analisis de carbohidratos

ANÁLISIS DE ALIMENTOS
PROGRAMA - CALENDARIO
(Semestre 08 - 1)
Ju 27 Septiembre
Ma 2 Octubre
Ju 4
Ma 9
Ju 11
Ma 16 OCTUBRE
Ma 23
Ju 25
Ma 30
Ma 6 Noviembre
Ju 8
Ma 13
JU 15 NOVIEMBRE
Proteína cruda.
Proteína soluble.
Alimentos ricos en proteínas. Leche y huevo Seminarios:
Antibióticos en leche.
Carne y productos cárnicos.
Seminarios Nitratos y nitritos, Trimetilamina, Anabólicos.
3a EVALUACION PARCIAL
Carbohidratos. Métodos generales.
Polisacáridos. Seminarios Almidón y Celulosa.
Fibra.
Alimentos ricos en carbohidratos. Azucares y mieles.
Cereales y sus derivados. Seminario Aflatoxinas,
Pruebas reológicas de las masas
Componentes asociados a cereales. Seminarios.
Mejoradores y blanqueadores, Vitaminas complejo B.
4a EVALUACION PARCIAL
ALIMENTO
VOLATIL POR SECADO
(HUMEDAD)
MATERIA SECA
INORGANICA
(CENIZAS)
ORGANICA
SOLUBLE EN DISOLVENTES
ORGANICOS
(GRASA O LIPIDOS)
CON NITROGENO
(PROTEINAS)
NO GRASO SIN NITROGENO
(CARBOHIDRATOS)
DIGERIBLES
NO DIGERIBLES
(FIBRA)
ANALISIS DE CARBOHIDRATOS
1. Calidad Nutricional
2. Estabilidad química
3. Verificación de la calidad
4. Control de procesos, etc.
A) Tecnólogo: Métodos rápidos, simples y reproducibles, para
controlar la calidad final del producto.
B) Asesores: Rápidos, sin equipo especializado y que puedan
ser aplicados en diferentes condiciones.
C) Nutricionistas: Conocimiento detallado del contenido de
diferentes carbohidratos, por su efecto metabólico.
DESARROLLO DEL ANALISIS DE CARBOHIDRATOS
El análisis de cualquier constituyente esta limitado al conocimiento
de su química.
Químicos farmacólogos y médicos, en el descubrimiento de
nuevos medicamentos naturales.
Estudios de análisis elemental por técnicas de combustión,
considerando al C como fuente principal de energía.
Análisis proximal de Weende (1860), cuantificación de
carbohidratos por diferencia, después de determinar humedad,
proteína, grasa, cenizas y material no digerible (fibra cruda).
Las industrias de refinación del azúcar, la cervecera y la de
vinos, interesadas en métodos para la cuantificación directa de
azucares solubles. Métodos empíricos avalados en 1897 por la
“International Commission on Uniform Methods of Sugar Analysis”
(ICUMSA).
Principalmente refractometría, polarimetría, gravedad específica
y métodos para reductores.
A principios del siglo XX se hacen intentos para medir azucares
directamente, usando métodos para reductores.
Clasificación en digeribles y no-disponibles, 1936, con problemas
metodológicos que subestiman el contenido total, cuando se
encuentra sacarosa.
Ante las dificultades en la cuantificación directa, un comité sobre
requerimientos energéticos de la FAO, en 1947, recomienda que
se evite el uso del método “por diferencia” y solicita se realicen
esfuerzos para desarrollar métodos adecuados para cuantificarlos
directamente.
El impacto de la bioquímica analítica y las aplicaciones de los
sistemas de cromatografía inician una nueva era en el análisis de
carbohidratos (1960).
El desarrollo de sistemas de HPLC (1980), abre una nueva
etapa en el campo.
CARBOHIDRATOS EN ALIMENTOS
•-
Mezclas complejas.
•-
Interacción con otros componentes.
•-
Diversas características físicas y fisicoquímicas.
•-
Ampliamente distribuidos.
CLASIFICACION DE CARBOHIDRATOS EN ALIMENTOS
a) Carbohidratos Disponibles o Digeribles
Azúcares (solubles)
Dextrinas y Almidones
b) Carbohidratos No-disponibles o No-digeribles
(Fibra, Fibra Dietética).
Celulosa
Hemicelulosa
Pectinas
+ Lignina (NO ES CARBOHIDRATO)
METODOS GENERALES
1. Los más desarrollados son para los azucares, principalmente
monosacáridos
2. En principio los polisacáridos podrían ser analizados con los
mismos métodos, una vez hidrolizados totalmente
Si solo se desea conocer la presencia o no de carbohidratos
se puede realiza una detección cualitativa
Prueba de Molish.
-
Hidrólisis y deshidratación con H2SO4
-
Condensación con a-naftol. Coloración púrpura.
ANALISIS DE CARBOHIDRATOS SOLUBLES (AZUCARES)
DETECCION DE AZUCARES SOLUBLES
1. Prueba de Benedict.
- Azúcares reductores.
- Cobre en medio alcalino.
- Formación de óxido cúprico.
- Precipitado color ladrillo.
