SUSCEPTIBILIDAD "IN VITRO" DE CEPAS DE

Rev. Inst. Med. trop. São Paulo
31 (5): 346-350, setembro-outubro,
1989
SUSCEPTIBILIDAD "IN VITRO" DE CEPAS DE Cryptococcus A 5 DROGAS ANTIFÚNGICAS
A. J .B A V A & R. N E G R O N I
(1)
RESUMEN
S e e s t u d i ó l a s u s c e p t i b i l i d a d " i n v i t r o " d e 24 c e p a s d e 3 e s p é c i e s d e l g é n e r o
Cryptococcus a 5 drogas antifúngicas (anfotericina B , 5 fluorocitosina, ketoconazol,
i t r a c o n a z o l y m i c o n a z o l ) . L a s m i s m a s se a g r u p a r o n s e g ú n s u e s p é c i e , v a r i e d a d y
origen de aislamiento.
P a r a determinar l a c o n c e n t r a c i ó n i n h i b i t o r i a m í n i m a (C.I.M.) de c a d a d r o g a
se e m p l e ó e l m é t o d o d e d i l u c i ó n e n a g a r c o n e l m e d i o b á s i c o n i t r o g e n a d o p a r a
l e v a d u r a s , a d i c i o n a d o d e g l u c o s a . S e o b t u v o a d e m á s l a m e d i a g e o m é t r i c a de e s t o s
v a l o r e s p a r a c a d a g r u p o y se c o m p a r o c a d a u n o de ellos.
L o s r e s u l t a d o s obtenidos fueron h o m o g ê n e o s c o n l a s o l a e x c e p c i ó n de las c e p a s
de C r y p t o c o c c u s s p (no n e o f o r m a n s ) , en I a s c u a l e s se d e t e c t a r o n e l e v a d o s v a l o r e s
de C . I . M . p a r a l a 5
fluorocitosina.
U N I T E R M O S : Cryptococcus; Drogas antifúngicas; Susceptibilidad "in vitro".
INTRODUCCIÓN
L a c r i p t o c o c o s i s es u n a m i c o s i s s i s t ê m i c a
E n t r e Ias c a r a c t e r í s t i c a s salientes de esta úl
c u y o a g e n t e e t i o l ó g i c o es u n a l e v a d u r a c a p s u
t i m a figuran: s u p r e s e n c i a m a y o r i t a r i a en los ais
l a d a : el C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s . E s t a h a s i d o
lamientos clínicos en determinados áreas dei
repetidamente
en
p l a n e t a , l a i m p o s i b i l i d a d , h a s t a el presente, de
m u e s t r a s de suelo c o n t a m i n a d a s c o n e x c r e m e n -
su recuperación del medio ambiente y s u m a y o r
tos de p a l o m a s
aislada del medio ambiente
1
3
1
.
4
resistência a los agentes antifúngicos, mencio1 0
O t r a s e s p é c i e s de C r y p t o c o c c u s , c o n s i d e r a
n a d a por algunos autores .
d a s h a b i t u a l m e n t e c o m o no p a t ó g e n a s se r e c u
peraron de m u e s t r a s c l í n i c a s y de tierra, c o n t a
m i n a d a s o no con e x c r e m e n t o s de p a l o m a s
3
y
se h a n s e n a l a d o o c a s i o n a l m e n t e c o m o a g e n t e s
c a u s a l e s de i n f e c c i o n e s
5
6
.
