DEGRADACION RU:MINAL DE LOS INHIBIDORES DEL FRIJOL (Phaseolus vulgaris)a DE TRIPSINA Raul Ricalde Velascob Antonia de la Cruz Moralesb Jose Antonio Martinez Garciab German D. Mendoza Martinezc RESUMEN Ricalde VR, De la Cruz MA, Martinez GJA, Mendoza MGD. Tec. Pecu. Mex. 1999;37(3)57-62. Se midio la digestibilidad rurninal in situ (DISMS) y la concentracion de inhibidor de tripsina (IT) en 5 variedades de frijol (Phaseolus vulgaris): Bayo Rio Grande, Bayo blanco, AzufrJdo, Ojo de cabra y Negro San Luis, a las 4, 8 y 12 horas, no existiendo correlacion de la DISMS con la concentracion inicial del IT (P>0.05). No existieron diferencias en la DlSMS de las variedades de frijol despues de las 12 h de incubacion. Los inhibidores de tripsina fueron degradados en un 80.5% a las 12 h de incubacion. La variedad Bayo blanco tuvo la menor (P< 0.05) concentracion de IT (3.78 mg/g) con relacion al resto de las variedades. Hubo diferencias en el tiempo medio (h) de degradacion de las variedades: 8.6 Bayo Rio Grande; 10.3, Bayo blanco; 6.4 Azufrado; 8.8 Ojo de cabra; 5.0 Negro San Luis; sin existir correlaci.'" con la concentracion iuicial de IT (P< 0.05). El uso de autoclave redujo la concentracion del IT en un 93%. La degradacion runlinal in situ de la materia seca de las variedades de frijol, no esta asociada a la concentracion inicial de inhibidores de tripsina, los cuales son extensamente degradados en el rumen. PALABRAS CLAVE: Phaseolus vulgaris, l!'actores antitripsicos, Recibido el 24 de marzo de 1999 y aceptado para su publicaci6u el 2 de febrero de 2000. b Carrera de Mediciua Veteriuaria y Zootecnia, Departamento de Producci6n Agricola y Animal, Universidad Aut6uoma Metropolitana, Unidad Mexico queda fuera de norma, IIendurecido II, representando alrededor de 81,000 toneladas (2), 10 cual puede ser un recurso para la alimentaci6n de rumiantes. El frijol con una adecuada en proteina crud a (PC) con un rango de 20 a 30% (3,4), ",in embargo tiene un gran numero de fdctores antinutricionales, en su mayoria termolabiles Especialidad de Gauaderia, Colegio de Postgraduados. Carretera Mexico-Texcoco km. 36.5 Montecillo. Estado de Mexico. CP 56230, Mexico. Tel. 01(5)8-04-59-00 ext. 1716 J!ax 01(5)8-04-59- 79 E-mail: I:mendoza@colpos. colpos.mx dencia y solicitudes de separatas) es una leguminosa concentraci6n Xochimilco. c Digestibilidad. nutricional (1). Se estima que un 10% deI trijol total que se consume anualmente en Se ha comprobado que cuando se prolonga el almacenamiento del trijol (Pha.l'eolu.l' vulgari.l'), se endurece, 10 cual se traduce en tiempos prolongados de cocci6n, sabores indeseables y detrimento en el valor a Runlen, (5), entre los que destacan los inhibidores de tripsina, saponinas, hemaglutininas, isoflavonas, gluc6sidos cianogenicos, taninos y t'actores de flatulencia (6,7,8). (correspon- "7 Raul Ricalde Velasco, Los inhibidores de tripsina (IT), at'ectan a la actividad de la enzima pancrecltica tripsina. Read y Hass citados por Aguirre, (9) fueron los primeros en reconocer la presencia de un inhibidor de tripsina en material vegetal, el cual es una protefna rica en cistinq y baja en metionina, de una sola cadena polipeptfdica, cuyo peso molecular es de alrededor de 25,000 daltons, por 10 que es t'actible de