se planteó una segunda ruta sintética. En
lugar de comenzar hidrolizando el N,O-acetal bicíclico, se propuso reducir
inicialmente el grupo nitro del compuesto 2 a amina, utilizando para ello H2
soportado sobre un catalizador de niquel platinado para formar el compuesto
5 (Esquema 3.9).
BnO
OBn
(R)
(R)
BnO
(S)
(R)
O
O2N
MeO2 C
OBn
BnO
(S)
(R)
N
(S)
O
O
H2, Ni Raney / H 2PtCl6
O
O
H 2N
MeO 2C
3.5 h, r.t.
( R)
O
BnO
O
N
OMe
OMe
O
2
5
Esquema 3.9
Sorprendentemente, el compuesto 5 no se pudo aislar, ya que
inmediatamente, en el propio medio de la reacción, el grupo carbonilo del
éster sufre un ataque intramolecular por parte de la amina recién formada,
perdiendo MeOH y generando así la lactama 6 (Esquema 3.10).
BnO
OBn
O
2
BnO
O
48%
O
BnO
H HN
MeO
N
OMe
BnO
OBn
(R)
(R)
O
O
(S)
HN (R)
(R)
-MeOH
O
N
5
O
6
Esquema 3.10
(R)
(S)
O
O
O
(S)
OMe
45
Este nuevo compuesto 6 posee un gran interés, dada su estructura
tan restringida generada por la aparición de la lactama. Por esta razón, a
pesar de que no nos va a permitir alcanzar nuestro objetivo inicial,
decidimos aprovechar el producto obtenido y modificar nuestro objetivo
inicial hacia el derivado C-glicosídico mostrado en el esquema 3.11.
BnO
(R)
(R)
BnO
(R)
HO
OBn
HN
O
OH
O
(S)
(R)
N
( R)
(S)
NHAc
HN
OMe
O
O
O
HO
O
(S)
O
6
NHMe
O
GalNAc-Aa
Esquema 3.11
Se puede observar que este compuesto posee un resto análogo al
GalNAc (verde) y una parte aminoácido (azul), que está protegido en forma
amida para simular una cadena peptídica.
46
Así, el siguiente paso dado para la obtención de nuestro nuevo Cglicoaminoácido análogo del antígeno Tn, fue la hidrólisis del compuesto 6
en HCl 4N a 40 ºC y posterior acetilación de los grupos amino y alcohol
utilizando la misma metodología descrita anteriormente para la formación
del compuesto 3 (Esquema 3.12).
BnO
(R)
(R)
BnO
OBn
O
BnO
O
(S)
HN (R)
(R)
N
( R)
(S)
OMe
2) Ac2O, Py, 3h, 87%
O
O
(R)
(R)
1) HCl 4N, 40 ºC, 12 h
O
(S)
BnO
OBn
O
(S)
HN (R)
(R)
O
6
(S)
NHAc
OAc
7
Esquema 3.12
En esta ocasión, al contrario que ocurrió con la formación del
compuesto 3, únicamente se obtiene el compuesto 7, ya que el protón
involucrado es considerablemente menos ácido, ya que está situado en
posición D de una amida y no de un grupo NO2.
Una vez obtenido el compuesto 7, se trató con una disolución de
MeO- / MeOH, para recuperar el grupo OH libre y formar el compuesto 8
(Esquema 3.13).
47
BnO
(R)
(R)
BnO
OBn
O
( S)
HN (R)
(R)
O
BnO
(R)
(R)
MeO- /MeOH, pH = 9
(S)
NHAc
1.5 h, r.t., 95%
OAc
BnO
OBn
O
( S)
HN (R)
(R)
O
7
(S)
NHAc
OH
8
Esquema 3.13
Una vez liberado el grupo OH, se intentó su oxidación directa a
ácido con diversos oxidantes: reactivo de Jones (CrO3),5 O2 sobre Pd/C,6
RuO47 o PDC8. Sin embargo, ninguno de estos procedimientos dio los
resultados esperados: o reaccionaba de forma incompleta hasta el aldehído,
o no se podía aislar ningún compuesto, o en algún caso, directamente no
reaccionaba. Por tanto, se decidió oxidar el alcohol en dos etapas, pasando
por el aldehído y posterior oxidación al ácido. Aunque alguno de los
métodos anteriormente mencionados oxidaba el alcohol hasta aldehído, lo
hacía con bajos rendimientos. Por tanto, el procedimiento con el que se
obtuvo mejor rendimiento fue utilizando el reactivo de Dess-Martin.9
Posteriormente, el aldehído fue oxidado utilizando el reactivo de Tollens
[Ag(NH3)2+] (Esquema 3.14), que ha de ser sintetizado in situ: a partir de
AgNO3, se hace reaccionar con NaOH, y el precipitado se redisuelve con
NH4OH.
5
(a)Heilbron, I.; Jones, E.R.H.; Sondheimer, F. J. Chem. Soc. 1947, 1586-1590. (b)
Heilbron, I.; Jones, E.R.H. J. Chem. Soc. 1949, 604-607.
6
An, G.; Ahn, H.; De Castro, K. A., Rhee, H. Synthesis, 2010, 3, 477-485.