E l p r o p ó s i t o d e e s t e t r a b a j o es c o m p a r a r l a
susceptibilidad "in vitro" a 5 drogas antifúngic a s de c e p a s de C r y p t o c o c c u s , a i s l a d a s en s u
g r a n m a y o r í a , e n n u e s t r o m e d i o , en l o s ú l t i m o s
E l estúdio antigénico dei polisacárido c a p s u
lar de C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s , p e r m i t i ó s u
2
agrupación en 4 serotipos; A , B , C y D . E l par
5 a n o s . L a f i n a l i d a d p r i n c i p a l es e s t a b l e c e r s i
existe diferencia de s e n s i b i l i d a d a estas d r o g a s
entre I a s c e p a s o b t e n i d a s de p a c i e n t e s y a q u e l l a s
serotípico A D se c o r r e s p o n d e c o n C r y p t o c o c c u s
a i s l a d a s de l a n a t u r a l e z a y ver si a t r a v e s de
n e o f o r m a n s v a r i e d a d n e o f o r m a n s y el B C c o n
este e s t ú d i o se p o d r í a e s t a b l e c e r a l g ú n t i p o de
la v a r i e d a d gattii dei m i s m o h o n g o
(1) C e n t r o d e M i c o l o g í a del D e p a r t a m e n t o
1 1
12
.
caracterización epidemiológica.
de M i c r o b i o l o g í a de l a F a c u l t a d de M e d i c i n a de l a U n i v e r s i d a d de B u e n o s A i r e s .
P a r a g u a y 2155. P i s o I I . C P . 1421. C a p i t a l F e d e r a l . B u e n o s A i r e s , A r g e n t i n a .
MATERIALES Y MÉTODOS
c) M e d i o d e c u l t i v o y p r e p a r a c i ó n d e p l a c a s :
se u t i l i z o a g a r a l 2 % e n a g u a d e s t i l a d a a d i c i o
a) C e p a s e s t u d i á d a s : se e s t u d i a r o n 24 c e p a s
n a d o d e g l u c o s a a l 1 0 % . E s t e m e d i o b a s e s e fra
d e l e v a d u r a s d e l g ê n e r o C r y p t o c o c c u s , 22 d e
c i o n ó e n t u b o s d e 2 2 x 3 c m c o n 17 m l c a d a u n o
ellas pertenecientes a l a M i c o t e c a dei C e n t r o de
y se esterilizo e n a u t o c l a v e .
Micología y 2 enviadas por la D r a . K w o n C h u n g .
Posteriormente
L a s c a r a c t e r í s t i c a s g e n e r a l e s d e I a s m i s m a s (de-
se c o l o c o en b a h o de a g u a
nominación, espécie, variedad, serotipo y origen
a 4 5 ° C h a s t a e l m o m e n t o d e a g r e g a r el s u p l e
d e a i s l a m i e n t o ) se r e s u m e n e n l a T a b l a nv 1.
mento. E s t e último estuvo compuesto por 2 m l
de Y e a s t N i t r o g e n B a s e ( D I F C O )
b) P r e p a r a c i ó n d e i i n ó c u l o : s e r e a l i z o u n re
p i q u e de Ias c e p a s en t u b o s c o n t e n i e n d o
medio
d e a g a r m i e i d e S a b o u r a u d y s e i n c u b a r o n a 28°C
concentrado
10 v e c e s (6,7 g e n 100 m l d e a g u a d e s t i l a d a ) y
1 m l de l a d i l u c i ó n c o r r e s p o n d i e n t e s de a n t i f ú n gico, a m b o s estériles.
d u r a n t e 48 h o r a s . L a s c é l u l a s f u e r o n s u s p e n d i d a s
L a m e z c l a d e l a b a s e y el s u p l e m e n t o s e v o l
en solución fisiológica estéril y l l e v a d a s a u n a
t u r b i d e z e q u i v a l e n t e a l 0,5 d e l a e s c a l a d e M a c
c ó s o b r e p l a c a s d e P e t r i d e 10 c m d e d i â m e t r o
Farlan.
y se h o m o g e n e i z o c o n m o v i m i e n t o s
rotatórios.
TABLA 1
Caracteristicas generales de Ias distintas cepas de C r y p t o c o c c u s estudiádas
CEPA
ESPÉCIE
VARIEDAD
ORIGEN DE AISLAMIENTO
MOY
VAR
neoformans
neoformans
L.C.R.
\
\
GIU
FER
RIV
MUN
sangre
AME
CAB
M
CAB
R
e x c r e m e n t o s de p a l o m a
LOP 1
»
LOP 2
ROD
ROC
PER
g-attii s e r o t i p o B
GAI
L.C.R.
