SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO Susana Córdoba Introducción Hasta hace dos décadas las pruebas de sensibilidad para levaduras no eran consideradas necesarias ya que la mayoría de las levaduras de importancia clínica eran sensibles a la anfotericina B, el antifúngico de elección para el tratamiento de las micosis invasoras. El aumento registrado en el número de infecciones fúngicas debido al incremento de la población infectada por el HIV, el número de pacientes hospitalizados y de otro tipo de pacientes inmunocomprometidos, generó la necesidad de desarrollar agentes alternativos, más eficaces y menos tóxicos, motivos éstos, por los que la detección de la resistencia de los hongos a los antifúngicos, es en la actualidad, un tema prioritario. Uno de los métodos que permiten diferenciar entre microorganismos sensibles y resistentes, es la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) que no es más que aquella concentración del antifúngico capaz de inhibir el crecimiento del hongo ensayado. Si bien, existen otros métodos para conocer si un microorganismo es sensible o resistente a un antimicrobiano, la determinación de la CIM es uno de los más sencillos y factible de realizar en los laboratorios clínicos. El objetivo principal de estos métodos es que puedan ser utilizados como una guía en la selección del tratamiento adecuado. Sin embargo, hay que considerar que la infección clínica es un sistema complejo y dinámico y que los resultados obtenidos in vitro, en forma relativamente simple, a veces tienen poca correlación. 1 Método de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos. Documento M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) antes “National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)”. El método que describe este estándar está pensado para evaluar levaduras que causan infecciones invasoras. Estas levaduras abarcan todas las especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Este método no se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimórficos como Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Coccidiodes spp., Sporothrix spp. o Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Las pruebas de susceptibilidad para los hongos miceliales están descriptas en el documento M38A2 del CLSI. El documento M27-A3 es un “ESTÁNDAR DE REFERENCIA”. Se desarrolló a través de un proceso de consenso con la intención de facilitar un acuerdo entre laboratorios sobre la forma de evaluar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos. Un objetivo primordial de un estándar de referencia es sentar las bases para que se puedan desarrollar otros métodos más accesibles pero que obtengan resultados similares al estándar. Las condiciones más adecuadas del estándar quedan resumidas en la Tabla 1. Tabla 1: Principales condiciones del estándar aprobado por el CLSI Variable Medio de Cultivo pH Tampón Tamaño del inóculo Preparación del inóculo Temperatura de incubación Tiempo de incubación CIM Estándar RPMI 1640 7,0 ±0.1 a 25C ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS) 0,165 mol/L, pH 6,9-7,1 0,5-2,5 x 103 cel/mL 0,5 McFarland. 35ºC 24-48 h para la mayoría de las levaduras del Género Candida. 70-74 h para Cryptococcus neoformans Anfotericina B: Ausencia de turbidez Flucitosina/Azoles/Equinocandinas: 50% de inhibición 2 Inconvenientes del método de referencia A pesar de la importancia que significa contar con un método estandarizado todavía hay una serie de inconvenientes. En primer lugar, la concentración de glucosa en el RPMI 1640 es tan sólo del 0,2%, lo que da lugar a un escaso crecimiento de las levaduras, incluidas las especies menos exigentes como C. albicans. Este retardo en el crecimiento, hace que no siempre se pueda realizar la lectura a las 24 h, motivo por el que debe prolongarse la incubación otras 24 h. Sin embargo, el punto más conflictivo, es tal vez, que la determinación de la CIM queda sujeta a la subjetividad de la lectura visual. Para la anfotericina B la elección de la CIM no ofrece ningún problema, ya que al ser un fármaco fungicida, in vitro produce una inhibición completa del crecimiento. No ocurre lo mismo con los azoles, las equinocandinas y en ocasiones, tampoco con la flucitosina. Con estos compuestos, cuya actividad es fungistática, se observa una inhibición parcial del crecimiento y como consecuencia, la aparición de cierta turbidez en todas las concentraciones del antifúngico. Debido a este hecho, la elección de la CIM es un ejercicio absolutamente subjetivo y ha sido la causa principal de la poca reproducibilidad intra e interlaboratorio de estas técnicas. En el caso de utilizar un macrométodo, el