173 UNIDAD XIII: MICROBIOLOGÍA RUMINAL El estómago de los rumiantes se caracteriza por encontrarse dividido en cuatro cavidades diferentes: retículo, rumen, omaso y abomaso. El abomaso es el único que se caracteriza por ser glandular y es análogo al estómago de los no rumiantes. La degradación del alimento en los rumiantes se realiza principalmente por digestión fermentativa y no por digestión enzimática. Este proceso de digestión fermentativa (realizada por microorganismos que se ubican en los divertículos estomacales) le permite al rumiante la degradación de los hidratos de carbono estructurales, como así también de los demás componentes de la dieta. El ternero nace con el aparato digestivo adaptado a una dieta láctea, en ese momento la gotera esofágica se cierra y conecta el esófago con el abomaso, evitando de esa manera el efecto desfavorable que generaría el paso del alimento por el rumen. La etapa de transición entre el lactante y el rumiante, implica en el ternero una serie de cambios en la morfología, función del aparato digestivo, desarrollo de microorganismos y procesos metabólicos. Al nacimiento el ternero nace con una flora bacteriana que se desarrolla a medida que se van desarrollando los divertículos estomacales, la primer semana se encuentran bacterias celulolíticas, durante las primeras tres semanas aumenta la flora productora de lactato (debido al escape esporádico de leche desde la gotera esofágica que produce un descenso de pH en el rumen) y recién a la sexta semana se encuentran presentes todas las especies propias del animal adulto. 2 3 1 4 Estomago de los rumiantes (1) retículo, (2) rumen, (3) omaso, (4) abomaso Ecosistema microbiano responsable de la digestión fermentativa Dentro de los microorganismos responsables de la digestión fermentativa se encuentran bacterias, protozoos y hongos. Las bacterias son adquiridas por el animal por contacto directo con otros bovinos o por contacto indirecto con elementos contaminados, como ser el alimento o el agua de consumo. 174 Las bacterias se pueden clasificar en función de los sustratos que utilizan y a los productos finales de su fermentación (se debe tener en cuenta que una misma bacteria puede cumplir más de una función metabólica): a) Bacterias celulolíticas: fermentan hidratos de carbono estructurales de la pared celular (celulosa, hemicelulosa y sustancias pécticas), siendo el producto de la fermentación ácidos grasos volátiles (AGV) (principalmente acetato). b) Bacterias amilolíticas: fermentan hidratos de carbono de reserva de granos (almidón), generando principalmente propionato (AGV). c) Bacterias sacarolíticas: fermentan hidratos de carbono simples y el producto de la fermentación es butirato (AGV). d) Bacterias lactolíticas: metabolizan el lactato y producen AGV, especialmente propionato. e) Bacterias lipolíticas: metabolizan las grasas y producen ácidos grasos libres y AGV principalmente propionato. f) Bacterias proteolíticas: degradan proteínas, resultando de la misma la liberación de AGV y amoníaco. g) Bacterias metanógenas: producen metano. h) Bacterias ureolíticas: hidrolizan la urea produciendo CO2 y amoníaco. Los microorganismos ruminales actúan en sistemas cooperativos dentro de un ecosistema muy complejo, donde simplemente sobresale la actividad de alguna especie, pero la misma depende de las condiciones que establecen en conjunto toda la biomasa. Un factor muy importante que regula el desarrollo bacteriano es el pH ruminal, dentro del rango fisiológico, las bacterias celulolíticas se desarrollan mejor a pH entre 6,0 y 6,9 mientras que las amilolíticas lo hace a valores de pH más ácidos (5,5 a 6,0). La gran importancia que presenta la actividad bacteriana en el rumen es que son responsables de la mayor parte de la actividad celulolítica y además son capaces de sintetizar sus proteínas a partir de compuesto nitrogenados no proteicos, principalmente amoníaco. Además de las bacterias en el rumen