GAR
D r a . K w o n C h u n g (*)
CEPA B
CEPA C
GAG
"
albidus
diffluens
GIO
EPE
SRI
CEM
unigutulattus
BRU
albidus
tierra
diffluens
Referencias:
(*) c e p a s e n v i a d a s p o r l a D r a . K w o n C h u n g .
L . C . R . : líquido
céfalorraquideo.
(*)
e x c r e m e n t o s de p a l o m a s
gânglio linfático
U n a v e z s o l i d i f i c a d o e l m e d i o s e e l i m i n o el a g u a
d) C r y p t o c o c c u s a l b i d u s v a r . d i f f l u e n s
y
de c o n d e n s a c i ó n en e s t u f a a 37°C. S e r e a l i z a r o n
C r y p t o c o c c u s unigutulattus aislados del medio
igualmente p l a c a s de control sin antifúngico y
ambiente.
c o n p o l i e t i l e n g l i c o l 200.
e) C r y p t o c o c c u s a l b i d u s v a r . d i f f l u e n s a i s l a
d) A n t i f ú n g i c o s u t i l i z a d o s : L o s s o l v e n t e s
utilizados fueron a g u a destilada p a r a
anfoteri-
c i n a B y 5 f l u o r o c i t o s i n a ; p o l i e t i l e n g l i c o l 200 p a
do de m u e s t r a c l í n i c a .
E n l a T a b l a nv 2 s e o b s e r v a r a n l o s v a l o r e s
obtenidos con las distintas drogas.
ra i t r a c o n a z o l y k e t o c o n a z o l y cremofor p a r a m i c o n a z o l . A p a r t i r de I a s s o l u c i o n e s m a d r e se hi-
DISCUSIÓN
cieron d i l u c i o n e s en p r o g r e s i ó n g e o m é t r i c a de
Ias d r o g a s en s o l u c i ó n f i s i o l ó g i c a estéril, desde
L o s resultados obtenidos no m u e s t r a n en la
1.000 h a s t a 2 u g / m l , p a r a o b t e n e r e n I a s p l a c a s
m a y o r i a de los casos diferencias s i g n i f i c a t i v a s
c o n c e n t r a c i o n e s f i n a l e s 20 v e c e s m e n o r e s (50
entre los v a l o r e s de l a m e d i a g e o m é t r i c a de la
h a s t a 0,09 u g / m l ) .
C.I.M. de Ias 5 d r o g a s en los 4 g r u p o s estable
c i d o s . H a c e e x c e p c i ó n el de los C r y p t o c o c c u s
e> I n o c u l a c i ó n d e I a s p l a c a s : s e u t i l i z o p a r a
s p . (no n e o f o r m a n s ) , q u e m u e s t r a a l t o s v a l o r e s
este p r o p ó s i t o u n a p a r a t o d e i t i p o d e i m u l t i r r e
de C . I . M . p a r a l a 5 f l u o r o c i t o s i n a , en c o m p a r a
p i c a d o r d e S t e e r s . S e u b i c a r o n 0,3 m l d e I a s s u s
c i ó n c o n los C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s . L a bi­
p e n c i o n e s de l e v a d u r a s en c a d a u n a de I a s o q u e
b l i o g r a f i a r e v i s a d a no a p o r t a d a t o s sobre este
d a d e s del m i s m o . E n p r i m e r l u g a r se i n o c u l a r o n
punto.
los controles y s e g u i d a m e n t e Ias p l a c a s conte
niendo a n t i f ú n g i c o s , de m e n o r a m a y o r c o n c e n tración.
