uniYersidad Yer a g r u za ia FACULTAD DE B10A N A U SIS CAMPUS X A LA PA Experiencia Recepcional Metodologias Inmunologicas Aplicadas al Diagnostico de las Infecciones Parasitarias A lu m n o : R icardo U lises M artinez M arcial D ire cto r del T rabajo: Q.C. R icardo Vazquez B allona M iem bros del Ju ra d o : Q.C. Diana A uro ra C arm ona C ortes M .I.C. Jose B ernardo H ecto r E scobar H enrriquez M.E. Sandra Luz G onzalez H errera J u n io de 2013 Agradecimientos Primeramente a Dios por haberme dado la vida para poder disfrutar de alia, y hoy brindarme la oportunidad de terminar este capltulo de mi vida que fue mi Educaci6n Universitaria. A mi seiiora madre Viacruz Marcia! Flores por ser el eje central de nuestra familia, padre y madre a la vez, amorosa, justa, luchadora constante, guerrera y ejemplo de vida a seguir. Gracias por ser un gran ejemplo en mi vida, y apoyarme en todas mis decisiones. A mis hermanos Uriel, Yemina y C6sar. Por su carifto, su comprensidn y sus palabras de apoyo. No pude tener mejores personas con quien crecer. A mis abuelitos Ricardo y Magdalena, por preocuparse y cuidarnos desde pequenos demostrandonos ese gran amor de abuelitos. A mis tios y primos, que mas que esos terminos son mis pap£s y mis hermanos por haber confiado en mi. A la Universidad Veracruzana, mi alma mater por permitirme estar en sus aulas y hoy poder estar egresando orgullosamente de ellas. A mis profesores por toda su dedicacidn en este camino. Gracias a todos Q.C. Ricardo Ulises Martinez MarciaI indice Resumen:.................................................................................................................... 3 I. Introduccten.............................................................................................................. 4 II. Antecedentes de la Inmunologla............................................................................5 III. Mecanismos de defensa del Hospedador........................................................... 9 3.1 Inmunidad Natural............................................................................................10 3.2 Inmunidad Adquirida....................................................................................... 11 IV. Aspectos Generates de la Parasitologla........................................................... 13 4.1 Clasificacten de los Parasites.........................................................................15 V. Inmunidad Frente a los Parasites...................................................................... 17 5.1 Inmunidad innata frente a parasites.............................................................. 17 5.2 Respuestas inmunitarias adaptativas frente a los parasites.........................18 VI. Inmunoparasitosis y Evasten de la Respuesta Inmune....... .............................19 VII. Diagnbstico inmunoldgico de InfeccionesParasitarias......................................22 VIII. Parasites Tisulares y Hematicos.......................................................................25 8.1 Generalidades de Protozoos:................... 25 8.2 Generalidades de Helmintos:..........................................................................26 IX. Ehfemtedad de Chagas o Tfipaiiosomiasis am ericana................................... 27 9.1 Patogenia......................................................................................................27 9.2 Respuesta Inmune a la Infeccten por Trypanosoma cruzi.........................29 9.3 Metodos inmunotegicos para la deteccten deTrypanosoma cruzi.............. 30 X. Lelsfim aniosls...................................................................................................... 31 10.1 Patogenia................................................................................................... 32 10.2 Respuesta Inmune Frente a Leishmania mexicana................................. 33 10.3 Matodos Inmunotegicos para el diagndstico de Leishmania mexicana.. 34 XI. Triquinellosis........................................................................................................34 11.1 Patogenia....................................................................................................34 11.2 Respuesta Inmune frente a Trichineilaspiralis................................... 35 11.3 Matodos Inmunotegicos para la deteccten de Trichineila spiralis........... 36 XII. Toxoplasmosis....................................................................................................36 12.1 Patogenia.................................................................................................. 37 1 12.2 Respuesta Inmune frente a Toxoplasma gondii....................................... 38 12.3 Mbtodos Inmunolbgicos para la deteccibn de Toxoplasma gondii......... 38 XIII. Entamebosis......................................................................................................39 13.1 Patogenia....................................................................................................39 13.2 Respuesta Inmune frente a Entamoeba histolytica.................................. 41 13.3 Mbtodos Inmunolbgicos para la Deteccibn de Entamebosis...................42 XIV. Plasmodiosis.................................................................................................... 42 14.1 Patogenia................................................... .42 14.2 Respuesta Inmune frente a Plasmodium..................................................43 14.4 Diagnostico Inmunolbgico para la deteccibn de Plasmodium..................44 XV. Fasciolosis.:........................................................................................................44 15.1 Patogenia................................................................................................... 45 15.2 Respuesta Inmune Frente a Fasciola hep&tica....................................... 45 15.3 Diagnbstico inmunolbgico de Fasciola hepatica...................................... 46 XVI. Paragonimosis.................................................................................................. 46 16.1 Patogenia................................................................................................... 46 16.2 Diagnbstico Inmunolbgico de Paragonimus..............................................47 XVII. Hidatidosis................................................................. 47 17.1 Patogenia................................................................................................... 48 17.2 Respuesta Inmune frente a Echinococcus granulosus.............................50 17.3 Diagnbstico Inmunologico para Echinococcus granulosus......................51 XVIII. C isticercosis............................................................... 51 18.1 Patogenia....................................................................................................51 18.3 Mbtodos Inmunolbgicos para la deteccibn de Cistycerccus cellulosae... 52 XIX. Onchocercosis..................................................................................................53 19.1 Patogenia................................................................................................... 53 19.2 Respuesta Inmune frente a Onchocerca volvulus............................ 54 19.4 Diagnbstico Inmunolbgico para Onchocerca volvulus.............................. 54 XX. Conclusiones......................................................................................................55 XXI. Referencias:......................................................................................................56 2 Res u men: La interacci6n pardsito-hospedador se establece mediante un sistema complejo que permite la eliminacidn del pardsito o su perpetuacidn en el hospedador. Esta relacidn depende del pardsito y sus mecanismos de evasidn ante la defensa del hospedador y de la respuesta del organismo parasitario frente a la agresidn. Los grandes avances en tdcnicas inmunoldgicas a travds del descubrimiento de los anticuerpos monoclonales mejoraron en fonria radical las metodologias para detectar anticuerpos en muestras seroldgicas. Es por ello que los exdmenes son lo suficientemente especificos para el inmunodiagndstico en la deteccidn de anticuerpos anti parasitarios presentes en un suero de estudio. En principio, los procedimientos diagndsticos permiten ahorrar tiempo o evitar tdcnicas potencialmente peligrosas (conteo de huevos en andlisis fecales, extensiones sanguineas y biopsias de tejidos) y que ademds permiten analizar multiples muestras de suero. La mayorla de las infecciones parasitarias son crdnicas, dada la debilidad de las defensas inmunitarias innatas contra ellas y la capacidad de los pardsitos para evitar o resistir la eliminacion a travds de las respuestas inmunitarias adaptativas. 3 I. Introduce ion Fresno, M. & Munoz, M. (2009) reconocen que existen una amplia variedad de parbsitos capaces de infectar a los seres humanos. En muchos casos, el parbsito puede colonizar un tejido u 6rgano y mantener su numero sin causar dano (colonizacibn). La enfermedad ocurre cuando ocasiona signos y sintomas de inflamacibn o de perturbacibn funcionai dando lugar a un problema clinico y no es una secuencia inevitablemente asociada a una infeccibn. Las reacciones de defensa pueden producirse de forma especifica o inespecifica. Las respuestas inespecificas tienen la ventaja de intervenir rbpidamente durante una infeccibn aguda y pueden permitir la supervivencia del hospedador hasta que las respuestas especificas congreguen nuevas defensas. Las respuestas inespecificas, la mayoria de las cuales se producen minutos u horas despubs de la infeccibn, componen lo que se denomina respuesta o inmunidad natural o innata cuyo nivel no se incrementa por inmunizacibn repetida. Por otra parte, la inmunidad adaptativa o Antigeno especifica, se incrementa por exposicibn repetida del Antigeno que la induce, tarda en aparecer dias o semanas tras la exposicibn primaria, pero con frecuencia es indispensable para una completa resolucion de la enfermedad. Los grandes avances en tbcnicas inmunolbgicas a travbs del descubrimiento de los anticuerpos monoclonales mejoraron en forma radical las metodologias para detectar anticuerpos en muestras clinicas. Es por ello que son lo suficientemente especificos para el inmunodiagnbstico en la deteccibn de anticuerpos anti parasitarios presentes en un suero de estudio. En prinoipio, los procedimientos diagnbsticos que permiten ahorrar tiempo o evitar tbcnicas potencialmente peligrosas (conteo de huevos en anblisis fecales, extensiones sanguineas y biopsias de tejidos) son aquellos en los que se pueden analizar multiples muestras de suero. 