1 MÉTODO RADIOLÓGICO PARA EVALUAR LA

MÉTODO RADIOLÓGICO PARA EVALUAR LA MOTILIDAD
GASTROINTESTINAL EMPLEANDO RATONES NO ANESTESIADOS
TOSO1, Ricardo E.; BOERIS 1, Mónica A.; LEON 2, Luis
1
Centro de Investigación y Desarrollo de Fármacos (CIDEF). Facultad de
Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Pampa, Calle 116 y 5,
General Pico, La Pampa, CP 6360, Argentina
2
University of Applied Sciences, Am Krümpel 31, 49090 Osnabrück, Alemania
Correspondencia: retoso@vet.unlpam.edu.ar
RESUMEN
Se describe un modelo experimental para evaluar la acción de drogas o
formulaciones medicamentosas sobre el tránsito gastrointestinal en ratones. El
modelo consiste en administrar a ratones las sustancias a ensayar y
posteriormente suministrar per os una solución de sulfato de bario. A
continuación, o
l s animales se inmovilizan en jaulas individuales para tomar
radiografías seriadas. Observando el progreso de la sustancia radiopaca en el
tracto gastrointestinal puede evaluarse comparativamente la acción de las
drogas ensayadas con respecto a drogas de referencia y al grupo control.
Examinando las placas radiográficas se puede cuantificar el tiempo de vaciado
gástrico así como el tiempo de evacuación intestinal de la sustancia radiopaca
y si el mismo depende de las drogas administradas. De la misma forma puede
estimarse la velocidad del tránsito gastrointestinal midiendo el tiempo desde la
administración de la sustancia radiopaca hasta el comienzo de la evacuación.
Este modelo experimental tiene ventajas sobre otros métodos con animales
vivos, ya que es incruento y económicamente factible al no requerirse para las
pruebas material y equipamiento específico y costoso. Por otro lado es un
método de análisis rápido en su ejecución y en la lectura de resultados y que
permite adicionalmente la reutilización de los animales luego de un periodo de
reposo. El reducido tamaño corporal de los ratones permite evaluar varias
drogas al mismo tiempo radiografiando varios grupos de animales en una sola
placa. Se concluye que este modelo in vivo no es invasivo, que no requiere
anestesiar a ratones y que ahorra sensiblemente el número de animales de
laboratorio necesarios para realizar estudios de farmacología experimental.
INTRODUCCIÓN
Para evaluar el efecto de drogas sobre la motilidad gastrointestinal se
pueden utilizan diferentes modelos experimentales. Todos tienen ventajas y
desventajas en su preparación y ejecución. En este trabajo se analizan los más
comunes y se describe un nuevo protocolo de trabajo.
El baño de órganos o también llamado estudio sobre músculo aislado
viene siendo utilizado desde hace décadas (Cejalvo Lapeña et al., 1989). Aún
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en la actualidad se emplea como un método de elección in vitro para obtener
información cuantificada sobre la acción de drogas en el aparato
gastrointestinal (Zanolari et al., 2007; Nürnberg & Leon, 2008; Aydin et al.,
2009; Jeong et al., 2009), reproductor (Ocal et al., 2004) o circulatorio (MoránPinzón et al., 2008). El baño de órganos se emplea en diferentes especies, en
la determi nación de la actividad de drogas sintéticas, en el estudio de fármacos
fitoterapéuticos (Nürnberg & Leon, 2008; Leon et al., 2008), de carácter
etnobotánico (Gilani et al., 2007; Ghayur et al. 2007), en la determinación del
efecto de diferentes fases biológicas sobre la actividad del músculo liso
(Hirsbrunner et al.; 2002) e incluso en el efecto de algas sobre la motilidad
gastrointestinal (Pérez Gutiérrez & Vargas Solís, 2007). Su ventaja es la
posibilidad de determinación de dosis de acción eliminando las respuestas de
carácter reflejo neuronal (Gual, 1992).
