HPLC

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN
FACULTAD DE QUÍMICA
ANÁLISIS DE DROGAS Y MEDICAMENTOS
Práctica 6
“Identificación y cuantificación de Naproxeno por
cromatografía de líquidos”
Equipo 4:
Manzanilla Rivas Raúl
Mijangos Ramos Iván Felipe
Rangel Méndez Jorge Aarón
Sánchez Yama Jorge
Fecha de entrega:
16-Abril-2010
6to. Semestre
Salón 7
INTRODUCCIÓN
El naproxeno es antiinflamatorio no esteroidal derivado del ácido fenilpropiónico
que presenta actividad analgésica así como antipirética. Tiene apariencia de
polvo blanco cristalino, carece de
olor característico y es prácticamente
insoluble en agua. Es ampliamente empleado en la farmacología y administrado
generalmente por vía oral. Por esta vía es absorbido a nivel de las membranas
del
tracto
gastrointestinal
para
pasar
a
la
circulación
sanguínea
y
posteriormente se dirige al sitio blanco para ejercer su acción farmacológica 1.
Su uso se asocia a una menor incidencia de alteraciones gastrointestinales que
la del AAS por lo que se le da un uso muy amplio en el área de la farmacología.
Como es el caso de cualquier medicamento de uso generalizado la industria
farmacéutica requiere de herramientas y métodos para el monitoreo de la
cantidad de principio activo en este tipo de formas farmacéuticas y encuentra en
la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) una poderosa herramienta.
La CLAR es una técnica de separación constituida por una fase estacionaria
sólida y una fase móvil líquida. Las separaciones se logran por partición,
2
adsorción o procesos de intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria
empleada. Los compuestos a analizar se disuelven en un líquido orgánico y la
mayoría de las separaciones tienen lugar a temperatura ambiente. Por lo tanto,
la mayoría de las drogas, sean compuestos no volátiles o térmicamente
inestables,
pueden
analizarse
mediante
esta
técnica
sin
riesgo
de
descomposición. El tiempo de elusión de un compuesto puede ser descrito por
su factor de capacidad, ya que depende de la naturaleza química del
compuesto analizado, la composición y la velocidad de flujo de la fase móvil y la
composición y el área superficial de la fase estacionaria. La longitud de la
columna es un parámetro determinante de la resolución. Sólo los compuestos
que tienen diferentes factores de capacidad pueden ser separados por CLAR 2.
Se estima que entre el 80 y el 90 % de las separaciones analíticas son
realizadas en la modalidad de
fase inversa. Prácticamente todas las
separaciones en fase inversa son llevadas a cabo con fases estacionarias con
superficies hidrofóbicas químicamente modificadas. Pequeñas variaciones en
la superficie química y geométrica puede conducir a notables diferencias en la
interacción con la superficie, y como resultado de esto, diferencias en la
selectividad cromatográfica. La fase móvil por mucho es la mayor herramienta
para el control de la retención del analito en el análisis mediante CLAR en fase
inversa. Variaciones en la composición del disolvente, tipo de modificador
orgánico, pH, y concentración del buffer proveen al cromatógrafo de un valioso
conjunto de variables para el desarrollo con éxito de un método de separación 3.
El detector de absorbancia de UV/Vis monitorea la absorción de luz ultravioleta
o visible en el efluente de CLAR. Son los detectores más comunes ya que la
mayoría de los analitos de interés para el área farmacéutica presentan
absorbancia UV. El detector de arreglo de fotodiodos, proporciona espectros UV
mientras que funciona como un detector de absorbancia multifrecuencia UV/Vis.
Facilita la identificación de los picos y es por esto el detector preferido en la
elaboración de métodos analíticos. La validación del método analítico es parte
integral del sistema de control de calidad, puesto que confiere fiabilidad a los
3
resultados analíticos obtenidos en un análisis, a fin de asegurar que un
medicamento cumpla los parámetros de calidad establecidos. La validación del
Factor
COLUMNA
Descripción
Octadecil silano unido químicamente a poros
de gel sílice o micropartículas de cerámica
(water CL-18)
DIMENSIONES
4.6 mm x 15 cm
PRESIÓN MÁXIMA
248 bar
FASE MÓVIL
Acetonitrilo-agua (50:50)
FLUJO
1.0 mL/min
DETECTOR UV-VIS
254 nm
método es un proceso dinámico y no debe ser considerado una situación de
una sola ocasión. El diseño y validación del método debe ser tal forma que
asegure robustez a lo largo de la vida del método. La precisión de los datos es
afectada por las variaciones en el proceso de preparación, la preparación de la
muestra y el rendimiento del instrumento. Cuando los métodos validados son
confiables se generan datos que resultan dignos de confianza.4
Se recomienda separar con
doble espacio los párrafos
de la introducción
OBJETIVO
El alumno aprenderá a usar el cromatógrafo de líquidos para cuantificar una
muestra problema de Naproxeno, empleando el método de calibración absoluta.