4 De acuerdo a Miller, H. (1990) el suministro adecuado de antigenos especieespecificas y/o anticuerpos muy especificos, son los elementos esenciales para un diagnbstico exitoso de enfermedades parasitarias intemas. Antonio Cruz (2000) destaca que este tipo de tbcnicas estbn avocadas a la deteccibn de anticuerpos, para la formacibn del complejo denominado antfgenoanticuerpo. L6pez, C., Quiroz,D., Pinilla, E. (2008) mencionan que la deteccibn de anticuerpos en suero surgib como una altemativa econbmica frente a los cultivos y anblisis de isoenzimas de los diferentes parasitos. La deteccibn de anticuerpos sbricos (IgG, IgM, IgA, e IgE), es utilizada para el diagnbstico de diversas parasitosis, en especial la busqueda de parbsitos tisulares como por ejemplo Cysticercus cellulosae, Echinococcus granulosus, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Fasciola hepMica, entre otros. Para determ inar la presencia de anticuerpos se pueden emplear una variedad de tbcnicas, entre Inmunofluorescencia ellas, Inmunoensayo Indirecta (IFI), Ligado Inmunoblot, a Enzimas Doble (ELISA), Inmunodifusibn, Aglutinacibn en Lbtex, Hemaglutinacibn Indirecta y la Bentonita Floculacibn. Cada una de estas tbcnicas puede emplear distintos tipos de antigenos del parbsito: sombticos, metabblicos, o de superficie, para exponerse con anticuerpos presentes en el suero de estudio. Debido a las caracteristicas de los antigenos parasitarios cada una de estas pruebas es utilizada acorde a la infeccibn parasitaria en estudio, el motivo es la sensibilidad y especificidad de cada una de estas. li. Antecedentes de la Inm unologia En 2002, Parslow G., Tristam, Stites, Daniel, Terr, Abba & Imboden, John describen que la inmunologia estudia los diferentes mecanismos mediante los 5 cuales el cuerpo se defiende de agentes infecciosos y otras sustancias extranas en su ambiente. Defmida de modo amplio, la inmunologia cubre muchas llneas de defensa, incluso las barreras ffsicas como la piel, sustancias qulmicas protectoras de la sangre y en los liquidos tisulares, y en las reacciones fisiologicas de los tejidos a la lesidn o a la infeccidn. Goldsby, Richard; Kindt, Thomas; Osborne, Barbara & Kuby, Janis (2004) describen que la disciplina de la inmunologla surgid cuando se observd que los individuos recuperados de ciertos trastomos infecciosos quedaban protegidos contra la enfermedad. El termino latino immunis, que significa “exento”, es el origen de la palabra inmunidad, que significa el estado de proteccidn contra anomalias infecciosas. La primera referenda escrita sobre los fenomenos de la inmunidad se encuentra en Tucidides, el gran historiador de las guerras Peloponesas, al describir una plaga en Atenas, escribid en el afio 430 A.C. que solo quienes se habian recuperado de la misma podian cuidar a los enfermos porque no contraehan el padecimiento por segunda vez. El primer intento registrado para indudr inmunidad de manera deliberada los llevaron a cabo los chinos y los turcos en el siglo XV. Varios informes sugieren que las costras secas dejadas por las pustulas de la viruela se inhalaban o se insertaban en pequefios cortes debajo de la piel (Variolacidn). El mddico inglds Edward Jenner introdujo el liquido de una pustula de cowpox en un nifto de 8 afios de edad y luego lo infectd de manera intencional con la viruela. Tal como lo esperaba el nifio no presentd la enfermedad. Louis Pasteur tuvo dxito en el desarrollo en cultivo de la bacteria que al parecer causaba el cdlera de las aves de corral, y a continuacidn, demostrd que los polios inyectados con la bacteria cultivada desarrollaban el trastomo. Despuds de unas vacaciones de verano, inyecto algunos polios con un cultivo antiguo. Los animates enfermaron pero, para sorpresa suya, se recuperaron. A continuacidn, Pasteur 6 desarroll6 un cultivo fresco de la bacteria con la intenci6n de inyectaria en algunos polios nuevos. No obstante, cuenta la historia, su abastecimiento de polios era limitado y, por esta razbn, utilizb los polios inyectados con anterioridad. Una vez mas, para su sorpresa, los polios estaban protegidos del todo contra la enfermedad. Pasteur conjeturb y demostrb que el envejecimiento habla debilitado la virulencia del agente patbgeno y que esta cepa atenuada podria administrarse para conferir proteccibn contra el padecimiento. Denominb a esta cepa atenuada vacuna (del latln, vacca, que significa vaca), en honor al trabajo de Jenner con la inoculacibn del cowpox. Pasteur extendib estos hallazgos a otras afecciones y demostrb que era posible atenuar, un agente patbgeno y suministrar la cepa atenuada como una vacuna. En 1885, Pasteur administrb su primera vacuna a un ser humano, un joven que en repetidas ocasiones la mordedura de un perro rabioso. Al estudiar in vitro de lo que les ocum'a a las bacterias expuestas a leucocitos o al suero, Elie Metchnikoff en 1882 reconoce el significado del fenbmeno de la fagocitosis en tejidos animates, enunciando la "Teon'a de la Inmunidad Celular” . Fudenberg, H.H. en 1982 enuncia que el descubrimiento de la capacidad antimicrobiana de algunas sustancias contenidas del suero llevb en 1890 a Behring y Kitasato al desanrollo de la ’Teona de la Inmunidad Humoral". Tras afios de enconadas luchas cientificas entre los partidarios de ambas teorias, la reconciliacibn de las dos tuvo lugar al demostrarse que la opsonizacibn facilitaba la fagocitosis. A partir de estos estudios se establecib que el alto grado de especificidad inmunolbgica que se producia tras la inmunizacibn se debia fundamentalmente a la formacibn de anticuerpos especificos, que en el hospedador infectado neutralizarian las toxinas producidas por los microorganismos y harian a los microorganism os mbs sensibles a la fagocitosis. Como resultado de esto, la inmunidad especifica se estudib fundamentalmente en tbrminos de la formacibn de anticuerpos, y la terapia y profilaxis de las enfermedades infecciosas se concebia como la administracibn al hospedador de 7 anticuerpos especificos para el microorganismo infectante (sueroterapia) o de una inmunizaciPn disenada a inducir la formaciPn de esos anticuerpos por el propio hospedador. En las primeras dPcadas del siglo XX comienza el estudio de la naturaleza de los anticuerpos y de las sustancias, denominadas antigenos, que inducian su producciPn. TambiPn se estudian las caracteristicas que determinan la antigenicidad, estableciPndose que el tamafio, la naturaleza bioquimica y el carPcter extrafio de la moIPcula eran factores importantes, desarrolIPndose la inmunoquimica. Uno de los puntos de mayor especulaciPn fue el del modo de formaciPn de los anticuerpos tras la inyecciPn del antigeno. Ehrlich en 1897 habla sugerido que los antigenos se combihaban con receptores presentes en la superficie de las cPiulas tisulares y Jeme propuso que la especificidad de los anticuerpos estaba fonmada antes de la uniPn con el antigeno. Los trabajos de Talmage, que ’demostraron que las cPiulas que sintetizaban los anticuerpos transportaban los receptores para el antigeno, dieron lugar a que Burnet propusiese la 'Teoria de la SelecciPn Clonal". A pesar de la cantidad de estudios enfocados hacia el estudio de los anticuerpos y el papel que jugaban en la reacciPn inmunolPgica, algunos trabajos se realizaron sobre las cPIulas que sintetizan los anticuerpos, demostrPndose el papel de las cPiulas plasmPticas y linfocitos B en la producciPn de gammaglobulinas, como efectores de la respuesta humoral. TambiPn fue puesta de manifiesto la existencia de unos Prganos centrales inmunitarios, sefialando Good y Miller en i960 ei papel fundamental del timo de la respuesta inmune, y Glick y colaboradores en 1956 el de la bolsa de Fabricio en las aves. Como ha ocurrido en muchas otras disciplinas los conocimientos en el campo de la Inmunologia han tenido grandes aplicaciones prPcticas. El descubrimiento en 1896 de la aglutinaciPn fue utilizado rppidamente por los bacteriologos para el diagnPstico microbiolPgico, iniciando el desarrollo de la serologia. Otro gran 8 avarice en los mbtodos serolbgicos aplicados al diagnbstico de las enfenmedades infecciosas fue el descubrimiento en 1946 por Oudin de la precipitacibn, siendo modificado por Ouchterlony para dar lugar a la doble inmunodifusibn. La gran revolucibn dentro de las pruebas serolbgicas ha sido la aplicacibn de tbcnicas que incluyen un sistema indicador de la reaccibn antfgeno-anticuerpo como la inmunofluorescencia, las tbcnicas inmunoenzimaticas y el radioinmunoensayo. Otra de las grandes aplicaciones prbcticas de la Inmunologia fue el descubrimiento por Kbhler y Milstein en 1975 de los anticuerpos monoclonales, cuya aplicacibn revolucionb campos tan distintos como el diagnbstico y la terapbutica de las enfenmedades infecciosas o tumorales o muchas breas de la investigacibn, tanto bbsica como aplicada. Los hitos mbs representatives del conocimiento en el campo de la lnmunologia.se han reflejado en la concesibn de numerosos premios Nobel a cientificos que han contribuido al desarrollo de esta disciplina. III. M ecanism os de defensa del Hospedador Las reacciones de defensa pueden producirse de forma especifica o inespecifica. Las respuestas inespecificas, aunque indiscriminadas y no especificas de Antigeno, tienen la ventaja de intervenir rbpidamente en una infeccibn aguda y pueden permitir la supervivencia del hospedador hasta que las respuestas especificas congreguen nuevas defensas. Las respuestas inespecificas, las cuales la mayoria se producen minutos u horas despubs de la infeccibn, componen lo que se denomina respuesta o inmunidad natural o innata cuyo nivel no se incrementa por inmunizacibn repetida. En contraposicibn, la inmunidad adaptativa o Antigeno especifica, se incrementa por inmunizacibn repetida del Ag que la induce, tarda en aparecer dias o semanas tras la exposicibn primaria. Aunque la mayor parte de los intimamente relacionados que rara vez actuan independientemente. 9 3.1 Inm unidad Natural La inmunidad natural implica los mecanismos inespecificos, mec£nicos, quimicos, celulares y algunos inmunologicos, que previenen la colonizacibn o infeccidn de individuos sanos por los microorganismos del entomo. Una de las mas importantes defensas contra la infeccidn la constituyen los fagocitos profesionales del hospedador, polimcrfonucleares (PMN) y Ids monocitos/ macrdfagos. Cuando se produce una infeccidn, los PMN son las ceiulas que acliden primero al sitio de la misma. Los PMN giiiados por sUstancias quimiotacticas difundidas desde la regidn infectada, alteran sus mecanismos de adhesidn adhiriendose y atravesando el endotelio. Posteriormente estos mismos factores provocan una migracidn dirigida de los PMN hacia el lugar de la inflamacidn o infeccion. Los fagocitos son capaces de intemar por endocitosis y destruir toda una serie de microorganismos, aunque estas funciones se ven potenciadas por componentes de la respuesta inmunitaria especifica entre los que se encuentran: 1. Citocinas, secretadas principalmente por linfocitos despues del reconocimiento del Antigeno. 2. Anticuerpos, secretados por linfocitos B, que les dotan de propiedades opsdnicas y efectoras aumentando el reconocimiento y unidn de microorganismos. Los fagocitos producen una serie de moleculas que median su accidn antiinfecciosa que se ha dividido cldsicamente en dependientes o independientes del oxigeno. Entre estas ultimas se incluye una serie de compuestos microbicidas extremadamente bdsicos como lisozima, catepsina, lactoferrina, elastasa y las recientemente descritas defensinas. Los eosindfilos contienen una serie de proteinas tbxicas que ayudan en la defensa contra helmintos. 10 Las cPIulas NK son un grupo de linfocitos grandes granulares que destruyen algunas cPIulas infectadas por parPsitos intracelulares mediante citotoxicidad directa no restringida por el MCH o por mecanismos de citotoxicidad dependiente de Anticuerpo (ADCC). Los productos de los microorganismos tambiPn estimulan directamente la slntesis de citocinas por macrPfagos y cPIulas NK, por lo que algunas citocinas pueden ser consideradas como parte de la inmunidad natural. Sin embargo su cantidad aumenta despuPs de una respuesta inmune especlfica debido a la sintesis directa o a su control por parte de los linfocitos Ag- especlfico. El TNF juega un papel central en la respuesta antiinfecdosa por sus propiedades inflamatorias activando los macrPfagos y Polimorfonucleares (PMN), ademPs de tener un importante papel en la producciPn de prostaglandinas, activa las propiedades antitrombodticas, la sintesis de factor adivador de plaquetas (PAF) y la expresiPn de moIPculas de adhesiPn en cPIulas endoteliales y la proliferaciPn de fibroblastos. AdemPs, TNF estimula la dtotoxiddad de otras cPIulas efedoras inmunes, como son los eosin6filos, cPIulas NK y linfocitos T. 3.2 Inm unidad A dquirida La respuesta inmune especlfica normalmente es lenta y no muy efediva cuando se enfrenta a un organismo por primera vez. Sin embargo, cuando se induce memoria inmunolpgica, la segunda vez es mucho mPs rPpida y efediva. Esta respuesta, que se caraderiza por poseer espedficidad y memoria, estP mediada tanto por linfocitos T como B que poseen receptores especlficos de Ag en su membrana capaces de reconocer variados determinantes antigPnicos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden ser de tres tipos principales considerando los prindpales mecanismos efedores. Los monocitos son incapaces de destruir dertos patPgenos, peno su capaddad de destrucdPn aumenta considerablemente si son adivados por dtodnas secretadas por cPIulas Th1. Esta 11 activacibn es mediada por IFN-g, aunque otras linfocinas, espcialmenre TNF juegan un papel coestimulador de la actividad el IFN. La activacibn de macrbfagos implica un mayor aumento de todos los mecanismos de destruccibn de los mismos especialmente aquellos dependientes de 0 2 y de NO. Los linfocitos B segregan Acs especlficos con la cooperacibn de los linfodtos Th1. Estos Acs son capaces de erradicar ciertas infecciones por varios mecanismos: 1. Previenen la unibn de los microorganismos a sus receptores tisulares y celulares. 