Marcadores

Mejoramiento genético
MAS ( Selección Asistida por Marcadores)
5- Mejoramiento genético
- Enzimas de restricción
1° - Mutación
4- Selección
- Variación
2 ° - Recombinación
natural (ó dirigida)
- Hibridación
- Recombinación
artificial:
Ingeniería genética:
3- Diversidad
MAS: ( Selección
Asistida por
Marcadores)
- Genéticos
1960
(Construcciones genéticas: ADN
recombinante)
- Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR):
replicación “in vitro”
- Moleculares
Biol. (Mgter) Laura Torres
* Marcadores genéticos *
Huellas…….
Huellitas……
.
Gen de interés agronómico
Marcador genético
Locus “marcador”
Biol. (Mgter) Laura Torres
Características deseables de un marcador
- Herencia mendeliana clásica
- Polimórfico
- Codominante
- No epistático
- Sin influencia ambiental
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos
Ingeniería Genética:
dirigidos….Hibridación,
(Recombinación Artificial)
Recombinación …..y
Selección
Marcadores Genéticos y
Moleculares
- Moleculares
Secuencias nucleotídicas
“codificantes” y “no codificantes”
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas
“codificantes”
Hibridación con
“sondas”
Amplificación por PCR
RFLPs
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Loci marcador:
Endosperma
blanco
Y
Y
5 cM
Marcadores Morfológicos
Maíz
- loci de expresión temprana
Loci de interés:
Androesterilidad (ms1)
ms1
ms1
Cebada
Loci marcador:
Endosperma arrugado
sex1
sex1
Biol.(Mgter) Laura Torres. Fac. Cs. Agropecuarias. UNC
Loci de interés:
Androesterilidad (ms9)
1cM ms 9
ms 9
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: Selección Asistida por Marcadores (MAS)
Marcadores morfológicos: controlados por un
solo loci y presentan expresión temprana
a) En Brassica:
Loci marcador:
primera hoja
vellosa
b) En maíz:
Loci con
carácter de
interés:
Loci marcador: raíz
Haploidía
primaria ó coleoptilo
púrpura
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mapa genético
(Marcadores morfológicos)
Lycopersicum esculentum (2n= 24)
normal
alto
liso
moteadao
enano
pubescente
normal
normal
necrosis
Infl.
simple
Infloresc comp
Biol. (Mgter) Laura Torres
Detección de marcadores
Metodología
Electroforesis
Equipo
Tecnología de los marcadores
Interpretación de las combinaciones de bandas
Ventajas y desventajas
Tratamiento del material vegetal
Electroforesis en geles de almidón, de acrilamida ó
capilar (cromatógrafos)
Tinción histoquímica, química, fluorocromos
Análisis de los patrones de bandas ó cromatogramas
Biol. (Mgter) Laura Torres
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
MARCADORES Isoenzimáticos :
- Polimorfismo a nivel del producto génico
(polipéptido o proteína)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Ventajas
- Técnica consistente, reproducible y bajo costo
- Co dominantes
- Estudios de
diversidad
parámetros poblacionales
mapas genéticos
Desventajas
- Bajo número de sistemas de tinción para detectar enzimas
- Análisis basado en el fenotipo
- Inapropiados para MAS (ej: Tomate: el loci Mi controla la
resistencia nemátodes está ligado al loci de la fosfatasa ácida
El loci para androesterilidad está ligado a una fosfatasa
Biol. (Mgter) Laura Torres
Aplicaciones
- Genética de poblaciones
- Conservación ex situ de germoplasma
- Evolución de especies cultivadas (evaluar la diversidad
genética de las poblaciones locales de Allium sp, mediante
isoenzimas)
- Evaluación y caracterización de germoplasma (evaluar la
diversidad genética y la estructura de una colección de base de
Arachis spp)
- Erosión genética
- Flujo de genes
- Estabilidad genética en bancos de germoplasma (evaluar la
diversidad genética de las entradas de semilla de ….spp,
conservadas y suministradas por jardines botánicos europeos
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético
Cruzamientos
dirigidos….Hibridación,
Recombinación …..y
Selección
Ingeniería Genética:
(Recombinación Artificial)
Marcadores
- Moleculares
Secuencias nucleotídicas
“no codificantes” y “codificantes”
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas
“codificantes”
Hibridación con
“sondas”:
Amplificación por PCR
RFLPs
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: Marcadores Moleculares
Información previa de la secuencia:
SI
- Microsatélites ó SSR:
Simple Sequence Repeats
- CAPS:
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
- SCARs:
Información previa de la secuencia:
NO
- RAPDs:
Random Amplified Polymorphic DNA
- RFLP:
Sequence Characterised Amplified Region
Restriction Fragment Lenght
Polymorphism
- STSs:
- AFLPs:
Sequence-Tagged Sites
- ESTs:
Amplified Fragment Lenght
Polymorphism
Espressed Sequence Tags
- SAMPLs:
- EST - SSRs:
Selective Amplification of Microsatellite
Polymorphism
Espressed Sequence Tags of SSRs
- SNPs:
Single Nucleotide Polymorphism
- ISSRs: Inter-Simple Sequence Repeats
- Minisatélites ó VNTRs
Biol. (Mgter)
(Mgter) Laura
Laura Torres
Torres
Biol.