encontramos los protozoos que constituyen la microfauna ruminal, se desarrollan preferentemente a pH superior a 6 y si bien están siempre presentes no son indispensables para la función ruminal, ni para la supervivencia del animal. Se adquieren por contacto directo con otros rumiantes y metabólicamente se diferencian de las bacterias en que poseen menor actividad celulolítica y son incapaces de sintetizar proteínas a partir de nitrógeno no proteico (NNP). Una función importante de los protozoos es la de moderar la fermentación amilolítica, debido a que consumen preferentemente bacterias amilolíticas y además engloban trozos de almidón, que pasan con el protozoo al intestino, evitando la fermentación ruminal 175 Interacción entre los factores que afectan el pH ruminal Ración rica en forraje grosero (alto contenido de hidratos de carbono estructurales Ración rica en concentrado (alto contenido de almidón) Largo tiempo de rumia Corto tiempo de rumia Alta producción de saliva Baja producción de saliva pH ruminal elevado (6 – 6.8) pH ruminal bajo (5.5 - 6) Concentración y velocidad de absorción de AGV bajas Concentración y velocidad de absorción de AGV altas Metabolismo ruminal de los hidratos de carbono Los hidratos de carbono representan el componente más abundante en la dieta de los rumiantes. Los principales hidratos de carbono presentes en la dieta se pueden clasificar en polisacáridos de reserva como el almidón o estructurales como la celulosa, hemicelulosa y pectinas. El tipo de carbohidrato predominante va a determinar el desarrollo de los microorganismos adecuados para su fermentación y el ajuste del pH a su rango ideal. Los factores que participan en la modificación del pH ruminal son: a) la saliva (posee un pH de 8,1 a 8,3 que tiende a elevar el pH ruminal), por eso ante dietas ricas en hidratos de carbono estructurales, aumenta el tiempo de rumia, con ello aumenta la producción de saliva y por ende el pH ruminal, alcanzando el valor óptimo para el desarrollo de las bacterias celulolíticas. b) producción de AGV, cuanto mayor es la producción de AGV más bajo es el pH ruminal, cuanto más rica es la dieta en concentrados energéticos mayor es la producción de AGV. c) absorción de los AGV, la velocidad de absorción de la AGV tiene una relación directa con su producción y una relación inversa con el pH, con la finalidad de evitar su acumulación en el rumen. 176 El pH ruminal está relacionado al tipo de dieta y al tipo de microorganismos que se desarrollen, estando también asociado al tipo de AGV producido, aumentando la proporción de acetato cuando el pH se aproxima a 6,9 y de propionato cuando se acerca a 5,5. Cuando el pH se aleja de valores fisiológicos se desarrollan especies bacterianas anormales que alteran el patrón fermentativo, cuando el pH baja de 5,5 se desarrolla bacterias lactogénicas (generadoras de lactato) y se produce una acidosis ruminal y por encima de pH 7 el rumen es colonizado por la flora de putrefacción como Escherichia coli y Proteus spp. El almidón, presente principalmente en los granos, que son considerados un alimento concentrado energético debido a que poseen baja concentración de agua, aportan mucha energía en poco volumen. Al ingresar el almidón con la dieta es atacado principalmente por bacterias amilolíticas que lo desdoblan para producir glucosa y AGV (principalmente propionato). La digestibilidad del almidón en el rumen es elevada y la fracción que pasa al intestino es atacada por la amilasa pancreática y se absorbe como glucosa. Almidón G1P G6P Succinato Fumarato Succinil CoA MetilmalonilCoA Glucólisis Malato PropionilCoA Piruvato Oxalacetato Propionato La digestibilidad del almidón depende de la facilidad con que pueden acceder a él las bacterias amilolíticas. El almidón se ubica en el grano en el endosperma y está protegido por dos barreras, por un lado el pericarpo (cubierta que recubre al grano y prácticamente indigestible para los microorganismos