O b s e r v a n d o los valores obtenidos en otros
t r a b a j o s , los n u e s t r o s s o n c o m p a r a b l e s en el c a s o
de l a a n f o t e r i c i n a B , l a 5 f l u o r o c i t o s i n a y el m i c o
f) L e c t u r a e i n t e r p r e t a t i o n d e l o s r e s u l t a ­
nazol. Quizas aquellos obtenidos con ketocona
d o s : I a s p l a c a s i n o c u l a d a s se i n c u b a r o n a 2 8 " C
z o l e i t r a c o n a z o l se m u e s t r e n u n p o c o m á s e l e v a
d u r a n t e 48 h s y l u e g o s e r e a l i z o l a l e c t u r a d e
dos. E s t a d i f e r e n c i a p u e d e ser m o t i v a d a por el
Ias m i s m a s . S e considero como
uso de u n m e d i o de c u l t i v o q u e se c o n s i d e r a me­
concentración
inhibitoria m í n i m a (C.I.M.) a la menor concen­
n o s a d e c u a d o p a r a el e s t ú d i o de
t r a c i ó n d e a n t i f ú n g i c o q u e i n h i b i ó el d e s a r r o l l o
a z ó l i c o s " i n v i t r o " . S i n e m b a r g o r e c u r r i m o s a él
del h o n g o . L a s p r u e b a s se r e a l i z a r o n por d u p l i
por tratarse de u n m e d i o u n i v e r s a l m e n t e e m -
cado.
antifúngicos
p l e a d o p a r a Ias d e t e r m i n a c i o n e s de la s e n s i b i l i d a d " i n v i t r o " y porque no altera los resultados
S i g u i e n d o los critérios
adoptados
por
de l a 5 f l u o r o c i t o s i n a y de l a a n f o t e r i c i n a B .
8
F R O M T L I N G et a l . se o b t u v o l a m e d i a g e o m é
trica de los d i s t i n t o s g r u p o s y se considero c o m o
s i g n i f i c a t i v a u n a diferencia c u á d r u p l e entre los
valores obtenidos.
E l r e s u l t a d o de l a c e p a de C r y p t o c o c c u s a l ­
b i d u s v a r . d i f f l u e n s a i s l a d o de u n a m u e s t r a clí
n i c a no fue t o m a d o en c u e n t a p o r c a r e c e r de
significación estadística.
RESULTADOS
CONCLUSIONES
L o s r e s u l t a d o s fueron a g r u p a d o s de l a si
guiente manera:
a) C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s v a r .
E l estúdio de la s e n s i b i l i d a d " i n v i t r o " a los
neofor­
m a n s de m u e s t r a s c l í n i c a s .
b) C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s v a r .
d i s t i n t o s a g e n t e s a n t i f ú n g i c o s es t e m a d e c o n s
tante discusión. E l procedimiento m á s utilizado
p a r a e s t e f i n es el d e d i l u c i ó n e n a g a r , q u e p e r
neofor­
m a n s de m a t é r i a s fecales de p a l o m a s .
m i t e el e s t ú d i o d e l a s e n s i b i l i d a d d e n u m e r o s a s
cepas simultaneamente. Nosotros h e m o s elegi­
do esta m e t o d o l o g i a y a que p e r s e g u i m o s u n ob
c) C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s v a r . g a t t i i , 2
jetivo epidemiológico al c o m p a r a r l a sensibili­
de ellos a i s l a d o s de m u e s t r a s c l í n i c a s en n u e s t r o
d a d a n t i f ú n g i c a de C r y p t o c o c c u s de diferentes
medio y 2 enviados por la D r a . K w o n C h u n g .
o r í g e n e s de a i s l a m i e n t o .
TABLA2
V a l o r e s de l a m e d i a g e o m é t r i c a de las C . I . M . obtenidas
(en u g / m l )
N? d e
cepas
Grupo
Cryptococcus neoformans
var. neoformans (casos
ITRA
7
clínicos).
Cryptococcus neoformans
var. neoformans (medio
7
ambiente).
gattii
C r y p t o c o c c u s s p . no
Cryptococcus albidus
(caso clínico)
AMB
5 FC
0,85
3,80
0,31
0,13
0,16
(0,19-1,56)
(1,56-6,25)
(0,10-0,39)
(0,09 0,19)
(0,09 0,39)
1,56
(0,78-3,12)
5,15
0,35
(0,19-0,78)
0,11
0,28
(3,12 12,5)
(0,09-0,19)
(0,09 0,78)
0,65
3,71
0,32
0,19
0,27
(0,39 0,78)
(3,12 6,25)
(0,19-0,39)
(0,19-0,19)
(0,19-0,39)
0,50
3,58
0,54
0,28
> 50,00
5
(0,19-0,78)
(3,12-6,25)
(0,39-0,78)
(0,09-1,56)
(50,0 50,0)
1
0,39
6,25
0,39
0,09
> 50,00
neofor­
m a n s (medio ambiente)
MICO
4
Cryptococcus neoformans
var.
