estudio histoquimico de la cresta, barbillas y

ESTUDIO HISTOQUIMICO DE LA CRESTA, BARBILLAS Y
OREJUELAS DE Gallus domesticl~sL.
Por
CARLOS CEVALLOS BOHORQUEZ
Departamento Inierfaculta~ivode Morfologa R.licroscópica.
Universidad de Oviedo.
RESUMEN
S e estudian las crestas, barbillas y orejuelas a nivel histoquírnico, utilizando diversos métodos
clásicos d a difrreiic:iación. Al final presentarnos un cuadro comparativo d e los resultados metacromáticos a dilerente pH de las estructuras estudiadas.
INTRODUCCION
En trabajos anteriores hemos realizado estudios a nivel estructural y ultraestructural, d e los apéndices cefálicos del G u l f i ~ds o m e s t i c ~ ~L.s (crestas, barbiBOI-IORQUEZ, C . , 1972-1975 (3a-3b), estableciendo niveHas y orejurlas), CEVALLOS
les de comparación con trabajos como los d e BoYL~:,J., 1 9 a (8), RIZZOLI,C. E.,
1950 (19); SZIRNAI,
J. (21-22), BOAS,N . F., lgLt9 (3) y otros a nivel estructural,
ultraestructural e histoquimico. E n cuanto a este último punto el d e la histoquímica, objeto del presente trabajo, hemos realizado análisis d e los apéndices
crfálicos utilizando métodos clásicos, encontrando algunas diferencias notables
entre las reacciones que s e realizan en las diversas estructuras d e las crestas,
barbillas y orejuelas, haciendo surgir nuevamente tan intensamente estudio, tan
íntimamente ligado al campo d e la histofisiología, patología aviar y al d e la
productividad avícola.
MATERIALES Y METODOS
Para el estudio histoquímico hemos utilizado ejemplares jóvenes (dos meses y cuatro meses) d e Gallus domesticus L. (híbridos), machos e n condiciones
normales y sin ninguna tara patológica.
Fueron sacrificados por decapitación, y las crestas, bart)illas,y orejuelas
fijadas d e acuerdo a los métodos por realizar, a fin d e poner e n evidencia la:,
diferentes reacciones histoquímicas a estudiar.
S e hicieron cortes d e 8 p, 10 p y 16 p.
Los métodos d e tinción utilizados han sido el P A S , el verde d e metilo
pironina-Pappenheim-Unna, reacción d e Feulgen y el azul d e toluidina al 0,2 en
solución tampón a p H 3; 3,5; 4,2, 7 y 9.
Los fijadores empleados fueron formo1 neutro 10 c c , agua destilada 90 cc:,
acetato d e plomo a saturación. Bouin y formo1 al 15 % para congelación.
ANALISIS H I S T O Q U I M I C O Y OBSERVACIONES
L a s observaciones a nivel histoquímico, l a s hemos realizado con el siguiente planteamiento:
1) Análisis d e la c a p a epidérmica.
2) Análisis d e la c a p a dérmica.
3) Estudio d e la zona del tejido mucoso.
En todas e s t a s regiones hemos realizado un estudio comparativo d e la
presencia d e mucopolisacáridos y ácidos nucléicos.
Observaciones de la capa epidérmica y de la dermis
En nuestras observaciones hechas con el método del P A S , hemos podido
constatar e n la c a p a reticular d e la zona s u b epitelial d e la cresta y barbillas, la
presencia d e gran número d e vasos sanguíneos sinusoidales. Estos vasos s e
muestran e n cambio a u s e n t e s en l a s orejuelas, e n donde hay solamente una
pequeña banda d e tejido muy similar a la c a p a reticular d e la cresta y barbillas.
E n la c a p a dérrnica d e la cresta, barbillas y orejuelas, s e encuentran en
cambio fibras colágenas d e aspecto homogéneo, y vasos sanguíneos e n espiral
(Fotos A y B).
Los resultados observados con la técnica del P A S , fueron los siguientes,
d e s d e la zona superficial hacia l a p a r t e m á s profunda:
1." Intensa reacción P A S positiva e n c a p a córnea.
2.O
Positividad m á s débil o ausencia d e reacción PAS positiva, e n capas
espinosas y basal del epitelio; intensa P A S positividad en la membrana basal del
epitelio.
3.O P A S positivo e n las paredes d e los vasos sanguíneos y también en el
tejido conectivo situado inmediatamente por debajo del epitelio.
4 . O Zona P A S negativa.
5.O M á s hacia adentro tejido conectivo P A S positivo.
6.O Células sanguíneas P A S positivas, lo mismo q u e la zona mucosa.
7.' Tejido mixomatoso, constituido por células estrelladas con sustancia
fundamental metarromática (como veremos más adelante con las tinriones d e
azul d e touidina realizados a diferentes pH).
