Metodologías de la NCCLS para pruebas e inhibición documento M26-A. Curva de tiempo muerto. La determinación de la tasa de muerte de un aislado bacteriano por un agente antimicrobiano (o combinación de agentes) se ha aplicado ampliamente a la evaluación de nuevos fármacos. El uso de tal curva de muerte para guiar la quimioterapia en un paciente individual rara vez se realiza. Existe interés en los métodos de matar el tiempo por varias razones. Los estudios de tiempo muerto son uno de los medios más confiables para determinar la tolerancia a los antimicrobianos. El método de cruva de tasa de muerte es útil para determinar la sinergia o el antagonismo entre dos (o más) agentes antimicrobianos. Los estudios han demostrado que existen diferencias importantes entre los resultados de las pruebas de sinergia con curvas de muerte y los resultados se correlaciona mejor con la curación en modelos animales. Esto no es sorprendente porque los resultados del tablero de damas se evalúan solo en un punto de tiempo mientras que las curvas de muerte miden los cambios a lo largo del tiempo. La pendiente de las curvas de muerte realizadas con diferentes concentraciones de un solo agente permite comparar las tasas de disminución en el recuento de supervivientes. Esta tasa real de muerte puede ser más importante que la concentración a la que se produce el 99,9% de muerte del inóculo final. Cuando se usan curvas de muerte para evaluar un agente antimicrobiano, se recomienda realizar pruebas en varios múltiplos de la CMI. A intervalos (usualmente 0, 4, 8, 10 a 12 y 24 horas de incubación) se cuentan las colonias, y los resultados se grafican en papel semilogarítmico con el recuento de colonias sobrevivientes en la ordenada en escala logarítmica y el tiempo en la abscisa en escala aritmética. (Los resultados se pueden convertir a log10 y se puede usar papel de gráfico normal, si se desea). Con el tiempo, el recuento de colonias puede aumentar después de una disminución inicial. Esto puede deberse al uso de mutantes resistentes, a la inactivación del agente antimicrobiano o al rebrote de células bacterianas susceptibles que han escapado a la actividad antimicrobiana adhiriéndose a la pared del vaso de cultivo. La importancia clínica de dicho rebrote (en caso de que ocurra) no está clara, particularmente si ocurre después del tiempo equivalente al intervalo de dosificación habitual del agente antimicrobiano que se prueba. Varios factores deben ser considerados: El momento en que ocurre el rebrote La dosificación del antibiótico en el entorno clínico El tipo de bacteria El antibiótico en sí Cuando se produce un nuevo crecimiento, es útil determinar las CMI de los supervivientes para ver si se seleccionó un organismo resistente de la población estudiada. La inactivación del antibiótico puede determinarse mediante ensayos apropiados en el tiempo 0 y a las 24 horas. Un método simple para verificar la inactivación del antibiótico es usar una muestra de caldo (esterilizado por filtración) en el tiempo 0 y a las 24 horas para realizar CMI con una cepa de referencia de ATCC apropiada. Si la CMI a las 24 horas es marcadamente más alta que a las 0 horas, el antibiótico ha sido inactivado. Si el rebrote no puede explicarse por la inactivación del fármaco o la aparición de una subpoblación resistente, la repetición de la prueba sería útil con la interpretación de los resultados. Los métodos para la interpretación de los estudios de muerte-cinética pueden variar. La actividad bactericida tal como se define por la eliminación del 99.9% del inóculo final se puede determinar a partir de las curvas de tiempo muerto al observar la presencia o ausencia de una disminución de log10 en UFC / ml. La sinergia se define como una disminución de log10 en UFC / ml entre la combinación y su constituyente más activo después de 24 horas con el componente menos activo que se prueba en una concentración ineficaz. Algunos investigadores consideran que la pendiente de cuatro a ocho horas es el factor más importante para los antibióticos que se administran con frecuencia. Un nuevo enfoque utiliza el suero tomado de un sujeto al que se le ha administrado un antibiótico y mide la tasa de destrucción sérica (tasa bactericida sérica). El análisis de regresión lineal se usa en las curvas resultantes para determinar la tasa bactericida en suero (definida como la pendiente de la línea de regresión con unidades que son el cambio en log10 UFC / ml por hora de exposición al agente). Para fines de comparación, cuanto más negativa es la pendiente, más rápida es la tasa de actividad bactericida. La regresión lineal se puede usar para definir las pendientes de las curvas de tiempo muerto. Otro método para comparar la curva de tiempo-muerte es calcular el porcentaje medio muerto en varias ocasiones. Si