2. Neutralizan o inactivan directamente al microorganismo; ocurre cuando los anticuerpos se unen a un antlgeno que posee una funcibn vital para el parbsito, como pueden ser las toxinas. 3. Activan la fijacibn y el sistema del C promoviendo la lisis de los microorganismos. 4. Favorecen la fagocitosis de los monocitos, macrbfagos y PMNs a travbs de la unibn a los FcR (Opsonizacibn) y 5. Promueven las reacciones de citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC) de las cblulas citotbxicas y eosinbfilos. Las cblulas T CD8 citotbxicas destruyen cblulas infectadas con microorganismos intracelulares a travbs del reconocimiento del Ag asociado al MHC. Su activacibn requiere la cooperacibn de las citocinas producidas por las cblulas Th1, IL-2 y en menor medida IFN-g. Median preferentemente la actividad antiviral aunque tambibn son efectivas contra algun protozoo intracelular. Su accibn puede ser directamente citotbxica o debido a la secrecibn de linfocinas como IFN-g. La induccibn de una u otra subpoblacibn de linfocitos T (Th1 O Th2), que implica la sintesis concomitante de las respectivas linfocinas, es clave para inducir una respuesta inmune protectiva en la mayoria de las infecciones por microorganismos. 12 IV. Aspectos G enerales de la Parasitologia De acuerdo a Tay Zavala, Lara Aguilera, Velasco & Gutierrez Castrejdn (2002) el parasitismo es el resultado de las interrelaciones entre dos o mas seres vivos, uno de ellos llamado parSsito y otro denominado hospedero o mesonero, tambiSn es influido por las interacciones de los seres vivos antes mencionados y el medio ambiente, interacciones que constituyen la ecologla del parasitismo. Existen distintos criterios para enunciar los distintos tipos de asociaciones, los cuaies han sido discutidos por numerosos investigadores como Lapage (1951), Cameron (1956), Baer (1952), Caullery (1952) y otros, pero quizas el que explica mas ciaramente el fendmeno de las asociaciones , es el que agrupa de la manera que a continuacidn se sefiala, aunque el aumento de los conocimientos sobre la fisiologia y la bioquimica animal se han incrementado recientemente en forma considerable, lo que permite conocer este tipo de asociaciones con bases mas profundas en lo que respecta a la dependencia metabolica. • Inquilinismo: Asociacidn entre dos seres vivos, en la cual uno (el inquilino) utiliza como morada las estructuras o cavidades del otro (e| hospedero) al que no le ofrece ninguna ventaja. • Comensalismo. En este tipo de asociacidn uno de los seres vivos funciona como hospedero sin recibir ni perjuicio ni beneficio; mientras que el otro asociado (comensal) se procura casa y sustento del mesonero. • Mutualismo. Esla asociacidn biologica entre dos seres vicos en la que a los asociados se les denomina mutualistas y ambos reciben beneficio sin que tengan dependencia necesaria para su existencia, ya que cada uno podrla vivir sin la presencia del otro. • Simbiosis. Este tipo de asociacidn bioldgica, que es muy similar a la anterior, ya existe dependencia necesaria para la supervivencia, ya que los dos asociados (simbiontes) no pueden vivir separados. 13 • Parasitismo. La asociacibn biol6gica entre dos seres vivos, en la cubl uno de los asociados (el parbsito), deriva todo el beneficio de la asociacibn para si, es decir, casa y sustento del otro llamado hospedero con la particularidad que el parasite causa dafio a este. De acuerdo con el numero de especies animales que les pueden servir de reservorios a los parbsitos los podemos dividir en: • Estenoxenos: en las cuales pocas especies de animales les sirven como reservorio. Por ejemplo : Entamoeba histolytica. • Eurixenos: en los que muchas especies les sirven de reservorio, por ejemplo Toxoplasma gondii. De acuerdo con el tipo de ciclo biolbgico y el numero de hospedadores requeridos para completarlo, los podemos diferenciar en: • Monoxenos: aquellos parbsitos que en su ciclo biolbgico tienen un solo hospedero. • Polixenos: Parbsitos que en su ciclo biolbgico presentan un hospedador definitivo y uno o varios intermediarios. • Metaxeno: es aquel parbsito en cuya transmisibn intervienen uno de sus hospedadores, ya sea el definitivo o el intermediario. Como se ha venido mencionando con frecuencia al hospedador (hospedero o mesoneno), bste tambien se define de la siguiente manera: • Intermediario: es aquel que alberga las formas mbs inmaduras o asexuadas del parbsito. • Definitivo: el que alberga las formas sexualmente maduras del parbsito. • Paratbnico: es un hospedador intermediario superfluo, ineficiente, el cual solo permite el desarrolio parciai del parbsito, no libera formas infectantes y debe ser ingerido por otro hospedero. 14 • Reservorio: en este mesonero se garantiza la existencia del parSsito en la naturaleza. • Transmisor: el que transfiere activamente el parSsito de un hospedador a otro. 4.1 C lasificacidn de los Parasitos Linneo publicb en 1758, la d6cima edicibn del Systema Naturae en la que us6 el sistema binomial de nomenclature, en el que se emplean los nombres de origen griego o latino pare denominar a los parasitos y asi el primer vocablo corresponde al gbnero y el segundo a la especie de manera que estos nombres son vblidos en todo el mundo y en todas las lenguas por lo que cuando decimos Entamoeba histolytica, el nombre es vblido en Mexico, como en China. Los .parasitos pertenecen al reino animal y al protista, en base a sus caracteristicas morfologicas y a la historia natural. Cuando se vieron que las caracteristicas de los parasitos eran muy similares entre si, se agruparon en generos, los generos en familias, las familias semejantes se incluyeron en un mismo orden, los ordenes parecidos se agruparon en la misma clase y 6stas a su vez en el mismo Phyllum o Rama, la que a su vez es una de las principales divisiones del Reino. De acuerdo a Tay- Lara (2002) todo parbsito queda agrupado en cierto numero de casilleros, de acuerdo principalmente a sus carecten'sticas morfolbgicas, ya que la mayoria de estos fueron descritos a finales del siglo pasado y a principios de este. Pare que el paresitismo tenga lugar deben cumplirse distintos requisites en relacibn con el parasite y el hospedador de acuerdo a Becerril, Marco Antonio (2008) son los siguientes: • Dosis o cantidad del inbculo. Para que se produzca dafio al hospedador el parasite debe infectar con una dosis minima; algunos deben encontrarse en niveles superiores a 1 x 106 para ocasionar dafios; a otros les basta con 15 uno o dos niveles. Si el mecanismo se basa en toxinas, entonces la infeccibn se basa en la cantidad de toxina para producir el trastomo. • Factores de virulencia. En la naturaleza cada especie de parbsito estb fonmada pro diferentes grupos con rasgos comunes, moleculares, fisilbgicos o morfolbgicos a los que se denominan cepas; es decir, pueden existir una o mas de una cepa de parbsitos. A pesar que cada cepa de parbsitos con caracterlsticas biolbgicas, bioqulmicas, moleculares o genbticas bien definidas, dentro de la misma especie del parbsito hay cepas que poseen la capacidad de lesionar y otras que la tienen, esto es, existen cepas patbgenas y cepas no patbgenas, respectivamente. La patogenicidad (capacidad para infligir dafto) de un parbsito depende de los factores de virulencia; entre bstos, de manera general, se pueden mencionar los siguientes: a. Molbculas de superficie que le pemnitan al parbsito adherirse a la superficie de los tejidos del mesonero. b. Enzimas que degraden los tejidos del hospedero. c. Mecanismos moleculares que superen las defensas del cuerpo humano. d. Rapidez de reproduccibn (mayor que la reproduccibn de las cblulas del hospedador). e. Secreciones que alteren la fisiologla de los tejidos del hospedador y que actuen como toxinas. f. Espacio flsico ocupado y que obstruya el funcionamiento normal de una persona infectada. g. De manera mecbnica, los movimientos del parbsito pueden lastimar los tejidos del hospedero. h. Competencia por los alimentos que se encuentran en el medio. • Fase del parbsito. No todas sus fases son infectivas y patbgenas para el ser humano. 16 V. Inm unidad Frente a los Parbsitos En ia terminologia de las enfermedades infecciosas, una infeccibn parasitaria es la producida por parbsitos animales, tales como protozoos y helmintos. La mayoria de los parbsitos tiene ciclos vitales complejos , una parte de los cuales tiene lugar en el ser humano ( o en otros vertebrados), mientras que el resto depende de hospederos intermediaries. La mayoria de las infecciones parasitarias son crbnicas, dada la debilidad de las defensas inmunitarias innatas contra ellas y la capacidad de los parbsitos para evitar o resistir la eliminacibn a travbs de las respuestas inmunitarias adaptativas. Adembs, muchos antibi6ticos antiparasitarios no erradican con eficiencia estos microorganismos. Las personas que viven en breas endemicas necesitan tratamientos quimiterbpicos repetidos, debido a su continua exposicibn, y es frecuente que el coste y los problemas logisticos hagan imposible la administracibn de tales tratamientos. 5.1 Inm unidad innata frente a parbsitos Aunque se ha demostrado que distintos protozoos y helmintos activan diferentes mecanismos de la inmunidad innata, y a menudo estos organismos pueden sobrevivir y replicarse en sus hospedadores gracias a su capacidad de superar estas defensas. La respuesta inmunitaria innata mbs importante frente a protozoos es la fagocitosis, pero muchos de estos parbsitos resisten este tipo de eliminacibn e incluso pueden replicarse en el interior de los maerbfagos. Los fagocitos tambibn atacan a los helmintos parbsitos y secretan sustancias microbicidas que matan a los organismos de un tamafto excesivamente grande para fagocitarse. Muchos helmintos tienen grnesos tegumentos que les permiten resistir a los mecanismos citocidas de los neutrbfilos y maerbfagos; algunos pueden activar la via altema del complemento, aunque segun K. Abbas, Abul, H. Lichtman,Andrew & Pillai, Shiv (2008) los parbsitos recuperados de personas infectadas parecen haber desarrollado una resistencia a la lisis mediada por el complemento. 17 5.2 Respuestas inm unitarias adaptativas frente a los parbsitos. Los distintos protozoos y helmintos son muy variables en sus propiedades estructurales y bioquimicas, sus ciclos vitales y sus mecanismos patogenicos. Por tanto no resulta sorprendente que diferentes parbsitos desencadenen reacciones inmunitarias adaptativas peculiares, menciona K. Abbas (2008). En general los protozoos patbgenos han evolucionado para sobrevivir en el interior de las cblulas bianco. Por otro lado los metazoos como los helmintos sobreviven en los tejidos extracelulares, por lo que su eliminadbn depende a menudo de tipos especiales de respuestas de anticuerpos. El principal mecanismo de defensa contra protozoos que sobreviven en el interior de los macrbfagos es la inmunidad celular, en especial la activacibn de los macrbfagos por las citocinas sintetizadas por los Linfocitos TH1. Por otro lado, la activacibn de los linfocitos T h2 por los protozoos conlieva una prolongacibn de la supervivencia de los parbsitos y la exacerbacibn de las lesiones, debido a las acciones supresoras de los macrbfagos que tienen las citocinas de los linfocitosT^2 en especial el IL-4. Los protozoos que se replican en el interior de las cblulas hospederas y provocan lisis estimulan respuestas especlficas de anticuerpos y LTC (Linfocitos T Citotbxicos). Hoy se sabe que la respuesta de LTC es un mecanismo de defensa importante contra la propagacibn protozoos intracelulares. La defensa contra muchas infecciones por helmintos depende de la activacibn de los linfocitos TH2, que favorecen la sintesis de anticuerpos de tipo IgE y la activacibn de los eosinbfilos. Los anticuerpos IgE que se unen a la superficie de los helmintos pueden activar los mastocitos, y los anticuerpos IgG e IgA aproximan a los eosinbfilos a los helmintos y activan a estos para que liberen el contenido de sus grbnulos. En las infecciones por helmintos es frecuente observar una produccibn de anticuerpos IgE especlficos y eosinofilia, ambas respuestas se 18 atribuyen a la tendencia de los helmintos a estim ularel subgrupo TH2 de linfocitos T cooperadores CD4+,unas cblulas IL-4 e IL-5 . La IL-4 estimula la slntesis de IgE y la IL-5 facilita el desarrollo y la activacibn de los eosinbfilos. Estos ultimos resultan mas eficientes en la elim ination de los helmintos que otro tipo de leucotitos, ya que la protelna bbsica principal de los grbnulos eosinbfiios pueden ser mbs tbxicos para estos organismos