problema se resolvió parcialmente de una forma más objetiva, que consistió en diluir el tubo control de crecimiento 1:2, lo que equivale al 50% de inhibición. De esta forma se compara la turbidez resultante de las diluciones con toda la batería de tubos y se elige visualmente el primer tubo que muestre una turbidez similar o menor a la del tubo diluido. Sin embargo, en el caso del micrométodo la lectura del 50% de inhibición es totalmente subjetiva. Puntos de corte Este es un aspecto muy controvertido debido a que existen una multitud de factores que influyen en la evolución clínica del paciente y la CIM no es más que uno de ellos. Sin embargo, es muy útil disponer de un valor de CIM que identifique aquellos pacientes que tienen pocas posibilidades de evolucionar adecuadamente si se trata la infección con dicho antimicrobiano y viceversa. Rex et al, han propuesto puntos de corte tentativos para fluconazol e itraconazol frente a especies pertenecientes al género Candida. La metodología empleada siguió el documento M27-A del CLSI. 3 En la Tabla 2 se muestran los puntos de corte propuestos por el CLSI para fluconazol, itraconazol y flucitosina. Se incluyen además, los puntos de corte sugeridos para voriconazol y las equinocandinas. Tabla 2: Puntos de corte (mg/L) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3 Antifúngico Sensible Sensible dependiente de la dosis Intermedio Resistente Fluconazol ≤8 16-32 ----- ≥64 Itraconazol ≤0,125 0,25-0,5 ----- ≥1 5-fluorocitosina ≤4 ----- 8-16 ≥32 Voriconazol ≤1 2 ----- ≥4 Equinocandinas ≤2 ----- ----- ----- Intervalo de concentraciones El intervalo de concentraciones elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos críticos, si estos están definidos, y los resultados esperados para las cepas de Control de Calidad. Basados en estudios previos, se recomiendan las siguientes concentraciones de antifúngicos que están recogidas en la Tabla 3. Tabla 3. Intervalo de concentraciones recomendadas para cada antifúngico Antifúngico Intervalo (µg/ml) Anfotericina B 16-0,0313 5-fluorocitosina 64-0,125 Ketoconazol 16-0,0313 Fluconazol 64-0,125 Itraconazol 16-0,0313 Voriconazol 16-0,0313 Posaconazol 16-0,0313 Ravuconazol 16-0,0313 Anidulafungina 16-0,0313 Caspofungina 16-0,0313 4 Documento EDef 7.1 European Committee on Antimicrobial Suceptibility Testing (EUCAST). Método de microdilución para la determinación de la CIM para levaduras fermentadoras. Este método se basa en el documento M27-A del CLSI, sin embargo, fue desarrollado únicamente para levaduras fermentadoras y además le incorpora algunas modificaciones con la intención de mejorar la técnica. Una diferencia importante es que utiliza RPMI más 1.8% de glucosa, de modo de obtener concentración final del 2%, esta modificación permitiría una mejor determinación de la CIM. Debido a que las levaduras asimilan la glucosa como fuente de carbono, parece razonable que la adición de glucosa al medio permita un mejor desarrollo de estos microorganismos. La excepción a este punto la forman la mayoría de las levaduras no fermentadoras (Cryptococcus neoformans, Trichosporon spp., Rhodotorula spp. etc.), en las que el agregado de este compuesto no produce mejoría significativa del crecimiento. Otra modificación fue el tamaño del inóculo. La elección de un inóculo más elevado (0,5-2,5 x 105 UFC/mL) favorece el desarrollo y permite la lectura a las 24 h. Por último, se consideró la CIM, para este método, como la inhibición del 50% del crecimiento. Dicha lectura se realiza en forma automatizada mediante un lector de microplacas, que mide la turbidez de cada pocillo y permite determinar objetivamente el punto de corte establecido. En la Tabla 2. se muestran las principales características de los métodos de referencia propuestos por el CLSI y EUCAST. 5 Tabla 2. Principales características de los métodos de referencia (CLSI y EUCAST) CLSI / M27-A3 Levaduras Macro y Microdilución EUCAST / E.Def 7.1 Levaduras Microdilución CLSI / M38-A2 Filamentosos Microdilución Medio Pocillo microplaca Inóculo /ml Espectrof. Incubación RPMI Fondo redondo RPMI + 2% glucosa Fondo plano RPMI Fondo redondo Formato 0,5 – 2,5 x 103 UFC/ml 0,5 – 2,5 x 105 UFC/ml 0,4 – 5 x 104 UFC/ml 24-48h Candida spp 72h Cryptococcus 24h Candida spp 24h Rhizopus spp. 48h Aspergillus spp y Fusarium spp. 72h Scedosporium spp Lectura Espectrofotométrica Espectrofotométrica Visual (0,1,3,4) CIM / Inhibición Azoles, equinocandinas Azoles y 5FC: 50% y 5FC: 50% Anfotericina B: 90% Anfotericina B: 100% Azoles y 5FC: 50% Anfotericina B: 100% En síntesis, tanto el micro o macrométodo de referencia (CLSI o EUCAST) son los recomendados como métodos estandarizados, aunque todavía existen algunas limitaciones como son la detección de resistencia a la anfotericina B y para Cryptococcus neoformans. 