se elige el método de eliminación del tiempo, es importante que el usuario determine la reproducibilidad intralaboratorio de los recuentos de colonias (log10 UFC / ml) que pueden afectar la interpretación de los resultados. Preparación del inoculo. Si el aislamiento de prueba se almacenó (por ejemplo, a -20 ºC o -50 ºC), es aconsejable subcultivar el aislado tres veces antes de la prueba para garantizar que el organismo tenga un crecimiento y un estado metabólico óptimos antes de la exposición al fármaco. La preparación del inóculo es similar a otros métodos utilizados para la prueba de susceptibilidad. (1) Para abordar la posibilidad de resistencia distribuida heterogéneamente entre colonias, toque ligeramente entre 5 y 30 colonias de un único tipo morfológico de una placa de agar de 16 a 24 horas que contenga un medio de cultivo no selectivo e inocúlelas en un tubo que contenga 5,0 ml de caldo precalentado (35 ºC) (Mueller Hinton o caldo de soya tripticasa). Para las bacterias gramn egativas, se necesitan menos colonias (cinco colonias) que para las bacterias gram positivas. (2) Incube esta suspensión bacteriana a 35 ° C hasta que esté visiblemente turbia, por ejemplo, hasta 6 horas para los estafilococos y <6 horas para las varillas gram negativas. Se recomienda que este inóculo de la fase logarítmica se prepare en un matraz, vaso de precipitados o botella y se incube con una incubadora-sacudidor para promover la uniformidad y la optimización del crecimiento. (3) Ajuste la turbidez del cultivo de caldo en crecimiento activo (fase logarítmica) para obtener una turbidez comparable visualmente a la de un estándar de turbidez McFarland de 0.5.2 Diluya el cultivo ajustado en caldo (método de macrodilución) o solución salina al 0,9% (método de microdilución) de modo que después de la inoculación, cada tubo o pocillo contenga aproximadamente 5 x 105 UFC / ml. El número de UFC / ml en el medio de caldo justo antes de la incubación, es decir, el inóculo final, se estima en comparación con un estándar de turbidez de McFarland y luego se usa para inocular soluciones de antibióticos. Sin embargo, el recuento de colonias de este inóculo final debe determinarse por dilución en serie en solución salina y subcultivo a incubación media y durante la noche para permitir la interpretación de los puntos finales de muerte. El procedimiento de dilución para obtener este inóculo final varía de acuerdo con el método y se debe calcular para cada sistema. El volumen de inóculo exacto entregado a los tubos o pozos debe conocerse antes de poder realizar este cálculo. Por ejemplo, si el volumen del medio en el tubo es de 2,0 ml y el inóculo es de 0,1 ml, el cultivo ajustado (1,5 x 10 8 CFU / ml) se debe diluir 1:20 con caldo para obtener 7,5 x 106 CFU / ml. Cuando se inoculan 0,1 ml de esta última suspensión en 2,0 ml de caldo, el inóculo final de bacterias será de aproximadamente 4 x 105 UFC / ml. Debido a que la prueba bactericida mínima mide el 99,9% de la muerte del inóculo final, se preparan varias alícuotas de inóculo final a 35 ºC si se utiliza el método de tubo o matraz pequeño. La primera alícuota se usa para medir el tamaño del inóculo por dilución en serie en solución salina y subcultivo a medio sólido para que al día siguiente se pueda determinar adecuadamente el punto final de muerte. Se usan otras alícuotas idénticas para inocular soluciones antibióticas. Las colonias viables en el inóculo se deben contar para verificar el tamaño final del inóculo. (Esto puede hacerse fácilmente utilizando el tubo de ensayo de control de crecimiento o un segundo pocillo de control de crecimiento en la placa de microdilución). Esto se hace utilizando una micropipeta para administrar 0,1 ml de cada uno de un 10-2, 10-3 y 10 -4 dilución del inóculo final en solución salina sobre las superficies de placas de agar y luego esparcir esto sobre la superficie. Después de la incubación durante la noche, la placa que muestra de 20 a 200 colonias se usa para calcular el tamaño final del inóculo. Por ejemplo, si hay 40 colonias en la placa inoculada con 0.1 ml de una dilución 1: 1000 (dilución final de 10-4), entonces el inóculo contenía (40 x 104 o) 4 x 105 UFC / ml. Procedimiento El método de la curva de tiempo muerto se realiza en tubos de vidrio (matraces o vasos de precipitados, siempre que sea posible) que contienen cada uno > 10 ml de MHB o caldo adecuado y las concentraciones elegidas de agente (s) antimicrobiano (s) a analizar. Los frascos, vasos o botellas permiten analizar un mayor volumen de caldo, lo que resulta en un desafío mayor para el agente antimicrobiano debido al número absoluto de organismos y la optimización del crecimiento, y, por lo tanto, la tasa de muerte. Un tubo o matraz sin antibiótico se usa como control de crecimiento. El inóculo