Subido por SANTIAGO ISMAEL DIAZ VIDES

CONTEO DE LEVADURAS CON CAMARA DE NEUBAUER

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CONTEO DE LEVADURAS CON CAMARA DE NEUBAUER
YEAST COUNTING WITH NEUBAUER CHAMBER
Santiago Díaz Vides
Resumen
En el presente informe, se realizó la práctica de conteo de levaduras en la
cámara de Neubauer con el fin de que los estudiantes adquieran habilidades en
microscopia básica, las cuales sean capaces de aplicar en futuras prácticas. La
metodología que se aplicó consistió en la dilución de levaduras adquiridas
comercialmente, para posteriormente realizar el montaje de la solución en la
cámara de Neubauer y su observación en el microscopio.
Introducción
El recuento en cámara de Neubauer es una técnica utilizada en medicina y
biología para conocer el número de células presentes en una muestra.
Actualmente esta técnica es utilizada en menor medida con respecto a otras
técnicas de conteo de células que son más precisas y exactas, como la es la
turbidimetría, la citometría, el cálculo de la biomasa, entre otras.
La cámara de Neubauer consiste en una placa de cuarzo gruesa con forma de
portaobjetos, de aproximadamente 30x70 mm y 4 mm de grosor. En una cámara
simple, la parte central es donde se realiza el conteo de células y esta posee
grabada una retícula cuadrangular, esta retícula mide 3 mm x 3 mm de lado, y
se subdivide en 9 cuadros de 1 mm de lado cada uno. El cuadrado central es el
destinado al recuento de hematíes y plaquetas. Se divide en 25 cuadrados
medianos de 0,2 mm de lado y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez
en 16 cuadrados pequeños. Esto quiere decir que el cuadrado central está
compuesto por 400 cuadrados más pequeños.
El cubreobjeto es un cuadrado de cuarzo de aproximadamente 22 mm x 22 mm.
Al momento de realizar el conteo, se debe ubicar la cámara en el centro de la
placa, de tal manera que cubra la parte central de la cámara, y así se crea un
espacio de 0,1 mm entre la cámara y el cubreobjeto.
Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habrá de preparar una
muestra con una concentración apta para su recuento. Típicamente, el rango de
concentraciones que permite contar el hematocitómetro está entre 250.000
células y 2,5 millones de células por ml. Por debajo de 250.000 células / ml (2,5
* 105) la cantidad de células contadas no es suficiente para poder dar una
estimación lo suficientemente fiable de la concentración celular y por encima de
2,5 millones (2,5 * 106) la probabilidad de cometer errores de conteo crece
demasiado, y también el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un recuento
con fiabilidad. Por encima de esta concentración es conveniente diluir la muestra
para acercar la concentración al rango óptimo.
Metodología
Se realiza una solución madre con la levadura, y luego se toman 10 µL y se
diluyen en 1ml, para obtener una solución de 10-2.
Se toman 10 µL de la mezcla preparada anteriormente con la micropipeta, se
coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se coloca en posición
horizontal sobre la mesa, en un lugar donde sea cómodo pipetear. Se saca la
punta de la pipeta de la muestra, y siempre manteniéndola en posición vertical
se lleva hasta la cámara de Neubauer. Se coloca la punta de la pipeta en el borde
del cubreobjetos, en el extremo de la cámara de Neubauer. Se trata de dejar que
el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral, por
capilaridad. Se suelta el pistón suavemente mientras se supervisa que el líquido
está entrando correctamente y de forma uniforme en la cámara. En caso de que
aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien,
repetir la operación.
Una vez cargada la cámara de Neubauer para el recuento celular, se lleva al
microscopio donde se colocó la cámara de Neubauer en la bandeja del mismo.
Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. Para este informe
se contaron 5 cuadros grandes de una cámara de Neubauer de 0,1 mm de
profundidad. Realizar el recuento celular por cuadros seleccionados previamente
y anotar en una hoja de resultados la cantidad de células contadas en el primer
cuadro. Repetir el procedimiento con el numero de cuadros seleccionados, en
este caso 5 cuadros. Mientras mayor sea el número de cuadros a contabilizar,
mayor será la precisión de la medida.
Posterior al conteo de células se debe aplicar la formula del calculo para la
concentración celular la cual está definida a continuación por la ecuación 1:
𝑪𝒆𝒍
# 𝒄𝒆𝒍 𝒙 𝑭𝑫
=
𝒎𝒍
# 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝑽
Ecuación 1.
Cel/ml = Concentración celular en un mililitro, # cel = Numero de células, FD = Factor
de dilución, # cuadros = Numero de cuadros, V = Volumen de la cámara
El número de células es la suma de todas las células contadas en todos los
cuadros.
El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde hemos hecho el
recuento. Como el volumen de 1 cuadro grande es:
0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie
0,01 cm2 * 0,1 mm (profundidad) = 0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001
ml
Resultados
Anteriormente se dijo que contaron 5 cuadros, sin embargo, no se especificaron,
estos cuadros fueron los cuadros de las esquinas y el cuadro central, como se
muestra en la figura 1.