2. Prueba de Barfoed.
- Monosacáridos reductores.
- Acetato de cobre en medio ácido.
- Precipitado rojo de óxido cuproso.
3. Prueba de Saliwanoff.
- Ceto-azúcares (Fructosa)
- Resorcinol en HCl
- Deshidratación y condensación.
- Coloración rojo-púrpura.
4. Prueba de Bial.
- Pentosas
- Orcinol con cloruro férrico en HCl.
- Deshidratación y condensación.
- Coloración verde.
PREPARACION DE LA MUESTRA
- Azucares en solución.
- Extracción de azucares.
AZUCARES EN SOLUCION
Remoción de interferencias:
a) Gases disueltos.
b) Pigmentos y compuestos coloridos
. Carbón activado.
. Clarificación (sales de plomo).
c) Proteínas:
. Solventes orgánicos.
. Arrastre con un precipitado inorgánico
d) Sustancias reductoras
. Intercambio iónico.
EXTRACCION DE AZUCARES
-Soluciones acuosas. Muchas interferencias
Sales
Ácidos
Proteínas y aminoácidos
- Soluciones alcohólicas:
. Etanol 70 - 75%.
. Etanol en dos pasos:
1) 50% en un baño de agua a ebullición.
2) Precipitación de proteínas y polisacáridos ⇑ al 95%.
. Metanol 85% en reflujo.
. Isopropanol 40% TA (alimentos preparados).
CUANTIFICACION DE AZUCARES LIBRES
A. METODOS FISICOS
1. Solubilidad.
2. Gravedad específica.
3. Indice de refracción.
4. Rotación óptica. Polarimetría.
B. METODOS QUIMICOS
1. Propiedades Reductoras.
2. Reacciones de Condensación.
3. Reacciones de Substitución.
C. METODOS BIOQUIMICOS
1. Enzimáticos
2. Microbiológicos
A. METODOS FISICOS
SOLUBILIDAD
- Alta solubilidad en agua.
Sol. alcohol 80% calientes.
- Estimación gravimétrica ú otro método físico.
- Poco específico (azúcares solubles totales).
GRAVEDAD ESPECIFICA
- Utiliza higrometros calibrados en °Bx (w/w en %)
- Método estandarizado para sol. puras de sacarosa.
- Da resultados aproximados para otros azúcares.
- Rápido.
INDICE DE REFRACCIÓN
- Estandarizado para sol. puras de azúcares.
- Azúcares solubles totales.
- Poco específico.
ROTACION OPTICA (POLARIMETRIA)
- Utilizando luz de longitud de onda fija.
- Actividad óptica de los azúcares libres.
- Cuidado con la mutarotación
- Interferencias por subs. ópticamente activas.
TODAS:
- Altamente dependientes de la temperatura.
IR Y POLARIMETRIA:
- Requieren de soluciones clarificadas.
La desviación de la luz polarizada puede ser hacia la
derecha (substancias dextrógiras) o hacia la izquierda
(levógiras) y se indica con + o – respectivamente.
ROTACIÓN OPTICA DE ALGUNOS AZUCARES
Glucosa o DEXTROSA +52.7
Fructosa o LEVULOSA -92.4
Sacarosa +66.5
Al hidrolizarse la sacarosa, la mezcla (Glu + Fru)
desvía la luz polarizada hacia la izquierda (-20):
AZUCAR INVERTIDA y la enzima que cataliza la
reacción es conocida como INVERTASA.
B. METODOS QUIMICOS
PROPIEDADES REDUCTORAS
En medio alcalino reducen rápidamente a iones oxidantes como
Ag+, Hg2+, Cu2+ y Fe(CN)6 debido a que la molécula se deshidrata y
se produce enolización.
H-C=0
|
H-C-OH
NaOH
|
→
HO-C-H
-2H2O
|
H-C-OH
|
H-C-OH
|
CH2-OH
OH
|
H-C-O-Na+
|
C-OH
||
C-H
|
C-OH
||
H-C
|
CH2-OH
ENEDIOL O REDUCTONA
AZUCAR
ENEDIOLES
-OH
Cu2+
Cu+ + AZUCARES ACIDOS
Cu(OH)2
H2O
Cu2O pp rojo ladrillo
METODOS QUE UTILIZAN SALES DE COBRE
- Lane-Eynon (Método de Fehling) Volumétrico. 1-5 mg/ml.
La solución de azúcar se coloca en la bureta y “titula” al cobre con
calentamiento continuo y azúl de metileno como indicador.
Para el cálculo se requiere “calibrar” al reactivo con una solución de
concentración conocida, para generar “un factor” expresado en peso.
factor (mg)
C (mg/mL) =
volumen (mL)
- Munson & Walker. Gravimétrico. 0.1-5 mg/ml
- Nelson-Somogyi. Colorimétrico (arsenomolibdato).
50-300 mg/ml.
OTROS METODOS REDUCTORES (Colorimétricos):
a) Ferrocianuro alcalino → Azul de Prusia
1-10 mg/ml.
b) Trifenil tetrazolio → Trifenil formazan
10-100 mg/ml.
c) Acido dinitro salicílico (DNS) → Compuesto colorido
0.2-2 mg/ml.