que las enzimas proteoliticas y los intermediarios reactivos del oxigeno producidos por los neutrofilos y los macrbfagos. La expulsibn de algunos nematodos intestinales podria deberse a mecanismos dependientes de la IL-4, pero que aparentemente no requieren la participatibn de la IgE. Las respuestas inmunitarias adaptativas a los parasitos tambibn pueden contribuir a la lesibn del tejido. Algunos parbsitos y sus productos inducen la aparitibn de respuestas granulomatosas con fibrosis asociada. VI. Inm unoparasitosis y Evasion de la Respuesta Inmune A pesar de los variados dispositivos de proteccibn que el hospedador elabora en contra de la gran cantidad de antigeno que el parbsito presents, este es capaz de sobrevivir por largo tiempo utilizando mecanismos de evasibn que han desarrollado a lo largo de su existencia. La cronicidad de las infecciones parasitarias es una indicatibn de que el sistema inmune (SI) es incapaz de erradicar al parbsito, y esto se debe a que el invasor posee los instrumenios para eludir la respuesta inmune (Rl). Pfaff, A.W., Candolfi, E (2003) menciona que una vez establecidos, las diferentes especies de parbsito presentan una gran habilidad para suprimir y/o desviar la Rl del hospedador de tal forma que la infeccibn es finalmente controlada y tolerada, pero no eliminada. K. Abbas (2008) escribe que los parbsitos evitan la inmunidad protectors reduciendo su capacidad inmunbgena e inhibiendo las respuestas inmunitarias del 19 hospedador. Distintos par£sitos han desarrollado formas notablemente eficaces para resistir a la inmunidad de acuerdo a la sigulente tabla: Paras ifos Principales de Resultado estrategias Evasidn T ry p a n o s o m a A um ento en la actividad fagocftica >T CD8+ y < TDR y T IR c ru zi A nergia d e cblulas T Inm unosupresibn Produccion d e IgM bloqueadora B loquea inhibidores de IgG. Produce m ucina q u e induce an erg ia de Suprim e la respuesta de T , q u e cblulas T hum anas es revertida por IL-2. E n ta m o e b a E v a d e la V A C Inactiva el com plem ento h is t o l y t ic a Elim ina com plejos A g-A c d e su eubierta E v a d e la R esp u esta S upresidn d e IM C Inm unosupresibn D e g ra d a tio n d e A cs por proteasas E vad e la inm urie R espu esta H um oral L ib e ra tio n d e productos q u e actuan sobre Incapacita m acrbfagos; produce P G 2 m acrbfagos M odula la Rl Induce citocinas Th1 P la s m o d iu m V ariacibn antigbnica Evasibn d e la Rl f a lc ip a r u m A dh eren cia de eritrocitos infectados al la funcibn de los Evita destruccibn en bazo endotelio vascular Form acibn d e anticuerpos bloqueadores B loquea Acs q u e inhiben la invasion d e los eritrocitos M im etism o m olecular A ltera reconocim iento inm une Inm unosupresibn A nergia d e cblulas T Ligandos peptfdicos alterados Altera funciones d e cblulas T d e m em oria T o x o p la s m a Form acibn d e quistes, lo calizatio n en sitios g o n d ii anatbm icos Inm unoprivilegiados P erm ite a taquizoitos residir y multiplicarse E vitar la Rl C reacibn de vacuola parasitbfora C am b io de antlgenos durante Evasibn de R l diferenciacibn 20 R egulacidn negativa d e M H C clase II R ed u ce presentacidn d e Ag a T Estim ulacion d e m oldculas antiinflam atorias Control d e la infeccidn del hospedador Bloqueo de la fosforilacidn transcripcidn de M A PK, de N F k B, M a n te n e r activacidn de estable de en B loquea una relacidn H /P STAT3 L e is h m a n ia P rev ie n e la pro du ctio n IL -1 2 m e x ic a n a m acrdfago protectora Infecta m acrdfagos sin producir IL-1 D efecto s la resp u esta en Th1 Inm unidad M ed iad a por Cdlulas Induce cfelulas T supresoras E vaden RI P6ptidos repetitivos Interfieren con m aduracidn norm al d e una R I efectiva Inhibicidn d e form acidn d e fagolisosom a y Evade los procesos en zim a s proteollticas del lisosom a proteollticos en m acrdfago C y s t ic e r c c u s Produccidn Prevencidn de ataq u e inm une c e ll u lo s a e cau sa apoptosis d e eosindfilos d e an exin a B por T. solium por el hospedador Abreviaturas: VSG, variantes glicoprotei'cas de supeificie; RI, respuesta inmune; GP63, glicoproteina 63; C, complemento; TDR, respuesta timo dependiente; TIR, respuesta timo independiente; IL, interieucina; VSP, variantes proteicas de superficie; VAC, via aitema del complemento; Ag-Ac, antigeno-anticuerpo; IMC, inmunidad mediada por celulas; PG, prostaglandina;RBC, eritrocitos; MHC, complejo principal, de histocompatibilidad; H/P, hospedador/parisito; Ig, inmunoglobulina. Tornado de Revista Medica de la Extension Portuguesa - U LA Vol 2/Num2/2008 Asi, ciertos par£sitos intracelulares facultativos, especialmente protozoos, esten protegidos de gran parte de los sistemas efectores inmunes, debido a su localizacidn intracelular y aunque la c6lula hospedadora puede expresar Ag del 21 parbsito en su membrana, bstos, de hecho, no suelen desencadenar una respuesta inmune protectiva frente a las cblulas infectadas. 1. Cambio de Antigenos de superficie. Es una modificacibn de la e>qDresibn antigbnica especifica de estadio, de forma que, durante los estadios de parbsitos maduros en los tejidos, los antigenos producidos no son iguales a los de las fases infecciosas. 2. Variacibn antigbnica. Es la modificacibn continua de los principales antigenos de superficie, por lo que cuando el hospedador comienza a formar anticuerpos contra el parbsito, el organismo que estb creciendo ya es distinto desde el punto de vista antigbnico. 3. Evitando la lisis mediada por C. Muchos microorganismos evitan la lisis mediada por C, bien por inhibicibn de la activadbn de la cascada del C. La inhibicibn de la activacibn se puede conseguir por la sintesis o adquisicibn de molbculas reguladoras, el bloqueo de la activacibn de C o la formacibn de un complejo del complemento C5b-9 no litico. 4. Evasibn de los sistemas microbicidad. Ciertos microorganismos intraceiulares facultativos son capaces de evadir los sistemas microbicidas de los fagocitos. Existen bbsicamente 3 tipos de evasibn: a. Inhibicibn de la fusibn entre el fagosoma y el lisosoma. b. Escape de la vacuola fagocitica al citoplasma. c. Resistencia a los sistemas de degradacibn de los lisosomas. V II. Diagndstico inm unologico de Infecciones Parasitarias Desde principios de este siglo, cuando Landstainer inicib la era de la inmunologia hasta nuestros dias, se ban realizado muchos hallazgos que comprometen al hospedero en la reaccibn antigeno-anticuerpo y al modo de realizar la investigacibn de dicho proceso. 22 Actualmente la inmunologla interviene en la mayoria de las disciplinas mbdicas y la parasitologla no es la excepcibn a esta afirmacion, ademas desde hace mas de setenta afios las pruebas inmunolbgicas se utilizan en esta brea. Las pruebas mbs importantes en el diagnbstico inmunolbgico de enfermedades parasitarias son las siguientes: Precipitacibn: Esta reaccibn se realiza cuando un antlgeno soluble reacciona con su anticuerpo y forma un precipitado. Aglutinacibn: Es una prueba en donde el antlgeno celular o particulado se encuentra en suspensibn, este antlgeno agiutina con su anticuerpo especlfico. Floculacibn: Esta prueba es una variante de la precipitacibn pero la reaccibn se manifiesta por formacibn de grumos. Hemaglutinacibn indirecta: Con algunos antlgenos parasitarios se sensibilizan glbbulos rojos, como resultado estos globulos rojos sensibilizados son aglutinados por anticuerpos especlficos. Fijacibn de complemento: Se realiza cuando un antlgeno se pone en contacto con un anticuerpo especlfico en presencia de complemento. Contrainmunoelectroforesis: Llamada tambibn electroinmuno-difusibn, la cual consiste en hacer reaccionar antlgeno y anticuerpo en un gel sometido a campo elbctrico. Inmunoelectroforesis: Esta prueba es una combinacibn de mbtodos fisioqulmicos e inmunoqulmicos, el material a investigar (antlgeno) inicialmente es sometido a una separacibn por electroforesis y posteriormente se enfrenta al antlgeno fraccionado con el suero (anticuerpo) a examinar, de tal manera que los antlgenos y anticuerpos se difunden en un medio apropiado (gel) el uno hacia el otro para evidenciar la formacibn de bandas de precipitacibn al encontrarse. 23 Anticuerpos fluorescentes (Metodo indirecto): En el cual un suero desconocido (anticuerpo) se pone en contacto con antlgenos conocidos, luego se afiade antigamaglobulina marcada con fluoresceina y posteriormente se observa en microscopio de fluorescencia. Esta pmeba ha sido modificada para obtener un antlgeno soluble adherido a una base de acetato de celulosa y su lectura se realiza en un fluordmetro. Analisis Inmunoenzimdtico: Es una pmeba que consiste en ligar a un tubo o placa de poliestireno el antlgeno el cual se pone en contacto con suero (anticuerpo), posteriormente se nace contactar esta union (antlgeno-anticuerpo) con antiglobulina marcada con enzima y luego esta enzima se hace reaccionar sobre un substrato dando una reaccibn de color. La selecciPn de la prueba depende de las caracterlsticas de cada una de ellas en relacibn al estado de la enfermedad y al pardsito que la produce, sin embargo, cada laboratorio debe estar familiarizado con un grupo de tPcnicas cuyo uso estP estandarizado y cumplan los objetivos para lo cual son empleadas y que sean de utilidad cllnica. Una pmeba inmunologica tiene las siguientes caracterlsticas: Especificidad: La especificidad de una pmeba esta dada por la relation de individuos no infectados que den pmeba positiva, de tal manera que hay dos tipos de especificidad: alta y baja. • Alta especificidad significa que en presencia de individuos no infectados la posibilidad de que la pmeba sea positiva (detecte anticuerpos) es minima. • Baja especificidad se refiere a que en presencia de los mismos individuos no infectados se puede hallar positiva la pmeba en muchos individuos. 24 Sensibilidad: Es la relaci6n entre los individuos infectados que den una prueba positiva (detectar anticuerpos), generalmente se expresa como las otras caracteristicas en porcentaje. Reactividad: Se relaciona con la cantidad de anticuerpos infectados, asi una prueba de alta reactividad es aquella que detecta una minima cantidad de anticuerpos y al contrario, una prueba de baja reactividad es la que detecta el nivel de anticuerpos cuando estos han llegado a cifras o diluciones altas. Por lo tanto la eleccibn de la prueba es aquella que cumple con una alta especificidad y sensibilidad y se acompafia de una baja reactividad, lo que elimina en lo posible la determ inacidn de anticuerpos cruzados o residuales de una infeccidn previa. V III. Par&sitos Tisulares y Hem aticos. 8.1 G eneralidades de Protozoos Son organismos unicelulares que desempefian todas las funciones dentro de un organismo vivo. Haeckel, desde finaies del siglo pasado, los incluyd dentro del Reino Protista, consider£ndolos, junto con los hongos, protistas superiores, o sea, organismos que est£n dotados de un nucleo verdadero. De Haro Arteaga, I; Salazar Schettino, P.M. & Cabrera Bravo, M. (2002) mencionan que segun la clasificaciPn de la sociedad de Protozoologos de 1980, los protozoos par£sitos pertenecen a tres Phyla: Sarcomastigophora, Apicomplexa y Ciliophora. Los sarcomastigoforos se subdivides a su vez, en dos grandes Subphyla: Mastigophora y Sarcodina, respectivamente los flagelados tisulares y las amibas. 25 Los mastigofbros o flagelados que parasitan animates se denominan Zoomastigophora. Dentro de este gran grupo se encuentran parbsitos de tejidos como Trypanosoma cruzi y Leshmania mexicana. En el subphylum Sarcodina se encuentra la clase Lobosea (movimientos por medio de pseudbpodos) con una sola especie de parbsito que puede producir dafio extraintestinal que es Entamoeba histolytica. Dentro del Phylum Apicomplexa, tenemos a la clase Sporozea en donde encontramos un grupo de parbsitos tisulares, la mayoria por su ciclo biolbgico, se consideran digenbticos puesto que requieren de dos mesoneros para completarsu ciclo; como por ejemplo: Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. 