7
Ashby, E.C.; Goel, A. B. J. Org. Chem. 1981, 46, 3936-3938.
8
Corey, E.J.; Schmidt, G. Tetrahedron Lett. 1979, 20, 399-402.
9
(a) Dess, D. B.; Martin, J. C. J. Org. Chem. 1983, 48, 4155-4156. (b) Dess, D. B.; Martin,
J. C. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7277-7287.
48
OBn
BnO
(R)
(R)
BnO
O
(S)
(R)
HN
NHAc
BnO
(R)
HN
42%
(R)
(R)
(R)
2) Tollens
(S)
OBn
BnO
1) Dess-Martin
(S)
(R)
(R)
(S)
H
BnO
(R)
HN
O
O
8
(S)
(S)
( S)
OH
O
O
OBn
BnO
NHAc
(R)
NHAc
O
H
9b
9a
Esquema 3.14
Sorprendentemente, no se pudo aislar el compuesto con el grupo
ácido carboxílico libre, sino que éste descarboxilaba a temperatura ambiente
para formar una mezcla de los diastereómeros 9a y 9b, ya que, a pesar de
que la reacción de Tollens tenga lugar en medio básico, el work up requiere
un tratamiento ácido para la eliminación de la plata por precipitación de
AgCl. Este tratamiento genera el grupo ácido, formando así un compuesto
1,3-dicarbonílico, que descarboxila a temperatura ambiente (Esquema 3.15).
BnO
OBn
BnO
O
BnO
O
H
-CO2
BnO
HN
HN
NHAc
NHAc
HO
O
OBn
O
O
BnO
NHAc
O
HN
BnO
OBn
O
9
Esquema 3.15
La estructura de ambos compuestos pudo ser elucidada utilizando
técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y espectrometría de masas. La
asignación completa de las señales de 1H RMN se realizó con experimentos
bidimensionales y mediante un experimento 2D NOESY se pudo identificar
cada compuesto (Figuras 3.5 y 3.6).
49
Figura 3.5. 2D-NOESY del producto 9a. Los OBn y el H del NH han sido
omitidos para una mayor claridad.
Para el compuesto 9a, se observan picos de cruce NOE entre los
hidrógenos H3-H3a y H3a-H7a. Esto nos indica que se trata del
diatereómero con configuración S en el C3.
50
6
7
H5
7a
O4
H
3a
N1 H
H 2 3 NHAc
H
O
9b
Figura 3.6. 2D-NOESY del compuesto 9b. Los OBn y el H del NH han
sido omitidos para una mayor claridad.
Para el compuesto 9b, no se observa pico de cruce NOE entre los
hidrógenos H3-H3a, sino que se observan entre los hidrógenos H3-H5 y H3H7. Esto nos indica que se trata del diatereómero con configuración R en el
C3.
De esta forma, aunque no se haya logrado llegar al Cglicoaminoácido objetivo, se han logrado sintetizar dos C-glicoaminoácidos
en su forma protegida, 9a y 9b, los cuales presentan una estructura muy
restringida debido a la presencia del esqueleto lactama.
Estos nuevos compuestos presentan en su estructura un resto
análogo al GalNAc (verde) y, aunque no tan evidente, una parte aminoácido
51
(azul), que está protegido en forma amida para simular un enlace peptídico
(Figura 3.7).
BnO
BnO
OBn
O
BnO
OBn
O
BnO
HN
HN
NHAc
NHAc
O
O
"aminoácido enmascarado"
"GalNAc"
Figura 3.7
Posteriormente a este trabajo, la desprotección de los grupos OBn
bajo atmósfera de H2, con Pd soportado sobre C como catalizador, permitirá
llegar a dos nuevos C-glicoaminoácidos (Figura 3.8).
HO
OH
HO
O
HO
OH
O
HO
HN
HN
NHAc
O H
Figura 3.8
H
NHAc
O
55
Se ha logrado la D-C-glicosilación del tri-O-bencil-2-nitro-Dgalactal utilizando como nucleófilo el N,O-acetal bicíclico derivado de
serina 1, formándose el compuesto 2 con una elevada diastereoselectividad.
Se generan tres nuevos centros estereogénicos, con un control total de la
selectividad, ya que de los ocho compuestos posibles, únicamente se forma
el compuesto 2 (Figura 4.1).
BnO
(R)
BnO
OBn
(R)
O
(R) (S)
O2N
MeO2 C
O
(S)
N
O
(R)
(R)
(S)
O
OMe
2
Figura 4.1
Por otro lado, se ha llevado a cabo la síntesis de dos Cglicopéptidos diastereómeros 9a y 9b, análogos del antígeno Tn, con una
estructura bicíclica y, por tanto, con una libertad conformacional muy
restringida. La síntesis se ha llevado a cabo en disolución, utilizando el
compuesto 2 como producto de partida.
