CARACTERIZACION VARIETAL DE VINOS POR HPLC Introducción Es de interés de todos los países vitivinícolas poder establecer parámetros que permitan identificar las variedades con que han sido elaborados los vinos que se comercializan. La declaración de la variedad en la etiqueta es un factor importantísimo en publicidad y comercialización del vino. Las autoridades de control de los países vitivinícolas tienen la responsabilidad de chequear esta clase de información. Se ha podido comprobar que en un vino en particular, la impresión digital antociánica es típica de una variedad y es fundamental poderla determinar. También existen otros compuestos que contribuyen a la caracterización de los cepajes. Por esta razón el INV comenzó la investigación hace años para la determinación de los perfiles antocianicos de diferentes variedades tintas y el posterior tratamiento estadístico de los resultados. Para realizar este estudio fue necesario elaborar una base de datos con los perfiles antocianicos de las diferentes variedades, de origen indudable. Contar con ella es fundamental para que pueda ser utilizada como elemento de comparación. En general, la forma mas práctica de acceder a un banco de datos es a través de microvinificaciones o con muestras comerciales de diferentes orígenes geográficos del mundo, comercializados en comercios y seleccionados al azar. No obstante ello, dichas muestras comerciales, usadas para esta finalidad, deben ser chequeadas con análisis químico, sensorial y constatada su genuinidad. En nuestro caso se realizó a través de microvinificaciones, extrayendo muestras de todas las zonas vitivinícolas y con estas muestras se construyó una base de datos con los perfiles antociánicos. Para este desarrollo se utilizó el concepto de vino varietal con la intención de expresar la dominancia en ese vino de una variedad como componente fundamental. De acuerdo a la legislación Argentina se define la variedad en el marbete cuando la concentración de la misma dominante es del 85% o más (1). Puede por lo tanto, el consumidor enfrentarse con un vino varietal, según reglamento (85% o mas), que apenas aporte impacto sensitivo varietal, y otro en cambio, sin que cumpla esta exigencia, que sí lo aporte. Se debe tener en cuenta que un vino viene muy marcado por la peculiaridad de sus variedades. Con una tecnología de punta, se puede lograr un vino que exprese su región, cargado de notas de singularidad que le aporta el cepaje. Para la determinación del perfil antocianico se utilizó el método propuesto, por el Dr. Otteneder en la Office International de la Vigne et du Vin (2), que se efectúa por HPLC. La aplicación de la HPLC de fase reversa ha ayudado a proveer el crucial camino de identificar el espectro antociánico en vinos tintos. COMPUESTOS FENOLICOS DE LA UVA: ANTOCIANOS Los antocianos son los pigmentos rojos, responsables del color de los vinos tintos, están localizados en las vacuolas de las células del hollejo y en las tres o cuatro primeras capas celulares de la hipodermis. Están presentes en la pulpa de variedades tintoreas (vitis vinifera Alicante Boushet, Aspirant Boushet) Según las especies del género vitis se han identificado mas de 21 heterósidos (antocianinas) que son monoglucósidos y derivados acilados (sobre los cuales se fija una molécula de ácido, generalmente el p-cumárico, ácido acético) de cinco antocianidinas diferentes, entre las cuales la malvidina es la más importante cuantitativamente. Los antocianos se llaman también antocianinas y sus derivados privados del azúcar antocianidinas. Los vinos contienen inmediatamente después de la vinificación alrededor de 200 a 500 mg/l de antocianos que disminuyen a medida que transcurre el tiempo. El contenido en compuestos fenólicos del vino dependen tanto de la variedad, el rendimiento de la cosecha como de las condiciones edafoclimáticas y técnicas culturales aplicadas al viñedo. Una gran cantidad de autores (3), (4) y (5) han demostrado que las variedades se pueden determinar por el perfil de antocianos. Las