KETO
Referencias:
I T R A : Itraconazol
KETO:
ketoconazol
M I C O : miconazol
AMB:
anfotericina B
5 F C : 5 fluorocitosina
E n t r e p a r é n t e s i s f i g u r a n los v a l o r e s m á x i m o s y m í n i m o s de C . I . M . o b t e n i d o s c o n c a d a u n a de
las drogas.
E s conocido que varios factores
câmbios importantes
provocan
en los resultados
obteni­
d o s " i n v i t r o " . S o n e l l o s el p H , c o n c e n t r a c i ó n
1 — N o h u b o diferencias en la sensibilidad
" i n v i t r o " entre a m b a s v a r i e d a d e s de C r y p t o ­
coccus neoformans.
iónica y composición q u í m i c a del medio utiliza­
do, s o l u b i l i d a d y d i s t r i b u c i ó n de l a d r o g a p r o b a d a en este ú l t i m o , l a d e n s i d a d del i n ó c u l o , l a
fase e n q u e s e e n c u e n t r a e l h o n g o q u e lo c o n f o r
m a y el t i e m p o y t e m p e r a t u r a de i n c u b a c i ó n .
2 — N o se c o m p r o b a r o n
susceptibilidades
s i g n i f i c a t i v a m e n t e d i s t i n t a s entre Ias c e p a s de
Cryptococcus neoformans variedad
neofor­
m a n s a i s l a d o s de c a s o s c l í n i c o s y de l a n a t u
raleza.
3 — L a s c e p a s de C r y p t o c o c c u s s p . (no neo
No o b s t a n t e los esfuerzos r e a l i z a d o s por m u chos laboratórios, los r e s u l t a d o s no s o n c o i n c i
formans) r e c u p e r a d a s del m e d i o ambiente así
c o m o u n a de C r y p t o c o c c u s a l b i d u s v a r . dif­
9
dentes entre s i . E s menester l a b ú s q u e d a de u n a
f l u e n s a i s l a d a de u n a p a c i e n t e e x h i b i e r o n v a l o
metodologia sencilla que permita obtener resul
res m á s e l e v a d o s d e C . I . M . p a r a l a 5 f l u o r o c i
tados significativos desde p u n t o de v i s t a clínico
tosina.
y de fácil e j e c u c i ó n por los laboratórios de m e n o r
complejidad.
SUMMARY
"IN
T e n i e n d o en c u e n t a l a m e t o d o l o g i a u t i l i z a d a
VITRO"
SUSCEPTIBILITY
O F CRYPTO­
COCCUS STRAINS TO 5 ANTIFUNGAL DRUGS.
p a r a el e s t ú d i o de l a s e n s i b i l i d a d " i n v i t r o " de
las c e p a s de C r y p t o c o c c u s a d i s t i n t o s
g i c o s , p o d e m o s c o n c l u i r lo s i g u i e n t e :
antifún­
A c o m p a r a t i v e s t u d y of t h e " i n v i t r o " s u s c e p ¬
t i b i l i t y of 24 C r y p t o c o c c u s s t r a i n s to 5 a n t i f u n g a l
drugs (amphotericin B , 5
fluorocytosine,
micona-
4.
B E N N E T T , J . E . ; K W O N C H U N G , K . J . & H O W A R D , D.
H . — E p i d e m i o l o g i c differences a m o n g s e r o t y p e s of C r y p -
zole, itraconazole a n d ketoconazole), w a s carried
t o c o c c u s n e o f o r m a n s . A m e r . J . E p i d e m . , 105: 5 8 2 - 5 8 6 ,
out.