Como se mencionó, estos estudios sobre músculo aislado sugieren, pero
no predicen el efecto que provocan las drogas cuando se administran en los
animales, haciendo necesario los ensayos in vivo (Firpo et al., 2005). Para
visualizar el progreso del contenido gastrointestinal, se comenzaron a utilizar
sustancias no irritantes de la mucosa intestinal de los animales de
experimentación y que puedan visualizarse a simple vista a través de la pared
intestinal, por ejemplo carbón (Jannsen & Jageneau, 1957). Generalmente se
utilizan ratas o ratones a los cuales se les administra carbón vegetal activo por
vía oral utilizando una sonda gástrica. Es unos de los métodos más utilizados
en la actualidad para evaluar la actividad motora gastrointestinal in vivo
(Agbaje, 2009). También se utilizan con la misma finalidad en reemplazo del
carbón otros indicadores como el azul de evans (Sánchez et al., 2005;
Lugowska-Umer et al., 2008).
Como desventaja, los métodos que utilizan sustancias indicadoras
requieren sacrificar a los animales para evaluar el progreso del contenido
gastrointestinal. De esta manera se requiere el empleo de un considerable
número de animales para evaluar cada droga.
Para reducir el estrés y el número de animales utilizados se ha
propuesto utilizar ratones con ayunos de cortos períodos de tiempo, 3 horas, y
evitar el sacrificio estimando el tránsito intestinal midiendo el tiempo desde la
administración oral hasta el comienzo de la evacuación de heces con carbón
(Nunes Marona & Bastos Luchesi, 2004).
Se han utilizado sustancias radioactivas como indicadores, ya en el año
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1979, Purdon y Bass administraron una suspensión de Ba SO4 en ratas para
evaluar la radioactividad en distintos segmentos estimando de esa forma la
velocidad de desplazamiento del contenido gastrointestinal. El empleo de radio
nucleótidos se continúa utilizando (Tsopelas et al., 2008). Esta técnica requiere
sacrificar a los animales, abrir la cavidad abdominal y ligar distintas secciones
del tracto gastrointestinal. Como ventaja se obtiene una lectura más precisa del
progreso de la sustancia radioactiva en cada sección, ya que ésta, como
consecuencia de los movimientos peristálticos se va mezclando con el resto del
contenido. Este grado de precisión no puede lograrse con las sustancias
colorantes donde el progreso se evalúa a simple vista o con ayuda de una lupa.
De este modo sólo se observan las porciones de intestino que contienen
carbón pero sin determinar la concentración de éste. Esta particularidad
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representa un problema cuando se quieren estudiar alteraciones peristálticas.
Como desventaja obliga a manejar sustancias radioactivas y además se
necesitan los equipos de medición aumentando el costo. Del mismo modo que
se indicó para el método del carbón requiere un gran número de animales para
evaluar cada droga.
También puede citarse el método empleado por Plaza et al. (1996) que
consiste en insertar electrodos para medir las contracciones gastrointestinales.
Las ratas deben ser sometidas a una intervención quirúrgica para insertar los
electrodos que se conectan a un registrador. El método es muy invasivo y los
animales necesitan cuidados para evitar que intenten sacarse los electrodos.
En otras fuentes se cita la medición EFS (electric field stimulation) para
determinar la actividad muscular (Tung & Borderies, 1992).
Los métodos descritos requieren el sacrificio de los animales, ya sea
para extraer una sección de intestino para estudios de músculo aislado, o para
realizar la lectura de los resultados. Los métodos que realizan lecturas de
distintos parámetros gastrointestinales por inserción de electrodos requieren
una cirugía previa. Sin embargo puede recurrirse a métodos no invasivos como
la observación por medio de rayos x. Extrañamente, mientras que este método
de diagnóstico es esencial en gastroenterología humana, rara vez es utilizado
en animales de experimentación (Cabezos et al., 2008).
Algunos autores utilizaron rayos x en ratas para estudiar las dilataciones
en el tracto digestivo que se producen en ratas infectadas con Tripanosoma
cruzi (Guillén Pernía et al., 2001).
Siracov et al. (2005) utilizaron un método radiológico para evaluar los
efectos de la etosuccimida en ratas anestesiadas. Estos estudios permitieron
determinar que la atonía gastrointestinal y los disturbios peristálticos pueden
ser suprimidos por el uso de metilsulfato de neostigmina. Para tomar las
radiografías estos autores inmovilizaron a los animales anestesiándolos con
éter. Este procedimiento debió repetirse ocho veces en un plazo de 28 h para
obtener los resultados.