8.2 Generalidades de Helm intos Son metazoos pianos y cillndricos, se encuentran en el humano principalmente en el aparato digestico; algunos presentan organos de fijacion y otros carecen de ellas, tambibn en lo que respecta al tamaflo, varia considerablemente, los hay casi microscopicos como los machos de Trichinella spiralis y los que miden varios metros. Tambibn en cuestiones de grosor, se encuentran, sobre todo en nematodos, los filiformes de grosor de un pelo, y los gruesos como un Ibpiz. En cuanto a la forma tambibn hay mucha variacibn, pues los hay en forma de hoja como los trematodos, acintados y con segmentos como los cestodos y cillndricos como los nematodos. A la clase trematoda pertenecen los gbneros Fasciola y Paragonimus. Al primer gbnero pertenece Schistosoma mansoni, del segundo gbnero encontramos a Taenia solium y Echinococcus granulosus. Las formas larvarias de T. solium y de E. granulosus parasitan al hombre, el primero produce la cisticercosis y el segundo el quiste hidatfdico, hidatidosis o enfermedad hidatldica. 26 La clase Adenophorea (AphasmidiaJ tiene de importancia el gOnero Trichinella de especie spiralis, La clase Sescernentea (Phasmidia) es la que mayor numero de generos de importancia mOdica agrupa, en ella se encuentran Ascaris, Onchocerca. Las especies son Ascaris lumbricoides, Toxocara y Toxocara canis, y Onchocerca volvulus. IX. Enferm edad de Chagas o Tripanosom iasis am ericana Trypanosoma cruzi , es el agente causal de la enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis americana; es un protozoario flagelado transmitido por insectos hematOfagos denominados triatOminos y fue descuebierto en 1909 por el Dr. Carlos Chagas en Minas Gerais, Brasil, quien, describe la forma aguda de la enfermedad en Berenice Soares de Moura, una niria de dos arios que muere a los 82 arios de infectada y sin haber padecido la enfermedad; asi mismo describe la morfologia y ciclo biolOgico del parasito en huOspedes vertebrados e insectos transmisores y realiza observaciones del curso de la infection en animales de laboratorio y cultivo. 9.1 Patogenia Trypanosoma cruzi produce lesiones por diferentes mecanismos patogenicos los cuales estan relacionados con factores que determinan la evolution de la infection y dependen fundamentalmente del parasito y del hospedador. Parasite Poftmorfisitio H ospedador ConstituciO n genOtica Tropism o Sexo Viruiencia Edad 27 C o n stltu d d n antig^nica Raza Cantldad de Par&sStos Especie fnfecciones Respuesta Inm unoldgica Ternperatura Estado nutricionai y diets Respecto a la relacidn H/R, a nivel celular se sabe que las formas infectantes de T. cruzi penetran la cglula y como amastigotes se reproducer! por fision binaria cada 12 horas; de estas formas, aproximadamente 15% sufre degeneration y el resto induce lisis citoplasm£tica de la c6lula parasitada. Las cepas m£s virulentas son aquellas que tienen mayor poder de penetraddn (aquellas en las que predominan las formas delgadas) y de 6stas cuyos amastigotes presentan mayor indice de mortalidad de las c£lulas hospedadoras; asi, cuanto mayor sea el numero de par^sitos y de c6lulas muertas, mayor ser£ la cantidad de antigenos parasitarios liberados. T. cruzi puede parasitar cualquier elemento del organismo, lo cual estd basado en observaciones experimentales y en humanos, donde se demuestra claramente que aun cuando existen cepas con tropismos bien definidos para c6lulas, tejidos u Prganos, las c^lulas m^s frecuentemente parasitadas son musculares cardiacas, macrdfagos, fibroblastos, neuroglia central o periferica y musculares estriadas o lisas. 28 9.2 Respuesta Inm une a la Infeccibn p o r Trypanosoma cruzi. Trypanosoma cruzi induce en el vertebrado una respuesta inmune especifica y altera en forma inespecifica y generalizada la funcionalidad del sistema inmune. La respuesta inmune defiende al hospedador contra los efectos de la invasibn parasitaria desde el momento de la infeccibn, realizando un papel preponderante en el control del numero de parbsitos en el organismo. Los mecanismos desarrollados evitan que una eventual reinfeccibn de lugar a una nueva fase aguda. A pesar de esta actividad protectora, el microorganismo no es erradicado y se establece una relacibn hospedador- parbsito condicionado por las caracteristicas de ambos y por factores ambientales que tiende a llevar la infeccibn aguda a la cronicidad. Durante la fase aguda de la infeccibn, en los pacientes ha sido descrita un severa inmunodepresibn, cuyo nivel mas importante coincide con el pico mbs elevado de la parasitemia. En la fase indeterminada de la infeccibn, la respuesta inmune se restablece. En la fase crbnica el parasitismo es escaso en contraposicibn con la presencia de una miocarditis intensa debida, segun algunos autores a fenbmenos de autoinmunidad. En la lisis de epimastigotes y tripomastigotes se ha demostrado la efectividad de mecanismos citotbxicos, adembs de la liberacibn de antigenos del parbsito por cblulas infectadas que pueden adsorberse tanto a cblulas sanas como infectada hacibndolas susceptibles a la lisis mediada por anticuerpos o a la accibn citocida. La infeccibn por T. cruzi durante la fase aguda, estimula una respuesta humoral especifica con altos niveles de anticuerpos del tipo IgM, para incremetarse posteriormente los de las clases IgG e IgA, lo cual orienta para el reconocimietno de las infecciones recientes o crbnicas. Gonzblez- Cappa; Kloetzel J., Katzin; dos Santos, R. (1994) realizaron ensayos in vitro donde observaron que los anticuerpos interactuan con el tripomastigote circulante induciendo su lisis y pueden poseer anticuerpos adheridos a su 29 superficie y ser lisados por accion del complemento, a dembs el parasito puede liberarse de la accibn de anticuerpos por un mecanismo de capping. 9.3 M etodos inm unolbgicos para la deteccion de Trypanosoma cruzi. El serodiagnbstico se utiliza para demostrar la presencia de anticuerpos especificos generados por la infeccibn con T. cruzi, los metodos utilizados son de eleccion principalmente en las fases indeterminada o crbnica. En tbrminos generales, el inmunodiagnostico se raliza con base en dos criterios distintos. 1. Cuando se requiere detectar fbcil y rbpidamente si un individuo infectado, como es el caso del donador o receptor de sangre u brganos asi como en estudios con fines epidemiolbgicos: estas pruebas denominadas de tamizaje, deben de presentar una alta sensibilidad aun cuando la especificidad sea baja. 2. Cuando sea necesaria una deteccibn precisa para la confirmacibn de casos que as! lo requieran con antecedentes clinicos o epidemiolbgicos, en cuyo caso se realizarb una o dos pruebas diferentes a la inicial. Existen pruebas que a travbs del tiempo han demostrado sensibilidades y especificidades adecuadas, con lo cual, a la fecha se busca no solo obtener resultados confiables, si no ademas reproducibles y por ende, comparables en los diferentes centres de diagnbstico e investigacibn, segun menciona Salazar (2006). Cura E. y Wendel S. (1994) escriben que los mbtodos serolbgicos para estos fines, son valorados por su nivel de reactividad; asi, existen aquellos que detectan concentraciones muy bajas de anticuerpos como es el caso del Inmunoensayo enzimbtico (ELISA indirecta); los de reactividad intermedia como la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y la Hemaglutinacibn Indirecta (HAI) y los de baja reactividad como la reaccibn de fijacibn del complemento, los ensayos de agiutinacibn directa o con particulas, asi como los que se realizan en placas de agar, estas ultimas cada vez mas en desuso, algunas por su complejidad tbcnica, 30 otras por su dificultad para el manejo de grandes cantidades de muestras y otras por su diflcil reproducibilidad por el tipo de reactivos empleados. Para el diagnbstico de la enfermedad de Chagas, la OPS/OMS recomienda especialmente el uso de las siguientes pruebas: 1. Hemaglutinacibn Indirecta 2. ELISA indirecta 3. Inmunofluorescencia indirecta En la confirmadon serologica segun la Organizacion Mundial de la Salud se deben emplear dos pruebas tomando en consideration los antigenos empleados, asi como el tipo de anticuerpos que se desean demostrar. Si se realizan dos pruebas simultbneamente IFI/ELISA, IFI/HAI, o ELISA/HAI, la certeza diagnbstica estarb entre el 98 y 99.5%; resultados sbricos con reactividades discordantes deberbn ser sometidos a una tercera evaluation con otra tbcnica y en caso de repetirse la discordancia realizar nuevamente el procedimiento con una nueva muestra. Puede considerarse como normal la variacibn de un titulo entre dos muestras serolbgicas de un mismo individuo, segun Guhl F. & Nicholls S. (2001). En consecuencia, reactividad en una sola prueba serolbgica no constituye un criterio diagnbstico. X. Leishm aniosis Para von Stebut E. (2007) la leishmaniosis es endbmica en mbs de 60 paises en Ambrica Central, Ambrica del Sur, India, el Oriente Medio, el Norte de Africa y el Sur de Europa. Se estima que aproximadamente 12 millones de personas se encuentran infectadas por parbsitos del gbnero Leishmania y cada ano se reportan alrededor de 2 millones de nuevos infectados. Aproximadamente 350 millones de personas viven en zonas de riesgo. Existen 3 formas cllnicas prindpales de leishmaniasis con compromiso cutbneo: la leishmaniasis cutbnea localizada (LCL), la leishmaniasis cutbnea difusa (LCD) y la 31 leishmaniasis mucocutanea (LMC). La LCL se manifiesta como una o multiples pdpulas que aumentan de tamano y que tipicamente se ulceran. Las lesiones se localizan principalmente en las extremidades inferiores y demoran entre 3 y 18 meses para curar en mas del 90 % de los casos. En Mexico la principal especie causal de LCL es L. mexicana. En la LCD ocurre diseminacion de lesiones nodulares cargadas de parasitos en toda la piel. La LCD es causada mas frecuentemente por especies del complejo de la L. mexicana y por L aethiopica. La LMC se caracteriza por inflamaciOn granulomatosa de la mucosa de la nariz, cavidad oral y faringe, que lleva a destruction del tabique nasal y del paladar. Las lesiones mucosas pueden aparecer simultaneamente con un cuadro de LC; sin embargo, lo mas frecuente es que aparezcan despubs. Como los criterios clinicos y epidemiolOgicos s6lo permiten hacer un diagnostic*) probable de la enfermedad, es indispensable la utilization de pruebas de laboratorio para lograr un diagnOstico definitivo. 10.1 Patogenia El lipofosfoglucano (LPG) parasitario es una moiecula compleja de superficie que despliega polimorfismos importantes. Protege a Leishmania del estallido respiratorio mediante el secuestro de aniones superdxido y radicates hidroxilo, la inhibition de una actividad eficaz de la proteina cinasa-C, relevante en el estallido respiratorio. Se ha demostrado, pues, que permite la persistencia del parasito en espacios no liticos dentfo de los neutrOfilos. Otras moleculas, tambien ancladas a la superficie del parasito, glucoinositolfosfolipidos (GIPLs), De Assis RR et al. (2012) estudiaron tambiOn que polimorfismos, inhiben la liberaciOn de NO, entre otras acciones, en modelos animates. 32 Femandez-Figueroa et al. (2012) reportaron un aumento importante de IL-1J3 en lesiones y a nivel sistbmico en pacientes con leishmaniasis cutanea diseminada. Los autores mencionan que la susceptibilidad o resistencia a la enfermedad se ha asociado a variaciones genbticas, especificamente a un polimorfismo en el gene para IL-1J3, con incremento del proceso inflamatorio.. 10.2 Respuesta Inmune Frente a Leishmania mexicana La respuesta inmune ante la infeccibn por Leishmania inicia con la respuesta innata, describen Ruiz JM, Becker I. (2007). Los receptores TLR2 , presentes en macrbfagos, cblulas dendriticas (CO) y cblulas asesinas naturales (NK) reconocen molbculas en la superficie del parbsito, tales como el lipofosfoglicano (LPG) y una glicoproteina de 63kDa (gp63) e inducen la produccibn de citocinas proinflamatohas: TNF-a, IFN-g e IL-12, asi como de ffiolbailas coestiffiUladOras. Los factores del complemento C3b y C3bi se unen al parasito y median la adhesion y posterior fagocitosis a travbs de la unibn de los receptores del complemento CR1 y CR3 presentes en el macrbfago. El macrOfago cubre un papel triple en la enfermedad, mencionan Ruiz JH & Becker I. (2007), ya que es una cblula hospedera, cblula presentadora de antigenos que activan las cblulas T especificas, y celula efectora cuya eficacia leishmanicida depende de la activacibn por parte de las citocinas IFN-g y TNF-a. La respuesta principal a la leishmaniosis es de tipo celular. El progreso de la infeccibn, depende de la dicotomia en el desarrollo de las cblulas T CD4+ hacia las vias Th1 (proteccibn) o Th2 (exacerbacibn). La IL-12 induce la expansibn de clonas Th1, con la elaboracion de diferentes perfiles de citocinas, como IFN-g y TNF-a, que inducen la produccibn de bxido nitrico (NO) en el macrbfago. 