GACETILLA JOVENES INVESTIGADORES TECNOLÓGICOS JIT 2013

GACETILLA JOVENES INVESTIGADORES
TECNOLÓGICOS
JIT 2013
IMPLEMENTACION DEL MÉTODO DE DECOLORACIÓN DEL CAROTENO-ÁCIDO LINOLEICO PARA EVALUAR LA
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN MIEL
ÁLVAREZ, María Belén; BURGUÉS, Maia; COLOSIMO, Julieta; GALETTI,
Valeria
Centro de Investigación y Desarrollo en Tecnología de Alimentos – Facultad Regional
Rosario - Universidad Tecnológica Nacional
E. Zeballos 1341 (S2000BQA) Rosario, Santa Fe, Argentina.
valeria_galetti@hotmail.com
Palabras claves: Miel, -caroteno, capacidad antioxidante.
RESUMEN
El interés por determinar la capacidad antioxidante de un alimento se basa en la
posibilidad de incorporar estos a la dieta, para prevenir enfermedades de variada
naturaleza. La inhibición de la decoloración del β-caroteno en una oxidación conjunta
con el ácido linoleico, es una metodología bien conocida para la evaluación de la
capacidad antioxidante en productos naturales. El objetivo de este trabajo fue
establecer los valores adecuados para los parámetros del ensayo de decoloración del
β-caroteno-ácido linoleico, para su aplicación en la evaluación del poder antioxidante
de la miel. Se lograron establecer las condiciones operativas para aplicar la técnica,
seleccionando la concentración adecuada para la preparación de las muestras de miel,
los tiempos de ensayo y las calibraciones para la expresión de los resultados. Sin
embargo, su aplicación demanda un tiempo relativamente prolongado para una
determinación analítica y se requieren cuidados extremos para garantizar la
reproducibilidad de los resultados.
INTRODUCCIÓN
Resulta relevante incrementar el valor agregado de los productos apícolas argentinos
comercializados en el mundo, consolidando la imagen de su calidad diferenciada en el
mercado internacional e incorporando la identificación de origen [1]. En consecuencia,
es de primordial importancia conocer las características fisicoquímicas y sensoriales
de cada una de las mieles que se producen en Argentina, a los efectos de contar con
la información necesaria, que permita desarrollar una herramienta diferenciadora, para
su producción y comercialización.
Entre otras propiedades, la miel tiene el potencial de ejercer una acción antioxidante
por la inhibición de la formación de radicales libres, gracias a la acción de los
flavonoides y de otros polifenoles presentes en su composición [2]. Los nutricionistas
afirman que el sabor más agradable de la miel la hace más apetecible para muchos
consumidores, que incorporan escasas cantidades de vegetales ricos en antioxidantes
en su dieta, pero que estarían dispuestos a consumir miel. Sin embargo, pocos
estudios han examinado los perfiles de antioxidantes en mieles de distinto origen floral,
como para asegurar sus beneficios [3].
El término antioxidante se aplica generalmente a cualquier sustancia que en bajas
concentraciones comparadas a las de un sustrato oxidable, puede retrasar o prevenir
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la oxidación de ese sustrato, incluyendo varios tipos de moléculas encontradas en los
seres vivos [2]. En este sentido, el interés por la capacidad antioxidante de un alimento
se basa en la posibilidad de incorporar estos a la dieta, para prevenir enfermedades de
variada naturaleza.
La inhibición de la decoloración del β-caroteno en una oxidación conjunta con el ácido
linoleico, es una metodología bien conocida para la evaluación de la capacidad
antioxidante en productos naturales, ya que los carotenoides son extremadamente
susceptibles a la oxidación por especies radicales libres. Esta técnica se basa en la
medición espectrofotométrica de la decoloración de los carotenoides causada por su
interacción con radicales peroxilo (LOO●), producidos durante la oxidación del ácido
linoleico. La reacción que tiene lugar es una adición del radical peroxilo al sistema
poliénico de los carotenoides, produciendo un radical estabilizado por resonancia. Este
radical centrado en el carbono, es capaz de reaccionar con otros radicales dando
productos no radicales (etapa de terminación). De no ocurrir esto, el nuevo radical
estabilizado añadirá oxígeno molecular en una etapa de propagación de una reacción
en cadena, produciendo un radical caroteno-peroxilo [4]. Si existen antioxidantes en la
sustancia analizada, los radicales libres reaccionarán con dichos compuestos, en lugar
de atacar al β-caroteno, evitando que se decolore. Es decir que cuanto mayor sea la
actividad antioxidante en la sustancia de interés, menor será la decoloración del βcaroteno.
Esta técnica ha sido usada en la evaluación del poder antioxidante de sustancias
diversas como alcaloides [5], jugos vegetales [6], guayaba [7], chocolate [8], mieles [9],
polen apícola y propóleos [4].
El trabajo publicado utilizando miel como sustrato, no explicita todas las condiciones
de ensayo [9]. Los otros antecedentes mencionados, coinciden en que conviene usar
una temperatura de incubación de la muestra igual a 50ºC y efectuar las lecturas
espectrofotométricas a una longitud de onda de 470 nm [9, 10 y 11]. En cambio,
proponen valores diferentes en lo relativo al tiempo de ensayo, a las concentraciones y
al modo de preparación de los reactivos y de las muestras.