Las orejuelas presentan las mismas característi(:as que las crestas, en 10
q u e respecta a la reacción del PAS.
L a reacci611 1'AS positiva, fue observada especialmente intensa en la
membrana basal del epitelio pavimentoso d e revestimiento y en la capa córnea.
La P A S positividad s e presentó también, en paredes vasculares y en algunos
haces d e fibras r o l á g ~ n a s . Esta misma reacción s e encontró con intensidad
uniforme en la zona media.
Observaciones pn la barbilla con la. tinción de Feulgen
Hemos observado que los nucleolos d e las células d e las capas basal y
espinosa, s e rnustraron negativos a la reacción de Feulgen. Fueron en cambio
positivos los núcleos, especialmente los de las células sanguíneas. S e observó
gran acúmulo d e linfocitos alrededor d e los vasos.
Observaciones con el verde metilo pir0nin.a
Los nucleolos mostraron intensa coloración con l a pironina (buena tinción
del RNA), observándose que el DNA s e coloreaba en verde. La coloración del
DNA por verde d e metilo, mostraba distribución semejantes a la revelada por la
técnica d e Feulgen. Con este último método no s e tiñen las capas d e queratina,
pero se puede notar bien la zona d e transición.
S e parecía una transici6n desde la capa hasal a la zona epidérmica queratinizada, observándose disminución d e la tinción de los núcleos, los cuales s e
hacen cada vez menos visibles a medida que nos acercamos a la capa cbrnea.
Análisis del tejido mucoso
El análisis del tejido mucoso, lo hemos realizado utilizando los métodos dr1
PAS y la metacromasia con azul d e toluidina.
Indudablemente, el estudio de las reacciones del PAS en cada una de
estas estructuras nos ha llevado a demostrar la presencia d e polisacáridos en
diclios tejidos, y como veremos en su capítulo correspondiente, los materiales
rnetacromáticos fueron observados casi exclusivamente en el espacio interfibrilar
d e la r a p a rnucoide.
La capa mucoide está ligeramente teñida en comparaci6n con la intensa
reacción d e la capa del tejido conectivo.
E n la capa mucoide, la metacromasia s e localiza en la sustancia fundamental, entre las fibras, mientras que la sustancia P A S positiva está asociada estrictamente a las fibras mismas. E n la capa mucoide las fibras son sólo estructuras
r!íJ positivas. Al teñir con el PAS obtuvimos un color rojo intenso, índice d e un
gran contenido en mucopolisacáridos neutros.
La reacción d e PAS s e observó negativa en la sustancia mucoide d e la
cresta:, pero menos pronunciada o casi imperceptible en las orejuelas.
Bien podemos decir por nuestras observaciones, q u e el PAS tiñe positivamente a las fibras colágenas.
ESTUDIO DE LAS ZONAS DEL TEJIDO MUCOSO
CON LA REACCION METACROMATICA
El análisis histoquímico s e realizí, utilizando la reacción metacromática con
: toluidina.
Las variaciones que hemos observado han sido conseguidas utilizando pH a
diferenits escalas.
Nuf:stras observaciones nos han dado los siguientes resultados:
Mt-tacromasia con azul de tnluidina (pH 4,2). S e observó una fuerte meta(21 tejido mucoide (Fot. l-2), correspondiente a los mucopolisacáridos
ácidos, q u e s e manifiestan en forma d e color rojo púrpura. Tal metacromasia
disminuyó en la zona inferior en donde observamos más bien una abundancia de
vasos PAS positivos.
Utilizando iin pH más bajo, del orden d e 3,5, los niucopolisacáridos carboxilados ya no deben mostrar reacción metacromática, pudiendo d e e s e modo
distinguir, si la metacromasia es debida a grupos carboxilados o a otros grupos
ácidos. Es así como las metacromasias observadas a estos pH bajos podemos
considerarlos debido a la presencia d e fosfornucopolisacáridos y d e sulfomucopolisacáridos.
Continuando bajando el pH, observamos que a p H 3 desaparecen la metacromasias, por lo que puede decirse que la metacromasia d e las barbillas es debida
a la presencia de mucopolisacáridos ácidos carboxilados.
L I ~ J I I tbri
I ~ ~ ~ ~
Crestas
En las crestas observamos una metacromasia más marcada q u e e n las
barbillas. Los mucopolisacáridos ácidos s e encuentran concentrados en la capa
fundamental, integrando las zonas interfihrilares en donde está ampliamente
repartido el tejido mucoide. Sin embargo la zona central constituida por los
grandes vasos, no s e tiñe metacromáticamente.
Utilizando pH 3,5 observamos que las metacromasias s e siguen presentando intensas e n la zona del tejido mucoide, pero no e n las fibras colágenas. Las
zonas epidérmicas profundas y dérmicas dan e n cambio metacromasia negativa.