33 IL-4 e IL-10 determinan la diferenciacidn hacia donas Th2 (y activacidn polidonal de cdlulas B), y la produccidn de IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 y TGF-b. 10.3 Mdtodos Inmunologicos para el diagnbstico de Leishmania mexicana Ready PD (2010) establece que las p rin cip a ls tdcnicas seroldgicas utilizadas para el diagndstico de la infeccidn por Leishmania son: 1. Prueba de aglutinacidn directa (DAT) 2. Prueba de aglutinacidn rdpida para tamizaje (FAST) 3. Prueba de anticuerpos fluorescentes o inmunofluorescencia indirecta (IFA) 4. Inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) XI. Triquinellosis Los helmintos del g6nero Trichinella son pardsitos de una gran variedad de especieS de malferos, tanto domdsticos como silvestres. Trichinella spiralis se reproduce sexuaimente en la mucosa intestinal, produdendo larvas que forman quistes en musculo dsqueldtico, causando la enfermedad llamada Triquinellosis. La enfermedad es transmitida al hombre por la ingestidn de came cruda o mal cocida de animales que contiene larvas viables. i 11.1 Patogenia i I El efecto patogdnico primario de Trichinella spiralis procede de la destruccidn de las fibras del musculo estriado en las cuales se enquista, durante esta etapa, los sintomas varian seguh la intensidad de la infeccidn. Hay un intenso dolor muscular por lo general llega a su maximo entre los dfas 12- 20. Los musculos suelen volverse hipersensibles a la presidn. Una vasculitis acompafiard a la migracidn de las larvas y es la causa de las hemonragias en astilla y tal vez edema periorbitario. Probablemente algunas manifestaciones neurologicas de la triquinelosis tambien 34 I tienen como causa la vasculitis; tambign se han encontrado granulomas que en ocasiones tienen larvas de Trichinella en cerebros de pacientes que han muerto por la infeccidn. Desde el punto de vista clinico, se presentarg pocas veces lamiocarditis manifiesta. Por lo regular, la muerte por triquinelosis se atribuye a miocarditis, encefalitis o neumonitis. 11.2 Respuesta Inmune frente a Trichinella spiralis Los estudios sobre proteccidn contra la trichinellosis son pocos y solo a nivel experimental, principalmente en modelo murino. Se sabe que los animates que han sufrido de una infeccibn primaria con Trichinella spiralis frente a una reinfeccibn presentan una fuerte respuesta inmune a nivel intestinal eliminando los adultos y preadultosil-3 Las cglulas capaces de transferir inmunidad en una infeccibn primaria son los linfocitos T, los cuales aparecen tempranamente en los ganglios linfgticos mesentgricos, pero desaparecen una vez que los pargsitos intestinales son expulsados. Asi mismo aunque los linfocitos T son los que principalmente se encuentra'n involucrados en la protecciOn, fracciones enriquecidas con linfocitos B son capaces de transferir inmunidad, reflejgndose bsta en una disminucibn en la fecundidad de la hembra. Estudios posteriores se han encaminado a la purificacibn de antigenos de secrecibn-excrecidn y de superficie de los diferentes estadios del ciclo de vida del pargsito, los antigenos que principalmente se han empleado son los de Larva infectante (LI), ya que son relativamente fgcil de obtener de musculos infectados con T. spiralis, y por otro lado es el estadio mgs inmunoggnico. Se ha observado que los antigenos de secrecion-excrecibn de 48 y 50/55 kDa purificados, obtenidos de LI son los predominantes en los ensayos de proteccion, pero el efecto aparentemente se produce sobre los adultos disminuyendo la fecundidad de las hembras. Aparentemente la respuesta inmune se ejerce sobre 35 los adultos; sin embargo estos antigenos se expresan unicamente en larvas en desarrollo. 11.3 Metodos Inmunoldgicos para la deteccidn de Trichinella spiralis Es casi evidente al analizar los sfntomas cltnicos y antecedentes, auqnue debe de confitmarse por pruebas de laboratorio. Las pruebas serologicas utilizadas en la deteccidn de Trichinella spiralis son: 1. La Floculacion de la Bentonita 2. ELISA XII. Toxoplasm osis La toxoplasmosis es una enfermedad parasitaria producida por el agente etioldgico Toxoplasma gondii cuyo nombre gendrico se deriva del griego: toxon que significa arco, haciendo referenda a la forma que tiene el pardsito. El tdrmino especffico procede del tipo de hospedero donde Nicolle y Menceux lo encontraron en 1908 por primera vez, cuenta Tay (2002). Pero fue hasta los aftos de 1927 a 1942 cuando Olff y cols., demostraron progresivamente que Toxoplasma causa meningoencefalitis en el reden nacido y que la via transplacentaria es uno de los mecanismos de transmisidn a traves del cual el pardsito pasa de la madre al producto. Durante 1950-1970 se estudiaron diversos aspectos de la tocoplasmosis como mecanismos de transmicion, diagndstico y tratamiento, pero fue a partir de 1969 cando se empezd a conocer lo que aparentemente es el d d o bioldgico completo de este protozoo, gradas a los trabajos que simultdneamente llevaron a cabo varios investigadores. 36 12.1 Patogenia T. gondii invade cualquier ceiula de los tejidos humanos, con excepcidn de los eritrodtos, ayudado por una enzima cuya caracterizacidn quimica no se ha predsado pero a la que se le denomina “factor facilitador de la penetracidn”. La liberaddn del paresito de la c6lula hospedadora propicia la invasidn a otras celulas y diseminaddn por via hemategena. El hecho de que la infecdOn por este parasito de manifestadones dinicas mas severas en nifios y que se halla demostrado mayor resistencia en animates adultos cuando se les inocUla el parasito, permite afirmar que la edad es uno de los factores importantes en la patogenia. Es de suponerse tambten que los linfodtos del timo tienen un papel destacado en la inmunidad contra este parasito, ya que los anticuerpos matemos no protegen al producto. De acuerdo con Frenkel, las lesiones tisulanes en la toxoplasmosis son de las siguientes modalidades: 1. ReacdOh inflamatoria por la destrucdOn de las celulas parasitadas. Espedalmente intensa durante la fase proliferativa del parasito y en tejidos donde no hay regeneraciOn celular y la espedalidad fundonal es alta como en ojo y cerebro. Esta reacciOn esta constituida por linfodtos, monocitos, polimorfonucleares y a veces celulas plasmaticas. 2. Necrosis tisular por la ruptura delos quistes en fase crOnica. Aunque los parasites son destruidos, hay necrosis de las celulas adyacentes como resultado y de fenomenos de hipersensibilidad. Las lesiones la sintomatologia son mayores mientras mas grande es el numero de paresitosque se liberan al romperse los quistes, pero en todos los casos la retina es el drgano mas afectado. 3. Infarto y necrosis. Se presenta por la afectaddn de los vasos sanguineos vecinos a una lesibn parenquimatosa. 37 4. Necrosis periacueductal y periventricular. El parOsito entra a ventriculos a partir de las lesiones parenquimatosas, afecta las cOlulas ependimarias y subependimarias. Hay reaction inflamatoria y form ation de pequefias ulcerasque pueden obstruir el acueducto de Silvio. 12.2 Respuesta Inmune frente a Toxoplasma gondii Boothroyd JC, Dubremetz JF. (2008) menciona que el desarrollo de una fuerte respuesta inmune celular Th1 es primordial en el control de la infection por T. gondii, con la production de tito tin a s proinflamatorias que incluyen IL-12, IFN-g y TNF-a. Durante la fase initial de la infection, los neutrOfilos, macrOfagos y cOlulas asesinas naturales (NK) constituyen la principal respuesta del hospedero, mediante la fagotitosis, toxicidad celular y la production de IFN-g por las NK. Los macrOfagos y cOlulas dendriticas presentan los antigenos a las cOlulas CD4+ y CD8+, elititando una repuesta tipo Th1 mediante la secretion de IL-12. El TNF-a y el Oxido nitrico (NO) producidos por los macrOfagos incrementan la destruction del parOsito. Cuando el parOsito es controlado, la respuesta es controlada mediante IL-10 y el TGF-B, que modulan la importante respuesta inflamatoria debida a la respuesta Th1. En sujetos en los que predomina la respuesta Th2, no se bloquea la replication parasitaria. La patogenia de la enfermedad se asotia a una replication no limitada y a una continua destruction de cOlulas parasitadas. 12.3 MOtodos InmunolOgicos para la deteccidn de Toxoplasma gondii Las pruebas utilizadas en el diagnOstico de infection por T. gondii son: 38 1. Reaction de Hemaglutinacibn Indirecta 2. Reaction de Inmunofluorescencia 3. Mbtodo de ELISA. XIII. Entam ebosis La amibiasis se define como la infection producida por Entamoeba histolytica, parbsito protozoo cosmopolita incluido tradicionalmente en el Phylum Sarcomastigophora. Ximbnez C, Cerritos R, Rojas L, Dolabella S, Morbn P, Shibayama M, Gonzblez E, Valadez A.Hembndez E, Valenzuela O, Limbn A, & Partida O,Silva EF (2010). En su estudio mentionan que en Mexico, la amibiasis se encuentra entre las primeras 20 causas de morbilidad. Una proportion de personas infectadas desarroilan la enfermedad invasiva, a nivel intestinal (ej. colitis intestinal) o extraintestinal (ej. absceso hepbtico) atribuibles a E. histolytica. Es de importaneia eontar con los nuevos procedimientbs de diagnbstico, printipalm ente en paises en desarrollo, los mbs afectados debido a conditiones defitientes de higiene, contaminacibn fecal y hatinamiento, para reevaluar la morbi-mortalidad de la amibiasis. 13.1 Patogenia Una vez concretado el desenquistamiento, E. histolytica tiene el potential de feproducirse en el moco que recubre el intestine grueso mediante divisibn binaria de los trofozoltos. Algunos parbsitos serbn eliminados con este moco en la forma de trofozoitos y/o quisles y otros aleanzarbn las ceiulas del epitelio, las cuaies serbn destruidas, fagocitadas. La lesibn tipica que que se produce son ulceras extendidas, eh "cliello de bOtella" defiriidas por la extenSibn lateral de E. histolytica 39 sobre la lamina basal. Si dicha Ibmina es penetrada, la invasibn a torrente sanguineo determinant la diseminacibn del parbsito a otros brganos, principalmente a higado, en la forma de abscesos, y con muchlsima menor frecuencia a pulmones, cerebro y otros tejidos. Ante una perforacibn, los trofozoftos tambibn pueden propagarse a tejidos contigiios. E. histolytica tiene una amplia gama de factores, cuyo objetivo es la adhesibn, dafio a la membrana celular, lisis, fagocitosis y digestibn de las cblulas ingeridas, con los fines ultimos de la reproduccibn y supervivencia. • La lectina galactosa/N-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc, 260 kDa) estb involucrada en el proceso de adhesibn a mucinas, eritrocitos, neutrbfilos, bacterias y cblulas epiteliales. • La adhesibn es rbpidamente seguida por la muerte celular, siendo la causa al menos uno de dos procesos: la permeabilizacibn por pbptidos formadores de poros (amebaporos) y la induccibn de apoptosis. • La induccibn de apoptosis por la via 3-caspasa. Los trofozoitos remueven cblulas apoptbticas opsonizadas y necrbticas, asi como bacterias y eritrocitos, los cuales pueden ser utilizados como fuente de hierro. • Proteasas: Las cisteinproteasas, muy abundantes (inicialmente 20, ahora se han identificado 50 genes) han demostrado tener un papel importante en la invasibn, degradacion de la mucina, digestibn del material fagocitado y el proceso inflamatorio in vitro. Los trofozoitos deficientes de bstas son menos virulentos. Tambien degradan las anafilotoxinas del complemento C3a y C5a, IgA secretora y la IgG sbrica. Existen estudios experimentales que involucran a una colagenasa y fosfolipasas como factores de virulencia. • La fagocitosis de cblulas, una vez desprendidas bstas de las proteinas de la matriz extracelular. 40 • Las cblulas epiteliales reaccionan produciendo citocinas con efectos multiples, entre ellos la induccibn de una importante reaccion inflamatoria. Los neutrbfilos no eliminan a los trofozoitos, y contribuyen en el dark) tisular y la dianrea mediante la liberacion de sus grbnulos citotbxicos. Ralston KS, Petri Jr WA. (2011) dice que los parbsitos, adembs, son capaces de inducir la produccibn y activacibn de citocinas de lineas celulares derivadas del intestino. 