Inhibidores potenciales de TTBK1 en la enfermedad de Alzheimer: Un análisis integrado de Docking y Dinámica molecular Natalia Rincón Montes1, María Juliana Pimiento Pacheco2 1. Microbiología, Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes, 2. Biología, Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Introducción La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por un declive a nivel cognitivo, comportamental y funcional con manifestaciones clínicas frecuentes como la pérdida de memoria de eventos recientes (Scheltens et al, 2016). La EA es reconocida como la principal causa de demencia por la OMS contribuyendo en un 60-70% de los casos (OMS, 2023). La prevalecía de demencia por Alzheimer incrementa de forma drástica con la edad, por lo que constituye un desafío considerable en el panorama de la salud, particularmente entre la población de adultos mayores. Las características patológicas distintivas en el tejido cerebral de individuos con EA incluyen niveles aumentados de β-amiloide (Aβ) y tau hiperfosforilada (p-tau) (Zhang, 2021). Aquí nos centraremos en la hiperfosforilación de tau y los NFTs, los cuales son marcadores claves para el diagnóstico neuropatológico de EA (Metaxas & Kempf, 2016). Tau es una proteína que principalmente se encarga de facilitar la formación y estabilización de los microtúbulos (Yoshida et al., 2012). Los microtúbulos se extienden por los axones neuronales y son esenciales para el transporte celular (Kumar et al., 2023). En la EA se produce una alteración en la proteína tau mediante un proceso de hiperfosforilación, el cual resulta en la formación de agregados de tau que desencadenan en la formación de NFTs, estos son estructuras anómalas de fibrillas de agregados de tau retorcidos (Kumar et al, 2023). Los NFTs interfieren con las funciones normales de las células nerviosas, contribuyendo al daño celular y al avance de la enfermedad. Por otra parte, TTBK1 es una serina/treonina/tirosina quinasa conservada expresada en el cerebro, específicamente en las neuronas corticales y del hipocampo (Sato et al., 2006). En estudios se ha encontrado que TTBK1 fosforila las proteínas tau en sitios relacionados con la EA, incluidos Ser198, Ser199, Ser202 y Ser422, e induce la agregación de tau (Sato et al., 2006). Dada la relación de TTBK1 con la fosforilación de Tau, TTBK1 surge como un blanco clave para abordar la EA, y sus inhibidores selectivos se perfilan como prometedores fármacos eficaces para el tratamiento de esta afección. Por tanto, el objetivo de este trabajo es evaluar dos fármacos PDB:VP7 y PDB:IQY como potenciales inhibidores de TTBK1. Para el cumplimiento de este objetivo, se realizó el uso de herramientas bioinformáticas como el docking y la dinámica molecular. Primero, el docking molecular o acoplamiento ligando-proteína tiene como objetivo prever cómo se unirá un ligando a una proteína de estructura tridimensional conocida (Morris & Lim-Wilby, 2008). En este caso el acoplamiento de los ligandos VP7 e IQY a TTBK1. Los métodos exitosos de docking exploran eficazmente espacios de alta dimensión y utilizan funciones de puntuación precisa, lo cual es valioso para cribar bibliotecas de compuestos, clasificar resultados y proponer hipótesis sobre la inhibición del blanco (Morris & Lim-Wilby, 2008). A su vez, la dinámica molecular se centra en la interacción entre los ligandos VP7 e IQY y la proteína TTBK1, permitiendo una simulación detallada de eventos a nivel atómico durante su unión. Esta aproximación captura cambios conformacionales, fuerzas de interacción y energías asociadas, facilitando la comprensión de cómo los ligandos impactan en la estructura y dinámica de la proteína. Este análisis revela información crucial sobre la afinidad y estabilidad de la interacción ligando-proteína, siendo fundamental para desentrañar los mecanismos subyacentes. Los resultados de la dinámica molecular contribuyen a comprender la relación