degradarse por las enzimas proteolfticas del rumen. Presumiblemente 10s inhibidores de tripsina no tienen actividad en el rumen, dado que su pH optimo es entre 4 y 5 (10,11,12) y solo en condiciones de acidosis se presenta un pH de esta naturaleza en el rumen (13). Dado que los inhibidO' ~ S de tripsina, atectan la actividad prot olitica en el intestino delgado, es posible e atecten la actividad de los microorganismos ruminales y la digestabilidad in 5'itu de la materia seca (DISMS). El presente trabajo tuvo el objetivo de determinar la cantidad de inhibidor de trip&ina en 5 variedades de frijol, y conocer su degradaci6n ruminal 5 variedades de frijol (PhaseoLu!J'vuLgarLI') endurecido: Bayo Rfo Cuadro Bayo I. Rio Grande, Bayo blanco; Azutfado, Ojo de cabra y Negro San Luis. La concentraci6n del inhibidor de tripsina se determin6 .en muestras desengrasadas con hexano, con la tecnica modificada de Kakade et aL. ( 14), usando un espectrotot6metro 1E Cary UUV- Visible, marca Varian con absorbancia de 410 nan6metros. Las muestras incubadas en el rumen no se trataron con hexano. Con el objeto de comprobar la naturaleza termolabil de los inhibidores, se procesaron muestras de trijol en autoclave a 16 libras de presil)n y a 125°C durante 30 minutos. Las determinaciones de materia seca y nitr6geno (Kjeldhal) se realizaron de acuerdo a los procedimientos de la AOAC (15). La desaparici6n in situ de la materia seca, se midio incubando 5 9 de muestra de cada variedad, molida con una malla de I mm en bolsas de dacron (10 x 20 cm; 40 micrones tamafio de poro) .Las bolsas se incubaron en un bovino con canula ruminal, por duplicado, a las 4, 8, 12 y 16 horas, obteniendo la tasa de degradaci6n y el tiempo medio de acuerdo a una cinetica de primer orden ( 16, 17) . Los resultados se analizaron de acuerdo a un disefio completamente al azar (18). La intormaci6n medida a diterentes tiempos in situ. Se utilizaron et a[ Concentracion inicial de inhibidor de tripsina (IT), y proteina cruda (PC) de variedades de frijol (Phaseolus vulgaris) . Grande Bayo blanco Azufrado Ojo de cabra Negro "San Luis" Error estandar a,b Medias con distinta literal en la misma 58 columna, son diferentes (P<O.O5) DEGRADACION Cuadro RlJMINAL 2. Ta8a (Kd) inhibidores DE LOS INHIBIDORES DE TRIPSINA DEL FRIJOl y tiempo medio (TM) de degradacion ruminal de los de tripsina en variedades de frijol (Phaseolus vulgaris). Variedad Kd, %/h TM, h Bayo Rio Grande 11.59b 8.588 Bayo blanco 93.59b 10.318 Azufrado 15.59ab 6.42a Ojo de cabra 11.32b 8.828 Negro 20.28a 5.00b 2.43 1.84 Error San Luis estandar a,b Medias con distinta literal en la misma de incubaci6n se analiz6 con el procedimiento de mediciones repetidas (19). Las medias de tratamientos fueron comparadas con la pl-ueba de Tukey, usando el procedimiento GLM del SAS (20). columna, son diferentes las cuales representan entre un 12 a 16 % de la proteina total de la semilla de trijol (21). A pesar de utilizadas La concentraci6n tripsina inicial se presenta hubo correlaci()n de inhibidores en el Cuadro entre la protefna blanco, que alrededor Cuadro del 13% del Luis. en las albuminas, mg/g) en y la 4 variedades fueron que existen concentraci6n para mayor media de la variedad para la es similar seca de variedades 12 28.46c