METODOLOGÍA
Condiciones de cromatógrafo:
Preparación de la fase móvil.
Se prepararon 30 mL de una mezcla de metanol (grado HPLC) y agua en
proporción 50:50.
4
Preparación de la mezcla de disolvente.
Se prepararon 20 mL de una mezcla de metanol (grado HPLC) y agua en
proporción 90:10.
Preparación de la solución de referencia.
Se preparó una solución de la sustancia de referencia en mezcla de disolvente
con una concentración de 2.5 mg/mL de naproxeno; para lo cual, se pesó 25
mg de naproxeno y se mezcló con la solución de mezcla de disolvente en un
matraz volumétrico de 10 mL y se llevó hasta línea de aforo. Posteriormente se
prepararon 10 mL de una dilución de 25 µg/mL de de naproxeno en fase móvil;
para lo cual, se utilizó 0.1 mL de alícuota de la solución anterior, se adicionó en
un matraz volumétrico y se llevó al aforo de 10 mL con fase móvil.
Preparación de la solución de la muestra.
Se pesaron 5 tabletas de medicamento naproxeno marca GI. Se trituraron las
tabletas en un mortero hasta polvo fino y se trasfirió en un vaso de precipitados
31.7 mg (cantidad equivalente a 25 mg de naproxeno); se añadió 1 mL de agua
destilada y se agitó vigorosamente hasta completa dispersión. Después se filtró
la mezcla directamente a un matraz volumétrico de 10 mL; se llevó a línea de
aforo con metanol (grado HPLC), se mezcló y transfirió una alícuota de 0.1 mL
en un matraz volumétrico de 10 mL. Posteriormente se aforó con fase móvil y
se mezcló perfectamente.
Cuantificación de la muestra problema.
La cuantificación del naproxeno se llevó a cabo mediante Cromatografía de
Líquidos de Alta Eficiencia (CLAE o HPLC por sus siglas en inglés). Se utilizó el
equipo Agilent Technologies 1200 series, se ajustaron los parámetros y se
inyectó volúmenes iguales de 20 µL de la preparación de referencia y de la
muestra problema. Se registraron los cromatogramas y se midieron los tiempos
de retención de los picos principales. Se halló el área bajo los picos e informó la
cantidad de C14H14O3 que había en la muestra tomada.
5
DIAGRAMA DE FLUJO
6
Figura 1. Preparación de la fase móvil y la mezcla de disolvente.
7
Figura 2. Metodología empleada en la determinación de naproxeno por CLAE.
8
RESULTADOS
Se pesaron las cinco pastillas de naproxeno requeridas para la determinación.
Los pesos se aprecian en la tabla 1.
Tabla 1. Peso de las pastillas de naproxeno.
Número de astilla
Peso (mg)
1.
319.3
2.
316.0
3.
316.3
4.
319.3
5.
317.2
Total
1588.1
El marbete de las pastillas indicaba que contenían 250 mg de naproxeno, por
tanto, la cantidad pesada de las cinco pastillas trituradas equivalente a 25 mg
de naproxeno fue de 31.76 mg.
Se procedió con la determinación empleando el cromatógrafo de líquidos. Los
cromatogramas obtenidos para la solución de referencia y para la muestra
problema se aprecian en las figuras 3 y 4 respectivamente.
9
Figura 3. Cromatograma de la solución de referencia.
Figura 4. Cromatograma de la muestra problema.
La información más relevante de cada cromatograma se resume en la tabla 2.
Cabe señalar, que el pico de importancia en cada caso es el que aparece a
10
2.29 minutos correspondiente al naproxeno y por tanto se proporciona la
información sólo de este pico.
Tabla 2. Parámetros obtenidos de los cromatogramas de la solución de
referencia y de la muestra problema.
