Subido por Mili García

UNIVERSIDAD DE GUADALAJAR2

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UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
Centro Universitario de la Ciénega
Práctica No. 4: “Separación de
aminoácidos por
cromatografía”
Bioquímica ll, impartida por: Peter Knauth
Alumna: Milagros Esmeralda García Lara
Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo
Fecha en la que se realizó la práctica: 10 de Abril del 2019.
Fecha de entrega del protocolo: 30 de Abril del 2019.
Separación de aminoácidos por cromatografía
Objetivo
Separar los aminoácidos por cromatografía en capa fina con el fin de
identificar estos aminoácidos en una mezcla y además conocer el principio
de la técnica y sus aplicaciones.
Introducción
A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos
individuales de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las
investigaciones de la estructura de las proteínas. El uso de la cromatografía
es adecuada para averiguar los diferentes aminoácidos presentes en una
muestra (análisis cualitativo) La cromatografía es un conjunto de técnicas
basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla. En la cromatografía en capa fina,
CCF o TLC se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda
dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de
láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de
aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas
(celulosa, poliamida, polietileno, etc).
De todos los métodos, el más general y utilizado es el de la reacción con la
ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con
aminoácidos formando un compuesto de color purpura, a excepción de la
prolina que da un color amarillo.
Material
Material
Tubos capilares
Vidrio de reloj
Vaso de precipitado de 600 ml
Equipos
Agitador magnético con placa de calentamiento
Reactivos
Ninnhidrina al 1% en etanol (70%)
Fase móvil: Butanol-ácido acético glacial- agua
destilada [8:1:1]
5 muestras de aminoácidos conocidos
6 muestras desconocidas
Fase estacionaria
Placa de silica-gel
Cantidad
6
1
1
1
20 ml
3 ml
1 ml c/una
1 ml c/una
1
Procedimiento
Separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina
Vaciar al vaso de precipitado ~ 0,5 cm de fase
móvil y taparla por 20 minutos con el vidrio de reloj
Señalar suavemente con un lápiz de grafito
No. 2 en la placa de silica-gel una línea recta
a 1 cm de distancia del eje de las ordenadas.
¿Toco la placa
con las manos
descubiertas?
No
Ubicar 6 puntos de descarga sobre la línea
trazada distribuyéndolos de tal manera
que no estén muy cercanos entre ellos.
Identificar los puntos de descarga con un
símbolo para identificar a la muestra. 1=V,
2=R, 3=G, 4=D, 5=A, 6=Muestra. (Fig. 1)
Aplicar con un tubo capilar gotas en cada
punto correspondiente de los estándares
y la muestra, y dejar secar. (Fig. 2)
Contaminación
de la placa
Si
Colocar la placa de silica-gel en el vaso
de precipitado con la fase móvil. (Fig. 3)
Dejar que corra la fase móvil hasta que llegue 1
cm antes del fin de la placa y dejar secar.
Sacar la placa de silica-gel y marcar
rápidamente con el lápiz hasta donde llego
la fase mocil en la placa y dejar secar
dentro de la campana de extracción. (Fig. 4)
Rociar la placa de silica-gel con ninhidrina al
1% en la campana de extracción tomando
las precauciones necesarias. (Fig. 5)
Dejar secar y colocarla sobre la placa caliente
del agitador magnético hasta observar la
presencia de las coloraciones. (Fig. 6)
Retirar con unas pinzas para crisol y
dejar enfriar.
Imágenes
Fig. 1-Identificacion con
símbolo de los puntos de
descarga.
Fig. 3-Placa de silica-gel
en el vaso de precipitado.
Fig. 2-Aplicación de las gotas con los tubos capilares
Fig. 4- Marca con lápiz de
la fase móvil.
Fig. 6- Secado de la placa de silicagel en el agitador magnético.
Fig. 5-Rociado con ninhidrina
al 1% sobre la placa.
