Inmunohematología 2016 Dra. Ana Cecilia Haro Sensibilización Ag + Ac Aglutinación Ag-Ac Enzimas SAGH LISS Polibrene PEG Albúmina Potencial zeta Tipo de Ac Densidad antigénica Tiempo de incubación Fuerza iónica pH Temperatura Títulación de antisueros GR 5% Sistema ABO Rh Título > 128 > 32 Score Aglutinatos Graduación en tubo Grumo único ++++ 10 2- 3 grumos +++ 8 Hasta 10 grumos ++ 5 Muchos, finos + 2 ninguno - 0 ++++ 10 +++ 8 ++ 5 + 2 Sistema Score ABO > 50 Rh > 50 0 Avidez GR 10% → ABO GR 50% → Rh Sistema ABO Rh Avidez < 8 segundos < 30 segundos Especificidad ABO Rh Reactivo GR “A” GR “B” GR “AB” GR “O” Reactivo Anti-A Anti-B Anti-A,B + + - + + - + + + - Anti-D + - GR “O” Rh D (+) DCe/dce R1r GR “O” Rh D (-) dce/dce rr Determinación de los grupos sanguíneos ABO y Rh Sistema ABO Grupo sanguíneo GR → Ag Plasma → Ac A A A Anti-B B B B Anti-A AB AB O O A y B Ninguno Ninguno Anti-A y AntiB DIRECTA Placa Anti-A INVERSA GR “O” Tubo Anti- B Anti- B Anti-AB GR GR “A”A B “B” O Anti-A A B AB A B O GR 5% GR 5% Interpretación Grupo sanguíneo PRUEBA DIRECTA PRUEBA INVERSA Anti - A Anti - B Anti - AB GR A GR B GR O O - - - + + - A + - + - + - B - + + + - - AB + + + - - - Muestra mal identificada Reactivos no controlados Muestra coagulada Dilución de Ig por trasfusión masiva de plasma Subgrupos ABO Quimera (transfusión o transplante) Expresión antigénica eritrocitaria disminuida (leucemia y otras neoplasias) Actividad antiaglutinínica escasa o nula (inmunodeficiencia) Lactantes < 4-6 meses dan reacciones débiles o nulas Presencia de autoanticuerpos (crioaglutininas) Sistema Rh (Ag D) Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes Antígeno D Normal común D parcial o D Débil Variante D Epitope: Normal Normal Mutados Cantidad de Ag: Normal Reducida Normal o Reducida Ac --- --- Epitope Antígeno --- Placa Tubo GR 5% D C Aglutina No Aglutina No Aglutina Aglutina Rh D (-) Rh D (+) D débil D parcial D parcial débil Rh D (+) Investigar antígenos D débiles Determinación de antígenos D débiles P Paciente Control GR 5% GR 5% Anti-D Soluc.Fisiol. Centrifugar y Leer Aglutina No aglutina No debe aglutinar Rh D (+) Incubar 37ºC 30 min (SENSIBILIZACIÓN) Centrifugar y Leer Aglutina No aglutina No debe aglutinar Rh D (+) Lavar 3 veces con solución fisiológica SAGH SAGH Centrifugar y Leer Aglutina Rh D débil (+) No aglutina Rh D (-) No debe aglutinar C ¿Cómo se informa un grupo sanguíneo? Nombre y Apellido: Fecha: GRUPO SANGUÍNEO: FACTOR Rh D: AB B O A Negativo Positivo Prueba de Coombs Prueba que permite demostrar la presencia de anticuerpos que sensibilizan los glóbulos rojos. El reactivo de Coombs ó SAGH reconoce fracción Fc de las Ig o las fracciones de C específicas. + Suero Coombs AGLUTINACIÓN PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (PCD) • Detecta glóbulos rojos sensibilizados “in vivo” PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA (PCI) • Detecta glóbulos rojos sensibilizados “in vitro” Detecta los Acs y/ó componentes del Complemento fijados in vivo a los hematíes del paciente. Descartar el plasma rpm Sangre entera anticoagulada con EDTA Separar una alícuota para lavar con SF Muestra: GR del paciente en estudio Lavar 3 veces con solución fisiológica Preparar suspensión globular al 5% 100 µL de GR + 1900 µL de SF 1 gota de suspensión de GR al 5% 1 gota del Rvo de Coombs rpm 45” a 1000g LEER Resultado positivo: presencia de aglutinación. Se debe indicar la intensidad de la positividad: +, ++, +++, ++++. Resultado negativo: dejar a temperatura ambiente 10 minutos, centrifugar y leer. • Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal (EHFN) • Reacción Hemolítica Postransfusional • Anemia Hemolítica Autoinmune (AHAI) • Anemia Hemolítica Inducida por Fármacos EHFN Reactivo de Coombs + MUESTRA: GR del bebé lavados (2-5%) Sensibilización de los GR in vivo con Acs maternos ¿QUÉ OCURRIRÍA SI… LOS LAVADOS SE OMITIESEN O SE REALIZARAN DEFICIENTEMENTE ? La muestra contiene GR sensibilizados y muchas globulinas no unidas Muestra 1ra Centrifugación Correcto Erróneo 3ra Centrifugación Correcto Erróneo Detecta los Acs y/ó componentes del Complemento presentes en el suero del paciente, los cuales serán fijados in vitro a los hematíes. MUESTRA: SUERO DEL PACIENTE REACTIVOS: • GR O Rh+ ó Paneles Selectores • Reactivo de Coombs • SF ó LISS (solución salina de baja fuerza iónica) Ag - Ac Incubar 30’ 100 µL SUERO a 37°C + 50 µL GR al 5% en SF Incubar 15’ 100 µL SUERO a 37°C + 50 µL GR al 5% en LISS rpm LEER Lavar 3 veces con SF 1 gota del Rvo de Coombs Si la reacción es positiva se debe ser titular Diluciones: 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 • Pruebas de compatibilidad • Detección de anticuerpos irregulares • Identificación de anticuerpos irregulares • Tipificación de antígenos en el GR • Anamnesis • Muestra • Fase Preanalítica • Limpieza del material • Centrífugas • Reactivos Se deben emplear -GR sensibilizados con IgG -GR sensibilizados con C’ -GR normales no sensibilizados Titulación del Rvo de Coombs. Controlar el pH de la SF (debe tener pH 7,0 – 7,2) Panel eritrocitario selector • Suspensiones de GR • Lavados • Fase Analítica • Tiempos de incubación • En la centrifugación • Lectura Lavado inadecuado Prueba interrumpida o diferida Interpretación errónea de pruebas positivas débiles Omitir el agregado de SAGH Pérdida de actividad de SAGH por mala conservación Centrifugación inadecuada Concentración de GR alta o baja Concentración alta de IgG en suero en estudio pH de solución fisiológica 6.0 disminuye sensibilidad Glóbulos rojos autoaglutinados o poliaglutinados Partículas, contaminantes, precipitados o fibrina presentes en tubos que producen agregación de GR Sobrecentrifugación Esta prueba permite que los GRs no aglutinados pasen libremente a través de la columna de gel bajo centrifugación, mientras que aquellos aglutinados, permanecen atrapados entre las esferas de gel. NEGATIVO POSITIVO GRACIAS POR SU ATENCIÓN