ruminales) y por una capa proteica gruesa y dura que rodea y aísla completamente al almidón en el endosperma corneo y es laxa e incompleta en el endosperma harinoso. Por ello para aumentar la digestibilidad del almidón se utiliza en la dieta granos partidos, molidos o bien se eligen aquellos granos con mayor proporción de endosperma harinoso. Entre los hidratos de carbono estructurales tenemos la celulosa, hemicelulosa y pectinas. Las uniones glicosídicas de tipo beta no pueden ser atacadas por las enzimas digestivas, solo pueden ser degradadas por las enzimas microbianas liberadas por los microorganismos ruminales, lo que representa la base de la simbiosis entre las bacterias y el rumiante en los procesos fermentativos. Los pasos a seguir para la degradación de los hidratos de carbono estructurales son: a) los microorganismos celulolíticos se adhieren a la superficie de los fragmentos de fibra vegetal, que ha sido cortada durante la masticación, 177 mezclado y rumia, con la finalidad de exponer la pared celular, b) los microorganismos liberan al medio las celulasas que realizan la digestión extracelular de la celulosa, produciendo residuos más pequeños, principalmente celobiosa (glucosa-glucosa con enlaces glicosídicos beta 1-4), c) la celobiosa es incorporada por la bacteria y atacada por la celobiasa que la desdobla en dos glucosas, d) la glucosa es utilizada por la bacteria para la producción de energía y AGV (principalmente acetato) que se libera de la bacteria. La variabilidad en la digestibilidad de la celulosa y de la hemicelulosa depende de la cantidad de lignina (estructura muy compleja y de alto peso molecular). La lignina representa menos del 3% de materia seca en un forraje tierno y alcanza valores superiores al 15 % en el forraje y no es degradada ni por las enzimas digestivas del animal ni por las microbianas del rumen, bloqueando de esa manera el acceso de los microorganismos a los hidratos de carbono de la pared. Aquí se manifiesta la importancia de los hongos presentes en el rumen, quienes son capaces de degradar celulosa unida a lignina, debido a la invasión de las hifas en el interior la cutícula y paredes celulares lignificadas, rompen las paredes celulares exponiendo los hidratos de carbono estructurales. Celulosa Celobiosa Glucosa Glucolisis CO2 Acetato Acetaldehido Piruvato NADH NAD+ Cuando un animal consume forrajes tiernos (por ejemplo un rebrote de primavera), la relación contenido celular:pared celular es suficientemente alta, se crean condiciones de fermentación muy diferentes a cuando un animal consume forrajes maduros con alto contenido de pared celular. En este último caso, el predominio de hidratos de carbono no solubles (celulosa y hemicelulosa), conduce al desarrollo de un ambiente celulolítico (pH mayor a 6 y baja producción y absorción de AGV, con predominio en la formación de acetato). Por el contrario, cuando el contenido celular es de alta disponibilidad, aun en el caso en que el animal se alimente de forraje, el aporte de fibra es bajo y las condiciones ruminales serán semejantes a aquellas de dietas suplementadas con almidón (pH menor a 6, mayor producción de AGV, con predominio de propionato). Al ser el ambiente ruminal fuertemente anaeróbico, los microorganismos para la producción de energía disponen solamente de la glucólisis, produciendo AGV, ATP y NADH. Los microorganismos utilizan el ATP como fuente de energía y eliminan los AGV como productos de deshecho. Con la finalidad de oxidar la segunda glucosa a través de la glucólisis necesitan que el NADH sea nuevamente oxidado a NAD+. Debido como se dijo anteriormente que el metabolismo microbiano es anaerobio y por ende no existe una cadena respiratoria como aceptora de H+, los microorganismos los transfieren a distintos aceptores de H +, 178 uno de los aceptores más importantes es el C, dando lugar a la formación de metano (CH4). Si bien este compuesto es rico en energía, esta no puede ser