molecular entre los ligandos y la proteína TTBK1, con posibles aplicaciones en el diseño de fármacos (Sargsyan et al., 2017). Metodología Docking Preparación de las estructuras pre-Docking. Para ello se descargaron las estructuras correspondientes a TTBK1 y los ligandos VP7 e IQY desde el Protein Data Bank (PDB), identificadas con los códigos 7ZHN y 7ZHP, respectivamente. Posteriormente, se empleó el software Pymol para la eliminación de moléculas de agua, iones fosfato y moléculas de etanediol Procedimiento de Docking Primero, se realizó la preparación del receptor TTBK1 por medio de la adición de hidrógenos polarizados y la generación de un nuevo archivo pdb . Para los ligandos VP7 e IQY, se realizaron pasos específicos, los cuales incluyeron la configuración de torsiones y la conversión de los ligandos a formato PDBQT. Posteriormente, se realizó la configuración de la cuadrícula para el docking se basó en la asociación de la macromolécula TTBK1 y la definición de dimensiones de la caja X,Y y Z a 44 guardando está en archivo CPF. Los parámetros del docking se ajustaron utilizando el algoritmo genético, especificando archivos de entrada y salida. Seguidamente, se realizó la ejecución de autogrid, lo que generó archivos .map y .glg, seguido por la ejecución de autodock para llevar a cabo el docking molecular. Análisis e interpretación de Resultados del Docking. Se realizó la evaluación de los resultados del docking mediante el programa Autodock. En este, exploraron diversas conformaciones, priorizando aquellas con menor energía. Finamente, se seleccionó la conformación más estable y se guardó el complejo en formato PDB. Dinámica Parte 1: Preparación con LEaP En la fase inicial de la metodología, se empleó LEaP para la preparación de los ligandos VP7 e IQY antes de la simulación. Estos ajustes detallados se realizaron mediante la modificación de los ligandos en los archivos VP7.mol2 e IQY.mol2. Utilizando herramientas como Parmchk, se generaron archivos de parámetros (.frcmod) para describir las propiedades de los ligandos. Posteriormente, Leap se utilizó para crear archivos adicionales (.lib) esenciales para la simulación. Estos procesos se ejecutaron en la terminal de un nodo específico. La segunda parte de esta etapa incluyó la generación de coordenadas y topología mediante tleap, con la adecuación de los nombres de archivos en el input correspondiente. Estas acciones aseguraron que los ligandos estuvieran listos para desempeñar su función en la simulación de la interacción con la proteína TTBK1. Parte 2: Ejecución con Amber La siguiente fase consistió en la ejecución del software Amber para simular las interacciones entre los ligandos VP7 e IQY y la proteína TTBK1. Durante esta etapa, se realizaron ajustes clave en los archivos de la carpeta "inputs dinámicas". La ejecución comprendió tres fases esenciales: minimización, equilibración y producción. En la fase de minimización, se ajustó el archivo min.in, modificando el número máximo de pasos a 2,000,000 y la frecuencia de pasos antes de cambiar al método de gradiente conjugado a 10,000. La equilibración, por su parte, implicó la adaptación de la cantidad de pasos por 100,000 en heat1.in y heat2.in. En heat2.in, se especificó el barostato como Berendsen y la temperatura a 100 K, según el manual de AMBER. Para la fase de producción, se configuró la escritura de archivos rst cada 5,000 pasos, coordenadas cada 10,000 pasos, y un total de 500,000 pasos, siguiendo las pautas del manual de AMBER. La ejecución del trabajo se inició con "nohup sh job.sh &", ajustando los flags según las necesidades específicas. Estos pasos se llevaron a cabo de manera meticulosa para garantizar la integridad y precisión de la simulación. Parte 3: Análisis En la fase final de la metodología, se llevó a cabo un análisis exhaustivo de las simulaciones realizadas. Se utilizó la herramienta CPPTRAJ con los archivos cpptraj.in y cpptraj2.in