El objetivo de este trabajo fue establecer los valores adecuados para los parámetros
del ensayo de decoloración del β-caroteno-ácido linoleico, para aplicarla a la
evaluación del poder antioxidante de la miel.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los reactivos utilizados fueron: ácido linoleico (Calbiochem), β-caroteno (Fluka),
Tween 40 (Merck), TROLOX® (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico)
(Sigma) y cloroformo Pro-Análisis (Cicarelli).
El método de inhibición de la oxidación del β-caroteno requiere de la preparación de
una emulsión β-caroteno-ácido linoleico [5, 6, 7, 8 y 10]. Para ello, se solubilizaron 3
mg de β-caroteno en 10 mL de cloroformo; 1 mL de esta solución se emulsionó con 40
mg de ácido linoleico, en presencia de 200 mg Tween 40. Finalmente, se evaporó el
solvente y se llevó a 100 mL, con agua destilada.
Para la preparación de la muestra, se ensayaron distintas concentraciones de miel,
comprendidas entre 1x10-3 y 1 mg/mL, realizando lecturas de absorbancia en distintos
tiempos. Soluciones más concentradas conservaban el color de la miel y podrían
causar interferencias en las lecturas espectrofotométricas, como ocurre con algunos
extractos vegetales [5].
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Para la expresión de los resultados, se seleccionó el TROLOX® como sustancia de
referencia. Este compuesto es un análogo de la vitamina E, soluble en agua. Se lo
utiliza en aplicaciones biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo y ha
sido adoptado como referencia en las determinaciones de capacidad antioxidante de
sustratos complejos, como los alimentos, bebidas y suplementos dietarios [12].
Las mediciones espectrofotométricas se efectuaron en un equipo Jasco Modelo 7800.
Se utilizó Excel 2007 para el tratamiento de los resultados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se encontró que la cantidad de cloroformo utilizada en la preparación de la emulsión
β-caroteno-ácido linoleico, se evaporaba fácilmente en una corriente de nitrógeno en 3
minutos, adoptando este tiempo para el procedimiento analítico.
Una vez obtenida la emulsión, se comprobó que la máxima absorbancia se producía a
470 nm, longitud de onda que se utilizó para las lecturas posteriores.
En la Figura 1, se observa que las soluciones de 0,1 y 1,0 mg/mL se estabilizan en
tiempos muy prolongados para la practicidad de un método analítico. La solución de
1x10-3 mg/mL, alcanza valores muy similares a los del control, con lo cual el método
carecería de sensibilidad. En consecuencia, se adoptó la concentración
correspondiente a 1x10-2 mg/mL para las soluciones de miel en agua y un tiempo de
ensayo de 300 minutos.
0,80
0,70
Absorbancia
0,60
0,50
0,001 mg/mL
0,40
0,010 mg/mL
0,30
0,100 mg/mL
1,000 mg/mL
0,20
control
0,10
0,00
0
100
200
300
400
tiempo [min]
500
600
Figura 1. Absorbancia en función del tiempo para distintas concentraciones de
miel
Finalmente, se obtuvo la curva de calibración, para expresar los resultados en mM de
TROLOX® por gramo de miel. Se utilizaron con este fin, soluciones comprendidas
entre 0 y 0,8 mM de TROLOX®. La curva de calibración obtenida respondió a la
ecuación Y = 2,549 Abs - 0,229, con un coeficiente de determinación R2=0,995, donde
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Y representa la concentración de TROLOX® en mM. Mediante un sencillo cálculo
matemático, se relacionará este resultado con la concentración de la muestra de miel,
para obtener el resultado final.
Para las condiciones de ensayo seleccionadas, se iniciaron los trabajos
experimentales con muestras de miel. Se observó que el procedimiento requiere
extremos cuidados en la preparación de la emulsión de β-caroteno-ácido linoleico, que
es muy sensible a la oxidación y puede decolorarse en la evaporación del cloroformo.
Además, esta metodología consume mucho tiempo: cada determinación implica 5 h de
reacción a 50 °C, más los tiempos de preparación y mediciones. También se requiere
un arduo control de las condiciones experimentales para lograr reproducibilidad en los
resultados. La oxidación del β-caroteno inducida térmicamente es bastante
inespecífica, produce la isomerización de los carotenoides en la primera etapa,
generando así productos con diferentes reactividades [13], que resultan difíciles de
controlar.
CONCLUSIONES
Se lograron establecer las condiciones operativas para aplicar la técnica de
decoloración del β-caroteno en la determinación de la capacidad antioxidante de la
miel. Sin embargo, en comparación con otros métodos existentes, su aplicación
demanda un tiempo relativamente prolongado; los reactivos son muy sensibles a la
oxidación y se requieren cuidados extremos para garantizar la reproducibilidad de los
resultados.
Será necesario continuar con las determinaciones, a los efectos de adquirir la
capacidad de obtener resultados confiables o introducir modificaciones en la técnica,
como las sugeridas por Chaillou y Nazareno [4].
REFERENCIAS
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