6 TÉCNICAS DE DIFUSIÓN En las dos últimas décadas, se desarrollaron y realizaron numerosos trabajos con el fin de mejorar las pruebas de susceptibilidad de los antifúngicos in vitro. En la actualidad existen técnicas de referencia disponibles para levaduras y hongos filamentosos. No obstante, distintos grupos de trabajo en todo el mundo comenzaron a desarrollar pruebas de susceptibilidad en medio sólido, en la intención de obtener técnicas que pudieran llevarse a cabo en el laboratorio clínico de rutina. En el 2004 el CLSI publicó su documento M44-A que sienta las bases para realizar las pruebas de sensibilidad de los antifúngicos en medio sólido con discos de papel. Además de la difusión en agar con discos de papel, la aparición de las tiras de E-test en el mercado, constituye una herramienta potencial al momento de realizar pruebas de susceptibilidad en los laboratorios de rutina, que por otra parte, cuenta con el aval de numerosos trabajos. Sin embargo, es conveniente recordar que el E-test nunca formará parte de un estándar ya que su origen es comercial. Discos de antimicrobianos Por el momento, el CLSI, en el documento M44 A, estandarizó el método de difusión en agar con discos para levaduras del Género Candida. En el documento se incluyen los puntos de corte de fluconazol y voriconazol para el Género Candida, que permiten clasificar a los aislamientos en 3 categorías: • Sensible. • Sensible dependiente de dosis. • Resistentes. En la Tabla 4. se muestran los puntos de corte del CLSI de los documentos M44-A y M27-A. 7 Tabla 4. Diámetro de inhibición de crecimiento y correlación con Concentración Inhibitoria Mínima para Candida spp. Antifúngico Concentración en el disco Halo de inhibición (mm) R* S-DD* S* CIM (µg/ml) R* S-DD* S* Fluconazol 25 µg ≤ 14 15-18 ≥ 19 ≥ 64 16-32 ≤8 Voriconazol 1 µg ≤ 13 14-16 ≥ 17 ≥4 2 ≤1 *Susceptible: S *Susceptible-dependiente de dosis: S-DD *Resistente: R Las pruebas en medio sólido y en especial las de difusión con disco son simples de realizar y los resultados se obtienen de forma rápida, siendo, en teoría, muy fáciles de interpretar. Sin embargo, en este punto hay que ser muy estrictos, pues si las técnicas no se realizan siguiendo rigurosamente las instrucciones sugeridas por los fabricantes, es posible que se obtengan resultados erróneos. Otras técnicas de difusión Existen varias técnicas estandarizadas que se utilizan en otros países. Las diferencias principales entre las distintas técnicas residen en la elección del medio, concentración del antimicrobiano en el disco, inóculo y puntos de corte. De todas ellas, las tabletas de antibióticos Neo-Sensitabs TM Rosco y las tiras de Etest (AB Biodisk) son los más utilizados en los laboratorios de rutina. Tabletas El antifúngico, en forma cristalina, se mezcla con una sustancia inerte sin actividad antimicrobiana que tampoco interfiere con ningún aspecto del proceso. La principal ventaja de este procedimiento es la estabilidad de las tabletas ya que duran 4 años a 37ºC. Se garantiza que la concentración del antimicrobiano en la tableta es del 90 al 110%. El procedimiento debe seguirse según las indicaciones del fabricante. Permite la valoración cualitativa de la sensibilidad a los antifúngicos evaluados. Candida krusei ATCC 6258. Halo de inhibición frente a anfotericina B. 8 Etest (AB Biodisk) Es una técnica cuantitativa. Consiste en la utilización de una tira de plástico que, en una de sus caras, lleva un gradiente de concentración del Tras la incubación, la intersección entre el crecimiento del microorganismo y la zona de Antifúngico antimicrobiano. inhibición en forma de elipse indican la CIM. Candida tropicalis. Halo de inhibición (CIM) frente a fluconazol y anfotericina B. 9 Referencias: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard Third Edition. CLSI document M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2008. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2008). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved standard Second Edition. CLSI document M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2008. EUCAST Definitive Document EDef 7.1: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Clin Microbiol Infect 2008; 14: 398–405. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2004). Method Antifungal Disk Diffusion Suceptibility Testing of yeast. Approved standard M44-A. National Committe for Clinical Laboratory Standards,Villanova, Pennsylvania. User’s Guide NEO-SENSITABS TM Suceptibility testing, 18th Ed. 2005/2006. Rosco Diagnostica A/S. 10