R E A C C I ~ METACROMATICA
N
Las ilustracionee que presentamos eii blanco y negro nos rnucbstrari zoiias más o
menos oscuras que representan zorius de rnayoi o menor reacción nietacrornáticu.
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Foto 2
Foto 1-2.-Barbillas de Callus dornesticus L. ~eñidascon azul de toluidina (pH 4.2). Fuerte rnetacrt3macia en el tejido rnucoide.
212
Segun nuestras observaciones, por lo tanto s e d e m u e s t r a la presencia d e mucopolisac'áridos carboxílicos, ya q u e observando estas mismas c4rcstas a un pH 3 , s e
I ~ ~ trtiservar
d o
disininiición d e la intensidad d e la metacromasia. E s t a disininución
correspondería por lo tanto a In aitseti<:ia d e reacciones d e mucopo1isac:áridos
ri1ií:os a pH tan bajo.
111aunirntar los p H a 4,2 7 y 9 (Fot. 3-4), pudimos evidenciar incremento
intensidad d e la mt,tacromasia, observando nienos diferencia d e ciiclia
intrnsitiad cii Iai; tlit'erentcs regiones estudiacias. Tal e s el c a s o d r las ohservacioiirs Iie(*lias a p H 9. Esto es probablemente debido a clur e n los lugares en donde
nids ~ i c e n t u a d ala meta<:rurnasia existen rnenos mucopolisacáridos fosforados o
atados q u e mucopolisa<:líiirios car1)oxílicos.
,., ...
6.-
En las orejuelas hemos observado una metacromasia mucho m á s m a r c a d a
a p H 4,2 (Fot. S), con una especial diferenciación. Se observa en cambio una baja
de esta tnetacromasia a p H 7 , ocasiona pérdida d e la diferenciación entre e1 tejido
niiicnso y 11)s elementos interf'ibrilares. a u n q u e persisten aún ligeras diferenciaciones ti? la metarromasia estudiada a pH 7 y 9, hecho contrario d e lo q u e hemos
podidu o b s e r ~ a re n las crestas y barl)illüs.
En cuanto a nuestras observacioncs e n l a s c a p a s fibrosas intercelulares,
ninguna reaccitíri da color cspecífico pudo s e r detectada.
C~rcítlro cornl)rírntivo tlc l a rcnccicín rnctacrom6/ica de las crestas, barbillas y
orry~~elics
de CILIIILS
domestirus L.
DISCUSION
Como habíamos señalado e n trabajos anteriores (3a-3b), pocos trabajos a
nivel histoqi~ímicos e h a n realizado (le las c r e s t a s , barbillas y orejiielas d e Gnllrls
rlnmesticr~s L. Sin embargo algunos trabajos especializados s e h a n realizado al
J. (21-22), referente a la copa fundamental d e la
respecto, como los d e SZIRXIAI,
rapa mucoide d e la cresta del pollo respondiendo favorablemente a la reacción
metacromática, pero e s negativa a la reacción d e PAS, las fibras son PAS
positivas. E s t a observación d e SZIRMAI
coincide plenamente con nuestros resulta-
Foto 3
Foto 4
Foto 3-4.-Creslas de Callus d o m e s t i c ~ ~L.
s teñidas con azul de ioluidina (pH 4,2 y 7). Aumento de la
intensidad de la metacromacia.
.
-. ....
,
,-
3 a*?,- 4;
Foto 5.-Oiejurl:~ de GIILLLII.F
d v ~ » ( ' ~ t i L.
~ . teñidas
~ ~ . s con azul d e toliiidina (pH 4,2). Matacroniaria inuclio
rnjs marcada con especial dif(~renciari6n.
dos, sin embargo nosotros hemos encontrado que cuando existe un aumento del
pH, aumenta la metacromacia y si bajamos el pH desaparece la metacromacia.
En cuanto a la presencia de la reacción PAS, del mismo modo pudimos
comprobar que es negativo en la sustancia mucoide d e la cresta, siendo positiva
en cambio en las fibras. En el estudio d e las barbillas s e encontró la misma
reacción d e PAS que en las crestas, pero fue menos pronunciada en las orejuelas,
DOYLE(6), nos dice que aproxiinadarnente la mitad d e la acumulacjón total en
proteínas de la cresta, s e encontró que era colágena, esta proporción está relativamente constante durante el periodo d e regresión. El total d e la acumulación d e
colágena, es similar a la total aparición de la proteína, esto parece estar relacionado con el peso.
Nosotros hemos comprobado estas reacciones utilizando en nuestras observaciones el verde d e metilo pironina, en la cual hemos observado una buena
tinción del RNA, observando que el DNA s e tiñe en verde, mediante el método de
Feulgen comprobamos que los nucleolos de las células de la capa basa1 y espinosa, s e mostraron negativos a la reacción d e Feulgen.
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