METODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS. INTRODUCCIÓN. Qué son los carbohidratos, Algunos ejemplos y algunos métodos. Métodos Se denominan carbohidratos a aquellos que responden a la fórmula empírica Cn(H2O)n. Entre los muchos elementos de nuestra alimentación los carbohidratos (conocidos también como hidratos de carbono, sacáridos o glúcidos) son una de las sustancias principales requeridas por nuestro organismo debido a su alto aporte energético, éstos se encuentran en azúcares, almidones y fibra. En todos los seres vivos se encuentran presentes los carbohidratos en el material genético a causa de la desoxirribosa y la ribosa presentes en él. Métodos Químicos -Método de Ácido Fenol Sulfúrico: se basa en los productos de reacción y degradación del ácido y del azúcar, en donde el azúcar se torna fundamentalmente hidroximetilfurfural (HMF) o furfural (F), leyendo una absorbancia a 490nm generando colores amarillos y anaranjados. -Método de Ácido Sulfúrico: sus fundamentos son los mismos del método de Ácido Fenol Sulfúrico, se diferencia en que los colores que se observan son azules y verdes leyendo una absorbancia de 620nm. *Estos métodos si bien son fáciles, rápidos, no interfieren con las proteínas y los resultados son confiables y reproducibles, si los carbohidratos no proporcionan HMF o F en la descomposición ácida, la muestra arrojará una amplia gama de colores. MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: Método Volumétrico o Propuesta de Lane-Eynon (1923) Este método se basa en la determinación del volumen de una disolución de la muestra, que se requiere para reducir completamente un volumen conocido del reactivo alcalino de cobre. El punto final se determina por el uso de un indicador interno, azul de metileno, el cual es reducido a blanco de metileno por un exceso de azúcar reductor. Este método se puede aplicar en productos como leche evaporada y condensada, productos lácteos, jarabes, mieles, mermeladas, néctares y jugos, dulces y moles. -Reactantes, procedimiento. Método Fehling-Soxhlet Este es el método químico más aconsejable para utilizar. El fundamento de éste es que precipita el óxido cuproso (Cu2O) en presencia de una sustancia reductora. Para este método se utilizan dos soluciones: -Solución a: sulfato de cobre cristalino. -Solución b: tartrato de sodio y potasio (o citrato de sodio) + hidróxido de sodio (o hidróxido de potasio o carbonato de sodio). 1. El citrato o tartrato evita la precipitación del hidróxido cúprico el álkali enoliza a los azúcares provoca su rompimiento en fragmentos reactivos que pueden oxidarse inmediatamente: Cu++ (cúprico) es reducido a Cu+ (el ión cuproso). 2. A medida que los iones Cu++ se reducen por los fragmentos de azúcar, los iones Cu+ se combinan con los iones hidroxilo para formar hidróxido de cobre (de color amarillo, Cu+). 3. El CuOH reducido pierde H2O en presencia de calor para dar como resultado óxido cuproso insoluble (Cu2O). 4. La determinación del cobre reducido se puede llevar a cabo por gravimetría, volumetría, o por métodos electrolíticos. El peso del Cu2O sólo es aplicable a muestras relativamente puras. Si bien este método es uno de los métodos químicos más utilizados, presenta una serie de desventajas, entre ellas está que la reducción del cobre y la oxidación de los azúcares no es estequiométrica. Otra es que la producción de óxido cuproso varía, dependiendo del reactivo álkali, la velocidad y tiempo de calentamiento y la concentración de azúcares en la muestra, además, los azúcares difieren en su habilidad para reducir la solución cúprica, por tanto, la titulación (o peso o absorbancia) deben ser convertidos en (miligramos de cobre) y posteriormente se debe recurrir a tablas para determinar la concentración de azúcar presente en la muestra. Método Gavimétrico o La Propuesta de Munson-Walker Este método corresponde a la cantidad de cobre reducido en presencia de azúcares reductores, en donde el peso de los miligramos de Cu2O corresponde a los miligramos de azúcares analizados (por medio de las tablas de Munson y Walker que aparecen en el AOAC). *Para el resultado de la concentración final hay que considerar las diluciones. NaOH + Cu++ + AZÚCAR REDUCTOR → CU+ + AZÚCAR ∆ (Cu 2O) OXIDADO La determinación del Cu2O puede ser gravimétrica, pero es generalmente mejor titular el óxido cuproso. Esto se puede realizar mediante uno de los siguientes métodos (se llevan mucho tiempo): TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO EL Cu 2O REACCIONA CON EL IÓN FÉRRICO (Cu+++) EL CUAL ES REDUCIDO AL IÓN FERROSO (Cu++). POSTERIORMENTE EL IÓN FERROSO ES TITULADO (+2 →+3) CON PERMANGANATO (+3, ROSA → +2, INCOLORO) 1) Cu 2O + Fe 2(SO 4 )3 → 2FeSO 4 + CuSO 4 + CuO 2) 10 FeSO 4 + 2KMnO 4 + 8H 2SO 4 → 5Fe 2(SO 4 )3 + K 2SO4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO SE OXIDA EL Cu + A Cu++ CON ÁCIDO NÍTRICO. POSTERIORMENTE SE HIERVE LA MUESTRA PARA ELIMINAR EL EXCESO DE HNO 3 HNO 3 Cu 2º → Cu(NO 3 ) 2 ∆ SE AÑADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIÓN DE KI 2I - + 2Cu++ → 2Cu + + I 2 SE TITULA EL I 2 LIBERADO CON UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3) S2O3-2 I2 + I - → I3 - → S4O6 -2 + 3I – (TRIIODURO) SE USA ALMIDÓN COMO INDICADOR: AZÚL → INCOLORO Desventajas del método: -NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES AZÚCARES REDUCTORES. -SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100 A 200mg DE GLUCOSA POR DETERMINACIÓN. Método Benedict Método Somogy I-Nelson Azúcar reductor + Cu++ → Cu+ + AZÚCAR REDUCTOR Procedimiento: Reactivos para el método de Somogy I - Nelson Reactivo de Somogy I – NaCO 3 - Carbonato de sodio – NaHCO 3 – Bicarbonato de Sodio – KaNaC H O – Tartrato de Sodio Potasio 4 H 4 O 6 – Tartrato de Sodio Potasio Reactivo de Nelson – (NH 4)6Mo 7 O24 - Molibdato de amonio – Na 2HAsO 7·H 2O – Arsenato de Sodio – H 2SO 4 – Ácido Sulfúrico – CuSO 4·5H 2O –Sulfato de Cobre Método Fluorimétrico Este método es posible realizarlo cuando los compuestos de la muestra absorben la radiación a una longitud de onda corta y luego emiten radiación a una longitud de onda más larga. Determinación de glucosa por medio de este método: • Extracción con iso-butil metil cetona. • Reacción con hidracida de ácido p–hidroxibenzoico. • Adición de reactivo y lectura a una emisión de 470nm. • Excitación a 454nm. Método Enzimático En este método se requiere de un extracto neutro o ácido libre de alcoholes y metales pesados (ya que no se pueden usar sales de plomo para clarificar los extractos). Este método se puede aplicar a una gran variedad de carbohidratos o compuestos relacionados como monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, ácidos, alocholes y polioles. Reacciones GLUCOSA OXIDASA H2O + O2 + GLUCOSA → LACTONA DE ÁCIDO DGLUCÓNICO + H2O CATALASA H2O2 → H2O + ½ O2 O2 + CROMÓGENO INCOLORO, REDUCIDO → CROMÓGENO AZÚL OXIDADO DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE SACAROSA/GLUCOSA -LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES Y DESPUÉS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIÓN -A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA FOSFORILACIÓN DE GLUCOSA MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6 -FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA GLUCOSAFOSFATO PRODUCIDA ES ESPECÍFICAMENTE OXIDADA POR EL NADP A GLUCONATOFOSFATO CON LA FORMACIÓN DE NADP REDUCIDO. Reacciones: HK GLUCOSA + ATP → G6P + ADP G6P-DH G6P + NADP+ → GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+ EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIÓN ES ESTEQUIOMÉTRICO CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE MIDE MEDIANTE EL AUMJENTO EN ABOSROBANCIA A 334, 340 Ó 365nm. INVERSIÓN ENZIMÁTICA -A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA ENZIMA ß-FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A GLUCOSA Y FRUCTOSA: ß-FRUCTOSIDASA SACAROSA + H 2O → GLUCOSA + FRUCTOSA EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y DESPUÉS DE LA INVERSIÓN ENZIMÁTICA Método Haderdorn-Hansen Método del Ácido 3.5 Dinitrosalicílico (DNS) Los azúcares presentes en una muestra de azúcar comercial o de algún producto azucarado se determinan cuantitativamente por métodos físico (ópticos/preferentemente) o por métodos químicos. Se basan en lo mismo: Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una sustancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Se puede utilizar el espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de radiación necesaria para las determinaciones de la cantidad de azucar en las muestras bajo estudio, comparándola después con la radiación absorbida por un blanco. La regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una sustancia con la concentracion de esa misma sustancia, se llama ley de Beer. Fehling, benedict, somogy, hagerdorn-hansen • MÉTODO FLUORIMÉTRICO • MÉTODOS ENZIMÁTICOS • CROMATOGRAFÍA DE GASES • CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA • MÉTODOS FÍSICOS Métodos Físicos Densimetría Este método proporciona una aproximación a la cantidad de azúcar presente en soluciones de azúcar relativamente pura, ya que la presencia de otros materiales solubles afecta a la gravedad específica de una solución. *Gravedad específica: la gravedad específica de una solución de azúcar es una función de la concentración de soluto a una temperatura definida. Determinación de Carbohidratos por Densimetría: Para este proceso se utiliza un instrumento de medición llamado Higrómetro (también utilizado para la medición de sólidos solubles totales), para este método se ha diseñado un higrómetro especial que lee el % de azúcar directamente a 20°C. ÍNDICE DE REFRACCIÓN FUNDAMENTO • EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA MEDIDA DE SU CONCENTRACIÓN. • LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZÚCARES DE IGUAL CONCENTRACIÓN TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO ÍNDICE DE REFRACCIÓN. POLARIMETRÍA Fundamento: -SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS SUS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS EN LA MISMA DIRECCIÓN, LA RADIACIÓN SERÁ POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR. • CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLÉCULA ASIMÉTRICA (UN COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO). LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES LLAMADO “COMPUESTO ÓPTICAMENTE ACTIVO” (e.g. GLUCOSA). • SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRÍA LA LUZ POLARIZADA NO SERÁ AFECTADA. • EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA COMPAGINAR VISUALMENTE LAS SOMBRAS DE UN COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE REGRESO A SU POSICIÓN ORIGINAL. • SE MIDE EL GRADO DE ROTACIÓN REQUERIDO. MAGNITUD DE LA ROTACIÓN DEPENDIENTE DE: • LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA. • LONGITUD DE LA CELDA • NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU CONCENTRACIÓN • TEMPERATURA POLARÍMETROS vs SACARÍMETROS • POLARÍMETRO: USA LUZ MONOCROMÁTICA Y LEE EN GRADOS ANGULARES (SE DEBE RELACIONAR CON LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR). • SACARÍMETRO: USA LUZ BLANCA Y LEE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR DIRECTA. Determinación de carbohidratos totales por Espectrofometría