para evaluar detalladamente las trayectorias de la simulación, abordando aspectos estructurales y dinámicos. Se generaron gráficas esenciales de RMSD para comprender el comportamiento molecular a lo largo del tiempo, y se visualizaron al final con Google Colab, el cual permitió que con el archivo generado de .ipynb se corriera el código para una representación efectiva. Además, se aplicó nuevamente CPPTRAJ con el archivo cluster.in para realizar un análisis de agrupamiento, permitiendo la comprensión de la distribución y agrupación de conformaciones. Estos pasos de análisis proporcionaron una evaluación integral de la dinámica molecular simulada, permitiendo entender la estabilidad, flexibilidad estructural y agrupación de conformaciones relevantes en la interacción entre los ligandos VP7 e IQY y la proteína TTBK1. Resultados y discusión Docking Se obtuvo 50 conformaciones para cada ejecución, tanto para VP7 como IQY, estás se ordenaron según la energía de unión (binding energy), siendo la conformación con la energía de unión más negativa la conformación 1 y la conformación con energía más alta para cada simulación correspondió a la conformación 50. Se define la energía de unión como la suma de las fuerzas intermoleculares que actúan sobre el complejo ligando-receptor (Ecuación 1)(Matossian et al, 2014) Δ𝐺𝑏𝑖𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔 = Δ𝐺𝑣𝑑𝑤 + Δ𝐺𝑒𝑙𝑒𝑐 + Δ𝐺𝐻𝑏𝑜𝑛𝑑 + Δ𝐺𝑑𝑒𝑠𝑜𝑙𝑣 + Δ𝐺𝑡𝑜𝑟𝑠𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙 (Ecuación 1). De lo anterior, se obtuvo los resultados de la tabla 1 a partir de la conformación 1 para cada ligando, VP7 e IQY. Se puede afirmar que el ligando IQY presenta una mayor afinidad a TTBK1 debido a que presenta un valor de energía de unión más negativo que VP7, siendo este de –5.56 (kcal/mol) para IQY y –5.27 (kcal/mol) para VP7. Asimismo, se evaluó la refRMS para cada ligando, esta corresponde a la diferencia Root Median Square (RMS) entre las coordenadas de la conformación actual y estructura de referencia, la RMS es usada para cuantificar la diferencia estructural entre dos estructuras moleculares, como la conformación predicha por el programa de docking y una conformación de referencia (Huey et al, 2012) P. Por defecto, el ligando de entrada se utiliza como la referencia (Huey et al, 2012) Para VP7 se encontró un valor de 5.16Å para su refRMS, lo cual indica que la conformación predicha de VP7 presenta una diferencia estructural de 5.16Å con la estructura de referencia. En el caso de IQY, el valor de refRMS de 5.63 indica una mayor diferencia estructural promedio de aproximadamente 5.63 Å en comparación con la estructura de referencia. Esto sugiere que la conformación predicha de IQY puede ser más variable o tener una desviación estructural más marcada en comparación con VP7. Por otra parte, se realizó el clustering para ambos ligandos (fig. 1.). Para VP7 se observaron 6 clusters, el cluster principal corresponde a 40 conformaciones que tienen una energía de unión menor a 0. A su vez IQY, presentó 10 clusters, su clúster principal consta de 33 conformaciones que presentan una energía de unión menor a 0. Finalmente, también se analizó las interacciones de los ligandos con residuos de aminoácidos para la conformación 1. De ello, se observó que VP7 e IQY interactúan de forma similar con los residuos, IQY presentó interacción con todos los residuos que interactúa VP7. Aunado al residuo LEU179, el cual no interactúa VP7. Así mismo, tanto VP7 como IQY interactúan con el residuo LYS156 por medio de un puente de hidrógeno (fig. 2.). Proteina Ligando refRMS Aminoacid Residues VP7 Binding Energy -5.21 TTKB1 5.16 IQY -5.56 5.63 MET107, LYS63. ASP176, LEU175, ASN159, ASP154, LYS156. MET107, LYS63, LEU175, ASP176, ASN159, AS154, LYS156, LEU179 TTKB1 Tabla 1. Resumen resultados para ligando IQY y VP7 en la conformación 1. A) . B) . Fig 1. A) Clustering para VP7, eje X corresponde a la energía de unión y