mg/g 35.05b 55.21a 27.22c 36.24b 58.58a Azufrado 31.30b 40.29ab 54.01a Ojo de cabra 26.23c 35.51b 50.59a Negro 36.69a 45.30a 58.04a 1.88 1.94 1.45 Bayo Rio Grande Bayo blanco San Luis Error estandar a,b,c Medias con distinta literal en la misma "0 columna, San ( 4.70 a 10 mencionado Horas de incubaci6n 8 son diferentes IT, Bayo Negro de las variedades 3. Digestibilidad ruminal in situ de la materia de frijol (Phaseolus vulgaris). Variedad las experimento la la menor La todas este se puede apreciar diterencias a pesar de que se ha mencionado cruda que en endurecidas, No siendo P<.31) se encuentra de y los IT (r=-.51 inhibidor I. (P<O.O5) (P<O.O5) por Raul Ricalde Velasco, Cuadro 4. Concentracion del inhibidor (Phaseolus vulgaris) en el rumen. et a{ de tripsina en variedades de frijol Horas de incubaci6n 4 Variedad 8 mg/g Bayo Rio Bayo blanco Grande 12 - 3.69a 1.70c 1.24a 3.12b 2.69b 1.09a 0.69bc Azutrado 2.99b 1.88c Ojo 3.3Sab 3.19a 1.08ab 3.26ab 1.74c 0.47c 0.11 0.29 0.14 Negro Error de cabra "San Luis' estandar a,b,c Medias con distinta literal en la misma Huisman et at. (22). Se observ6 una tendencia de relaci6n negativa, entre la concentraci6n de IT con el tiempo medio de degradaci6n (r=-.65, son diterentes (P<O,O5) bloquean dos de tripsina (18,23,24) y se podria alterar la digestion en intestino delgado en rumiantes. P<O.18). Cuando se trat6 el trijol en autoclave, se redujo la concentraci6n del IT a 0.317 mg/g comparado con el testigo (4.703 mg/ g), confirmando la naturaleza termolflbil de estos compuestos tal y como ya ha sido mencionado (22) .Bliss y Hall (23) encontraron con un tratamiento similar al aplicado en este ensayo, que se redujo la Los resultados de la cinetica de degradaci6n ruminal in !"itu de los IT se presentan en el Cuadro 2, mostrando que existen diferencias entre variedades, La degradaci6n de la materia seca a las diterentes horas de incubaci6n, no estuvo correlacionada con la concentraci6n inicial del IT, actividad del inhibidor de tripsina sin alterar la metionina. El grado de destrucci6n de los inhibidores de tripsina por calentamiento, estarfl en funci6n de las condiciones del proceso, como la ternperatura, tiernpo de La digestibilidad in situ de las variedades de frijol se presentan en el Cuadro 3, y la concentraci6n del IT en el Cuadro 4. Se puede observar que a las 4 horas de calentamiento, tarnafio de particula y condiciones de humedad (1,9,12). Si se usan tiempos de calentarniento mayores a los 29 mill se puede at'ectar negativarnente el valor nutritivo de la protein a (25) .Los cambios en la degradaci6n ruminal de la proteina del frijol tratado, asi corno en la incubaci6n se habia degradado alrededor del 30%, cerca del 50% a las 8 horas, desapareciendo el 80% del IT a las 12 horas, indicando columna, que este inhibidar puede ser degradado extensamente por los microorganismas del rumen. Seria importante conocer los posibles efectos de la eantidad del inhibidar que llega al intestino, dado que se ha demostrado que par cada mo1ecula de inhibidor, se disponibilidad de la proteina en intestino delgado, deberfln ser tornados en cuenta si se decide procesar el trijol endurecido para alimentar rurniantes. 