Enzimas de restricción:
Digestión (ó corte) de la doble cadena de ADN
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Endonucleasas: enzimas de restricción
AluI
Arthrobacter luteus:
AG´CT
TC´GA
Sitio de restricción (palíndromo)
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens:
G´GATCC
CCTAG´G
Sitio de restricción (palíndromo)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Marcador
molecular de
tipo:
RFLP
(Restriction
Fragment
Lenght
Polymorphisms)
1- Digestión
2- Electroforesis
3- Transferencia a
un soporte sólido
(membrana de
nitrocelulosa)
4- Hibridación con
“sondas marcadas”
5- Lavados
6- Revelado
Biol. (Mgter) Laura Torres
*MARCADORES MOLECULARES - Polimorfismo genético a nivel del DNA
1- Basados en la amplificación
del ADN (PCR: Reacción en
Cadena de la Polimerasa)
(Numerosos sistemas)
2- Basados en la digestión con
endonucleasas (enzimas de
restricción) :
RFLPs (Polimorfismo en la Longitud
de los Fragmentos de Restricciòn)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Marcador molecular
RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Enzimas de restricción
5’…ATAAAAAGTTATACTATTCCAAATGATTGTCCTGTGGTATGTAATTCTATTCCTCGTAAACCTAA
CTTATCTTTGATGTTTATTAGAGCAATATTAGTTATTATGTTAATTAAAGATTATAGTGAAATTAAAGAAACACCAAT
TTATCAGCAACAACTTGAATTAGAAGATCCTGCGCGCAACGCCTGTCTTGTAACTGATAGTGGAATTCGAACTG
AGCTGCAAAATGAACCAGTTACTGTACCAGTAACTCTTCCAACTTTGCCGACTTTTTCAAGTCCTAAAAATTAAT
CCTGTTAATTCATGTCAATTACGCGATTGCATAAGATGAGTTGTTTTAATGGATAGTGAGCGCCACTATGAATATG
GTTCGTATTCAAACTCTCATGGCATTGAATTTGATCCAAATCACCCTTACATTGATTTGATTAACGATGATTTCGA
TGAAAATGATTATCTTGATCTCGAGACGTTAAATCTTGAAGCTGATTATGATGATGTTGAAAGTTTAGCTCTTAG
GCTTAAAAATGCTCCTGACTACACTACTGAGATATTCGAGAAAATAGATAGAATACCAAACTTTGCGAGTTACAG
ATACTTCAGATGAGTTTTATACTTTAAGTTCGATGTTAACCGAGCATATGCAATCAATAATTACATTGCTTCCCAGT
ATACTATGGCCAATGGTCAGTCAGTTAACCAAATCTAATGTATTTCAAGCTGCAGACGATGTTAATATTACTAATT
ATTGGCGTTTGATGGACAGAAGATGGGATTTTATCGATGAACAGTTGAGAGTTCAATTTATTTTTAGAGCTTATG
ACTTGCGAGCGTATCAAAACGAGCGTGTGTCTCAAATTCTTTCTAGCAGTTTATTATTTGCTGGATTAAATCTAAT
TGG……….3'
pb
900
secuencia de ADN de
900 pb
Eco RI : (1 sitio de
corte)
692
- Enzima EcoRI
- Buffer
208
- H2O
GAATTC
Biol. (Mgter) Laura Torres
Segregación
Mendeliana
de alelos
marcadores
de tipo
molecular
(Ej. RFLP,
SSR)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Mejoramiento genético
Cruzamientos
dirigidos….Hibridación,
Recombinación …..y
Selección
- Moleculares
Ingeniería Genética:
(Recombinación Artificial)
Marcadores
Genéticos
Secuencias nucleotídicas
“no codificantes” y “codificantes”
- Morfológicos
- Isoenzimáticos
Secuencias nucleotídicas
“codificantes”
Basados en
hibridación con
sondas: RFLPs
Basados en la
amplificación por PCR
Biol. (Mgter) Laura Torres
Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Biol. (Mgter) Laura Torres
Replicación “in vivo” del DNA
* Helicasa
* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)
* Topoisomerasa ADN girasa
* Iniciación de la síntesis
* ADN polimerasa III
* Primasa, ARN polimerasa
* ADN ligasa.
