Subido por Victor Aca

Análisis cuantitativo de cannabinoides a partir de cannabisbien

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ANÁLISIS CUANTITATIVO DE
CANNABINOIDES A PARTIR DE
CANNABIS SATIVA UTILIZANDO 1HNMR
Integrantes
Viviana Elizabeth Gutiérrez Rangel
Ali Giese Guzmán Ramos
Melissa Romero Vargas
Gabriela Xicotencatl Sarmiento
Introducción
La planta de cannabis ha sido de interés medicinal durante siglos.
Entre los componentes de Cannabis sativa, los cannabinoides han
sido reconocidos como los componentes activos para la mayoría de
las actividades clínicas
Cannabinoides disponibles comercialmente como normas de referencia
certificadas:
•
•
•
•
delta-9-tetrahidrocannabinol ( D 9-THC o THC)
delta-8-tetrahidrocannabinol ( D 8- THC)
cannabidiol (CBD)
cannabinol (CBN:
Las actividades farmacológicas de los cannabinoides son muy diversas,
que van desde analgésico y antieméticos hasta el tratamiento de
glaucoma y esclerosis múltiple.
Material vegetal
• El material vegetal de cannabis sativa se obtuvo
del Instituto Stichting para la marihuana
medicinal (SIMM) en Rotterdam, Países Bajos, y
de Bedrocan BV, Países Bajos.
• Se utilizaron cuatro variedades diferentes de
cannabis.
• Después de la cosecha, el material vegetal se
secó al aire en la oscuridad a temperatura y
humedad constantes durante 4 semanas.
• Solo se usaron flowertops de plantas
femeninas. Estos se manicuraron para eliminar
otro material vegetal como hojas y tallos, y se
almacenaron a 20 ° C.
Extracción y cuantificación de
cannabinoides
Para cada análisis de material vegetal
(350 mg de peso seco) o control de
recuperación se extrajeron dos veces
durante 10 min con 15 ml de
metanol / cloroformo (9: 1, v / v).
Para evaluar la linealidad entre el
tamaño de la muestra del material
vegetal y el resultado de la
cuantificación, se extrajeron y
cuantificaron diferentes cantidades de
material vegetal (100, 300, 500 mg, todas
por triplicado).
Extracciones se iniciaron con 2
minutos de ultrasonidos y se
realizaron a 4 ° C. Ambos extractos
se combinaron y el volumen se llevó
a 50 ml con disolvente de
extracción.
Todos los experimentos se
basaron en triplicados. Para
los materiales vegetales, solo
se determinó la cantidad de
THCA.
Luego se mezclaron
0,5 ml de extracto
con 1,00 mg de
antraceno como
patrón interno.
Estas muestras se
evaporaron usando una
centrífuga de vacío y se
redisolvieron en 1 ml de
CDCl3 para análisis de 1
H-NMR.
Solventes y productos químicos
• El antraceno se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Se obtuvo cloroformo
desuterizado (CDCl3, 99,8%) de Eurisotop (Gif-sur-Yvette, Francia). Todos los
solventes orgánicos fueron de grado analítico y se obtuvieron de Merck Biosolve
Ltd. Valkenswaard, Países Bajos.
Cannabinoide
s puros fueron
previamente
aislados e
identificados
Se almacenaron
como soluciones
etanólicas a 20 °
C.
Los siguientes
cannabinoides
aislados se usaron
para la
cuantificación:
• delta-9-tetrahidrocannabinolic
acid A (THCA)
• cannabidiol (CBD)
• ácido cannabidiólico (CBDA)
• cannabinol (CBN)
• delta-9 tetrahidrocannabinol
(THC),
Los espectros de H-NMR
• Se registraron en CDCl3 usando un espectrómetro Bruker DPX 300, equipado
con una computadora Indy Silicon Graphics.
Para cada muestra se
registraron.
64 escaneos con los siguientes parámetros:
 puntos de datos de 32 K
 ancho de pulso de 4.0 ms
 retraso de relajación de 1 segundo.