60 DEGRADACION RUMINAL DE ,OS INHIBmORES DE TRIPSINA DEI 'RIJOl and trypsin inhibitor concentrations (IT) were measured in 5 bean ,'arieties (Phaseolus vulgaris): Bayo Rio Grdnde, Bayo Blanco, Azufrado, Ojo de Cabra y Negro San Luis. Samples were, incubated in situ for 4, 8, and 12 h. There was no correlation between the initial concentration of 11' (P> 0.05) and DISDM. After 12 h incubation, DISDM of the bean varieties did not differ (P>0.05). Trypsin inhibitors were extensi,'ely degraded (80.5%) by 12 h incubation. The variety Bayo Blanco had the lowest (P< 0.05) initial IT concentration (3.7S mg/g) .The half tune degradation (h) of IT ,va,'i: 8.6 Bayo Rio (:;rande; 10.3 Bayo Blanco; 6.4 Azufrado; 8.8 Ojo de Cabra; 5.0 Negro San Luis (P> 0.05). Treatment by autoclaving (125oC, 16psi) reduced IT concentration by 93%. In situ runlinal degradation of dry matter of the five beau varieties was not associated with the initial trypsin inhibitor concentrations ,vhich were themselves degrdded in the runlen. La intormacion de especies no rumiantes, muestra que el uso de leguminosas con inhibidores de tripsina tienen efectos detrimentales en ratas, ratones y pollos, donde los etectos negativos se presentan en periodos de 2 a 3 semanas, resultando en hiperplasia e hipersecrecion pancre:itica, alterando la digestion y absorcion de la proteina (26,27,28). Los resultados de este trabajo muestran que los inhibidores de tripsina se pueden degradar extensamente en el rumen, y que posiblemente se pueda aprovechar el trijol endurecido para la alimentaci6n de rumiantes, sin embargo, es necesario que se realicen estudios in viva para conocer si existen niveles limitantes de su uso en raciones. KEY WORDS: Phaseolus vulgaris, Tl1'Psin inhibitors, Runlen, Digestibility. TERATURA AGRADECIMIENTOS Se extienden agradecimientos al M. V.Z. Jose Luis Cordero Mora, al Tecnico Andres Lee Hernandez y a la M. en C. Magdalena Crosby Galvan, por su apoyo en la preparaci6n de los animales canulados yen los analisis de lab oratorio para la realizaci6n de este trabajo. CITADA 1. VaZqIIez CMG. Obtencion de barilla y concentrado proteinicIJ de frijol azIIfrallo endIIrecillIJ [tesis de lIlaestria] .Colegio de PostgradIIallos. CbapiIIgo, Mexico; 1987. 2. CODAl. El sistellla agroindIIstrial y los sistelllas alillleIIticios basicos. Frijol 3. SARH. Mexico. 1994:14. 3. Bressani R. Significado IIIItricional y alilllenticio del eIIllIIrecillliento del frijol Ell: Selllinario sobre el endIIrecillliento del frijol colllun. I>CCMCA, SEA. Rep. Dolllinicana SEF-l; 1983:25. 4. Van der Poel AFB. Effect of processing on antinIItritional value of dry beans (Phaseolu,'i vulgaris) A review. Anilll Feed Sci TechI\IJI 5. Uvalle BA. EvalIIaci6n nIItricional de siete frijoles colllestibles del estado de Chiapas [tesis licenciatIIra]. MexicIJ. UNAM; 1977. 6. Liener IE, Kakade lVIL. Protease inhibitors. In: Toxic constituents of plant foods stnffs. USA: Acadelllic Press; 1980:7-71. 7. Reyes MC. Deterlllinaci6n de ~IIIc6sidos cianogenicos en diferentes varicdades de frij (11 (Phaseolus vulgaris) [tesis IicenciatIIra]. Mexico. UNAM; 1980. 1990;29:179. RUMINAL DEGRADATION OF TRYPSIN INHIBITORS OF BEAN PhaseolousVulgaris ABSTRACT Ricalde VR, De la Cruz MA, Martinez GJA, Mendo/.a MGD. Tec. Pecu. Mex. 1999;37(3)57-62. Ruminal degradation of dry matter in situ (DISDM) 61 Raul Ricalde Velasco, et a[ 8. Vane P. Toxieologia de alimentos. Organizacion Panamericana de Salnd (OPS) Centro de Ecologia Hnmana y de Salnd. Metepec, Edo. de Mexico. 