se prepara según los métodos utilizados en otros tipos de pruebas de susceptibilidad. Si se usan tubos de ensayo, se debe agregar el inóculo de una manera que evite cualquier salpicadura en el interior del tubo de ensayo sobre el menisco. Los tubos deben pasar por vortex antes del muestreo para resuspender las bacterias que se adhieren a la pared. Determinación de puntos finales El muestreo para el recuento de colonias se realiza mediante la eliminación de muestras de 0,5 ml del caldo a horas específicas. Los tiempos incluyen cero horas, y generalmente 4, 8, 10 a 12 y 24 horas. Estas muestras se diluyen en serie en tubos de ensayo que contienen 4,5 ml de solución salina estéril (NaCl al 0,9%) para producir diluciones de 10 veces (10-1,10-2,10-3, 10-4). Hay una serie de métodos para determinar la CFU / mL a partir de estas diluciones. Las muestras (al menos 10 uL pero no más de 100 uL) se pueden eliminar de las diluciones seriadas, se pipetean en una placa de agar, se rayan y se cruzan de 10 a 20 minutos más tarde. Alternativamente, se pueden incorporar muestras de 1 ml de las diluciones seriadas en placas de vertido de agar. Otro método más usa muestras de 20 a 50 μL que se dejan caer sobre cada uno de los cinco puntos sobre placas de agar calentadas (35 oC durante 1 hora) y se dejan absorber sin estrías. Cualquiera que sea el método que se use, el número mínimo y exacto detectable de UFC / ml se debe determinar mediante diluciones en serie con un inóculo conocido. Cuando se prueban concentraciones más altas (> 4 x CMI) del (de los) agente (s) antimicrobiano (por ejemplo, agentes β-lactámicos), la transferencia del fármaco puede ser un problema. Puede ser un problema para las drogas con efecto de inóculo, incluso a 1 x MIC. Las diluciones en serie (10-1, 102,10-3, 10-4) en solución salina pueden minimizar este problema. Secar el inóculo sobre la superficie del agar antes de rayar también puede reducir el arrastre de antibióticos. Los problemas potenciales con el arrastre del fármaco se pueden determinar al rayar inicialmente una muestra de 100 uL del organismo de prueba en toda la superficie de una placa de agar caliente. Después de 10 a 20 minutos para permitir la absorción antimicrobiana en el agar, la placa se cruza con rayas cruzadas sobre toda la superficie. El arrastre antimicrobiano se puede detectar mediante la inhibición del crecimiento colonial en el sitio de la raya inicial. Si el arrastre de antibióticos es un problema, las células se pueden lavar después del muestreo del cultivo de caldo. Para los agentes b-lactámicos o los aminoglucósidos, se pueden usar aditivos tales como b-lactamasa o NaCl, respectivamente, para evitar el efecto del arrastre del fármaco. Las colonias se cuentan después de 24 a 48 horas de incubación. La incubación prolongada (48 horas) facilita el recuento de colonias, ya que las colonias son más grandes. Con ciertas combinaciones de organismo / antibiótico, las colonias resultantes se pueden cambiar (por ejemplo, tamaño enano) y no detectarse fácilmente. La incubación prolongada de las placas antes de que se cuenten las colonias puede ser más precisa. Una lente de aumento puede facilitar el recuento de colonias cuando las placas se incuban durante 24 horas. Los resultados de las determinaciones de muerte-cinética se pueden mostrar gráficamente trazando log10 CFU contra el tiempo. Se puede observar un efecto bactericida por una disminución > 3 log10 (muerte del 99,9%) en UFC en el momento especificado. Si se mide la sinergia de una combinación de agentes, la sinergia se puede definir como una disminución > 2 log10 en CFU / ml entre la combinación y su constituyente más activo. Al menos uno de los agentes antimicrobianos debe estar presente a una concentración que no afecte a la curva de crecimiento del organismo de prueba cuando se usa solo. Interpretación La interpretación de curvas de tiempo muerto y MBC puede ser difícil. Los resultados de Kill-Kinetic son más fáciles de interpretar durante las primeras 12 horas. Se sugiere tener un fármaco de comparación que se sabe que es bactericida contra el patógeno de prueba. Esto minimiza el problema con el rebrote. La comparación de aislados de casos clínicos con aislados de casos similares donde se logró la curación parece ser la forma más predictiva de evaluar los resultados de la cinética de muerte. Puede ser necesario un alto inóculo (107 UFC / ml) para evaluar los microorganismos que producen b-lactamasa si se están probando agentes b-lactámicos. Los MBC son especialmente difíciles de interpretar para ciertos microorganismos y antibióticos. Los agentes de S. aureus y b-lactámicos, en particular, son un problema con respecto a la interpretación debido a la mala reproducibilidad con las pruebas de MBC. Además, el efecto paradójico se ve a