CARACTERIZACION VARIETAL DE VINOS TINTOS POR HPLC Introducción Es de interés de todos los países vitivinícolas poder establecer parámetros que permitan identificar las variedades con que han sido elaborados los vinos que se comercializan. No es entendible hablar de vinos de calidad sin conocer de las variedades que los integran. La declaración de la variedad en la etiqueta es un factor importantísimo en publicidad y comercialización del vino. Las autoridades de control de los países vitivinícolas tienen la responsabilidad de chequear esta clase de información. Se ha podido comprobar que en un vino en particular, la impresión digital antociánica es típica de una variedad y es fundamental poderla determinar. También existen otros compuestos que contribuyen a la caracterización de los cepajes. Por esta razón el INV comenzó la investigación para la determinación de los perfiles antocianicos de diferentes variedades tintas y el posterior tratamiento estadístico de los resultados. Para realizar este estudio fue necesario elaborar una base de datos con los perfiles antocianicos de las diferentes variedades, de origen indudable. Contar con ella es fundamental para que pueda ser utilizada como elemento de comparación y así establecer las variedades correspondientes a las muestras a ensayar. En general, la forma mas práctica de acceder a un banco de datos es a través de microvinificaciones o con muestras comerciales de diferentes orígenes geográficos del mundo, comercializados en comercios y seleccionados al azar. No obstante ello, dichas muestras comerciales, usadas para esta finalidad, deben ser chequeadas con análisis químico, sensorial y constatada su genuinidad. En nuestro caso se realizó a través de microvinificaciones, extrayendo muestras de todas las zonas vitivinícolas y con estas muestras se construyó una base de datos con los perfiles antociánicos. Para este desarrollo se utilizó el concepto de vino varietal con la intención de expresar la dominancia en ese vino de una variedad como componente fundamental. De acuerdo a la legislación Argentina y a la de los países de la Comunidad Economica Europea se define la variedad en el marbete cuando la concentración de la misma dominante es del 85% o mas (2). Puede por lo tanto, el consumidor enfrentarse con un vino varietal, según reglamento (85% o mas), que apenas aporte impacto sensitivo varietal, y otro en cambio, sin que cumpla esta exigencia, que sí lo aporte, el simple hecho de ser la fuerza varietal de impresión sensitiva no sólo dependiente de volúmenes sino de cultivo. Se debe tener en cuenta que un vino viene muy marcado por la peculiaridad de sus variedades y la enología viene forzada por características varietales. Con una tecnología de punta, se puede lograr un vino que exprese su región, cargado de notas de singularidad que le aporta el cepaje. Para la determinación del perfil antocianico se utilizó el método propuesto, por el Dr. Otteneder en la Office International de la Vigne et du Vin (1), que se efectúa por HPLC. La aplicación de la HPLC de fase reversa ha ayudado a proveer el crucial camino de identificar el espectro antociánico en vinos tintos. COMPUESTOS FENOLICOS DE LA UVA: ANTOCIANOS Los antocianos son los pigmentos rojos, responsables del color de los vinos tintos. Están localizados en las vacuolas de las células del hollejo y en las tres o cuatro primeras capas celulares de la hipodermis. Están presentes en la pulpa de variedades tintoreas (vitis vinifera Alicante Boushet, Aspirant Boushet) Según las especies del género vitis se han identificado 21 heterósidos (antocianinas) que son monoglucósidos y derivados acilados (sobre los cuales se fija una molécula de ácido, generalmente el p-cumárico, ácido acético ó el ácido cafeico que forma Pinotin A en variedades sudafricanas.)de cinco antocianidinas diferente, entre las cuales la malvidina es la más importante cuantitativamente .