Rev Cubana Angiol y Cir Vasc 2001;2(1):68-72 Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular HIPORREACTIVIDAD DEL PLASMA RICO EN PLAQUETAS FRENTE AL COLÁGENO: UN POSIBLE MARCADOR DE LA ATEROSCLEROSIS Dra. Milagros García Mesa,1 Dr. Arquímedes Díaz Batista2 y José I. Fernández Montequín3 RESUMEN: Las plaquetas tienen una participación importante en la aterogénesis y la formación del trombo arterial, de ahí que el estudio de su funcionalidad parezca potencialmente útil como marcador de aterotrombosis. Con el objetivo de evaluar la reactividad plaquetaria en sujetos con diferentes manifestaciones clínicas de aterosclerosis, se compararon 63 pacientes con macroangiopatía diabética, 54 pacientes no diabéticos con diferentes manifestaciones clínicas de aterosclerosis y 68 voluntarios sanos con respecto a la agregación plaquetaria inducida en el plasma rico en plaquetas por diferentes concentraciones de difosfato de adenosina (ADP) y de colágeno. No hubo diferencia entre los grupos con respecto a la reactividad plaquetaria al ADP, pero la respuesta al colágeno estuvo de forma significativa disminuida en ambos grupos de pacientes. Los resultados sugieren que la hiporrespuesta del plasma rico en plaquetas frente al colágeno pudiera ser útil como marcador de aterosclerosis. DeCS: AGREGACION PLAQUETARIA/efectos de drogas; ATEROSCLEROSIS; COLAGENO; ADENOSINA DIFOSFATO. aterosclerosis.1 Esto sugiere la posibilidad de emplear la reactividad plaquetaria como marcadora de la ateros-clerosis. El cumplimiento de este propósito, sin embargo, ha tenido dificultades, ya que se trata de un tipo de célula susceptible a la activación por el contacto con superfi- No existe ninguna duda de la participación de las plaquetas en la aterogénesis y los eventos trombóticos arteriales, prueba de ello es el incremento de los niveles de constituyentes de los gránulos plaquetarios en los plasmas de sujetos con manifestaciones clínicas de 1 2 3 Doctora en Ciencias Biológicas. Investigadora Titular. Doctor en Ciencias Médicas. Investigador Titular. Especialista de II Grado en Angiología. Investigador Auxiliar. 68 cies o por agitación, por lo que la presencia en el plasma de los productos de la reacción de liberación plaquetaria, no es un indicador lo suficientemente específico como para ser utilizado en la práctica clínica como marcador de aterosclerosis.2 La detección de plaquetas circulantes portadoras de P selectina en su superficie pudiera tener valor diagnóstico,3 pero se trata de una metodología costosa accesible sólo a un número reducido de laboratorios. El método turbidimétrico de Born4 se ha utilizado durante mucho tiempo en los laboratorios de Hemostasia para medir la funcionalidad de las plaquetas así como para caracterizar el comportamiento de estas células en pacientes con las manifestaciones clínicas de la aterosclerosis.5-9 Estas investigaciones han tenido resultados diversos, de los cuales resulta difícil extraer conclusiones. En esto puede haber influido el hecho de que se han empleado diferentes niveles de concentración de los agonistas de la agregación plaquetaria y/o a factores genéticos. Hace algunos años en nuestro laboratorio se realizó la evaluación de la reactividad plaquetaria de los plasmas ricos en plaquetas de pacientes ateroscleróticos,10 sin embargo, en esa ocasión no se evaluó la respuesta al colágeno y se utilizó una concentración única de difosfato de adenosina (ADP). El presente trabajo fue realizado con el objetivo de evaluar la reactividad del plasma rico en plaquetas de pacientes ateroscleróticos diabéticos y no diabéticos frente a diferentes concentraciones de ADP y colágeno. mujeres, edad 53,1 ± 58 años), provenientes del servicio de Macroangiopatía Diabética del Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular (INACV) y 54 