56
MeO2C
N
(S)
(R)
(S)
BnO
O
(R)
(R)
BnO
O
O
(S)
(R) (S)
O2N N
O
MeO2C (R)(S) ( R)
(S)
NO2
OMe
OBn
BnO
BnO OBn
(R)
(R)
O
O
1
BnO
2
OBn
(R)
(R)
BnO
( R)
OMe
O
HN
O
BnO
(S)
(S)
(R)
O
9a
NHAc
H
OBn
(R)
(R)
BnO
(R)
HN
O
BnO
(S)
( S)
(S)
O
H
NHAc
9b
OBn
(R)
(R)
BnO
(R)
HN
O
O
O
(S)
(S)
(R)
N
(R)
(S)
OMe
O
O
6
Esquema 4.1
El grupo NO2 fue reducido a NH2, produciéndose posteriormente
un ataque intramolecular sobre el carbonilo del éster metílico y formación
de la lactama espirocíclica. Tras la hidrólisis del N,O-acetal bicíclico y
consiguiente diacetilación, se desacetila el grupo OH y es oxidado en dos
etapas hasta el ácido, que inmediatamente descarboxila (Esquema 4.1).
De esta forma se obtienen los dos C-glicopéptidos diastereómeros
9a y 9b, análogos del antígeno Tn, a escala miligramo. Obteniéndose 7 mg
del compuesto 9a, y 11 mg del 9b.
Posteriormente a este trabajo, se desprotegerán los grupos OBn,
utilizando para ello una atmósfera de H2, empleando Pd soportado sobre C
como catalizador, y se realizará el análisis estructural de ambos,
combinando técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y Cálculos de
Dinámica Molecular. Los cálculos obtenidos en estos estudios se
57
compararán con los obtenidos en anteriores investigaciones para la diamida
de D-O-D-GalNAc-L-Ser.
Además, en un futuro se optimizará la reacción de acetilación para
la obtención del compuesto 3 y, a partir de éste, sintetizar el primer Cglicopéptido objetivo (Esquema 4.2). Una vez sintetizado se llevará a cabo
un estudio conformacional similar al anteriormente descrito.
BnO
BnO
OBn
HO
O
O2N
CO2Me
HO
NHAc
OH
O
AcHN
MeHNOC
OAc
NHAc
OH
3
Esquema 4.2
61
Los espectros de RMN 1H y 13C se realizaron en un espectrómetro
Bruker ARX-300 y un Bruker Avance-400. Los desplazamientos químicos
se expresan en ppm en la escala G y las constantes de acoplamiento (J) en
hercios (Hz). Se utilizó como disolvente deuterado cloroformo, con TMS
como referencia interna.
Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se
realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode,
ionización ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.
Los ángulos de rotación óptica se midieron en un polarímetro
Perkin.Elmer 341, utilizando celdas de 1.0 dm de longitud y de 1.0 ml de
capacidad.
La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel
(Polichrom SI F254) sobre soporte de poliéster o aluminio y para su
visualización se utilizó luz ultravioleta y revelador de ácido fosfomolíbdico
en etanol.
La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.040.06 mm (230-400 mesh).
Todos los disolventes utilizados se purificaron utilizando técnicas
estándar.
62
(2R,2’S,3’S,4’R,5’R,6’R)-2-Acetamido-3-acetoxi-2-(4’,5’-bis(benciloxi)6’-(benziloximetil)-3’-nitrotetrahidro-2H-piran-2’-il)-propanoato
de
metilo [3] y
(2R,3R,4R,4aR,7R,7aR)-7-(Acetoximetil)-3,4-bis(benciloxi)-2(benciloximetil)-5-metil-4a-nitro-2,3,4,4a,7,7a-hexahidropirano[3,2c]pirrol-7-carboxilato de metilo [4]
BnO
(R)
BnO
OBn
(R)
BnO
O
(S)
(R) (S)
O2N NHAc
MeO2 C (R)
OAc
( 2R,2'S,3' S,4'R,5' R,6'R)-3
(R)
BnO
(R)
OBn
NO
(R) 2
O
(R)
N
(R)
(R)
OAc
CO2 Me
(2R,3R,4R,4aR,7R,7aR)-4
El compuesto 2 (150 mg, 0.21 mmol) se disuelve en THF (16 ml)
en un matraz esférico y se le añade HCl 4 N (4.5 ml). La mezcla se agita
durante una noche a 40 °C. El disolvente se elimina a vacio y el residuo se
disuelve en piridina/Ac2O (2:1, 6 ml). La disolución se agita durante 3 h, se
concentra y purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice
(Hexano/AcOEt, 1:1) para dar una mezcla de los compuestos 3 (72 mg,
0.11 mmol, 52 %), como un aceite viscoso; y 4 (75 mg, 0.12 mmol, 43 %)
como un aceite viscoso amarillento.
63
(2R,2'S,3'S,4'R,5'R,6'R)-3
ሾߙሿଶ଴
஽ = - 27.0 (c 1.00 en CH2Cl2).
HRMS (ESI) m/z = 665.2914 (M+H)+; calculado para C35H41N2O11+ =
665.271.