Figura 1.
La observación y conteo de levaduras bajo el microscopio óptico se vio de la
siguiente manera:
En el cuadrado superior izquierdo se contaron 25 levaduras, en el derecho se
contaron 19, en el extremo inferior izquierdo el conteo de células fue de 22
levaduras y en derecho del mismo lado fue de 27 levaduras y finalmente el
cuadrado central tuvo un total de 44 levaduras.
Una vez hecho el conteo de células, se procede a reportar la concentración de
células por mililitro, para ello se empleó la Ecuación 1, y se reemplazaron las
variables por los respectivos valores que se tienen, de tal manera que:
# cel, son las células que se contaron anteriormente, pero deben calcularse
individualmente por cuadrante.
FD, es el factor de dilución, en este caso, la muestra se diluyó hasta 10 -2 por lo
tanto, el factor de dilución es el inverso, es decir, 100.
# cuadros, esto se refiere a los cuadros en los cuales se realizó el conteo, como
se realizo en el cuadro central, este está compuesto de 25 cuadrados grandes y
16 cuadrados más pequeños, por lo tanto, el área total seria de 25x16=400
cuadros.
V, es el volumen de la cubeta es de 0,0001 ml debido a que cada el área es de
0,01 mm2, multiplicado por el espacio que hay entra el cubreobjeto y la placa que
es de 0,1 mm.
Por lo tanto, al reemplazar quedaría de la siguiente manera:
𝑪𝒆𝒍
𝟐𝟓 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎
=
𝒎𝒍
𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍
= 6,25x104 cel/ml
𝑪𝒆𝒍
𝟏𝟗 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎
=
𝒎𝒍
𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍
= 4,75x104 cel/ml
𝑪𝒆𝒍
𝟒𝟒 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎
=
𝒎𝒍
𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍
= 1,1x105 cel/ml
𝑪𝒆𝒍
𝟐𝟐 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎
=
𝒎𝒍
𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍
= 5,5x104 cel/ml
𝑪𝒆𝒍
𝟐𝟕 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎
=
𝒎𝒍
𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍
= 6,75x104 cel/ml
Finalmente, para obtener la concentración total de células levaduriformes, se
realiza una sumatoria de totas las concentraciones cel/ml:
∑(cel/ml) = (6,25x104 + 4,75x104 + 1,1x105 + 5,5x104 + 6,75x104) cel/ml
∑(cel/ml) = 3,42x105 cel/ml
Análisis de resultados
El análisis con respecto al resultado final, el cual se compone de la sumatoria de
las concentraciones por cuadrante, es una medición precisa si se habla del
intervalo de medición con respecto a la cámara de Neubauer, debido a que para
células sanguíneas como los glóbulos rojos, la cámara está diseñada para un
recuento de 250000 y 2500000 células, por lo tanto 342000 células, se encuentra
dentro de ese rango, cercano al extremo inferior del intervalo, de lo cual se puede
afirmar que la concentración celular es menor al promedio de células contables,
el cual es de aproximadamente 1,375x10 106 células por mililitro.
Sin embargo, la técnica de recuento en cámara de Neubauer tiene un intervalo
sesgado que es el que esta comprendido por los valores que se anunciaron
previamente, por lo tanto si hay mayor o menor cantidad se incurriría en un error
de estimación, por lo tanto esta técnica debe ser empleada para el conteo de
esporas en fluidos humanos (en medicina) pero también se puede aplicar para
el campo alimentario y agropecuario.
En caso de tener en poder un equipo con mayor poder de precisión y exactitud
como el espectrofotómetro se puede usar una técnica de turbidimetría para medir
la turbidez en una muestra y encontrar la concentración de células estimada por
una curva de calibración establecida por la escala de McFarland.
Conclusión
El recuento en cámara de Neubauer es una técnica para el conteo de células y
esporas que se ha establecido como una de las más populares debido a que fue
una de las primeras técnicas para la detección de enfermedades ya que si se
encontraba un numero celular superior al promedio, se reporta que la microbiota
está afectada y que ha sido contaminada por una mayor población, la cual es la
célula del conteo. Actualmente, con el avance tecnológico de la sociedad y en
este caso la ciencia, existen nuevas técnicas que permiten estimar que la
concentración de células en una muestra sea mucho más precisa, no obstante,
la cámara de Neubauer no ha sido dejada de utilizar por laboratorios y estudios
que la prefieren o por que no tienen los recursos necesarios para pagar un
estudio más costoso.
Referencias bibliográficas
-
O. Bastidas.
"Conteo
Celular
con
Hematocitómetro".
Celeromics. https://mural.uv.es/basgaros/Conteo-Camara-Neubauer.pdf (accedido
el 23 de mayo de 2022).
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