Los trabajos mencionados utilizando rayos x representaron un progreso
en la investigación de drogas con efectos sobre la actividad gastrointestinal in
vivo (X. Wang et al., 2007). Sin embargo, anestésicos inhalatorios como el
isoflorane (Torjman et al., 2005) o anestésicos fijos como propofol y
tribromoetanol (Sababi & Bengtsson, 2001) utilizados para inmovilizar a los
animales pueden en algunos casos interferir la acción de las drogas.
Cabezos et al. (2008) utilizaron radiología para determinar los efectos
del cisplastino sobre la motilidad gastrointestinal. Estos autores introducen una
modificación al método que consistió en utilizar ratas no anestesiadas, las
cuales podían entrenarse para que ingresaran en las jaulas de plástico que las
mantenían inmovilizadas durante aproximadamente cinco minutos. Tiempo
suficiente para tomar la radiografía. Además redujeron el tiempo de exposición
a 60 ms para evitar que los movimientos espontáneos de los animales alteren
la imagen.
En trabajos realizados para evaluar el efecto del estrés inducido por
hipotermia e inmovilización sobre la mucosa gástrica se determinó que la
hipotermia produce una serie de trastornos gástricos que se evidencian con
3
una disminución del flujo sanguíneo mucosal, un aumento de la viscosidad de
la sangre y de la motilidad gástrica (Murakami et al., 1985). Estos autores
indicaron que el estrés es producido por la hipotermia y no por la
inmovilización. De acuerdo con estos estudios las ratas que permanecen en
jaulas de inmovilización durante períodos de 7,30 h no sufren alteraciones en la
mucosa gástrica.
De acuerdo con estos antecedentes se describe en este trabajo un
método radiológico utilizando ratones como animales de experimentación y
manteniéndolos conscientes en a
j ulas individuales de inmovilización durante
todo el ensayo.
OBJETIVOS
Diseñar un método radiológico no invasivo , económicamente viable
como método screening para evaluar la acción in vivo de drogas sobre el
tránsito gastrointestinal que permita analizar simultáneamente varias drogas al
mismo tiempo.
Utilizar métodos de contención para los animales que eviten el uso de
anestésicos que puedan interferir con la acción de las drogas.
MODELO EXPERIMENTAL
El modelo consiste en formar grupos homogéneos de rato nes. El grupo
testigo o control recibe por las mismas vías con un volumen igual los
excipientes empleados para diluir las drogas control y las drogas a ensayar. Se
puede emplear a su vez un grupo cero sin ningún tipo de tratamiento. Se
utilizan grupos control positivo y/o negativo según se considere necesario. En
los grupos tratados se administran las drogas a ensayar disueltas en
excipientes.
Transcurrido el tiempo que los autores consideren necesario para
asegurar el inicio de la acción de las drogas, según nuestras investigaciones 30
minutos, se suministra una solución de sulfato de bario per os y se comienzan
a tomar radiografías seriadas. El tiempo entre radiografías se estima de una
frecuencia de 10 minutos durante el periodo de vaciado gástrico. Una vez que
los animales de todos los grupos han completado el vaciado gástrico se toman
radiografías cada 30 minutos hasta comprobar que los animales de todos los
grupos han comenzado la evacuación de la sustancia radiopaca.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales de experimentación
Se utilizaron ratones hembras de experimentación Mus musculus de 28 30 g de peso y clínicamente sanos. La totalidad de los animales procedían del
bioterio de la Universidad Nacional de La Pampa (Argentina). Fueron
alimentados ad libitum con una ración balanceada elaborada por la
Cooperación, Asociación Cooperativas Argentinas, San Vicente, Buenos Aires,
Argentina cuya composición centesimal es: 23 % proteína bruta, 5 % extracto
etéreo, 6 % fibra cruda, 10 % minerales totales, 1,3 % calcio, 0,8 % fósforo y 12
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% tenor máximo de humedad. Los animales permanecieron alojados en jaulas
de cría estándar con temperatura ambiental de 18–22 ºC y ciclos de
luz/oscuridad de 12 horas.
Los animales fueron sometidos antes de la experimentación a ayuno de
12 horas de alimentos sólidos y 4 horas de líquidos. Tiempos de ayuno
semejantes se encuentran frecuentemente en la literatura.