1
H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm) 1.88 (s, 3H, CH3CO2), 1.91 (s, 3H,
NCOCH3), 3.59 (s, 3H, CO2CH3), 3.61 (d, 1H, J = 11.4 Hz;
BnOCHCHNO2) 3.95 - 4.09 (m, 2H, BnOCH2), 4.18 (m, 1H, CHCH2OBn),
4.34 (d, 1H, J = 11.8 Hz; PhCHaHbO), 4.38 (d, 1H, J = 11.0 Hz;
PhCHcHdO), 4.41 – 4.52 (m, 5H, CH2OAc, PhCHeHfO, O2NCH,
CHCHCH2OBn), 4.59 – 4.71 (m, 2H, Canomérico, PhCHcHdO), 4.77 (d, 1H, J
= 10.0 Hz; PhCHeHfO), 4.89 (d, 1H, J = 11.8 Hz; PhCHaHbO), 6.54 (s, 1H,
NH), 7.08 – 7.36 (m, 15H, Ph)
(2R,3R,4R,4aR,7R,7aR)-4
HRMS (ESI) m/z = 647.2614 (M+H)+; calculado para C35H39N2O10+=
647.2605.
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.98 (s, 3H, CH3C=N), 2.60 (s, 3H,
CH3CO2), 3.64 (m, 1H; CHCHaHbOBn), 3.72 (s, 3H, CH3OCO), 3.85 (m,
1H; CHCHaHbOBn), 3.90 (t, 1H, J = 4.2 Hz; CHCHCHaHbOBn), 4.01-4.08
(m, 1H,CHCHCHaHbOBn), 4.44 (d, 1H, J = 11.9; PhCHcHdO), 4.51 (d, 1H,
J =3.1 Hz; PhCHeHfO), 4.54 (d, 1H, J = 3.1 Hz; PhCHeHfO), 4.64 (d, 1H, J
= 11.7 Hz; PhCHgHhO), 4.69 (s, 2H, AcOCH2), 4.75 (d, 1H, J = 11.9 Hz;
64
PhCHcHdO), 4.81 (d, 1H, J = 4.2 Hz; BnOCHCNO2), 4.82 (d, 1H, J = 11.7
Hz; PhCHgHhO), 5.07 (s, 1H, Canomérico); 7.39 – 7.24 (m, 15H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) į 20.6 (CH3C=N), 24.4 (CH3CO2), 52.8
(CH3OCO), 63.1 (PhCHgHhO), 65.8 (CHCHaHbOBn), 69.1 (BnOCHCNO2),
69.5 (Canomérico), 72.6 (AcOCH2), 72.8 (PhCHeHfO), 72.9 (PhCHcHdO), 74.3
(CHCHCHaHbOBn), 75.2 (CHCHCHaHbOBn), 118.9 (CD), 127.6, 127.7,
127.8, 127.9, 128.0, 128.3, 128.4, 128.4, 137.4, 137.47, 138.0 (Ph), 164.9
(C=N), 168.6 (CH3OCO), 169.7 (CH3CO2).
(3R,3aS,5R,6R,7R,7'R,7aS,7'aS)-6,7-Bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)7'-metoxi-7',7'a-dimetil-espiro[1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2b]pirrol-3,3'-2H-oxazolo[4,3-b]oxazol]-2,5'-diona [6]
BnO
(R)
BnO
OBn
(R)
O
(S)
HN (R)
(R)
O
O
O
(S)
N
(R)
(S)
OMe
O
(3R,3aS,5R,6R,7R,7'R,7aS,7'aS)-6
A una suspensión de Ni/Raney (2.00 g) en H2O (12 ml) se le añade
ácido hexacloroplatínico (50 mg) y NaOH al 20% (400 Pl). La disolución se
agita durante 2 h y 30 min a 50 °C. Se añade NaOH al 40% (6 ml) y se
mantiene la agitación a la misma temperatura durante 1 h y 30 min más. Se
forma una nube blanca en la parte superior del matraz. Ésta se elimina por
decantación lavando con H2O caliente (3 x 15 ml) y EtOH (3 x 15 ml). El
catalizador obtenido se suspende en EtOH (10 ml) y se prehidrogena
65
durante 10 min. Se añade una disolución del compuesto 2 (160 mg, 0.23
mmol) en EtOH (7 ml), y la mezcla de reacción se agita bajo H2 durante 3 h
a temperatura ambiente y presión atmosférica. Se filtra sobre tierra de
diatomeas y se evapora el filtrado, que se purifica por cromatografía de
columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 99:1) para obtener el
compuesto 6 (70 mg, 0.11 mmol, 48 %) como un aceite.
ሾߙሿଶ଴
஽ = +4.2 (c 1.00 en CHCl3).
HRMS (ESI) m/z = 645.3041 (M+H)+; calculado para C36H41N2O9+ =
645.2807.
