CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE EMBRIONES BOVINOS Fecha: 29/09/2012 Nombre y Apellido: Germán Daniel Romero Objetivo: 1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades presentadas. Criterios de evaluación: 1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer relaciones. 2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales. 3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas. 1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una clasificación de los embriones según: a. el estadio de desarrollo b. la Calidad (grado 1,2,3,4). c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta para calificar los embrión. 1 2 3 4 5 6 7 8 Imágenes: 1- Estado de desarrollo: 4 Calidad: 1 Característica para la clasificación: masa celular compacta y de buen color ocupa más del 60 % del espacio perivitelino. 2- Estado de desarrollo: 4 Calidad: 3 Característica para la clasificación: masa celular compacta y con muchas blastómeras sueltas, células degeneradas y muchas vesículas. 3- Estado de desarrollo: 6 Calidad: 1 Característica para la clasificación: hay diferencia entre el trofoblasto externo y el macizo celular interno, se nota el blastocele 4- Estado de desarrollo: 7 Calidad: 1 Característica para la clasificación: hay diferencia entre el trofoblasto externo y el macizo celular interno, se nota el blastocele, hay un aumento del diámetro total el embrión comprime la zona pelucida 5- Estado de desarrollo:4 Calidad: 4 Característica para la clasificación: se nota menos de un 50 % de la masa celular intacta el resto hay blastómeras sueltas, células de diferente tamaño y degeneradas con vesículas. 6- Estado de desarrollo: 4-5 Calidad: 4 Característica para la clasificación: se nota menos de un 50 % de la masa celular intacta el resto hay blastómeras sueltas, células de diferente tamaño y degeneradas con vesículas. 7- Estado de desarrollo:4 Calidad: 4 Característica para la clasificación: blastómeras desordenadas y sueltas células de apariencia granular o de crecimiento retardado. 8- Estado de desarrollo:1 Calidad: 4 Característica para la clasificación: Apariencia granular (puntillado) rodeado por una membrana vitelina lisa 2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con etilenglicol y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad, curva de congelado, método de descongelado y practicidad (costos, entrenamiento, etc.). Medios de congelación: 1- Etilenglicol: Remplaza osmóticamente el agua intracelular en las células del embrión antes de la congelación. Este método usa Tasas lentas de congelamiento reduce los cambios de volumen celular y minimizan la formación de cristales de hielo dentro de las células. 2- Vitrificación: Se usan altas concentraciones de crioprotectores y el embrión en una solución crioprotectora se coloca directamente en nitrógeno líquido. Debido a las altas concentraciones del crioprotector no se forman critales de hielo y la solución forma un vidrio ( las concentraciones de los crioprotectores son de 6M). Toxicidad: 1- Etilenglicol: a razón de 1.5 M no hay problemas de toxicidad. 2- Vitrificación: La altas concentraciones de los crioprotectores suelen ser tóxicos para el embrión, químicamente y osmóticamente pero son necesarias para vitrificar, para minimizar este riesgo se colocan los crioprotectores en dos pasos: el primero en concentraciones similares a los usados para el etilenglicol y el segundo paso ya las soluciones van a concentraciones de 6-7 M. Curva de Congelado: 1- Etilenglicol: inducción a los cristales de hielo a -5y -7°C (Seeding) luego descenso lento y prolongado de la temperatura (0,3 ó 1,0°C/min) hasta los -30 ó -35°C; posteriormente colocación en nitrógeno a -196°C. 2- Vitrificación: las curvas de congelamiento son muy rápidas debido a la concentración de los crioprotectores Método de descongelado: 1- Etilenglicol: tasa de descongelación relativamente rápida, (aproximadamente a 250°C/min) para evitar la recristalización. Se colocan los embriones en agua a entre 30- 35°C por 15 a 30 segundos. 2- Vitrificación: El calentamiento debe ser rápido generalmente a 37°C en baño María durante 20 segundos Practicidad: 1- Etilenglicol: no es necesario extraer el crioprotector después de la descongelación. Una vez en el útero el crioprotector sale del embrión y este se hidrata con los fluidos del útero. 2- Vitrificación: Su principal ventaja es la sencillez de la técnica a sido muy usada experimentalmente y su uso comercial es solo una cuestión de tiempo. Lo único que se necesitan más pasos para extraer el crioprotector. Costo y Entrenamiento: 1- Etilenglicol: es una técnica no costosa y con poco entrenamiento se puede realizar fácilmente. Podríamos decir que es de uso cotidiano a nivel campo. Lo que si se necesita es algo de equipamiento como microscopio congeladora y descogeladora. 2- Vitrificación: La técnica es más costosa que la anterior y ocupa más crioprotectores y se necesita más entrenamiento.