utilizada por el rumiante, dado que no poseen una ruta metabólica para su degradación y se pierde por la vía del eructo, lo que reduce la eficiencia en la utilización de los hidratos de carbono (la pérdida puede llegar a ser del 18% de la energía aportada por la dieta). Las ecuaciones para la producción de los diferentes AGV a partir de la glucosa son: Glucosa 2 acetatos + 2 CO2 + 8 H+ Glucosa butirato + 2 CO2 + 4 H+ Glucosa + 4 H+ 2 propionato + 2H2O Por cada 8 H+ generados por la oxidación de 4 NADH + H+ o 4 FADH2, se forma 1 metano. Por lo que podemos observar que la formación de metano será mayor con la producción de acetato, menor con la producción de butirato y la formación de propionato consume hidrogeniones. Esto demuestra que una dieta suplementada con almidón es más eficiente desde el punto de vista energético. Metabolismo de compuestos nitrogenados La degradación de proteínas a nivel intestinal no presenta diferencias entre rumiantes y no rumiantes, las proteínas son hidrolizadas por enzimas proteolíticas dando oligopéptidos, los que son atacados por oligopeptidasas que liberan aminoácidos, di y tripéptidos, los que son absorbidos. La gran diferencia se encuentra en que la proteína que llega al intestino del rumiante es diferente a la ingerida por la dieta, dado que los microorganismos ruminales degradan más del 50% de la proteína consumida. Debido a la presencia de proteasas en la membrana de las bacterias, las proteínas son degradadas a aminoácidos y pequeños péptidos que son absorbidos por el microorganismo. Una vez absorbidos los péptidos son hidrolizados a aminoácidos y pueden ser empleados para la síntesis de proteína microbiana, o bien pueden ser utilizados como fuente de energía. En este caso se separa el grupo amino del aminoácido y se libera al medio ruminal como producto de desecho y con el αcetoácido resultante lo utilizan para la producción de energía. El grupo NH2 liberado en el ambiente reductor del rumen se convierte en NH4+, por lo que la 179 concentración de NH4+, puede ser utilizada como un indicador de la actividad proteolítica. Los protozoarios tienen mayor actividad proteolítica que las bacterias, pero debido a que se encuentran en menos cantidad son responsables solamente del 10 al 20 % de la actividad proteolítica dentro del rumen. Los protozoos no tienen capacidad de sintetizar proteínas a partir de NH4+ y dependen de una fuente externa de aminoácidos, como ser la dieta u otros microorganismos de los que se alimentan. Cuando los protozoos consumen proteína bacteriana para sintetizar su propia proteína, elevan su valor biológico, es decir que sintetizan una proteína con cantidad y tipo de aminoácidos más próxima a la requerida por el rumiante (este proceso se denomina animalización de las proteínas). Esto es beneficioso para el rumiante, quien finalmente degradará al protozoario a nivel intestinal y aprovechará sus proteínas. Sin embargo, los protozoos representan un pequeño porcentaje (alrededor del 10%) de la biomasa microbiana ruminal y aportan un porcentaje menor de la proteína microbiana que llega al intestino, dado que utilizan su motilidad para alejarse de la zona de escape. Además, los protozoos consumen microorganismos que ya son fuente de proteínas para el rumiante, lo que hace que entre el 30 y 50% del nitrógeno proteico microbiano se recicle en el rumen. Los factores que afectan la cantidad de proteína que llega al rumen son: a) tipo de dieta, una dieta balanceada aporta mayor cantidad de energía lo que estimula la multiplicación microbiana, aumentando su concentración en el rumen y por ende su llegada al intestino, b) balance entre cadenas carbonadas y la fuente de N. Si existe un exceso de nitrógeno, como por ejemplo en los forrajes durante el otoño (mantienen la concentración de proteínas, pero disminuye significativamente la de hidratos de carbono solubles) se produce una acumulación ruminal de amonio (faltan cadenas carbonadas para