* Corrección : polimerasas I y III
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Replicación natural del ADN
Biol.(Mgter) Laura Torres.
REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA
Cebador
Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR….
(Replicación “in vitro” de un fragmento de ADN ó ARN)
Biol.
Biol.(Mgter)
(Mgter)Laura
LauraTorres
Torres
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Agua
Enzima Taq-polimerasa
Nucleótidos
Cebadores
Buffer y Mg+ +
Termociclador
Extracción
de ADN
ADN
molde
Muestra de
tejido
Electroforesis:
visualización del
fragmento de ADN
amplificado a partir
de los cebadores
Millones de copias (10 6)
de un fragmento de ADN
Biol.
Biol.(Mgter)
(Mgter)Laura
LauraTorres
Torres
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR (Polimerase Chain Reaction)
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la
amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o
bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer
investigación científica sobre el ADN amplificado
Biol. (Mgter) Laura Torres
Mejoramiento genético: Selección Asistida por Marcadores (MAS)
Condiciones de amplificación del DNA
Desnaturalización
Inicial:
5min
95ºC
Termociclador
1º Etapa:
Desnaturalización
94ºC
30s a 2 min
Polimerización
Final:
5min
68-72ºC
Etapas 1 a 3:
25-45 ciclos ó
repeticiones
2º Etapa:
Hibridación de cebadores
35-60 ºC
15-120seg
3º Etapa:
Polimerización
68-72ºC
30-150seg
Biol. (Mgter) Laura Torres
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Etapas para la
reacción de PCR
Los pasos 2 a 4 se repiten 3035 veces e incrementan más de
106 veces el fragmento de DNA
de interés
Biol.(Mgter) Laura Torres.
RAPDs
(Random Amplified
Polymorphic DNAs)
Base genética
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Base genética
de marcadores
tipo RAPDs
+
Biol.
Laura Torres
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Fac.(Mgter)
Cs. Agropecuarias.
UNC
Variedades de olivo : Frantoio y Oblonga ¿Sinonimia?
Electroforesis de marcadores RAPDs
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Mejoramiento genético: Selección Asistida por Marcadores (MAS)
MARCADORES GENÉTICOS MOLECULARES “
BASADOS EN LA PCR
(Replicación “in vitro” del DNA )
Microsatélites (SSR: Single Sequence Repeat)
Cebador 1 5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´
Cebador 1
Cebador 2 5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´
Cebador 2
Cebador 3
Cebador 3
5´- CGAT CGAT CGAT CGAT – 3´
Región de longitud
variable
Región de secuencia
conservada
(microsatélite)
Región de secuencia
conservada
Biol. (Mgter) Laura Torres
Base genética de marcadores
tipo Microsatélite ó SSRs
(Simple Sequence Repeats)
1
2
Biol.(Mgter) Laura Torres.
1x2
Marcadores tipo SSRs
(Microsatélites)
Dinucleótidos: (AT AT AT
AT) – (AT)23
Trinucleótidos: ATC ATC
ATC (ATC)16
Tetranucleótidos: ACGG
ACGG ACGG (ACGG)22
+
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Sinonimia: electroforesis de marcadores tipo SSRs en las
variedades de olivo Frantoio y Oblonga
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Fingerprinting: Variedad “Arbequina” de Olivo
oli 11
oli 12
oli 17
MPM
(pb)
oli 22
500
400
300
200
100
1
2
3
4
1
2
3
4
M
1
2
3
4
1
2
3
4
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Fingerprinting (huella genética)
Autoincompatibilidad en cerezo Prunus avium L.