Resultados
Los posibles aminoácidos
presentes en la muestra son: 2
(R) y 5 (A). De modo que la
sustancia desconocida
contiene los aminoácidos
arginina y alanina, debido a
que en el punto 6 (muestra)
en la forma de separación se
observan dos coloraciones en
distintas posiciones similar a
las que presentan el punto 2 y
el 5.
Factor de retención (𝑹𝒇 )
𝑹𝒇 (1) =
2,8
= 0,31
9
𝑹𝒇 (2) =
0
9
=0
𝑹𝒇 (3) = No es posible su
determinación debido a que
se combinó con el
aminoácido 4 al momento de
aplicarlo.
𝑹𝒇 (4) = No es posible su
determinación debido a que
se combinó con el
aminoácido 3 al momento de
aplicarlo.
𝑹𝒇 (5) =
Símbolo en la
placa
1
2
3
4
5
6
Aminoácido
Valina
Arginina
Glicina
Aspartato
Alanina
MUESTRA
Código de
tres letras
Val
Arg
Gly
Asp
Ala
MUESTRA
1,5
9
= 0,166
Código de una
letra
V
R
G
D
A
MUESTRA
Discusión
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos
que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco
y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a
hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra
molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que
presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que
da una coloración amarillenta.
Así mismo la distribución que obtienen los aminoácidos en la placa de silica
gel se debe a la interacción que tengan con el solvente, los aminoácidos
apolares son los que mejor interaccionan y pueden ser arrastrados por este,
tal es el caso de la valina y la alanina.
Cuestionario
1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de
fusión [°C], temperatura de ebullición [°C], estado físico a
25 °C y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados.
Reactivo
Peso
molecular
(g/mol)
Temperatura
de
ebullición
(°C)
Temperatura
de fusión
(°C)
Estado
físico a 25
°C
Ninhidrina
178,04
NA
241,11
Solido
Etanol
33,997
78,5
-114,1
Liquido
Solubilidad
NA
Soluble en agua,
éter y cloroformo
Para la preparación de la ninhidrina al 1%, se coloca 1 gramo de este
reactivo en un matraz aforado de 100 ml y se afora con etanol.
2. ¿Cuál es la diferencia entre los principios de separación:
adsorción, intercambio iónico, exclusión y afinidad?
En el caso de la adsorción el fenómeno tiene lugar sobre la superficie del
sólido donde la mayor parte del soluto queda retenido. En el intercambio
iónico el material tiene la propiedad de tomar partículas cargadas (iones
positivos o negativos) que quedan retenidas y fijadas ya no como lo que
ocurre con al adsorción en la superficie, sino en el interior. La adsorción
ocurre preferentemente en la superficie, mientras que en el intercambio
iónico, se produce sobre ciertas regiones preferenciales. Respecto a la
afinidad sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva
a un ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase
móvil. En la exclusión la muestra no interacciona químicamente con la fase
estacionaria, ni con la fase móvil.
3. Esquematice los tipos de cromatografía de forma
detallada
Bibliografía
Asociación escuela de estudiantes de ingeniería química. (2001). Termodinámica química.
Colombia: RECITEIA.
Luisot P (1982). “Bioquímica Estructural”, 2ª Ed. Editorial AC.
Smith I, Feinberg JG (1965) “Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis”.
Shandon Scientific Company Ltd.
Hoja de seguridad de la ninhidrina
Hoja de la seguridad del etanol
M.C. Gutiérrez-Bouzán, A. Burdó, J. CegarraI. (2009). LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN:
ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DE PESOS MOLECULARES EN SILICONAS POR GPC . -, de
Boletin intexter Sitio web:
https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099/13132/LA%20CROMATOGRAF%C3%
8DA%20DE%20EXCLUSI%C3%93N,%20AN%C3%81LISIS%20DE%20LA%20DISTRIBUCI%C3%
93N%20DE%20PESOS.pdf
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