Los FID fueron transformados de Fourier con LB de 0.5 Hz. Para el análisis
cuantitativo, se usó el área de pico después de la corrección de la línea de base.
Determinación de precisión
Se utilizaron estándares de cannabinoides certificados para evaluar la precisión
del método desarrollado.
De los viales recién abiertos
que contenían THC (1,0 mg /
ml), CBD (0,99 mg / ml) y
CBN (0,98 mg / ml) se
mezclaron 100 ml con 1,00
mg de antraceno como patrón
interno (todo por triplicado).
Se evaporaron usando
una centrífuga de
vacío y se
redisolvieron en 1 ml
de CDCl3 para análisis
de RMN.
Una parte alícuota
de las soluciones
etanólicas de los
patrones de
cannabinoides, se
diluyeron en etanol
a una concentración
de
aproximadamente
0,5 mg / ml
Cuantificaron
como se
describió
anteriormente.
Evaluación de la recuperación de
cannabinoides
• Quinientos miligramos de papel de filtro de celulosa (Schleicher
& schuell, GmbH, Cassel, Alemania)
Se cortaron
en trozos de
aprox. 0,5 cm
de diametro
Se coloca en
el recipiente
de extracción.
Cada cannabinoide
aislado (1,0 mg en
etanol) se añadió a
los discos de papel
de filtro.
Las muestras
añadidas se secaron a
temperatura ambiente
durante 24 h antes de
la extracción.
Resultados y discusión
■ Se realizo el método de H-NMR para el análisis cuantitativo de
cannabinoides y cannabinoides puros presente en el material vegetal
Cannabis sativa, para realizar un análisis cuantitativo de
cannabinoides sin la necesidad de separación cromatográfica
Tabla 1. Cuantificación de cantidades conocidas de
patrones de cannabinoides obtenidos comercialmente
CBN
Espectros de RMN
obtenidos en estos
experimentos
THCA-A
Fig. 2.
Espectros de RMN H de 0,5 mg (en
peso) de cada cannabinoide junto
con 1 mg de antraceno como
patrón interno
THC
CBDA
Fig. 2.
Espectros de RMN H de 0,5 mg (en
peso) de cada cannabinoide junto con 1
mg de antraceno como patrón interno
CBD
Fig. 2.
Espectros de RMN H de 0,5 mg (en peso) de cada cannabinoide
junto con 1 mg de antraceno como patrón interno
Tabla 2. Linealidad de las curvas de calibración de los cannabinoides
■ 𝑟 2 = mayor 0.99 (valores precisos)
La recuperación de cada cannabinoide con el método utilizado fue más de
92%
Tabla 3. Recuperación de los cannabinoides (%) después de
la extracción del papel de filtro con metanol / cloroformo, 9:
1 (v: v)
Los extractos de cuatro cultivos diferentes de Cannabis sativa fueron analizados
por su contenido de THCA utilizando el H-RMN
Casi no contenían THCA pero si un alto valor de CBDA
Fig. 3
Espectro H-NMR de un extracto de cannabis tipo droga junto con 1 mg
de antraceno como patrón interno
Tabla 4. Cuantificación de la cantidad de THCA en cuatro tipos diferentes de cannabis
(mg / g de material vegetal de peso seco), calculada a partir de la cantidad de
THCA en los extractos con RMN y GC
La fig. 4 muestra la alta linealidad entre la
cantidad de cannabis utilizado para la
extracción
y
los
resultados
de
cuantificación de THCA (no realizado para
CBDA).
Fig. 4
Linealidad entre la cantidad de material vegetal
extraído de cannabis y la cantidad de THCA (en
unidades arbitrarias) después de la cuantificación
Conclusión
■ El contenido del cannabinoide principal del material vegetal de Cannabis sativa y en
las preparaciones de cannabinoides aisladas se pudo analizar con un método
simple y en poco tiempo de solo 5 minutos.
■ El método de 1H-NMR tiene la ventaja de obtener un perfil general del extracto y se
puede determinar la pureza de un cannabinoide aislado, así como la identidad de
las impurezas
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