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.59 (s, 3H; CH3), 1.62 (s, 3H; CH3),
3.49 (s, 3H; OCH3), 3.57 (d, 1H, J = 5.7 Hz; BnOCHCHN), 3.74 (m, 2H,
CH2OBn), 4.12-4.19 (m, 2H, CHCH2OBn, CHCHCH2OBn), 4.37 (d, 1H, J
= 9.5 Hz; OCHcHdPh), 4.55 (s, 2H; OCH2), 4.61-4.73 (m, 5H, NCH,
OCH2Ph, OCHcHdPh, OCHeHfPh), 4.92-4.97 (m, 2H, OCHeHfPh, Hanomérico),
7.29-7.40 (m, 15H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 16.9 (CH3CN), 18.0 (CH3COMe),
51.6 (CH3O), 57.8 (NCH), 67.5 (CH2OBn), 68.69 (CD), 69.1 (OCHcHdPh),
71.0 (Canomérico), 71.9 (OCHcHdPh), 72.3 (CHCH2OBn), 73.5 (OCH2), 73.92
(OCHeHfPh), 76.8 (CHCHCH2OBn), 80.6 (BnOCHCHN) 103.0 (CH3CN),
108.1 (CH3COMe), 127.7, 127.7, 127.7, 127.8, 127.8, 128.1, 128.4, 128.5,
128.5, 128.7, 137.7, 138.1, 138.2 (Ph), 154.8 (NCO2), 173.6 (NCO).
66
Acetato
de
[(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-3-acetamido-6,7-dibenciloxi-5-
(benciloximetil)-2-oxo-1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3il]metilo [7]
BnO
BnO
OBn
(R)
(R)
O
(S)
HN (R)
(R)
O
(S)
NHAc
OAc
(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-7
El compuesto 6 (150 mg, 0.23 mmol) se disuelve con THF (7 ml)
en un matraz esférico y se le añade HCl 4 N (2.5 ml). La mezcla se agita
durante 12 horas a 40 °C. El disolvente se elimina a vacio y el residuo se
disuelve en piridina/Ac2O (2:1, 6 ml). La disolución se agita durante 3
horas, se concentra y purifica por cromatografía de columna sobre gel de
sílice (CH2Cl2/MeOH, 15:1) para dar el compuesto 7 (122 mg, 0.20 mmol,
87%) como un aceite viscoso incoloro.
ሾߙሿଶ଴
஽ = +56.2 (c 1.00 en CHCl3).
HRMS (ESI) m/z = 603.2701 (M+H)+; calculado para C34H39N2O8+ =
603.2701.
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.96 (s, 3H; OCOCH3), 1.98 (s, 3H;
NCOCH3), 3.55 (d, 1H, J = 7.6 Hz; BnOCHCHN), 3.63 (m, 2H,
CHCH2OBn), 4.07 (m, 1H, CHCHCH2OBn), 4.13 (d, 1H, J = 4.4 Hz;
CHCHCH2OBn), 4.27 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHaHbO), 4.31 (t, 1H, J = 7.6
67
Hz; NCH), 4.46 (d, 2H, J = 11.7 Hz; PhCHcHdO), 4.51 (s, 2H, AcOCH2),
4.52 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHaHbO), 4.58 (d, 1H, J = 11.7 Hz;
PhCHcHdO), 4.70 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHeHfO), 4.70 (d, 1H, J = 7.6;
Hanomérico), 4.88 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHeHfO), 6.18 (s, 1H; CONH), 6.42
(s, 1H; CONH), 7.25 – 7.40 (m, 15H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) G (ppm) 20.8 (OCOCH3), 23.1 (NCOCH3),
55.9 (NCH), 63.1 (CHCHCH2OBn), 63.2 (CD) 67.7 (CHCH2OBn), 71.4
(AcOCH2), 71.6 (CHCHCH2OBn), 73.4 (PhCHaHbO), 74.3 (PhCHeHfO),
75.6 (Canomérico), 76.5 (CHCHCH2OBn), 81.1 (BnOCHCHN), 127.7, 127.7,
727.8, 127.9, 128.2, 128.4, 128.5, 128.5, 128.7, 137.5, 138.0, 138.2 (Ph),
170.0 (OCOCH3), 170.6 (NCOCH3), 172.3 (NCO).
(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-N-[6,7-bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3(hidroximetil)-2-oxo-1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3il]acetamida [8]
BnO
(R)
OBn
(R)
BnO
O
(S)
(R)
HN (R)
O
(S)
NHAc
OH
(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-8
El compuesto 7 (122 mg, 0.20 mmol) se disuelve en 4 ml de
MeOH y se le añaden 2 ml de una disolución de NaOMe en MeOH 0.5 M.
Se deja bajo agitación durante 1.5 h. Posteriormente, se añaden un par de
puntas de espátula de Dowex ácido y se filtra. El filtrado se concentra y
68
purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH,
15:1) para dar el compuesto 8 (107 mg, 0.19 mmol, 95%) como un aceite
viscoso incoloro.
ሾߙሿଶ଴
஽ = +89.8 (c 1.00 en CHCl3).
HRMS (ESI) m/z = 561.2603 (M+H)+; calculado para C32H36N2O7+ =
561.2595.