13.2 Respuesta Inmune frente a Entamoeba histolytica Tay (2002) menciona a la inmunidad humoral que despubs del septimo dia de desarrollo de un AHA aparecen en el suero titulos elevados de anticuerpos antiamibas, los cuales persisten hasta por diez afios. El papel protector de dichos anticuerpos se pone en entredicho debido a que el AHA sigue su curso, a pesar de que como es sabido los anticuerpos anti-lectina son capaces de inhibir la adherencia de las amibas in vitro. Por otro lado el suero de individuos testigos e infectados (con altos titulos de anticuerpos anti-amiba) es capaz de lisar trofozoitos de cepas no virulentas in vitro, por activacibn del complemento en cualquiera de sus dos vias, clbsica o altema .Sin embargo, las cepas virulentas de E. histolytica son resistentes a la lisis mediada por el complemento. Por otro lado al parecer la inmunidad celular desempefia un papel protector importante en la amibiasis como lo sugieren las respuestas celulares obtenidas en modelos animates; la depresibn de estas respuestas resultb en un incremento de la invasividad . Debe notarse que durante la fase aguda del AHA, puede ocurrir una depresibn transitoria de: a) la respuesta inmune celular medida por hipersensibilidad de tipo tardio hacia ciertos antigenos amibianos, b) el numero de linfocitos T y c) la produccibn del factor inhibidor de la migracibn (MIF). 41 En relacidn a los linfocitos T, se ha observado que los pacientes con AHA tienen una relacibn T4/T8 menor a los individuos sanos, pero una vez que se curan, los niveles de linfocitos T4 se restablecen, asi como sus respuestas celulares contra la E. histolytica in vitro. 13.3 M6todos lnmunol6gicos para la Deteccidn de Entamebosis Las pruebas inmunotegicas utilizadas cuando se sospecha de amibiasis intestinal invasiva o extraintestinal son las siguientes: 1. ELISA 2. Contrainmunoelectroforesis 3. Inmunofluorescencia indirecta XIV. Plasm odiosis Es una parasitosis caracterizada por periodos febriles tipicos de acuerdo a la especie de Plasmodium infectante, precedidos por escalofrio intenso que terminan con diaforesis. Cursa con hepatoesplenomegalia y anemia que varia de leve a grave. Aunque generalmente el paludismo es un proceso agudo, a menudo puede tener una evolucibn crbnica. 14.1 Patogenia El paroxismo paludico es desencadenado por la liberacibn de metabolites contenidos en el eritrocito parasitado cuando ocurre su lisis. Estos metabolites al ponerse en contacto con lo sneutrofilos, los hacen liberar una lipoproteina que actua sobre el centro termorregulador del hipotelamo. La hepatomegalia y esplenomegalia obedecen a la hiperplasia compensadora de estas vlsceras debido al incremento de la destruction y fagocitosis de cblulas sanguineas parasitadas o no; a este mismo mecanismo se debe tambten la anemia, asi como el agotamiento de las reservas de hierro del organismo. 42 14.2 Respuesta Inmune frente a Plasmodium La producci6n de anticuerpos es un componente importante de la respuesta inmune a plasmodio. La infeccibn por el plasmodio induce un aumento en la sintesis de anticuerpos, particularmente de IgM e IgG en relacidn a la de IgA. Los antigenos derivados del parbsito activan policlonalmente a los linfocitos T, los cuales producen factores que promueven la diferenciadbn de las cblulas B en cblulas plasmbticas productoras de anticuerpos. S6lo una pequefia porci6n del total de los anticuerpos que se producen (6-11%) es especifica para antigenos del plasmodio, mientras que la inmensa mayoria de los anticuerpos no reaccionan con el parbsit. Es probable que la sintesis policlonal de anticuerpos sea parcialmente responsable de la presencia de autoanticuerpos en humanos y animales infectados con plasmodio, aunque se han sugerido otras posibles causas para explicar la generacibn de anticuerpos autorreactivos incluyendo: a) modificacibn de antigenos propios por accibn enzimbtica del parbsito, o por unibn de antigenos solubles a las cblulas; b) reactividad cruzada entre antigenos del plasmodio y antigenos del hubsped y; c)inducci6n de la actividad supresora. Tambien se han detectado anticuerpos dirigidos contra eritrocitos normales, linfocitos, macrbfagos, globulinas sbricas, corazbn, tiroides, factores nucleares y una gran variedad de proteinas intracelulares. Otro detalle importante es que los anticuerpos antieritrocito pudieran estar involucrados en la anemia asodada a malaria, dado que el grado de anemia no corresponde a la ocasionada por la ruptura de eritrodtos parasitados. El papel que tienen estos anticuerpos no estb daro, aunque se les ha asodado con la inmunopatologia. Durante el curso de la infeccibn por el plasmodio, se desarrollan anticuerpos especificos al parbsito con la misma cinbtica con la que se generan los anticuerpos inespecificos. Los anticuerpos especificos se incrementan 43 rapidamente y se pueden detectar a los pocos dias despues de que los parbsitos aparecen en sangre utilizando ciertas tecnicas de laboratorio. El aumento en el titulo se debe a la slntesis de IgG, IgM e IgA, mientras que IgD e IgE permanecen prbcticamente sin cambio. En los humanos la concentracibn de anticuerpos disminuye rapidamente despubs de la recuperacibn de la infeccibn; tambibn se ha observado la disminudbn de los tltulos de anticuerpos en individuos inmunes que se trasladan a areas donde no hay malaria. Martha Legorreta-Herrera & Pedro Sbnchez-Cruz (1998) describen que la inmunidad al plasmodio al parecer es especifica de especie y de estadio, no obstante, una enorme proporcion de anticuerpos producida por el huasped reconoce antigenos compartidos por diferentes especies y estadios del parasito. Esto correladona con la gran cantidad de anticuerpos no especificos que probablemente estan dirigidos contra metabolitos, productos de degradacibn o constituyentes del parasito, los cuales no representan blancos para la inmunidad humoral. 14.4 Diagnostico Inmunolbgico para la deteccidn de Plasmodium La prueba de eleccibn para el diagnbstico serolbgico lo constituyen: 1. Inmunofluorescencia Indirecta 2. Hemaglutinacibn Indirecta XV. Fasciolosis Fasciolosis es una zoonosis causada por el trematodo Fasciola hepatica, que afecta a animates vertebrados herbivoros (vacas, ovejas, cabras, entre otros) y a humanos. La infeccibn se adquiere debido a la ingesta de vegetales acubticos crudos o agua contaminados con metacercarias, la forma infectante. 44 Beltran-Fabian M, Munoz-Zambrano E, Del Pozo-L6pez F (2011) describen que se caracteriza por signos y sintomas relacionados con la obstrucddn biliar (parcial o completa en casos mas severos) y el grado de inflamacion: dolor abdominal, nduseas, vomito, anorexia, hepatomegalia blanda, fiebre, un cuadro similar al de una colecistitis cronica agudizada. La ictericia se hace evidente ante una obstruccidn completa, que requiere de cirugia o Sndoscopia de urgencia. 15.1 Patogenia El desarrollo de la infeccidn en el huSsped definitivo puede dividirse en dos fases: la fase paremquimal (o migratoria) y la fase biliar. La fase parenquimal comienza los gusanos jovenes recien desenquistados penetran la pared del intestino, tras lo cual migran por la cavidad abdominal y penetran en el hlgado u otros drganos; F. hepatica muestra una gran predileccidn por los tejidos hep£ticos. Ocasionalmente se dan localizaciones ectdpicas en los pulmones, diafragma, pared intestinal, rifiones o tejidos subcutdneos. Durante la migracidn los gusanos destruyen los tejidos y aparece inflamacidn alrededor del recorrido migratorio. La segunda fase o fase biliar, comienza cuando los parasitos entran en los conductos biliares del higado. A lii maduran los gusanos alimentendose de sangre y comienzan a producir huevos. Como resultado del dafio en los tejidos se obstruyen los conductos biliares, que se hipertrofian. 15.2 Respuesta Immune Frente a Fasciola hepatica El sistema inmune est£ regulado por el balance de las citoquinas secretadas por los linfocitos y macrofagos. Se ha propuesto una division funcional de los linfocitos T colaboradores (T-Co) CD4 +:a) la subpoblacidn Tco-1 secreta interleucina (IL) 1 (IL-1), IL-2 e interferdn gamma (IF-y), estimuladores de la inmunidad celular; b) la subpoblacidn Tco-2, en cambio, seaeta IL-4, IL-5 e IL-10 e induce la slntesis de 45 inmunoglobulinas (Ig) especificas, incluso la IgE y promueve la eosinofilia. Se sabe que los granos de los eosinbfilos descargados sobre la membrana de la Fasciola tienen efecto parasiticida. Se sabe que la IL-12, junto con los antigenos parasitarios, propicia la sintesis del IF-y. In vivo, los eosinbfilos tienen efecto citotdxico, mediado principalmente por la IgE y la lgG-2, especifico contra la Fasciola; en los humanos se ha observado disminucion progresiva de la IgG e IgA antiparasitaria en los enfermos curados. 15.3 Diagndstico Inmunoldgico de Fasciola hepatica Para fa Fase inicial (migracibn, aguda) las pruebas serolbgicas empleadas son las siguientes: 1. Hemaglutinacibn indirecta 2. ELISA 3. Inmunofluorescencia indirecta. XVI. Paragonim osis La paragonimosis es una enfermedad causada por diferentes especies de trematodos del genera Paragonimus. Paragonimus requiere de 2 hospederos intermediaries, un molusco y un crustbceo de agua dulce antes de instalarse en hospederos definitivos, el humano y una amplia variedad de mamiferos dombsticos y silvestres. 16.1 Patogenia Luego de ser ingeridas por el hombre las metacercarias son liberadas en el intestine delgado, donde atraviesan la mucosa intestinal e invaden la cavidad peritoneal, donde se trasforman en formas juveniles; este proceso tarda aproximadamente 2 a 6 horas posterior a la ingestibn, pueden migrar hacia los 46 musculos de la pared abdominal, donde permanecen varios dias y luego ingresan nuevamente a la cavidad peritoneal,migrando hacia la cavidad pleural a travbs del diafragma, y finalmente invaden el parbnquima pulmonar ubicbndose en la zonas peribronquiales donde en un lapso de 6 semanas, se trasforman en gusanos adultos, adquiriendo formas quisticas solidas, las cuales son formadas por la interaccidn con el sistema inmune del hospedero y la accidn proteolitica de metabolites del verme. En algunas ocasiones, se ubican en la cavidad pleural generando lesiones pleurales persistentes, pero esta migracidn falla cuando son incapaces 16.2 Diagn6stico Inmunolbgico de Paragonimus Para William R. Cornejo, Pilar F. Alva, Carlos R. Sevilla, Alina F. Huiza (2012) el diagndstico integral incluye mbtodos inmunoldgicos tales como: 1. Contrainmunoelectroforesis (CIEF) cuya sensibilidad y especificidad es de hasta 99%. 2. ELISA XVII. Hidatidosis Es una zoonosis cosmopolita, reportada con mayor frecuencia en Europa, Asia, Africa, America del Sur, Canada, Australia y Nueva Zelanda. Los agentes etiolbgicos son las formas larvarias de especies del cestodo Echinococcus. En Mexico, la informacidn sobre la hidatidosis es muy limitada. Los gbneros Echinococcus granulosus y Echinococcus multilocularis, agentes causales de la echinococosis quistica y echinococosis alveolar, respectjvamente, son los mbs importantes desde el punto de vista de salud publica y por su distribucibn geogrbfica e impacto economico a nivel mundial. 47 Existe gran variabilidad gendtica. Incluye actualmente 10 genotipos (G1-G3, G 6-9 y G10), y otras especies. La taxonomla aun se encuentra en revisidn. Perros y otros cdnidos son los hospederos definitivos en la mayor parte menciona Nakao et al., (2010). 17.1 Patogenia Tay (2002) describe que ei quiste hidatidico o hiddtide es una esfera o vesicula de tamafio variable, llena de un liquido incoloro y transparente. Presenta un continente o pared y un contenido. Continente o pared. Estd formado por dos capas adosadas de caracterlsticas morfologicas e histoquimicas especiales. - La albuginea, es una lamina delgada de 1- 2 pm, blanquecina, opaca, eldstica pero muy frdgil. Si bien permite el transporte osmdtico de muchas sustancias coloides y cristaloides, es impermeable a las bacterias y algunos farmacos. Esta formada por laminas concdntricas y su composicidn qulmica es semejante a la quitina y es PAS positiva. - La membrana germinativa o proligera reviste el interior de la albuginea y son conocidas en su conjunto como el endoquiste. Es una capa delgada que mide 15 a 20 pm de espesor, de color amarillento y de aspecto finamente granular. De ella nacen, se nutren y se liberan los escdlex. Porciones rotas de la membrana germinativa son capaces de quedar encerradas en pequeftas esferas que formardn quistes hijos; los restos no vitales generardn la arenilla hidatldica. Este fendmeno de vesiculacidn puede ocurrir tambien por la cara externa del quiste (vesiculacidn externa), siendo el responsable de la recidiva del quiste. Desde el punto de vista histoldgico es una masa de aspecto sincisial con numerosos nucleos, muy rica en glucdgeno. Contenido de la hidatide. Posee en su interior liquido y elementos figurados. 