menudo con S. aureus. El efecto paradójico se define como la aparición de recuentos de placas progresivamente crecientes durante al menos tres concentraciones consecutivas por encima de la CIM. Si esto ocurre, las concentraciones que exhiben el efecto paradójico generalmente se ignoran para S. aureus, pero se toman en cuenta cuando se trata de bacterias gram negativas que pueden ser productores inducibles / constitutivos del grupo 1 b-lactamasa (p. Ej., Enterobacter, P aeruginosa). Método de dilución de agar. El método de recuento en placa de dilución en agar se realiza preparando primero placas de agar Mueller-Hinton que contienen concentraciones de dilución dobles del agente β-lactama deseado. Cada placa de un panel de dilución se inocula pipeteando 0,05 ml (5 x 105 CFU por placa) de una preparación de inóculo estandarizada sobre la superficie del agar. Haga una raya inmediatamente con un bucle bacteriológico o una punta de pipeta para dispersar el inóculo en al menos tres direcciones opuestas. Las placas veteadas se dejan secar durante aproximadamente 15 minutos, en cuyo momento se superponen con 10 ml de agar Mueller-Hinton fundido (48 ºC) que contiene una concentración análoga del agente b-lactámico. La ventaja del método de recuento en placa de dilución en agar para la determinación de actividad bactericida es que minimiza la introducción de resultados espurios debido a factores técnicos. Debido a que las bacterias están inmovilizadas en una matriz de agar-gel, durante el tiempo de exposición bacteriana al antibiótico y durante el tiempo de recrecimiento de CFU viables después de la inactivación del agente, los factores técnicos (como el secuestro de la bacteria en las paredes del recipiente) por encima de la superficie del caldo, se minimiza el uso de inóculo de fase estacionaria y el arrastre de cantidades inhibidoras de agentes antimicrobianos sobre las placas de subcultivo). Método. Después de la incubación de la placa de agar durante 24 horas, se puede determinar la MIC. La CIM se define como la concentración en la primera placa de la serie de concentración ascendente para la cual el recuento de placa es al menos dos desviaciones estándar por debajo de la que representa el 0,1% del recuento de inóculo final. Los MBC pueden realizarse en cualquier período de tiempo especificado (por ejemplo, 3, 6, 12, 24 horas). Las MBC se realizan al primero inactivar el agente blactámico al inundar cada placa con 1 ml de una mezcla de b-lactamasa que contiene ambas lactamasas de los tipos I y II de Bacillus cereus. Después de la aplicación de la solución de blactamasa, las placas se vuelven a incubar durante 48 horas, momento en el que se realizan recuentos de colonias para determinar porcentajes de persistencia para cada concentración de βlactama. El MBC se define como la concentración en la primera placa de la serie de concentración ascendente para la cual el recuento de placa es al menos dos desviaciones estándar por debajo de la que representa el 0,1% del recuento de inóculo final Incubación. Para todos los métodos de prueba, las placas, tubos o bandejas deben incubarse a 35 ºC en aire o con CO2, si es necesario para el crecimiento del aislado del paciente. Para mantener la misma temperatura de incubación para todos los cultivos, las bandejas de microdilución no deben apilarse a más de cuatro de alto. Ejemplo de aplicación de método. La actividad antibacteriana de los extractos se determinó utilizando el método estándar del Clinical Laboratory Standard Institute. El agar nutriente (Biolab) se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego se colocó en un baño de agua a 50 ° C. A continuación, se preparó una solución madre de los extractos en DMSO (Sigma) y se diluyó adicionalmente en agar (Biolab) a 50 ° C para obtener unas concentraciones finales que oscilaban entre 0,3 y 5,0 mg / ml. Un mililitro (1 ml) de cada dilución del extracto se mezcló luego con agar de prueba de sensibilidad fundida (19 ml) a 50 ° C y luego se vertió en placas de Petri estériles para permitir que el agar se enfriara. Las placas que contenían solo agar nutritivo y otro conjunto que contenía agar nutritivo y disolvente de extracción se utilizaron como controles negativos, mientras que las placas que contenían amoxicilina (fármaco estándar) y ciprofloxacina (fármaco estándar) se usaron como controles positivos. Después de eso, la superficie del agar se dejó secar antes de que se estriara con cultivos de caldo de una noche estandarizados de las bacterias de prueba. Las placas se incubaron luego durante 24 ha 37ºC bajo condiciones aeróbicas. Cada prueba se realizó por triplicado. La CIM se definió como la concentración más baja del extracto o patrones (amoxicilina y ciprofloxacina) que inhibía por completo el crecimiento visible del organismo.