la síntesis de proteínas) y ese exceso de amonio produce un aumento de pH ruminal y por ende una alteración en el funcionamiento del mismo. Además, el exceso de amonio es absorbido por el rumen y detoxificado en hígado mediante la formación de urea, con el correspondiente gasto energético para el rumiante. En la mayoría de las especies la urea se elimina del organismo a través de la orina (producto de desecho del metabolismo proteico). Los rumiantes, en cambio, aprovechan la urea como fuente de nitrógeno para los microorganismos ruminales. La urea llega al rumen secretada con la saliva o directamente a través de la pared ruminal (difusión simple). Una vez en el rumen es desdoblada por los microorganismos ureolíticos en CO2 y amoniaco, cerrando el ciclo ruminohepático de la urea. Esto es importante, cuando la proteína es un elemento costoso de suplementar, en estos casos el metabolismo ruminal permite reemplazar parte de las proteínas de la dieta por alguna fuente de nitrógeno no proteico (NNP), como puede ser la urea. Sin embargo esta alternativa va perdiendo importancia a medida que el animal aumenta su nivel de producción y por lo tanto aumentan también sus requerimientos proteicos. 180 Metabolismo de lípidos En alimentos de origen vegetal, se encuentran bajas cantidades de lípidos, en forrajes frescos se pueden encontrar lípidos celulares (fosfolípidos y glicolípidos) y de superficie (ceras y cutina que carecen de valor nutritivo) alcanzando un valor que varía entre 0,5 y 10 % de materia seca (MS). En el caso de granos de oleaginosas (20 a 40 % de MS), tienen un elevado contenido de triacilglicéridos. Tanto los forrajes como los granos tienen un elevado porcentaje de ácidos grasos insaturados, de los cuáles es mínima la cantidad que llega al intestino delgado, debido a la biohidrogenación que ocurre a nivel ruminal. Los 4 procesos que ocurren a nivel ruminal con los lípidos son: hidrólisis, biohidrogenación, saponificación (ocurren siempre y en forma sucesiva) y síntesis de grasas a nivel ruminal (depende de la cantidad de ácidos grasos consumidos). a) Hidrólisis: los microorganismos para la hidrólisis de las grasas tienen en la superficie lipasas bacterianas, por lo cual las bacterias deben adherirse a la superficie del alimento. Los principales productos liberados de la hidrólisis son ácidos grasos y glicerol, además de alcoholes aminados (fosfolípidos) y galactosa (galactolípidos), estos productos son convertidos en AGV que son absorbidos por la pared ruminal. b) Biohidrogenación: luego de la hidrólisis, los ácidos grasos insaturados sufren una hidrogenación microbiana (por bacterias adheridas al alimento), esto es importante porque los ácidos grasos insaturados alteran la tensión superficial y la permeabilidad de las membranas bacterianas, perjudicando principalmente a los microorganismos celulolíticos. Esta biohidrogenación afecta entre el 70 y 90 % de los ácidos grasos quedando una pequeña proporción que pasa a formar parte del soma bacteriano, esto constituye una fuente de ácidos grasos esenciales e insaturados para el rumiante al ser absorbidos por el intestino. c) Saponificación: debido al pH ácido del rumen los lípidos se saponifican formando jabones insolubles de Ca++ y Mg++, esto representa la forma en que los lípidos abandonan el rumen. d) Síntesis de lípidos: los microorganismos no almacenan lípidos como triglicéridos, pero si necesitan lípidos para sintetizar sus membranas plasmáticas, para ello utilizan ácidos grasos que toman del rumen o bien que sintetizan en su soma, generando una gran variedad de ácidos grasos, algunos de ellos de cadenas impares y ramificadas, los que al reciclarse en el rumen por muerte bacteriana, representar un factor de crecimiento importante para otros microorganismos y una vez absorbidos pueden seguir alguna de las vías comunes a los demás ácidos grasos (incluso contribuyen a determinar las características organolépticas de la leche).