1977.
T h e s e strains were groupeo
according
to
5.
species, varieties a n d isolation's origins. T h e minim u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n (M.I.C.) w a s det e r m i n a t e d by the a g a r d i l u t i o n technique
yeast nitrogen base agar with dextrose.
mean geometrical
6.
in
D A M B R O S I , A.; N E G R O N I , R.; F A I N B O I M , H . & B A V A .
A . J . — C r i p t o c o c o s i s p o r C r y p t o c o c c u s a l b i d u s . R e v . arg e n t . M i c o l . , 10: 16-19, 1987.
The
of t h e M . I . C . v a l u e s of e a c h
D A C U N H A , T. & L U S I N S , J . — Cryptococcus albidus
m e n i n g i t i s , S t h . m e d . J . ( B g h a m , A l a . ) , 6 6 : 1230-1243. 1973.
7.
g r o u p w a s c o m p a r e d w i t h the others.
E M M O N S , Ch. — Saprophytic
s o u r c e s of C r y p t o c o c c u s
n e o f o r m a n s a s s o c i a t e d w i t h the p i g e o n ( C o l u m b a l i v i a ) .
A m e r . J . H y g . , 6 2 : 227-232, 1955.
T h e r e s u l t s o b t a i n e d were h o m o g e n e o u s w i t h
the o n l y e x c e p t i o n
of the " n o n
neoformans"
8.
F R O M T L I N G , R . A.; A B R U Z Z O , G . K . & B U L M E R , G .
S . — C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s : c o m p a r i s o n s of " i n v i t r o "
s t r a i n s , i n w h i c h , h i g h e r M . I . C . to 5 f l u o r o c y t o -
a n t i f u n g a l s u s c e p t i b i l i t i e s of s e r o t y p e s A D a n d B C . M y c o ¬
sine values were detected.
p a t h o l o g i a ( D e n H a a g ) , 94: 27-30, 1986.
9.
AGRADECIMIENTO
F R O M T L I N G , R . A . , ed. — R e c e n t t r e n d s in the d i s c o very, development and e v a l u a t i o n of a n t i f u n g a l agents.
B a r c e l o n a , J . R . P r o u s P u b l i s h e r s , 1987.
A la D r a . A m a l i a Fernandez y equipo
su gentil y desinteresada
por
colaboración.
10.
H E N D E R S O N , D. K.; E D W A R D S Jr., J . E.; D I S M U K E S ,
W . E . & B E N N E T T , J . E . — M e n i n g i t i s p r o d u c e d b y differ e n t s e r o t y p e s of C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s . I n :
Annual
M e e t i n g of A m e r i c a n S o c i e t y o f M i c r o b i o l o g y , D a l l a s , T x . ,
REFERENCIAS
1.
A J E L L O , L . — O c c u r r e n c e of C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s
1981. A b s t r a c t . A b s t .
11.
F11.
K W O N C H U N G , K . J . — A new g e n u s , F i l o b a s i d i e l l a , the
p e r f e c t s t a t e of C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s . M y c o l o g i a , 6 7 :
i n s o i l s . A m e r . J . H y g . , 6 7 : 72-77, 1958.
1197-1200, 1975.
2.
B A S T I D E , J . M. & M A L L I E . M. — U l t r a e s t r u c t u r e et b i o l o ¬
gie de C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s . B u l l . S o c . f r a n c . M y c o l .
12.
K W O N CHUNG, K. J.; BENNETT, J .E. & R H O D E S , J .
m e d . , 15: 11-20, 1986.
C. — T a x o n o m i c studies on F i l o b a s i d i e l l a species and
B A V A , A. J .& N E G R O N I , R. — Estúdio epidemiológico
1982.
t h e i r a n a m o r p h s . A n t o n i e v a n L e e u w e n h o e k , 48: 25-28.
3.
sobre c r i p t o c o c o s i s en S a n P e d r o ( B u e n o s A i r e s ) . R e v . arg e n t . M i c o l . , 9: 12-16, 1986.
R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 28/3/1989.