variables utilizadas son nueve antocianos, la suma de acetilados y cumarilados y el cociente entre acetilados y cumarilados. Ellas son Grupo I: Delfinidin 3 glucosido Cyanidin 3 glucosido Petunidin 3 glucosido Peonidin 3 glucosido Malvidin 3 glucosido Grupo II : Peonidin 3 acetilglucosido Malvidin 3 acetilglucosido Grupo III: Peonidin 3 cumarilglucosido Malvidin 3 cumarilglucosido Suma grupo II+III: grupo acetilados + cumarilados Razón grupo II/III: grupo acetilados / cumarilados El factor decisivo para determinar una variedad es el banco de datos de muestras autenticas con quien comparar resultados y se han establecido criterios sobre cuales antocianos o relación de ellos, cumplen al menos con una determinada variedad (6). Descripción del Método de Caracterización varietal por HPLC El método se basa en la utilización de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) de fase reversa, es decir donde las fases móviles están constituidas por mezclas de solvente polares, en este caso se utilizó la columna LiChrospher 100 RP 18 (5um) a 40ºC. La determinación se llevó a cabo por inyección directa del vino en el Cromatógrafo Liquido de Alta Performance, con Detector UV con Arreglo de Diodo, desarrollando un sistema binario, con gradiente de las fases móviles (Agua /Acido Fórmico / Acetonitrilo). Malvidin 3Gluc Malvidin 3 ac gluc Malvidin-3cum gluc Peonidin 3Gluc Peonidin 3Ac gluc Petunidin 3Gluc Cyanidin 3Gluc Peonidin 3cumglu Delfinidin-3gluc Delfinidin- Construcción de una Base de Datos Se construyó un banco de batos con muestras de origen indudable, obtenidas por microvinificación. Se determinó a cada muestra el contenido relativo de antocianos. ESTUDIO DE DATOS Los resultados fueron comparados por medio de procesos estadísticos. El requisito para este proceso es que las cantidades relativas de antocianos del vino sigan una distribución Normal presentados por ejemplo en box -Whisker, histogramas y probabilidad. La distribución normal de los resultados puede apreciarse con facilidad dibujando un histograma, en el que se muestra que las mediciones están distribuidas en forma simétrica en torno a la media Histogram for MV 3ACGL frequency 40 30 20 10 0 -2 8 18 28 38 MV 3ACGL Box-and-Whisker Plot V AC CU 10 8 6 4 2 0 BonardaCabernet Malbec Merlot SyrahTempranillo VARIEDAD EVALUACION ESTADISTICA Caracterización varietal por variedades Análisis Discriminante entre La evaluación se realizó con el paquete estadístico STAT GRAFIC SOFTWARE. seis Plot of Discriminant Functions VARIEDAD Bonarda Cabernet Malbec Merlot Syrah Tempranillo Centroids Function 2 5.7 3.7 1.7 -0.3 -2.3 -4.3 -9 -6 -3 0 3 6 Function 1 Conclusiones La determinación de perfiles de antocianos y relaciones entre estos permiten diferenciar distintos varietales de vinos tintos a través del análisis cromatográfico; hasta este momento son la mejor opción para este fin. Para una mayor certeza en la identificación se ha incorporado el contenido en ácido shikimico que es una variable más que mejora sustancialmente la diferenciación. A partir del año 2006 el INV oficializó este método (Resolución C23/2006) para la caracterización varietal de vinos tintos. Bibliografía (1) Resolución C.20 -2004 .INV (2) H. Otteneder and R. Marx. Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Institut fur Lebensmittelchemie Trier, Maximinerach 11 a, D-54295 Trier (3) Resolución C.20 -2004 .INV. (4) Arozarena,I,H.Casp,R Marin and Navarro,2000,Differentiation of some Spanish wines according to variety and region based on their anthocyanin composición,Eur.Food Res Technol.212:108-112 (5) Eder,R,S.Wendelin and I Barna,1994, Klassifiziierung von Rotweinsorten mittels Anthocyananalyse. (6) Roggero,I.P,I.L.Larice, C.Rocheville-Divorme,P.Archier and S.Coen,1988 Composition Anthocyanique del Cepages. (7) Otteneder,H.,Holbach,B.,Marx,R,Zimmer,M,2001,B Identificación of the grapae variety in redwine by means of the Anthocyanin composition, Proceedings of the 26 thWorld Congress of the Office International dela Vigne et du Vin, p,181