Parámetros
Solución de referencia
Muestra problema
Tiempo
2.293 minutos
2.293
Ancho del tiempo
0.0815 minutos
0.0858
Área
492.74280 mAU*s
498.33398 mAU*s
Altura
90.55084 mAU
88.36023 mAU
Área (%)
93.3743
95.0201
Por último se calculó la cantidad de naproxeno en mg presentes en los 31.76
mg pesados originalmente para la determinación de la siguiente manera:
1. Se empleó la fórmula:
DC (Rmp / Rref)
D = Factor de dilución de la muestra problema.
C = Cantidad de naproxeno en referencia
Rmp / Rref = Áreas de los picos obtenidos
2. Sustituyendo la fórmula:
(100) (0.025 mg/mL) (498.33/492.74) = 2.52 mg/mL
(2.52 mg/mL) (10 mL) = 25.28 mg de naproxeno
11
3. Las cinco pastillas debieron tener 1250 mg de naproxeno teóricamente
ya que cada una contenía 250 mg de naproxeno. Sin embargo
experimentalmente se obtuvo que:
31.76 mg ------------------------------------ 25.28 mg de naproxeno
1588.1 mg -----------------------------------
X
X = 1264.07 mg de naproxeno.
DISCUSIONES
Con base en los resultados obtenidos en el análisis de naproxeno para su
identificación y cuantificación por CLAE se tiene que:
El porcentaje de principio activo presente en las cinco pastillas utilizadas en
este análisis está dentro del margen indicado por la FEUM, ya que esta
establece un rango de 90-110 % de principio activo y la muestra analizada
presentó un porcentaje de 101.12 %. Este valor es muy importante ya que
garantiza que el fármaco desarrolle de manera satisfactoria su actividad
farmacológica en el organismo.
Con respecto a la identificación de naproxeno:
Se puede observar que, debido al tempo de retención y al carácter polar del
naproxeno, este tuvo una elución relativamente rápida. Esto era de esperarse
ya que en este análisis por CLAE de fase inversa los analitos mas polares
eluyen de manera más rápida.
Se puede apreciar una gran similitud entre los cromatogramas, ya que los picos
pertenecientes al naproxeno presentan tiempos de retención idénticos, 2.293
para la referencia y la muestra; en cuanto al área, los valores son similares
12
492.74 y 498.33 mAU*s para la referencia y muestra respectivamente. Es en
estos datos donde se puede observar una variación poco significativa la cual
ocasionó el aumento en el porcentaje de principio activo, que sin embargo está
dentro del rango permitido por la FEUM.
Los primeros dos picos que se aprecian en cada uno de los cromatogramas
pueden deberse a impurezas presentes en los disolventes y que no son
retenidas por la columna. Absorbieron luz Uv a la misma longitud de onda del
naproxeno y se puede decir que son especies con una considerable polaridad
debido a que sus tiempos de retención son muy bajos y por lo tanto eluyeron
con bastante rapidez.
CONCLUSIONES
Se cumplió con el objetivo de la práctica de aprender a cuantificar por CLAE
una muestra problema empleando el método de calibración absoluta.
De acuerdo a la cuantificación de las tabletas de naproxeno de 250 mg
realizada por CLAE se obtuvo un porcentaje de principio activo de 101.12 % el
cual está dentro del rango establecido por la FEUM.
El método utilizado posee una gran eficacia en la separación de los compuestos
que conforman una muestra problema en un tiempo bastante corto y con
resultados satisfactorios.
13
Es de gran importancia que los disolventes utilizados sean de grado HPLC para
evitar cualquier dato erróneo en el análisis producido por alguna impureza
contenida en el disolvente.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. P.A. Insel, Analgésicos-Antipiréticos y Antiinflamatorios, y Fármacos
Antigotosos, En: “Goodman & Gilman. Las bases Farmacológicas de la
Terapéutica”,8a edición, Editado por, J.G. Hardman, L.E. Limbird, P.B.
Molinoff, R.W. Ruddon y A.G. Gilman, McGraw-Hill Interamericana
Editores, S.A., México, 1996, pp. 661-686.
2. Meyer, V; Practical High Performance Liquid Cromatography; 4a edición,
John Wiley & Sons. Inc; St. Gallen,Switzerland; 2004; pp.261-265
3. Dong,M; Modern HPLC for Practicing Scientists; 4ª edición; John Wiley
& Sons, Inc; Hoboken, New Jersey ;2006; pp.136-143 , 195-201.
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