eje Y al # de conformaciones del cluster. B) Clustering para IQY, eje X corresponde a la energía de unión y eje Y al # de conformaciones del cluster A) . B) . Fig 2. A) Interacciones ligando VP7 en la conformación 1. B) Interacciones ligando IQY en la conformación 1. Dinámica La RMSD, o Root Mean Square Deviation (Desviación Cuadrática Media), es una medida utilizada en biología estructural para evaluar la similitud estructural entre dos conjuntos de átomos, como los átomos de una proteína en su forma original y los átomos de la misma proteína después de algún tipo de modificación o interacción, como la unión de un ligando. En el contexto de la interacción entre ligandos y proteínas, el RMSD se utiliza para evaluar qué tan bien se ajusta o se superpone un ligando con la proteína receptora. Si después de la unión del ligando la estructura de la proteína se desvía significativamente de su forma original, el RMSD será mayor. Un RMSD bajo indica una buena superposición y una interacción más favorable entre el ligando y la proteína (Sargsyan et al., 2017). Interacción proteína-ligando: TTBK1-IQY Interacción proteína-ligando: TTBK1-VP7 Fig 3. RMSD 50ns TTBK1-IQY Fig 4. RMSD 50ns TTBK1-VP7 La curva de RMSD refleja las variaciones en la forma de la proteína TTBK1 durante la interacción con los ligandos IQY y VP7. En el caso del ligando IQY, un RMSD de 0.4 Å indica un acoplamiento efectivo, sugiriendo que el ligando se ubica de manera estable en el sitio de unión de la proteína. Observamos pequeñas fluctuaciones en la estructura de la proteína y el ligando durante la simulación, que podrían ser causadas por movimientos normales debidos al calor y ajustes locales en la estructura debido a la interacción dinámica entre ambos. Es crucial considerar el impacto de la energía de minimización: cuando esta se realiza bajo restricciones que limitan la flexibilidad del receptor, puede ocasionar desviaciones notables en la forma realista del receptor. En el caso de la interacción TTBK1-VP7, observamos fluctuaciones similares a la interacción con IQY, respaldando la idea de un acoplamiento efectivo en ambas interacciones (Zacharias M, 2004). Conclusiones Los enfoques de acoplamiento ligando-receptor se centran en tres tareas esenciales: la identificación de ligandos potenciales capaces de unirse a un bolsillo específico del receptor, la predicción de una geometría de unión realista y la selección de dicha geometría como la solución de acoplamiento con menor energía o mayor clasificación. El análisis detallado de las interacciones entre la proteína TTBK1 y los ligandos VP7 e IQY ha revelado hallazgos significativos. Específicamente, se ha observado que el ligando IQY presenta una mayor afinidad hacia TTBK1 en comparación con VP7, indicado por su energía de unión más negativa. Además, el análisis de la refRMS ha señalado que la conformación predicha de IQY puede exhibir una mayor variabilidad estructural en comparación con VP7. En cuanto a la dinámica molecular, ha proporcionado una visión detallada de las fluctuaciones en la conformación de la proteína durante la interacción con ambos ligandos. Estas observaciones corroboran la eficacia de los ligandos en su interacción con TTBK1, proporcionando información valiosa para la selección de posibles inhibidores en el contexto de la enfermedad de Alzheimer. Referencias Scheltens, P., Blennow, K., Breteler, M. M., De Strooper, B., Frisoni, G. B., Salloway, S., & Van der Flier, W. M. (2016). Alzheimer's disease. The Lancet, 388(10043), 505-517. Zhang, X. X., Tian, Y., Wang, Z. T., Ma, Y. H., Tan, L., & Yu, J. T. (2021). The epidemiology of Alzheimer’s disease modifiable risk factors and prevention. The journal of prevention of Alzheimer's disease, 8, 313-321. Kumar A, Sidhu J, Goyal A, et al. Alzheimer Disease. [Updated 2022 Jun 5]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2023 Jan-. 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