( Excepto en la variedad Elbling que es la peonidina la más abundante). Los antocianos se llaman también antocianinas y sus derivados privados del azúcar antocianidinas. Los vinos contienen inmediatamente después de la vinificación alrededor de 200 a 500 mg/l de antocianos que disminuyen a la mitad todos los años, luego se estabilizan en 20 mg/l. El contenido en compuestos fenólicos del vino dependen tanto de la variedad vinífera y el rendimiento de la cosecha como de las condiciones edafoclimáticas y técnicas culturales aplicadas al viñedo. Una gran cantidad de autores (3), (4) y (5) han demostrado que la variedad de uvas se puede determinar por el perfil de antocianos y sus cantidades relativas. Las variables utilizadas son nueve antocianos y sus cantidades relativas. Ellas son Grupo I: Delfinidin 3 glucosido Cyanidin 3 glucosido Petunidin 3 glucosido Peonidin 3 glucosido Malvidin 3 glucosido Peonidin 3 glucosido Malvidin 3 glucosido Grupo II : Peonidin 3 acetilglucosido Malvidin 3 acetilglucosido Grupo III: Peonidin 3 cumarilglucosido Malvidin 3 cumarilglucosido Suma grupo II+III: grupoacetilados + cumarilados Razón grupo II/III: grupo acetilados / cumarilados El factor decisivo para determinar una variedad de uva es el banco de datos de muestras autenticas con quien comparar resultados y se han establecido criterios sobre cuales antocianos o relación de ellos, cumplen al menos con una determinada variedad (6). Descripción del Método de Caracterización varietal por HPLC El método se basa en la utilización de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución(HPLC) de fase reversa, es decir donde las fases móviles están constituidas por mezclas de solvente polares, es este caso se utilizo la columna LiChrospher 100 RP 18 (5um) a 40ºC. La determinación se llevó a cabo por inyección directa del vino en el Cromatógrafo Liquido de Alta Performance, con Detector UV con Arreglo de Diodo, desarrollando un sistema binario, con gradiente de las fases móviles (Agua /Acido Fórmico / Acetonitrilo). Malvidin 3Gluc Malvidin 3 ac gluc Malvidin-3cum gluc Peonidin 3Gluc Peonidin 3Ac gluc Petunidin 3Gluc Cyanidin 3Gluc Peonidin 3cumglu Delfinidin-3gluc Delfinidin-3gluc Construcción de una Base de Datos Se construyó un banco de batos con muestras de origen indudable, obtenidas por microvinificación. Además se le realizó a cada muestra el análisis individual del contenido relativo de antocianos. ESTUDIO DE DATOS Los resultados fueron comparados por medio de procesos estadísticos. El requisito para este proceso es que las cantidades de antocianos del vino sigan un distribución Normal presentados por ejemplo en box -Whisker, histogramas y probabilidad. Histogram for MV 3ACGL frequency 40 30 20 10 0 -2 8 18 28 38 MV 3ACGL La distribución normal de los resultados puede apreciarse con facilidad dibujando un histograma, en el que se muestra que las mediciones están distribuidas en forma simétrica en torno a la media. Un modelo matemático que habitualmente se emplea es la distribución normal o gausiana. Box-and-Whisker Plot V AC CU 10 8 6 4 2 0 Bonarda Cabernet MalbecMerlot SyrahTempranillo VARIEDAD EVALUACION ESTADISTICA Caracterización varietal por Análisis Discriminante entre seis variedades La evaluación estadística se realizó con el paquete estadístico STAT GRAFIC SOFTWARE. Plot of Discriminant Functions Function 2 5.7 VARIEDAD Bonarda Cabernet Malbec Merlot Syrah Tempranillo Centroids 3.7 1.7 -0.3 -2.3 -4.3 -9 -6 -3 0 3 6 Function 1 Conclusiones La determinación de perfiles de antocianos y relaciones entre estos permiten diferenciar distintas cepas de vinos tintos. Los Métodos cromatográficos y son la mejor opción para este fin. El análisis discriminante permite identificar la variedad como también saber en qué porcentaje se encuentra ésta en el vino. Con Un nivel de Confianza de un 95 %. Con las relaciones relativas entre los antocianos, en especial con la variable de Razón entre Acetilados y Cumarilados, se ha podido ver las diferencias entre un Cabernet Argentino, Chileno, Australiano, o de otro origen. Para una mayor certeza en la identificación debe evaluarse la posible incorporación de otros compuestos, como por ejemplo Acido Shikímico. La metodología debe validarse, determinado su robustez frente a variables ambientales (sitio de cultivo, clima ,sol, agua).Tecnológicas y genéticas BIBLIOGRAFIA (1) H. Otteneder and R. Marx. Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Institut fur Lebensmittelchemie Trier, Maximinerach 11 a, D-54295 Trier (2) Resolución C.20 -2004 .INV. (3) Arozarena,I,H.Casp,R Marin and Navarro,2000,Differentiation of some Spanish wines according to variety and region based on their anthocyanin composición,Eur.Food Res Technol.212:108-112 (4) Eder,R,S.Wendelin and I Barna,1994, Klassifiziierung von Rotweinsorten mittels Anthocyananalyse. (5) Roggero,I.P,I.L.Larice, C.Rocheville-Divorme,P.Archier and S.Coen,1988 Composition Anthocyanique del Cepages. (6) Otteneder,H.,Holbach,B.,Marx,R,Zimmer,M,2001,B Identificación of the grapae variety in redwine by means of the Anthocyanin composition, Proceedings of the 26 thWorld Congress of the Office International dela Vigne et du Vin, p,181