pacientes no diabéticos con historia de diferentes manifestaciones de aterotrombosis (21 hombres y 33 mujeres, 59,6 ± 61 años) provenientes de la consulta de hipercoagulabilidad del INACV. Los controles fueron 68 sujetos sanos (23 hombres y 45 mujeres, 60,8 ± 71 años), que participaban en chequeo médico laboral. Los sujetos dieron su consentimiento a participar en el estudio después de conocer las características del mismo. Todos negaron haber consumido algún antiagregante plaquetario u otros fármacos que modifican la agregación plaquetaria al menos 2 semanas antes de acudir al laboratorio. En el laboratorio se obtuvieron muestras de sangre de una vena antecubital con el empleo de jeringuillas plásticas desechables, en el horario de 7:30 a 09:00 a.m., después de 12 a 14 h de ayuno. La sangre fue vertida en tubos plásticos que contenían 0,1 volumen de citrato de sodio 3,8 % y centrifugada 5 min a 150 × G para obtener el plasma rico en plaquetas (PRP). El resto fue centrifugado 15 min a 1 000 × G para obtener el plasma pobre en plaquetas (PPP). La agregación plaquetaria fue determinada por el método turbidimétrico de Born.3 En cubetas de un agregómetro Elvi 840, se vertieron 200 µL de PRP que contenían 200 a 250 plaquetas/ × 109 /L , previo ajuste con PPP autólogo. Se indujo la agregación plaquetaria por adición de 20 µL de una solución de colágeno o ADP (Sigma Chem), después de 2 minutos de incubación a 37 °C con agitación a 1 000 rev./min. El cambio de la transmisión de luz a través de la muestra fue recogida en un registrador Omni-Scribe, calibrado mediante el empleo del PRP (0 cm en la escala de deflección) y PPP (16 cm en Métodos Participaron en este estudio 63 pacientes diabéticos tipo II con macroangiopatía y sin lesiones externas (22 hombres y 41 69 la escala de deflección), equivalentes a 0 y 100 % de agregación plaquetaria respectivamente. Los resultados fueron expresados en porcentaje de agregación como medida relativa de la amplitud (cm) del incremento en la transmisión de luz a través del PRP. Como parte del análisis estadístico se realizó la comparación entre los 3 grupos de sujetos mediante el análisis de varianza. Se consideraron significativas las diferencias con p < 0,05. colágeno fue dependiente de la concentración en el grupo control de una manera creciente entre 0,3 y 3,0 mg/mL. En los grupos de pacientes diabéticos y no diabéticos, la respuesta de agregación plaquetaria fue marcadamente inferior con respecto a la ocurrida en los controles en las 3 concentraciones empleadas. Como puede observarse en la tabla, a diferencia de los controles sanos, la respuesta a las concentraciones 0,3 y 1,0 mg/mL fue similar en los dos grupos de pacientes. Resultados Discusión Se emplearon 3 concentraciones de ADP y 3 de colágeno con el objetivo de evaluar la influencia de la enfermedad aterosclerótica diabética y no diabética sobre la reactividad de las plaquetas frente a diferentes magnitudes de estímulo. La agregacion plaquetaria inducida por ADP fue dependiente de la concentración los tres grupos de sujetos estudiados y no hubo diferencia significativa entre los grupos a ninguna de las concentraciones. La agregación plaquetaria inducida por El ADP y el colágeno son estímulos fisiológicos para la agregación plaquetaria, pero difieren en su ubicación tisular, en los receptores de la membrana plaquetaria que estimulan y los mecanismos mediante los cuales activan a estas células. Una revisión sobre el tema ha sido realizada por García y Coma.11 En la investigación realizada previa- TABLA. Agregación plaquetaria en plasma rico en plaquetas de controles sanos, pacientes con macroangiopatía diabética y pacientes con otras manifestaciones ateroscleróticas Estímulo Control N = 68 Grupos Diabéticos N = 54 No diabéticos N = 63 ADP (µmol/L) X ± DS X ± DS X ± DS P 16,0 ± 17,1 35,3 ± 24,2 44,0 ± 22,2 16,9 ± 22,0 32,4 ± 24,2 55,0 ± 2,3 0,2557 0,4087 0,1732 4,1 ± 10,1 7,2 ± 14,5 20,2 ± 23,5 4,7 ± 13,3 4,7 ± 14,0 20,2 ± 23,0 0,0006 0,0108 0,0004 0,2 1,0 3,0 13,8 ± 15,8 33,6 ± 28,0 54,0 ± 27,8 Colágeno (µg/mL) 0,3 1,0 3,0 13,6 ± 10,4 20,2 ± 22,7 5 7 ± 32,9 70 mente en nuestro laboratorio,10 la respuesta de agregación plaquetaria inducida con la concentración de ADP de 2,7 µmol/L en pacientes con enfermedades estenooclusivas de miembros inferiores, estuvo dentro de los límites de referencia para este laboratorio, sin embargo, se encontró un incremento del malondialdehido formado por plaquetas estimuladas por N etilmaleimida, que ocurre por activación de la fosfolipasa A2 en la membrana plaquetaria.12 Esto sugiere la existencia de modificaciones a nivel de la membrana celular. Los resultados de la actual investigación demuestran que la reactividad plaquetaria al ADP en los sujetos con diferentes manifestaciones clínicas de la aterosclerosis, no difere de los sujetos sanos, resultado que concuerda con el estudio anterior, mas encontramos una hiporrespuesta plaquetaria al colágeno en los pacientes, fueran diabéticos o no, lo que sugiere que estamos en presencia de un fenómeno relacionado con la aterosclerosis. Existen 3 alternativas para explicar este resultado: menor cantidad de receptores para el colágeno en su membrana externa. • Las membranas externas de las plaquetas de los pacientes poseen receptores de membrana con menor afinidad por el colágeno. La aterosclerosis trae como consecuencia la reducción de la supervivencia plaquetaria y, por ende, el incremento del recambio celular. Esto pudiera influir en la composición de la población celular con el predominio de plaquetas de menor volumen, que son menos reactivas. 13,14 Esta pudiera ser otra explicación al resultado obtenido y, aunque en principio debiera afectar por igual a la reactividad plaquetaria frente a los 2 agonistas, no debe olvidarse la influencia que puede tener el hecho de que, según se ha planteado, la agregación inducida por ADP en plasma citratado es un fenómeno inespecífico.15 En el futuro deben realizarse investigaciones para comprobar la veracidad de las hipótesis propuestas, no obstante, los resultados sugieren que la hiporrespuesta del plasma rico en plaquetas frente al colágeno pudiera ser útil como marcador de aterosclerosis. • El plasma de los pacientes contiene un elemento que inhibe selectivamente el mecanismo de activación plaquetaria que desencadena el colágeno. • Las plaquetas de los pacientes tienen SUMMARY: Platelets have an important participation in the atherogenesis and formation of the arterial thrombus and that’s why the study of their funcional capacity seems potentially useful as a marker of atherothrombosis. In order to evaluate the platelet reactivity in subjects with different clinical manifestations of atherosclerosis, 63 patients with diabetic macroangiopathy, 54 non-diabetic patients with different clinical manifestations of atherosclerosis and 68 sound volunteers were compared as regards the platelet aggregation induced in platelet-rich plasma by different concentrations of adenosine diphosphate (ADP) and of collagen. No difference was observed between the groups in relation to the platelet reactivity to ADP, but the response to collagen was significantly reduced in both groups of patients. The results suggest that the hyporesponse of the platelet-rich plasma to collagen may be useful as a marker of atherosclerosis. Subject headings: PLATELET AGGREGATION/drug effects; ATHEROSCLEROSIS, COLLAGEN; ADENOSINE DIPHOSPHATE. 71 Referencias bibliográficas 9. Torres A, Blumenfeld de Boch N, ArochaPiñango CL, Rodríguez A, Bosch V. Enfermedad tromboembólica en Venezuela. 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