48 -Liquido hidatidico. Es producto del metabolismo del parbsito, casi transparente, agua de roca. Penmite el intercambio de nutrientes con el hubsped, y le da la caracterlstica semiolbgica a la enfermedad hidatldica. La acumulacibn progresiva de liquido hidatidico, que es una respuesta biolbgica al aumento de la poblacibn de esc6lex, hace aumentar su presibn hasta 100 cm de agua, y es el indicador unico mbs confiable de la vitalidad global del quiste, ya que los quistes de crecimiento activo se palpan tensos mientras que los quistes rotos recientemente, en degeneracibn o muertos se palpan blandos. Esto es utilizado como marcador intraoperatorio de la vitalidad del quiste. Su densidad es de 1.007 a 1.012 y el pH de 7,4. El 98% corresponde a agua que contiene cloruro de sodio, urea, bcido urico y vestigios de albuminas y grasas. Este liquido posee propiedades antigbnicas. - Elementos figurados. Corresponden a elementos microscbpicos (veslculas prollgeras, escblices y ganchitos) y macroscbpicos (veslculas hijas). Veslculas prollgeras. Se forman por yemacibn de la membrana germinativa hacia el interior del quiste, las cuales al crecer forman pequeftas veslculas unidas por frbgiles pedlculos a la prollgera. Miden 250 a 500 pm de dibmetro y cada una suele contener 30 a 40 escblices. Al romperse estas veslculas liberan su contenido, que formarb lo que se conoce como arenilla hidatldica, que vista al microscopio aparece compuesta por veslculas prollgeras, escblices y ganchitos. Se calcula que un ml de arenilla corresponde a 400.000 escblices. Becerril (2008) describe a los escblices (protoescblices) como estructuras ovoideas de unas 200 pm de dibmetro. En condiciones favorables los escblices se invaginan presentando las cuatro ventosas y la doble corona de ganchitos. Los escblices viables ricos en glucbgeno son llamados ortoescblices y los no viables, pobres en glucbgeno que rbpidamente se alteran y dejan libres sus ganchitos son los metaescblices. Los escblex son los responsables de todas las manifestaciones cllnicas de la equinococosis, incluyendo la recurrencia despubs de la 49 contaminaci6n local, ya que son mbviles y fuertes, tienen funciones respiratorias pero no ingieren materia particulada. Crecen en su alojamiento de la membrana laminada, flotando y multiplicSndose en el medio Ifquido. Al ser liberados en el interior del quiste hidatidico, se pueden implantar sobre casi cualquier superficie tisular del organismo, de preferencia serosas, generalmente no sobre epitelios escamosos; y vuelven asi a crear un nuevo quiste hidatidico. Se conoce como acefaloquistes o quistes esteriles a las hid£tides que no forman vesiculas hijas ni escClices. Ganchitos. Son formaciones de 30 pm de longitud. Forman parte de la arenilla hidatidica y son de utilidad en el diagndstico microscdpico de la hidatidosis. Vesiculas hijas. Tienen la misma estructura que la hid&tide madre, albuginea y germinativa, y si bien son capaces de reproducirse, la mayon'a son infertiles. Pueden ser enddgenas o exbgenas, segun logren desarrollarse hacia el interior o el exterior del quiste. Suelen aparecer en quistes de larga evolucidn (infrecuentes en pacientes pedtetricos). El numero de vesiculas hijas por hid£tide es variable y su tamafio puede llegar hasta 30 pm. 17.2 Respuesta Inmune frente a Echinococcus granulosus La primera respuesta del tejido invadido es intentar destruir el huevo por medio de mecanismos inflamatorios; si no es posible, la economia intentar^ cubrirlo con una pared de tejido fibroso (adventicia, periquistica o ectoquiste) que por un lado aisla al par£sito y por otra le sirve de soporte mec^nico. El pardsito empieza a su vez a formar a su alrededor un cierre esferico de material quitinoso inerte con vacuolizacidn central y se establece asi la primera fase de un quiste viable. En los meses y afios siguientes el quiste crecer£ alrededor de 1 cm por afio, obligando lentamente al hu6sped a la entrega forzada de espacio orgdnico. La calcificacidn de la adventicia es un fenPmeno tardio, que ocurre por degeneracibn y suele verse en el 10% de las lesiones hepSticas, siendo muy excepcional en las pulmonares. 50 17.3 Diagn6stico Inmunologico para Echinococcus granulosus Para Amalia Raquel Ramirez, Beatriz Vanesa Roa, Juan Francisco Tagle (2006) el diagnbstico de la echinococosis qulstica se basa en los antecedentes epidemiolbgicos, los hallazgos clinicos, y serologla. Las pruebas inmunolbgicas utilizadas son: 1. Inmunoelectroforesis 2. Aglutinacibn de partlculas de latex 3. HemoaglutinaciOn indirecta 4. Inmunofluorescencia indirecta 5. ELISA XVIII. Cisticercosis La cisticercosis es una parasitosis de humanos y cerdos causada por el metacestodo de Taenia solium, el cual presenta el escolex del parbsito adulto invaginado en una veslcula, tambian llamado Cysticercus cellulosae. La infeccibn se adquiere al ingerir huevos o proglbtidos gravidos del cestodo, eliminados con las heces fecales del humano infectado con Taenia solium, el hospedero definitivo y principal factor de riesgo. Las oncosferas se liberan en intestino delgado, invaden la pared intestinal y migran a musculo estriado, SNC, ojos, tejido graso subcutbneo y corazbn, y otros tejidos, en donde se desarrollan los cisticercos, produciendo diversas patologlas. La invasibn a sistema nervioso central (SNC) da lugar a la neurocisticercosis (NC), un problema de salud publica en palses en desanrollo. 18.1 Patogenia Garcia HH, Gonzalez AE, Evans CAW, Gilman RH (2003) mencionan que los cisticercos deben sobrevivir en los brganos del hospedador durante semanas o 51 meses para poder completar su ciclo vital. Para ello tienen mecanismos de evasidn de la inmunidad del hospedador (mimetismo molecular, depresiPn de la inmunidad celular, etc.) y en el caso de la NCC, la barrera hematoencef£lica. Aunque los cisticercos maduren en unaS semanas, pueden pasar afios (incluso m^s de 10) desde la exposiddn a los slntomas. Estos aparecen tras la muerte del cisticerco o el fallo de los mecanismos de evasidn de la inmunidad del hospedador, con la consiguiente reaccidn inflamatoria. El cisticerco pasa por 4 estadios diferentes en su ciclo vital: 1. Estadio vesicular: minima inflamaciPn asociada. 2. Estadio vesicular-coloidal: muerte del pardsito o pprdida de la habilidad de controlar la inmunidad del hospedador. Las cPIulas inflamatorias infiltran y rodean la pared del quiste, por lo que los sintomas aparecen con m£s frecuencia en este estadio. 3. Estadio granular-nodular: colapso de la cavidad del cisticerco, por la fibrosis. 4. Estadio calcificado: nPdulo calcificado. 18.3 M6todos Inmunologicos para la deteccion de Cistycerccus cellulosae La identification de anticuerpos especificos y antigenos se utiliza actualmente para apoyar el diagndstico de neurocisticercosis, debido a su especificidad y sensibilidad limitadas. Inmunodiagnostico: Deteccion de anticuerpos (ELISA, EIBT, western blot). Deckers, Domy.( 2010). Una de las pruebas diagndsticas mejor caracterizadas es el ensayo de inmunoelectrotransferencia (Western Blot) con una especificidad y sensibilidad del 99% desarrollado por el CDC. 52 XIX. Onchocercosis La oncocercosis es una parasitosis del hombre causada por Onchocerca volvulus que afecta la piel y ojos, llegando a producir ceguera. El pardsito es transmitido por varias especies de insectos hematdfagos del gdnero Simulium en amplias zonas subtropicales del Africa occidental y en reducidas areas en el Yemen y America Central. En Mexico, se encuentran 3 focos enddmicos, Oaxaca y Norte de Chiapas, en los que se considera que la transmisidn ha sido "eliminadaH, y un tercerfoco, en el Sur de Chiapas, que cubre actualmente los criterios para que se considere la "transmisidn interrumpida" de acuerdo a Rodriguez-Perez et al., (2013) 19.1 Patogenia Los adultos y las microfilarias causan dafio en el hospedador vertebrado al ejercer accidn mecanica, bioquimica e inmunoldgica. La movilidad de las Mf a travds de los tejidos dermicos y oculares, la respuesta inflamatoria y los elementos efectores de la respuesta inmune adaptativa, son los factores que originan el cuadro clinico. El primero es un mecanismo inflamatorio alrededor de los tejidos donde se encuentran los adultos formando nddulos subcutdneos que provocan una intensa reaccion inflamatoria que evoiuciona a la esclerosis. El dafio fundamental y todas las consecuencias de la oncocercosis se producen por la muerte y destruccidn de las microfilarias en la piel y los ojos, acompafidndose de procesos inflamatorios derivados de la respuesta inmune. Las proteinas liberadas por las Mf destruidas sensibilizan al paciente, , la cual se manifiesta con una dermatitis muy pruriginosa asociada a una despigmentaddn de la piel denominada sama filariasica. Los antigenos de la larva infestante parecen inducir una respuesta humoral y celular. Se han identificado complejos inmunes circulantes implicados en la respuesta inflamatoria ante la infeccidn. 53 Las lesiones mas severas se producer) en el ojo a nivel de ia cornea donde hay pequefios depositos de material blanquecino que se observan como pequefios puntos blancos denominada queratitis puntata. Estas zonas hacen que la cornea se opacifique y obstaculicen el paso de la luz, produciendo ceguera. Las Mf se pueden encontrar en el humor vitreo y en el acuoso y afectan las regiones anterior y posterior de ambos ojos. 19.2 Respuesta Inmune frente a Onchocerca volvulus La inmunidad elicitada contra Onchocerca es compleja. Existen mecanismos de tipo Th2 dirigidos a la proteccidn contra larvas L3 y Mf y se tiene evidencia de que tanto las vlas Th1 y Th2 estdn involucradas en la resistencia ante los gusanos adultos. La sobrevivencia de las filarias adultas depende en gran medida de la induccidn de una respuesta reguladora. Inmunidad protectora: La respuesta inmunoldgica define varios grupos de individuos. En uno, hi el pardSito hi la enfermedad se desarrollan (inmunidad protectora); en otro, el parasito se desarrolla, la carga parasitaria varia entre baja y alta, y la enfermedad es leve o moderada, sugiriendo una intervencidn inmunoldgica reguladora (inmunidad concomitante). De acuerdo a G6mez Alberto, Ruenes Teresa,& Uribarren Teresa (2013) Existen algunos individuos en los que, no obstante que el par&sito se desarrolla, la respuesta inmunoldgica es exacerbada, Io que origina una muy baja carga parasitaria, pero un dafio cutaneo considerable (respuesta hiperreactiva o Sowda). 19.4 Diagnostico Inmunoldgico para Onchocerca volvulus Se utilizan diversos procedimientos para detectar lgG4 en pruebas inmunoenzimaticas, entre ellos ELISA es la prueba de predileccidn. 54 XX. Conclusiones Gracias a los avarices en las tecnicas inmunoldgicas despu6s del descubrimiento de los anticuerpos monoclonales se han podido confirmar las diferentes parasitosis de las cuales se sospechaba debido al cuadro clinico que el paciente presentaba. Las metodologias utilizadas en el diagndstico de las infecdones parasitarias evitan tecnicas de las cuales se requiere de mucho entrenamiento y que a veces son subjetivas como en el caso del examen Coproparasitoscopico. Ademas que no siempre son confiables en caso de una parasitosis ubicada en un organo o en sangre periferica ya que los parasites no son excretados mediante materia fecal. El Quimico Clinico tiene que poseer los conocimientos necesarios para cada prueba, asi mismo valores de sensibilidad, especificidad y reactividad, y cu£l es la prueba de prediieccidn en cada caso. Las desventajas que tienen estas metodologias es que solo se llegan a realizar en laboratories especializados o de investigacidn, y que en su mayoria son para fines estadisticos. Ademas que los costos son elevados como para establecerse examen de rutina en un laboratorio clinico normal. Finalmente, no hay una metodologia estandarizada para la identificacidn de cada par£sito del que se sospeche, cualquiera que fuera la metodologia empleada, se debe de complementar con la clinica, y otros recursos que el medico considere pertinente. 55 XXL Referencias Becerril Flores, Marco Antonio. (2008) Parasitologfa Mddica. Segunda Edicibn. Editorial Me Graw Hill. Mdxico, D.F. Mbxico. Becerril Flores, Marco Antonio; Romero Cabello, Raul. (2005) Parasitologla Mbdica de las Moleculas a la Enfermedad. Editorial Me Graw Hill. M6xico,D.F., Mexico. Bhattarai R, Budke CM, Carabin H, Proano JV, Flores-Rivera J, Corona T, Ivanek R, Snowden KF, Flisser A (2012). 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