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Análisis de diversidad
1
2
3
4
5
6
Electroforesis en gel de
agarosa 3%
7
8
9
M
MPM (pb)
1- Empeltre de referencia
(CSIC, España);
2- Empeltre LP;
200
3- Manzanilla de referencia
(CSIC, España);
4-Manzanilla EC;
IAS oli 12
5- Manzanilla 4S;
6- Manzanilla gigante 4S;
7- Picual de referencia;
8- Nevadillo EC;
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
9- Nevadillo 4S;
M: 100 pb. DNA ladder
(Sigma).
IAS oli 17
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Mejoramiento genético:
Selección Asistida por
Marcadores (MAS)
Loci A/a
(genotipo de
interés: aa).
A
a
Extracción
de ADN
Genotipo
mm
Análisis por PCR:
cebadores para el
loci M/ m
Mm
MM
mm
MM
Cebador
Loci
marcador
M/m
M
m
Cebador
Selección:
plantas
homocigotas
m/m”
Plantas con
genotipo aa
Biol. (Mgter) Laura Torres
Peritaje forense
Biol. (Mgter) Laura Torres
Electroforesis capilar:
resolución de marcadores
microsatélites (SSRs):
tamaño en pares de bases
Biol.(Mgter) Laura Torres.
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
Detección del agente causal del “maize bushy stunt”
1- Amplificación por
PCR
1
2
3
4
5
6
7
2- Digestión con enzimas
de restricción
3- Electroforesis
870 pb
1000
750
M
M1
M2 M3 M4 TE
TS
Microfotografía electrónica
de fitoplasmas
Planta sintomática de
maíz
Biol. (Mgter) Laura Torres
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
Taxonomía y filogenia de Fitoplasmas
HaeIII
RsaI
Regiones genómicas
evolutivamente
conservadas
Regiones
genómicas mas
variables
Figura 1. RFLP analysis of 1.2-kb PCR products (R16F2/R16R2 primers) of 16S
rRNA gene digested with HaeIII (A) y RsaI (B) restriction enzymes S, 100
bp.ladder (Promega), fragment size (bp) from
Figura 3. AluI restriction profile of a phytoplasmal tuf gene
fragment amplified with primer pair fTufAy/rTufAy.
Phytoplasma strain abreviations : AAY (American aster
yellows), ACLLcba, ACLLctes y ACLLjun (Argentinian
catharanthus little leaf), ChamAY (Chamomilla aster
yellows), MBS (Maize bushy stunt) y DauAY (Daucus aster
yellows). S, 100 bp ladder (Promega).
AluI
Biol. (Mgter) Laura Torres
(CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
TaqI
NlaIII
RsaI
Tsp509I
MseI
Biol. (Mgter) Laura Torres
Análisis
filogenético
72 AY1 (16SrI-B)
65
Maryland aster yellows (16SrI-B)
SAY (16SrI-B)
MBS (16SrI-B)
PRIVC (16SrI-B)
AV2192 (16SrI-L)
3
IOWB (16SrI-N)
OAY (Ca. Phytoplasma ateris)
PaWB (16SrI-D)
AVUT (16SrI-M)
6
RapePh (16SrI-C)
Valeriana rrnA (16SrI-M)
ACLLcbaI
73
ACLLctes
55
ACLLcbaII
3259
ChamAY
99 Soybean purple stem (16SrI-O)
SPS (16SrI-O)
ChLL (16SrI-Q)
21
17
Valeriana rrnB (16SrI-M)
57
Alfalfa stunt (16SrI-B)
THP Ca. Phytoplasma licopersicy
STRAWBERY multiplier (16SrI-K)
BBS3 (16SrI-E)
22
38
42
Blueberry stunt (16SrI-E)
Carrot proliferation (16SrI-A)
65
Oat proliferation (16SrI-A)
90
HYDP (16SrI-A)
BB (16SrI-A)
10036
STRAWBERY phylloid fruit (16SrI-R)
CPh rrnA (16SrI-C)
95
48
63
100
KVG (16SrI-C)
CPh rrnB (16SrI-C)
74 KVE (16SrI-C)
ACLR AY 16SrI-F
100
CVB (16SrI-F)
MPV
Figura 6. Phylogenetic tree
constructed by the neighbourjoining method of 16S rRNA
gene sequences from 31
phytoplasmas 16SrI -aster
yellows representative
subgroups strains, other related
16Sr phytoplasmas groups,
and A. palmae y A. laidlawi as
the outgroup. The numbers on
the branches are bootsatrap
(confidence) values. GenBank
accessions numbers of
phytoplasmal 16S rRNA gene
sequences: AY1 (Maryland
aster yellows) AF322644; SAY
(Severe aster yellows)
M86340; MBS (Maize bushy
stunt) AY265208 ; PRIVC
(Primose virescence)
AY265210; AV2192 (Aster
yellows phytoplasma)
AY180957; IOWB (Ipomea
obscura witche´s -broom)
AY265205; OAY (Ca.