Material farmacológico y dosis
Drogas de referencia: para comparación del efecto de las drogas que
disminuyen la motilidad gastrointestinal: Se administra vía subcutánea 0,05
mg/kg de N-butilbromuro de hiosciamina (Buscapina ® ampollas para inyección
de 20 mg/ml, Boehringer Ingelheim Argentina S.A. Avenida del Libertador 7208
Buenos Aires, Argentina). Para comparar efectos de drogas que aumentan la
motilidad gastrointestinal se administra vía subcutánea 0,08 mg/kg de
metilsulfato de neostigmina (Prostigmin® Ampollas de 0,5 mg/ml, IGN, Argerich
536, Haedo, Provincia de Buenos Aires, Argentina). Las drogas son
vehiculizadas en agua destilada estéril hasta un volumen de 0,2 ml totales para
la administración subcutánea que se realiza sobre la parrilla costal utilizando
una jeringa de 1 cc con aguja de 0,5 x 15 mm.
Sustancia radiopaca: con ayuda de una sonda gástrica se administra per
os 0,3 ml de una solución de 20 g de sulfato de bario (Gastropaque ´S´® Polvo
citratado, Laboratorio Temis - Lostaló S. A., Quintino Bocayuva 1766, Buenos
Aires, Argentina) disuelto en 7 ml de agua destilada. Esta dosis y concentración
ha sido determinada como la más eficaz por los autores en ensayos previos.
Drogas a ensayar: el método permite evaluar el efecto de drogas que se
administran tanto por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular u oral. Para
descartar interferencias en los resultados como consecuencia de distintos
manejos en los animales o la administración por distintas vías de las drogas de
referencia y las drogas a ensayar debe seguirse el siguiente procedimiento.
Cuando la dosis de la droga a ensayar se administra por vía oral, los animales
pertenecientes a los grupos testigo y control deben recibir una dosis de igual
volumen y por la misma vía del excipiente. Del mismo modo, los animales de
los grupos tratados deben recibir una dosis por vía subcutánea de igual
volumen con el excipiente empleado para vehiculizar la droga de referencia.
El volumen total de las drogas a administrar por vía oral no debe exceder
los 0,5 ml. Los autores observaron que volúmenes mayores pueden provocar el
pasaje a duodeno por exceso de presión en la cavidad gástrica.
Inmovilización de los ratones
Se utilizan jaulas de plástico individuales de elaboración propia. Las
jaulas de 2,5 x 10 cm presentan perforaciones que permiten una adecuada
ventilación para alojar a los animales durante todo el ensayo.
Instrumentación
Se empleó un equipo portátil rayos de rayos x (Fabricado por MGF,
Argentina). Como referencia, se sugiere emplear una potencia de 80 Kw, una
penetración 15 mA, tiempo de exposición de 0,01 segundos y distancia de foco
de 55 cm. La duración total de un ensayo para evaluar el tránsito
gastrointestinal puede extenderse hasta 7 – 8 horas.
5
EVALUACIÓN DE RESULTADOS
En la figura 1 se muestra ejemplarmente en un mismo animal de cada
grupo el progreso de la sustancia radiopaca desde la administración de la
misma hasta transcurridos 120 minutos de su administración. En la figura se
observa comparativamente el transito gastrointestinal del material radiopaco en
el grupo control (Figura 1, imágenes A), en el grupo control con buscapina
(Figura 1, imágenes B) y en grupo con neostigmina (Figura 1, imágenes C). En
todas las imágenes A, B y C se representan las radiografías seriadas tomadas
a un ratón perteneciente cada grupo a los 10, 20, 60, 90 y 120 minutos de
aplicado el sulfato de bario. Se presenta en las gráficas un único animal por
grupo, los autores indican que los resultados obtenidos en otros ratones de los
mismos grupos son análogos.
El tiempo de vaciado gástrico se determina con el tiempo en que se
tomó la radiografía que confirma que todos los estómagos de los animales del
grupo han evacuado en su totalidad la sustancia radiopaca del estómago. Por
ejemplo en la Fig. 1 (imágenes A) ocurrió en el grupo control a los 90 minutos
(A3) y en la Fig. 1 (imágenes C) a los 60 minutos de comenzado el ensayo
(C4). De esta manera pude confirmarse que los animales tratados con
neostigmina disminuyeron el tiempo del vaciado gástrico en 30 minutos con
respecto a los del grupo control. En tanto que la buscapina (Figura 1, imágenes
B) retrasó el vaciado gástrico durante los 120 minutos que duró el ensayo (B5).
