PRÁCTICA 2: OBTENCIÓN DE UN FROTIS SANGUÍNEO Y TINCIÓN DE GIEMSA Materiales: Frotis Sanguíneo: - 2 portaobjetos. - 1 cubreobjetos. - Gasas estériles. - Lanceta. - Alcohol metílico absoluto (libre de acetona). - Alcohol de 70º - (Guantes) Tinción de Giemsa: - Colorante de Giemsa. - Tampón PBS. - Pipeta Pasteur. - Cubeta. - Agua destilada. - Tubo de ensayo. Obtención de un frotis sanguíneo: 1. Obtención de la muestra (sangre capilar). Con la lanceta realizar un pequeño corte en la yema del dedo índice o corazón previamente desinfectado con alcohol de 70º. 2. Desechar la primera gota. 3. Depositar una gota en el extremo de un portaobjetos y colocarlo encima de la mesa. 4. Proceder a tapar el dedo pinchado y desechar la lanceta en un contenedor de residuos. 5. Realizar la extensión de la muestra. Colocar el segundo portaobjetos por delante de la muestra (que se encuentra en el primer portaobjetos colocado encima de la mesa), con una inclinación de 45º respecto al que contiene la muestra. Primero se procederá a un deslizamiento hacia el extremo donde se encuentra la gota de sangre. De esta forma se consigue que por capilaridad, la sangre ocupe toda el borde del segundo portaobjetos. Seguidamente se procederá a la extensión en sentido contrario de forma rápida y uniforme. 6. Dejar secar al aire. 7. Etiquetar el portaobjetos. Si el frotis está bien realizado deberemos observar tres partes: la cabeza, el cuerpo y la cola (forma de pluma). Es en el cuerpo realizaremos la observación y el estudio. Fuente de la imagen: http://html.rincondelvago.com/000759832.png Tinción de Giemsa: 1. Fijar el frotis con alcohol metílico absoluto durante 3 minutos. 2. Preparar en un tubo de ensayo una solución con una proporción de 1:9 con Giemsa y tampón PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). 3. Sumergir la muestra de forma vertical en la solución preparada durante 10 minutos. 4. Lavar el portaobjetos con agua destilada. 5. Dejar secar. 6. Aplicar el cubreobjetos sobre la preparación. 7. Listo para su observación en el microscopio. La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Es muy útil para la identificación de riketsias (plasmodium), protozoos… La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico, entre 6.4 y 6.9 por lo que se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. ¿Cómo vemos las células con esta tinción? 1. 2. 3. 4. 5. 6. Citoplasma: rosa Núcleos: azul Eritrocitos: rojo Gránulos de las células cebadas: violeta Bacterias: azul Parásitos: azul