Phytoplasma asteris) M30790;
PaWB (Paulownia witche´s broom) AY265206; AVUT
(Aster yellows phytoplasma)
AY265209, *, strains
sequenced in this study. Bar
represents 1 substitution in
JHP (Ca. Phytoplasma japonicum)
69
AusGY (Ca. Phytoplasma australiense)
81
96
1000 nt.
Stolbur
A laidlawi
A palmae
0 .0 01
Biol. (Mgter) Laura Torres
Marcador SCARS
Sequence Characterized Amplified Regions
En tomate:
Marcador asociado a resistencia a
Verticillium (loci Ve/ve).
Biol.(Mgter) Laura Torres.
SNPs (Single Nucleotide Polimorphism)
Biol. Mgter. Laura Torres
AFLPs
RFLPs
RAPDs
SSRs
(Microsatélites)
Ensayo de de
detección
Rápido
Lento
Rápido
Rápido
Reproducibilidad
Alta
Alta
Baja
Alta
Tipo de marcador
Co-dominante Co-dominante
ó dominante*
Dominante
Co-dominante
No
Si
Información sobre No
la secuencia
No
* según el análisis se realice mediante softwere o visualmente
Biol. (Mgter) Laura Torres
1: valor mas bajo
5: valor mas alto
Dom: dominancia
Cod: codominancia
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Mejoramiento genético
Utilidad de los marcadores genéticos y moleculares
1- Fingerprinting (huella genética: Identidad)
2- Conservación y Uso de Recursos Genéticos:
- Construcción de colecciones
nucleares (bancos de germoplasma)
- Relaciones filogenéticas
- Identificación de germoplasma elite
3- Mapas Genéticos
3- Diversidad y Estructura Genética:
- Nivel de heterocigosidad
- Frecuencias génicas y genotípicas
4- Diagnóstico: salud humana, animal,
fitopatología
6- Agroindustria
7- Peritajes forenses
7- Conocimiento y Uso del Sistema
Reproductivo:
- Grado de alogamia.
- Sistema de incompatibilidad.
- Identificación temprana del
sexo del organismo.
8- MAS (Selección Asistida por Marcadores):
Resistencias a factores bióticos y
abióticos
- Grado de introgresión
- Desarrollo de líneas puras.
- Protección legal: obtenciones de
genotipos de propagación agámica .
Mejora de caracteres cuantitativos
(QTLs: Quantitative trait loci
Biol. (Mgter) Laura Torres
Costo - beneficio
Métodos de selección: (detección de genotipos superiores)
Convencional
-Fácil identificación de
fenotipos segregantes
- Esquemas de
retrocruzamientos:
observación visual de
fenotipos a campo y análisis
de tejidos en laboratorio.
Convencional
y ¿…?
Asistida por
marcadores (MAS)
Vs
Asistida por marcadores (MAS)
¿…?
- Expresión tardía del carácter de interés.
- Proyecto privado o público? Tiempo de retorno.
- Costo de implementación: en disminución.
- Efectividad: en incremento. Influenciada por
factores ambientales y epigenéticos.
- Esquemas de retrocruzamientos: rápida y certera
identificación de individuos con el genoma
recurrente.
↑ grado de precisión
↑ tasa de progreso
↓ tiempo de obtención del producto.
- MAS no es la “LA” solución …….
Mayor evidencia empírica
Biol.(Mgter) Laura Torres.
Perspectiva de los Marcadores Moleculares
Agricultura:
Caracterización de genotipos
Cs. Biológicas:
Diagnóstico de patógenos
Desarrollos tecnológicos
para detección de
variaciones
cuanticualitativas de
ADN y proteínas
Cadena Agro-alimentaria:
cuantificación y
seguimiento de materia
prima en productos
elaborados
Análisis del control
genético de caracteres
cuanti y cualitativos
Mejora genética
Identificar MM ligados a
caracteres de interés
Retrocruzamientos asistidos
por MM
Empresas producción y servicios agropecuarios
Empresas biotecnológicas
Empresas de servicios para industria agroalimentaria
Biol. (Mgter) Laura Torres