El tránsito gastrointestinal se determinó tomando el tiempo transcurrido
desde la administración de la sustancia radiopaca hasta el tiempo en que se
tomó la radiografía donde se confirma que todos los animales de un mismo
grupo comenzaron la evacuación. En la Fig 1 (imágenes A) se observa que a
los 120 minutos hay indicios que comenzó la evacuación intestinal, mientras
que en la Fig. 1 (imágenes C) el animal tratado con neostigmina está
comenzando la evacuación a los 90 minutos y es evidente a los 120. En la Fig.
1 (imágenes B) es notorio el escaso progreso del contenido intestinal en el
animal tratado con buscapina. En el animal de este grupo se observa un
escaso vaciamiento gástrico y lento progreso de la sustancia radiopaca en el
tracto intestinal.
En el animal perteneciente al grupo neostigmina (Figura 1, imágenes C)
puede observarse un rápido vaciamiento gástrico que se completa a los 60
minutos. La evacuación intestinal está por comenzar a los 60 minutos, es más
evidente a los 90 minutos. Estas imágenes son consecuencia del aumento del
peristaltismo. La imagen tomada a los 120 minutos muestra que para
determinar con exactitud el comienzo de la evacuación deberían tomarse más
placas radiografías entre los 90 y 120 minutos.
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Fig: 1: imágenes A1 a A5
Fig: 1: imágenes B1 a B5
Fig: 1: imágenes C1 a C5
10
20
60
90
120
Fig. 1: Radiografías seriadas tomadas a un ratón perteneciente al grupo control (A), al grupo
tratado con buscapina (B) y al grupo tratado con neostigmina (C). Las 5 radiografías fueron
tomadas en todos los casos a los 10, 20, 60, 90 y 120 minutos de la aplicación de la sustancia
radiopaca (1: 10 minutos; 2: 20 minutos, 3: 60 minutos, 4: 90 minutos; 5: 120 minutos). En la
parte inferior de las jaulas de inmovilización de las imágenes C se observan dos marcas
radiopacas correspondientes a señas empleadas para identificación de los animales
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DISCUSIÓN
El método presentado permite determinar en ratones el efecto
antidiarreico/ antiestreñimiento de medicamentos o/ y drogas. La literatura
indica que el número de ratones por grupo para realizar pruebas de
farmacología experimental varía entre 5 (Akindele & Adeyemi, 2006), 8
(Hernández Perez et al., 1995) y 10. En nuestras investigaciones se formaron
grupos homogéneos de 5 ratones ya que esa cantidad es el mínimo exigido,
permite aplicar estadísticas y contempla las normas de uso racional de
animales de laboratorio.
El modelo de rayos x que se describe en este trabajo utiliza un método
de lectura de resultados no invasivo, permitiendo realizar un seguimiento visual
del progreso de la sustancia radiopaca en el tracto gastrointesinal.
Comparativamente, pueden observarse las diferencias entre grupos para
evaluar los efectos que producen las drogas. Estas diferencias pueden
cuantificarse midiendo el tiempo en que se produce el vaciado gástrico o el
comienzo de la evacuación. Podrán emplearse otros métodos más precisos
como la tomografía computarizada, siendo esta sin embargo sensiblemente
más costosa. Por otro lado, si se cuenta con equipo de radioscopia se puede
observar y determinar exactamente el momento en que se toman las
radiografías que confirman cada medición. Esto permitiría, en el caso del
ejemplo mostrado en la Fig. 2, hacer un seguimiento pasados los 120 minutos
hasta determinar el tiempo de vaciado gástrico bajo el efecto de la buscapina.
En el caso de la Fig. 3 habría sido posible determinar el momento exacto en
que comenzó la evacuación intestinal. En caso contrario, se deben tomar las
radiografías en espacios de tiempo cortos, se sugiere cada 10 minutos. Este
procedimiento, si bien aumenta el costo del ensayo evita las repeticiones.