1986:128. 9. Agnirre MMG. Detenninacion de inhibidores de tripsina en 13 semillas de legnminosas por el metodo mieroelectr()foretic() !tesis licenciatnraI. Mexico. UNAM; 1980. 18. Steel RGD, Torrie .JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2ud ed. New 1:(Jrk, USA: McGraw-Hill Book Co; 1980. 19. Wilcox C.J, Thatcher WW, IV1artin FG. Statistical analysis of repeated measurements in physiology experiments. .Journal Series No.9552 1!1orida Agric Exp Stat 141. 1990:35. 20. SAS User's Guide: Statistics (Version 5 Ed). SAS Inst Inc., Cary, NC. 1985. 21. Marquez VM, Lajolo FM. Composition and digestibility of albumin, globulin and gIutelins from (Phaseolus vulgaris) .J Agr Food Chem 11. Nieto VZ. Toxicologia en legnminosas. Departamento de Alimentos. Divisiou de Estndios de P()sgrad() Facnltad de Qnimica. UNAM. Mexic(). 1985:96. 22. 12. Donald B, Rayas Dp' Nielsen SS. Screeniug of heat-stable trypsin inhibitor in dry beans and their partial pnrificati()n fr()m great northeru beaJls (Pha.l.eolu,~ vulgaris). Using anhydro tripsinSepharose affinity chr()mat()graphy. J Agric l"0od Chem Soc 1992;40:32. Huisman BJ, Van der I'eol AFB, Leeuwen PV, Verstegen MWA. Comparison of growth, metabolism and organ weights in piglets and rats fcd on diets containing (Phaseolus vulgaris) beans. Br J Nutr 1990;(64):745. 23. Bliss FA, Hall TC. Food legumes compositional and nutritional changes induced by breeding. Cercal Food World 1977;(22):105. 13. 24. Wu C, Witakcr characterization inhibitors from vulgaris) var. 1990;(38):1523. 25. Arora SK. Chemistry and biochemistry of Icl:umes. Edward Arnold, New Dehli, India. 1983:572. 26. Kunitz M Crystallization of a trypsin inlubitor from soybeans. Science 1945;(101):668. 27. Kakade M, Foffa D, Liener 1!:1. Contrihution of trypsin inhibitor to the deteriour effect of unheatcd soybean ted to rats. .J Nutri 1973;(103):17n. 28. Lirner IE. Antitriptic and other antinutritional factors in legmnes. In: Nutritional improvement of food Irgumes by breeding. New York, US: Academic Press. 1972. 10. Bro\\'n JW, Oshorn TC, Bliss FA, Hall TA. (;enetic variation in the snbllllit-; of globnlin-2 and albnmin seed proteins of French beans. Theory Appl Genet 1981;(60):245. 1989;(29):1068. Britt()n RA, St()ck RA. Acidosis, rate of starctl digestiou and inmke. In: Agric Exp Stat OkIah()ma State University edit()r. Symp()sium Pr()ceedings: Feed intake by beef cattle. 1986:45. 14. Hamerstrand GE, Black LT, (;I()ver D. Trypsin inhibitors in soy prodncts: Modification of the staJldard analytical procedure. Cereal Chemistry 1981;58(1)42. 15. AOAC Ass()ciati()n ()f Official Anal)1ical Chemist-;. Official methods ()f aJlalysis. 14th ed. Washing tIm, DC; 1984. 16. Mehrez AZ, Orskov ER. A stlldy of artificial bag techniqne for detennining the digestibility of feed in the rnmen. ,1 Agri Sci CaJnb 1977;(88):645. 17. Smith LW, G()ering HK, Waldo DR, Gordon CH. In vitro digestion rate of f()rage cell wall comp()uents. ,1 Dairy Sri 1972;(54):71. 52 JR. Purification and partial of four trypsin chymotrypsin red kidney beans (Phaseolus Linden. Amer Chem Soc