tec mic-preparaciones

PREPARACIONES Y
TINCIONES
PREPARACIONES
• En fresco
• Temporales:
Microcultivos de hongos, preparaciones de
tejidos
• Fijas:
Gram, Ziehl Nielsen, Sheaffer y fulton, SEM, TEM,
naranja de acridina.
CONTRASTE DE FASES
PREPARACIONES TEMPORALES:
microcultivo de hongos
1.
Colocar en una caja de petri, un soporte para
portaobjetos, un portaobjetos, 2 cubreobjetos y
esterilizar a 121°C por 15 min.
2.
Colocar sobre el portaobjetos un fragmento de agar
papa dextrosa de 1cm2.
3.
Inocular con el asa micológica cada lado del cuadrito
de agar con el cultivo del hongo. Colocar encima un
cubreobjetos.
4.
Colocar a un lado, una torunda de algodón
impregnada de glicerol al 10%, estéril; incubar a
28°C durante 48 h.
MICROCULTIVO
PREPARACIONES TEMPORALES:
microcultivo de hongos
5.
Eliminar la torunda y agregar dos gotitas de
formaldehído g.r. Dejar reposar una hora.
6.
En un portaobjetos, colocar una gotita de azul
de algodón y colocar el cubreobjetos superior
del microcultivo, sellar con esmalte de uñas
transparente. Eliminar el agar y colocar otra
gotita de azul de algodón, sellar con esmalte.
7.
Observar a 10X y 40 X. Realizar
respetando los aumentos y colorearlos.
dibujos
MICROCULTIVO
Penicillium sp.
Acremonium sp.
Preparaciones Fijas
Agentes fijadores
• Agentes físicos .- calor, resinas
• Agentes químicos:
Etanol al 100%
Paraformaldehído
Gliceraldehído
tetróxido de osmio
Preparaciones Fijas:
• Transferir una pequeña porción de la
colonia a un portaobjetos limpio y
desengrasado, homogeneizar con una
gotita de agua.
• Dejar secar al aire y fijar con calor
suave.
TINCIONES
• TINCIONES SIMPLES
• TINCIONES DIFERENCIALES
• TINCIONES ESPECÍFICAS
Tinción de Gram
• Colocar una gotita de cristal violeta sobre el
frotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua
• Colocar una gotita de lugol durante 1 min.,
enjuagar con agua
• Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar
con agua
• Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y
enjuagar con agua
• dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X a
inmersión. Dibujar y colorear.
Cepas aisladas de gasoductos
(Tinción de Gram)
TINCIÓN CON NARANJA DE
ACRIDINA
• Transferir una gota del cultivo a un
portaobjetos limpio y
desengrasado, dejar secar al aire.
• Fijar con etanol al 100%, cubriendo
el frotis durante 5 min.
• Eliminar el etanol y colocar 100 L
de naranja de acridina durante 3
min.
TINCIÓN CON NARANJA DE
ACRIDINA
• Eliminar el exceso del colorante con
etanol al 70%.
• Observar en un microscopio de
epifluorescencia con un filtro azul,
emisión a 490 nm.
MICROSCOPIA DE
EPIFLUORESCENCIA
PREPARACIÓN FIJA:
SEM
• Fijar una porción del cultivo con glutaraldehído al 2%, g.m. por
8 h.
• Eliminar el glutaraldehído lavando 3-4 veces con amortiguador
de fosfatos
• Agregar 2 gotas de tetróxido de osmio y fijar durante 3 h.
• Lavar con amortiguador de fosfatos
• Deshidratar con etanol en concentraciones crecientes (40, 50,
60, 70 , 90 y 100%)
• Secar al punto crítico durante 1h
• Cubrir con carbono y oro en polvo
• Observar en el microscopio electrónico.
Microscopía Electrónica De Barrido
(SEM)
biopelícula de 10 m de grosor
D. alaskensis
TINCIÓN DIFERENCIAL
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)
• Se utiliza para diferenciar las bacterias
denominadas ácido alcohol resistentes de las
No ácido alcohol resistentes
• Algunas bacterias poseen, en su pared celular,
ciertos ácidos grasos de cadena larga que les
confiere la propiedad de resistir la decoloración
con alcohol ácido, tras haber sido teñidas con
colorantes básicos.
• Esta tinción requiere un calentamiento para que
el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene la capa cerosa formada por ácido
micólico
TINCIÓN DIFERENCIAL
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)
• Frotis bacteriano
• Cubrir el frotis con Fucsina fenicada y calentar hasta
emisión de vapores durante 5 minutos.
• Lavar con agua de la llave
• Decolorar con alcohol ácido 1 minuto (asegurándose
de que no se desprende mas color rojo).
• Lavar con agua de la llave para eliminar el exceso
• Agregar azul de metileno al 1% como colorante de
contraste
Mycobacterium sp. 1000 X
Nocardia asteroides, 1000 X
Los bacilos ácido alcohol resistentes aparecen coloreados en rojo sobre
el fondo azul de la preparación. Este tipo de tinción se utiliza para
observar los géneros Mycobacterium y Nocardia
Las bacterias No ácido alcohol resistentes se tiñen con el colorante de
contraste (azul)
Tinciones Estructurales
Estructura
Tinción
Flagelos
Método de Fontana-Tribondeau
Método de Leifson
Esporas
Método de Moeller
Método de Wirtz-Conklin
Cápsula
Método de Hiss
Método de la Tinta china
Corpúsculos
Método de Albert
Gránulos Metacromáticos
Método de Loeffler
TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON
Las esporas son formas de resistencia bacteriana.
Tienen forma esférica u oval. Al microscopio las
esporas sin teñir se observan como gránulos
brillantes.
Según su localización se distinguen tres tipos de
esporas: Centrales, Subterminales, Terminales
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Realizar el frotis
Cubrir el frotis con verde de malaquita
Calentar 5 minutos a emisión de vapores
Enjuagar con agua de la llave
Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto
lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.
Endosporas:
Técnica Schaeffer y Fulton
Bacillus sp.
2000 X
1250X
TINCIÓN DE NEGATIVA DE
CAPSULA
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La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que
envuelve la pared celular de algunas bacterias.
Esta compuesta de polisacaridos, mucopolisacaridos o
polipéptidos
Por su alto contenido de agua se tiñen débilmente por los
colorantes
Prepara un frotis a partir de una suspensión densa de bacterias
en solución salina al 0.85%
Agregar una gotita de cristal violeta o de tinta china.
Dejar secar al aire y observar