La permanencia de los animales en las jaulas de inmovilización facilita el
manejo y permiten observar si ha comenzado la evacuación ya que se pueden
observar en las radiografías deposiciones radiopacas retenidas en las jaulas
(Fig. 3).
Los autores de este trabajo han observado que los animales que son
colocados en las jaulas de inmovilización sólo intentan por unos 2 a 5 minutos
buscar una salida y luego se mantienen sin movimiento sin presentar signos de
resistencia o estrés manifiesto . Por este motivo la primera radiografía se toma
luego que los animales de grupo hayan suprimido sus movimientos. El tiempo
que se espera hasta tomar la primera imagen explica por que parte de la
sustancia radiopaca se encuentra en la primera porción del intestino delgado
en las radiografías tomadas a los 10 minutos (Fig. 1-3).
Aunque no puede evaluarse el grado de estrés que produce la
inmovilización, pueden tomarse como referencia los trabajos de Murakami et al.
(1985). Estos autores demostraron que el método de inducción de úlceras por
estrés inducido por hipotermia e inmovilización produce las lesiones como
consecuencia de la hipotermia, pero no de la inmovilización. Para confirmar
esta conclusión y utilizando la presencia de úlceras gástricas como indicador
de estrés, un grupo de ratones fue sometido a inmovili zación durante 12 horas.
Estos animales no presentaron lesiones gástricas cuando se evitó la
hipotermia.
8
De acuerdo con lo expuesto puede indicarse que el estrés producido por
la inmovilización no afecta la motilidad gastrointestinal, ya que en los trabajos
de Murakami et al. (1985) se confirmó que la génesis de las lesiones gástricas
se debían a dos factores, falla de la circulación mucosal y aumento de la
motilidad gástrica. Lo expuesto lleva a pensar que la inmovilización no produce
alteraciones significativas sobre la motilidad en tanto se ha demostrado este
efecto en animales anestesiados (Sababi & Bengtsson, 2001; Torjman et al.,
2005). En nuestros trabajos no observamos la pérdida de ningún animal, ni
durante el ensayo, ni tras ser devueltos a su habitáculo tras la finalización del
ensayo. Tampoco en los días posteriores a la finalización del ensayo se
contabilizaron pérdidas significativas.
Una de las ventajas que ofrece el método de rayos x es que los animales
luego de un período de descanso de una semana pueden utilizarse
nuevamente para repetir ensayos. De esta forma se puede administrar
nuevamente a aquellos animales que respondieron en forma errática y
descartar errores experimentales de respuestas individuales propias de la
idiosincrasia.
El empleo de ratones no anestesiados en reemplazo de las ratas
utilizadas por Cabezos et al. (2008) facilitan el manejo al momento de colocar
los animales en las jaulas de inmovilización. Por otro lado, el reducido tamaño
de estos animales en comparación con animales más voluminosos como ratas
permite radiografiar varios grupos al mismo tiempo. Nuestras experiencias
indican la posibilidad de realizar pruebas simultáneas con 5 lotes a 5 animales
por lote. De este modo es posible evaluar rápida y varias drogas en un solo
ensayo o día de investigación.
CONCLUSIONES
El reducido tamaño de los animales de experimentación permite trabajar
al mismo tiempo con una cantidad considerable de ratones y evaluar varias
drogas a la vez.
El método no es invasivo y no requiere el sacrificio de los animales para
evaluar resultados. Los animales luego de un período de descanso de una
semana pueden reutilizarse para ensayar las mismas u otras drogas.
El tiempo entre radiografías puede variarse según las drogas y la
cantidad de placas puede disminuirse para reducir costos.
El empleo de ratones y las jaulas de inmovilización de práctica
construcción facilitan enormemente el manejo de los lotes de animales, evita
errores de método y evita el uso de anestésicos y las posibles interferencias de
éstos en los ensayos.
El método permite evaluar resultados observando el progreso de la
sustancia radiopaca, pero además posibilita medir los tiempos de vaciado
gástrico y tránsito intestinal pudiendo estimar estadísticamente los resultados.
Se concluye que este método es una herramienta que posibilita la
valoración semicuantitativa del efecto de drogas sobre el tracto gastrointestinal,
de bajo costo, no invasivo y que no requiere el uso de anestésicos ni el
sacrificio de los animales para evaluar los resultados.
9
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