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 2.03 (s, 3H; CH3), 3.52 (m, 1H,
CHaHbOBn), 3.62 (d, 1H, J = 6.3 Hz; BnOCHCHN), 3.72-3.81 (m, 2H,
CHaHbOBn, OCHcHdPh), 4.03 (d, 1H, J = 12.0 Hz; OCHcHdPh), 4.13 (d,
1H, J = 4.5 Hz; CHCHCH2OBn), 4.15 - 4.24 (m, 1H, CHCHCH2OBn),
4.39 (t, 1H, J = 6.3 Hz; NCH), 4.53 (d, 1H, J = 11.6 Hz; OCHeHfPh), 4.54
(s, 2H, CH2OH), 4.60 (d, 1H, J = 11.9 Hz; OCHgHhPh), 4.68 (d, 1H, J = 6.3
Hz; Hanomérico), 4.72 (d, 1H, J = 11.6 Hz; OCHeHfPh), 4.90 (d, J = 11.9 Hz,
1H; OCHgHhPh), 6.60 (s, 1H, NH), 6.86 (s, 1H, NH), 7.19 - 7.52 (m, 15H,
Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 22.8 (CH3), 56.3 (NCH), 63.9
(OCHcHdPh,
CD),
67.3
(CH2OBn),
71.5
(CHCHCH2OBn),
71.7
(OCHeHfPh), 73.5 (CH2OH), 74.2 (OCHgHhPh), 76.5 (Canomérico), 76.6
(CHCHCH2OBn), 81.3 (BnOCHCHN), 127.9, 127.9, 128.0, 128.1, 128.4,
128.5, 128.7, 137.5, 137.8, 138.0 (Ph) 170.6 (NCOCH3), 174.1 (NCO).
69
(3S,3aS,5R,6R,7R,7aS)-N-[6,7-bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)-2-oxo1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3-il]acetamida [9a] y
(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-N-[6,7-bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)-2-oxo1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3-il]acetamida [9b]
BnO
BnO
OBn
(R)
(R)
O
(S)
HN (S)
(R)
O
BnO
(S)
BnO
O
(S)
(S)
HN (R)
(R)
H
NHAc
(3S,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9a
OBn
(R)
(R)
O
NHAc
H
(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9b
El compuesto 8 (47 mg, 0.084 mmol) se disuelve en 1 ml de
CH2Cl2. Se le añade 1 ml de una disolución de peryodinano de Dess –
Martin en CH2Cl2 y se deja reaccionando bajo agitación durante 1 h, a
temperatura ambiente. La reacción se detiene añadiendo una disolución 1:1
de NaS2O3 y NaHCO3 (5 ml) y posteriormente diluida con CH2Cl2 (10 ml).
Las fases se separan y la fase acuosa se lava con CH2Cl2 (3x10 ml). La
combinación de las fases orgánicas se lava con una disolución saturada de
NaCl, se seca con Na2SO4 y se concentra.
Por otro lado, se disuelve AgNO3 (139 mg, 0.84 mmol) en H2O y
se le añade NaOH al 10% gota a gota. Se va formando un precipitado de
color pardo oscuro. Cuando deje de precipitar, se le añade gota a gota
NH3OH hasta que el precipitado se redisuelva por completo. Esta disolución
se añade sobre el crudo obtenido anteriormente disuelto en CH2Cl2 (5 ml).
Se deja reaccionando durante dos horas a 50 qC. Conforme va reaccionando
se observa la aparición de un precipitado negro (Ag0). Una vez la reacción
70
ha concluido, se añade HNO3 hasta alcanzar un pH neutro. Se añade HCl 2N
y NH4Cl para formar AgCl y a continuación se filtra en tierra de diatomeas.
El filtrado se concentra y se lleva a cabo una extracción con AcOEt y H2O
para eliminar sales. La fase orgánica se seca en Na2SO4, se concentra y se
purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (CHCl3/MeOH,
95:5) para los compuestos 9a (7 mg, 0.013 mmol, 16 %) y 9b (11 mg, 0.021
mmol, 26 %) en una relación 38:62 (determinada por pesada y por 1H
NMR) como aceites viscosos amarillentos.
(3S,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9a
HRMS (ESI) m/z = 531.2471 (M+H)+; calculado para C31H35N2O6+ =
531.2490.
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 2.06 (s, 3H; CH3), 3.55 (d, 1H, J = 5.0
Hz; BnOCHCHN), 3.70-3.79 (m, 2H; BnOCH2CH), 3.84-3.91 (m, 1H;
BnOCHCHN), 4.16 (s, 1H; BnOCH2CHCH), 4.16-4.19 (m, 1H;
BnOCH2CH), 4.52 (d, 1H, J = 12.0 Hz; PhCHaHbO), 4.56 (s, 2H; PhCH2O),
4.62-4.69 (m, 3H, PhCHcHdO; Hanomérico), 4.77 (d, 1H, J = 12.0;
PhCHaHbO), 4.81-4.90 (m, 2H; PhCHcHdO, HD), 5.86 (s, 1H; NH), 6.03 (d,
1H, J = 8.0 Hz; AcNH), 7.26-7.47 (m, 15H; Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 22.8 (CH3), 52.7 (CHD), 56.8
(BnOCHCHN), 67.3 (BnOCH2), 69.1 (CHanomérico), 72.0 (PhCHaHbO), 72.8
(BnOCH2CHCH), 73.7 (PhCH2O), 74.4 (PhCHcHdO), 76.5 (BnOCH2CH),
80.4 (BnOCHCHN), 127.7, 127.8, 127.9, 128.0, 128.0, 128.5, 128.6, 128.9,
137.5, 137.6, 138.1 (Ph), 170.5 (NCO), 170.7 (NCO).
