CONCLUSIONES Juan Casado Vela CONCLUSIONES Del trabajo que se ha realizado se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1) Nuestro protocolo de extracción ha permitido determinar la presencia de PPO en dos extractos protéicos diferentes (soluble y particulada) en todas las variedades de tomate analizadas, evaluar la evolución de su actividad a lo largo del desarrollo del fruto, comprobar su implicación en la aparición de podredumbre apical en frutos de tomate, determinar sus constantes cinéticas y evaluar la efectividad de diferentes inhibidores químicos. 2) El protocolo de extracción enzimática utilizado permite purificar la enzima polifenol oxidasa hasta cuatro veces la PPO de la fracción soluble (E1) y más de tres veces la enzima presente en la fracción particulada (E2). Esto supone un punto de partida para futuros trabajos de purificación a homogeneidad y determinación de su función biológica. 3) Los niveles de PPO son altos en frutos jóvenes y en frutos afectados por podredumbre apical, mientras que desaparece en frutos sanos desarrollados y/o maduros. 4) La caracterización enzimática de ambas fracciones, el ratio variable E1/E2 en numerosas variedades y la inducción diferencial de sus niveles en frutos afectados por podredumbre apical aportan evidencias a favor de que E1 y E2 son isoenzimas diferentes. 5) Los cebadores diseñados permiten amplificar por RT-PCR secuencias de RNAm de PPO de fruto de tomate. El RNAm mayoritariamente expresado en frutos de 8-10 días de desarrollo post-antesis corresponde a transcrito de los genes A/A´, si bien no se puede descartar que en frutos más jóvenes se puedan expresar otros genes de PPO. 6) La estrategia diseñada para la de detección de tipos de RNAm de PPO en tomate abre una posibilidad para poder analizar la expresión en otros tejidos y un acercamiento a la explicación de la función fisiológica de cada una de las seis isoenzimas que es posible encontrar en tomate. 7) El Triton X-114 permite una extracción de PPO en forma activa e incrementa la solubilización de un número elevado de proteínas y en zimas de tejidos vegetales, en comparación con extracciones que utilizan únicamente - 129 - CONCLUSIONES Juan Casado Vela medios tamponados. La utilización de Triton X-114 es mucho más ventajosa que la utilización de Triton X-100 para extraer y solubilizar proteínas particuladas, y se ha mostrado como una herramienta importante para estudios de proteómica. 8) La puesta a punto de las técnicas de proteómica (preparación de muestras de fruto de tomate, electroforesis bidimensional, espectrometría de masas y búsquedas en bases de datos) han supuesto un avance significativo para la separación e identificación de proteínas de nuestras muestras, el análisis del proteoma de fruto de tomate y la comparación de perfiles proteómicos de frutos sanos y afectados por podredumbre apical. 9) Los sistemas antioxidantes de la planta, representado por el ciclo ascórbicoglutatión tanto en su faceta soluble (DHAR) como en su faceta de membrana (GPX, TPX), enzimas neutralizadoras de especies altamente reactivas (SOD, QOR/ALH), y la ruta de las pentosas fosfato como generadora de poder reductor (FK, RPI, TIM) están incrementadas en frutos afectados por podredumbre apical y pueden jugar un papel clave en detener la progresión de la necrotización al resto del fruto, evitando así la propagación de infecciones al resto de la planta. - 130 -