Especialización en Reproducción bovina 2011 IRAC CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE EMBRIONES BOVINOS Fecha: 30Ago11 Nombre y Apellido: Martin Atilio LAZARTE Objetivo: 1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades presentadas. Criterios de evaluación: 1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer relaciones. 2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales. 3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas. 1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una clasificación de los embriones según: a. el estadio de desarrollo b. la Calidad (grado 1,2,3,4). c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta para calificar los embrión. Código de Estadio 4 (Mórula) Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta, simétrico, células de tamaño y color uniforme. Zona pelúcida lisa. Código de Estadio 3 (Mórula Temprana) Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta color uniforme de la masa celular Especialización en Reproducción bovina 2011 IRAC Código de estadio 7 Blastocito expandido Código de calidad 2 entre el 50 y 84 % de las células intactas. Forma irregular de la masa celular y algunas blastómeras sueltas. Código de Estadio 4 Código de Calidad 3 entre el 25 y el 49 % de células normales. Blastomeras sueltas , células degeneradas Código de estadio 2 Código de calidad 4 Blastomeras desorganizadas y sueltas, células de apariencia granular Especialización en Reproducción bovina 2011 IRAC Embrión Nro 1 : Código de Estadio 4 Mórula- Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84% de la masa celular intacta, blastómeras sueltas. Embrión Nro 2 : Código de Estadio 4 Mórula -Código de Calidad 3 entre el 25 y el 49 % de la masa celular intacta, blastómeras sueltas y células degeneradas Embrión Nro 3 : Código de Estadio 4 Mórula- Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84 % de la masa celular intacta, blastómeras sueltas. Embrión Nro 4 : Código de Estadio 4 Mórula- Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta, simétrico y células de tamaño y color uniforme. Embrión Nro 5 : Código de Estadio 6 Blastocito- Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta, simétrico y células de tamaño y color uniforme, zona pelucida lisa. Embrión Nro 6 : Código de Estadio 7 Blastocito expandido- Código de Calidad 1 más del 85 % de la masa celular intacta, simétrico y células de tamaño y color uniforme, zona pelucida lisa. Embrión Nro 7 : Código de Estadio 4 Mórula -Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84 % de la masa celular intacta, blastómeras sueltas y células degeneradas Especialización en Reproducción bovina 2011 IRAC Código de Estadio 4 Mórula Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84 % de la masa celular intacta. Forma irregular de la masa celular y el color no es uniforme Código de Estadio 4 Mórula Código de Calidad 2 entre el 50 y el 84 % de la masa celular intacta Blastómeras sueltas y masa celular de forma irregular Código de Estadio 1(Infertilizado) Grado de Calidad 4 (Infertilizado .Apariencia granular con puntillado) 2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con etilenglicol y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad, curva de congelado, método de descongelado y practicidad (costos, entrenamiento, etc). Congelación -Transferencia Directa Principio: Proceso físico - químico complejo de intercambio de calor y agua entre las células y el medio externo que culmina con un cambio de fase liquida a sólida. Los embriones alcanzan su equilibrio osmótico antes de comenzar el Vitrificación Principio: Es un proceso termodinamico mediante un fluido incrementa su viscosidad durante el enfriamiento adquiriendo propiedades de un sólido. El fluido pasa a un estado solido no estructurado similar al vidrio de donde la técnica toma su nombre. Especialización en Reproducción bovina 2011 IRAC descenso de la temperatura y lo mantienen durante el enfriamiento. Medios De Congelación: Se utiliza el etilinglicol como crioprotector a una concentración de 1,5 M .Tiempo de estabilización debido a su alta permeabilidad no deben superar los 5 minutos. Método de Congelación Estabilización del embrión con el crioprotector a Tº ambiente hasta alcanzar el equilibrio osmótico .Prender la congeladora y estabilizarla entre -5 a -7 ºC luego colocar las pajuelas cargadas con el embrión y proceder a realizar el seeding (inducir la formación de hielo en el medio extracelular y se realiza tocando el envase de los embriones con una pinza enfriada previamente a -196 ºC). Luego se inicia el descenso controlado de Temperatura a una velocidad de 0,5 ºC /min hasta alcanzar la temperatura de entre -30 a -40 ºC , momento en que los embriones son sumergidos en el nitrógeno líquido. Medios de Congelación Para obtener el estado amorfo necesario para la vitrificación de embriones la concentración de crioprotectores que se utiliza es entre 4-8 M a una velocidad de congelación de 2500 ºC /min Los Crioprotectores son altamente toxicos a esas concentraciones por ese motivo existen diferentes métodos para minimizar la toxicidad de los crioprotectores como : Agregar crioprotectores a baja Tº Agregar en 2 o 3 pasos Exponer el embrión a los crioprotectores por periodos breves. Utilizar microvolumenes Incrementar la Velocidad de descenso de T a 15.000 ºC/min,(eliminar vapores de nitrógeno y envases de microvolumen) permitirá utilizar etilinglicol a 1,5 M en la vitrificación. Método de Vitrificación Inmersión directa en nitrógeno líquido, esto representa una velocidad para macrovolumenes + de 50 ul de º2500 ºC/min y para microvolumenes –de 20 ul una velocidad de enfriamiento de 22000 ºC/ min. La técnica más usada es el OPS , consiste en una pajuela de 0,25 ml se calienta se estira y se corta en el lugar más fino. El paso siguiente es equilibrar el embrión en el crioprotector de 1 a 3 min, luego a una segunda solución con un volumen no mayor a 5ul y finalmente pasarlo a una microgota de 1ul y hay que tener en cuenta que no debe sobrepasar un periodo de 25 seg entre las dos gotas y luego por capilaridad el embrión ingresa a la pajuela que se introduce en el nitrógeno líquido. Especialización en Reproducción bovina 2011 IRAC Descongelado La descongelación se efectúa colocando las pajuelas en un baño de agua a 30 ºC hasta que se descongele la pajuela, secar la pajuela y transferir el embrión dentro de los 15 minutos de descongelado. Calentamiento El calentamiento de embriones vitrificado debe ser rápido, generalmente a 37 ºC a baño Maria. La remoción del crioprotector debería iniciarse lo antes posible para minimizar la exposición intracelular a niveles tóxicos de crioprotector. Los embriones se colocan en soluciones con mucha menor concentración de crioprotector más 0,5 a 1 M de sucrosa para evitar que el agua ingrese a la celula al diluir los crioprotectores. Costos Es necesario adquirir un equipo de congelamiento automático que realice el descenso programado de la Tº Técnica Simple similar manejo de los embriones en fresco, hasta la estabilización y el cargado de la congeladora de embriones. Embriones In Vitro : Técnica de cripreservacion con resultados variables para embriones producidos in vitro(PIV) Costos Es una técnica más económica considerando que no es necesario adquirir ningún equipamiento especial Técnica Los procedimientos de vitrificación requieren cuidado extremos al planear el tiempo de los pasos y la ubicación de los embriones en los envases utilizados. Embriones In Vitro Técnica de criopreservacion con resultados estables y óptimos comercialmente para embriones producidos in vitro