71
(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9b
HRMS (ESI) m/z = 531.2471 (M+H)+; calculado para C31H35N2O6+ =
531.2490.
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 2.08 (s, 3H; CH3), 3.56 (d, 1H, J = 8.2
Hz; BnOCHCHN), 3.67 (m, 2H; BnOCH2CH), 3.92 (t, 1H, J = 8.2 Hz;
BnOCHCHN), 4.07 (t, 1H, J = 6.4 Hz; BnOCH2CH), 4.12 (s, 1H;
BnOCH2CHCH), 4.2-4.53 (m, 3H; PhCHaHbO, PhCHcHdO, Hanomérico), 4.57
(d, 1H, J = 11.7 Hz; PhCHcHdO), 4.64 (d, 1H, J = 11.5 Hz; PhCHeHfO),
4.73 (d, 1H, J = 11.4 Hz; PhCHaHbO), 4.77-4.83 (m, 1H; HD), 4.86 (d, 1H, J
= 11.5 Hz; PhCHeHfO), 6.13 (d, 1H, J = 7.5 Hz; AcNH), 6.31 (s, 1H; NH),
7.26-7.45 (m, 15H; Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 23.2 (CH3), 50.4 (CHD), 51.7
(BnOCHCHN), 68.3 (BnOCH2), 70.8 (BnOCH2CHCH), 71.6 (PhCHaHbO),
72.4 (BnOCH2CH), 73.6 (PhCHcHdO), 74.7 (PhCHeHfO), 78.0 (CHanomérico),
81.9 (BnOCHCHN), 127.9, 128.0, 128.2, 128.4, 128.5, 128.6, 128.9, 137.4,
137.9, 138.3 (Ph), 171.2 (NCO), 171.9 (NCO).
74
En este anexo se presentan los espectros de 1H RMN, 13C RMN y
las correspondientes correlaciones 1H – 1H (COSY) y 1H – 13C (HSQC) de
todos los compuestos cuya nueva preparación ha sido expuesta en la Parte
Experimental de esta memoria.
7.2
6.8
6.4
6.0
5.6
5.2
4.8
4.4
f1 (ppm)
4.0
3.6
6.00
5.11
1.84
0.89
1.98
1.96
4.98
4.95
4.86
4.83
4.77
4.76
4.73
4.70
4.57
4.56
4.54
4.50
4.48
4.44
4.43
4.39
4.28
4.26
4.24
4.14
4.11
4.10
4.09
4.06
4.03
3.70
3.66
6.61
1
7.51
0.97
0.94
2.01
0.91
16.46
7.37
7.35
7.33
7.32
7.29
7.26
7.25
7.21
7.20
7.19
75
H RMN 300 MHz en CDCl3
3.2
2.8
2.4
2.0
170
160
150
6.2
5.8
13
5.4
140
130
120
5.0
110
4.6
f1 (ppm)
100
90
f1 (ppm)
4.2
80
3.8
70
60
52.98
6.6
3.4
C RMN 100 MHz en CDCl3
3.0
2.6
50
40
30
20.74
24.59
2.81
2.95
1.18
1.31
0.78
3.03
1.25
2.05
1.18
2.02
1.19
1.15
1.20
1.22
1.00
15.68
1.98
2.60
4.80
4.80
4.74
4.69
4.65
4.53
4.51
4.45
4.06
4.05
4.04
3.91
3.90
3.89
3.88
3.86
3.85
3.83
3.77
3.72
3.65
3.64
3.63
3.62
5.07
5.05
7.38
7.37
7.35
7.34
7.33
7.32
7.31
7.29
7.29
7.28
7.27
7.26
7.25
1
77.48
77.16
76.84
75.39
74.45
73.07
72.99
72.74
69.66
69.30
65.93
63.24
7.0
128.56
128.53
128.53
127.86
127.82
119.10
7.4
138.14
137.63
137.56
169.90
168.75
165.06
76
H RMN 400 MHz en CDCl3
2.2
20
77
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
20
30
40
50
70
80
90
100
110
120
130
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
f2 (ppm)
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
f1 (ppm)
60
170
160
150
140
130
120
4.6
4.2
f1 (ppm)
110
100
90
f1 (ppm)
3.8
80
3.4
70
5.98
1.00
1.02
0.97
3.00
1.96
5.02
2.02
0.97
5.0
3.0
60
50
17.98
16.92
13
5.4
51.63
5.8
73.92
73.50
72.32
71.90
69.10
68.69
67.50
57.84
6.2
80.58
6.6
0.98
0.97
15.03
1.62
1.59
4.97
4.96
4.95
4.92
4.73
4.70
4.67
4.64
4.61
4.55
4.38
4.36
4.17
4.15
4.14
3.80
3.78
3.77
3.76
3.72
3.71
3.70
3.69
3.58
3.56
3.49
7.40
7.39
7.37
7.36
7.34
7.29
1
103.00
7.0
128.66
128.54
128.44
128.07
127.83
127.81
127.75
127.74
127.72
108.14
7.4
138.20
138.12
137.69
154.75
173.57
78
H RMN 400 MHz en CDCl3
2.6
2.2
40
1.8
30
1.4
C RMN 400 MHz en CDCl3
20
1
79
COSY en CDCl3
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0
4.5
f1 (ppm)
3.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
f2 (ppm)
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
HSQC en CDCl3
10
20
30
40
50
70
80
90
100
110
120
130
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
f2 (ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
f1 (ppm)
60
170
160
150
6.6
140
6.2
13
130
(R)
O
5.8
120
5.4
110
5.0
4.6
f1 (ppm)
100
90
f1 (ppm)
4.2
80
3.8
70
6.01
(S)
3.19
HN
O
2.10
BnO
2.10
(R)
1.00
1.99
5.08
(R)
(R)
3.4
60
23.17
20.91
7.0
0.96
BnO
55.95
7.4
0.98
15.45
1.98
1.96
4.89
4.86
4.71
4.69
4.68
4.59
4.56
4.52
4.50
4.47
4.44
4.32
4.30
4.28
4.28
4.25
4.13
4.11
4.07
4.06
3.66
3.65
3.64
3.62
3.61
3.59
3.59
3.57
6.17
6.41
7.36
7.35
7.33
7.32
7.30
7.29
7.28
7.27
7.26
1
81.21
76.54
75.70
74.41
73.52
71.70
71.52
67.79
63.25
63.16
7.8
138.29
138.10
137.60
128.82
128.55
128.45
128.27
127.98
127.88
127.84
127.77
172.36
170.74
170.13
80
H RMN 400 MHz en CDCl3
OBn
(S)
NHAc
OAc
7
3.0
2.6
50
2.2
40
1.8
C RMN 400 MHz en CDCl3
30
20
81
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
170
160
150
13
140
130
5.5
120
5.0
110
4.5
f1 (ppm)
100
90
f1 (ppm)
4.0
80
3.5
70
3.0
60
2.5
50
40
30
22.76
6.0
29.73
6.5
56.34
7.0
3.09
2.17
1.30
1.19
1.00
2.03
3.98
1.01
1.01
0.92
1.05
0.86
0.86
15.07
2.03
4.92
4.89
4.74
4.71
4.69
4.67
4.61
4.58
4.54
4.52
4.39
4.20
4.19
4.18
4.17
4.14
4.12
4.05
4.02
3.77
3.75
3.63
3.61
3.54
3.53
6.60
7.41
7.39
7.38
7.36
7.33
7.32
7.30
7.28
7.26
6.86
1
81.28
76.52
74.23
73.47
71.66
71.51
67.33
63.85
7.5
138.00
137.80
137.52
128.72
128.54
128.42
128.17
127.97
127.90
127.85
127.68
170.55
174.10
82
H RMN 400 MHz en CDCl3
2.0
1.5
C RMN 400 MHz en CDCl3
20
83
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
170
160
150
140
6.2
13
130
5.8
120
110
4.2
100
90
f1 (ppm)
80
3.8
70
60
2.89
0.99
2.06
3.89
3.74
3.73
3.55
3.54
1.02
5.0
4.6
f1 (ppm)
2.00
4.16
1.98
6.04
6.02
5.86
1.96
0.98
1.97
2.97
0.82
4.88
4.85
4.83
4.78
4.75
4.66
4.63
4.56
4.54
4.51
5.4
22.83
6.6
52.71
7.0
56.84
7.4
0.84
14.95
7.42
7.41
7.38
7.36
7.36
7.34
7.33
7.31
1
80.41
76.47
74.43
73.69
72.76
72.03
69.07
67.26
7.8
138.11
137.61
137.51
128.94
128.63
128.48
128.00
127.96
127.87
127.84
127.73
170.72
170.53
84
H RMN 400 MHz en CDCl3
3.4
3.0
50
2.6
40
2.2
C RMN 400 MHz en CDCl3
30
20
85
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
86
1
H NOESY en CDCl3
2.0
2.5
3.0
3.5
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
f2 (ppm)
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
f1 (ppm)
4.0
170
160
150
140
5.8
13
130
5.4
120
5.0
110
4.6
f1 (ppm)
100
90
f1 (ppm)
4.2
3.8
80
70
3.4
60
3.0
50
2.6
40
30
23.22
6.2
32.06
29.83
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50.42
7.0
2.89
1.00
2.16
0.98
1.05
0.95
0.98
1.01
1.01
1.02
1.00
2.98
0.82
0.88
15.05
2.08
4.87
4.84
4.82
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4.78
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4.47
4.45
4.12
4.07
3.92
3.70
3.68
3.67
3.66
3.65
3.57
3.55
6.31
6.14
6.12
7.40
7.39
7.37
7.36
7.35
7.33
1
81.95
77.98
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73.64
72.37
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70.81
68.31
7.4
138.33
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137.37
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127.95
171.88
171.16
87
H RMN 400 MHz en CDCl3
2.2
C RMN 400 MHz en CDCl3
20
88
COSY en CDCl3
HSQC en CDCl3
89
1
H NOESY en CDCl3