Los métodos de reductores requieren del grupo carbonilo libre
para la formación del enediol.
TODOS los monosacáridos son reductores
Los oligo y polisacáridos generalmente tienen UN grupo reductor,
al quedar libre el carbono 1 del monosacárido de uno de los
extremos.
Glucos
a
Glucos
a
H
α
Maltosa
Almidón (amilosa)
Lactosa
O
H
La SACAROSA NO TIENE EXTREMO REDUCTOR ya que los
dos carbonos que soportan al grupo carbonilo estan
involucrados en el enlace glucosídico.
Sacarosa
Para determinar sacarosa con los métodos de reductores se
requiere la hidrólisis ácida o enzimática.
Acida:
- baño maría a 60°C, 10 min y reposo 30 min a 35°C
- 16 - 18 hs a t.a.
- 30 seg en ebullición
Enizimática:
- Invertasa
Si sólo hay sacarosa en la muestra el resultado es directo.
Si hay mezclas de sacarosa y otros azúcares se debe realizar una
determinación ANTES de hidrolizar (reductores directos).
Sacarosa = Reductores después – Reductores antes
1. Si la calibración se hace con sacarosa hidrolizada
en las mismas condiciones el resultado es directo
2. Si la calibración se hace con una mezcla
equimolecular de glucosa y fructosa, el valor debe
ser corregido:
H2O
SACAROSA
GLUCOSA + FRUCTOSA
PM 342
PM 180
342g sacarosa
380g glu+fru
= 0.95
PM 180
REACCIONES DE CONDENSACION
En medios fuertemente ácidos los monosacáridos se
deshidratan y forman derivados del furfural que pueden
condensarse con compuestos fenólicos.
Furfural y derivados
CHO
CH2OH
H C OH
HO C H
H C OH
C O
-H2O
-H2O
H C OH
CH2OH
Aldohexosa
HO C H
H C OH
H C OH
O C
H
O
CH 2OH
HMF
5-(hidroximetil)-2-furaldehido
CH2OH
- Deshidratación con H2SO4 conc.
- Condensación con fenol
- Producto color amarillo
- Pentosas 480 nm.
- Hexosas 490 nm.
- 10-100 µg/ml
Las mismas condiciones ácidas producen la
hidrólisis de TODOS los enlaces glucosídicos, por lo
que puede ser usado para carbohidratos totales.
REACCIONES DE SUSTITUCION
Grupos hidroxilo involucrados
Especialmente importantes para conocer
estucturas y formar derivados que son utilizados
para otras determinaciones.
a) Formación de éteres. Eteres metílicos y
Trimetilsilanos para CFV
b) Formación de ésteres. Derivados acetilados.
C. METODOS BIOQUIMICOS
a) Reacciones enzimáticas
b) Fermentación diferencial con levaduras.
REACCIONES ENZIMATICAS
- Son muy específicas
- No requieren la separación de los azúcares
- Generalmente son reacciones acopladas.
GLUCOSA
1. Glucosa oxidasa/peroxidasa (Glucostat). 10-100 mg/ml
G.O.
Glu + O2 → Ac. glucónico + H2O2
P.O.
H2O2 + o-dianisidina → Color (540 nm)
2. Hexoquinasa/glucosa-6-P deshidro. 0.1-1.0 mg/ml
HK
Glu + ATP → G-6-P + ADP
GPD
G-6-P → 6-P-Gnato
NADP
NADPH(340 nm)
También se puede cuantificar fructosa, adicionando
fosfogluconato isomerasa (FGI)
HK
Fru + ATP → F-6-P + ADP
FGI
F-6-P → G-6-P
GPD
G-6-P → 6-P-Gnato
NADP
NADPH(340 nm)
SACAROSA
1.Hidrólisis con b-fuctosidasa (invertasa).
Invertasa
Sac → Glu + Fru
2. Cuantificación de glucosa y/o fructosa o midiendo
aumento del poder reductor.
MALTOSA
1. Hidrólisis con α-glucosidasa (maltasa)
α-glu
Mal → 2 Glu
2. Cuantificación de glucosa o aumento del poder reductor.
LACTOSA
1. Hidrólisis con β-galactosidasa (lactasa).
β-gal
Lac → Glu + Gal
2. Cuantificación de glucosa o galactosa con galactosa
oxidasa, o galactosa deshidrogenasa (GalDH).
GalDH
Gal → Galactolactona
NAD+
NADH
FERMENTACION DIFERENCIAL
- Diferenciación de isómeros D- y L- (Los microorganismos
sólo utilizan D-azúcares como fuente de carbono.)
- Diferenciación de azúcares. Cepas con requerimientos
específicos de fuentes de carbono.
ANÁLISIS DE ALIMENTOS
PROGRAMA - CALENDARIO
(Semestre 08 - 1)
Ju 27 Septiembre
Ma 2 Octubre
Ju 4
Ma 9
Ju 11
Ma 16 OCTUBRE
Ma 23
Ju 25
Ma 30
Ma 6 Noviembre
Ju 8
Ma 13
JU 15 NOVIEMBRE
Proteína cruda.
Proteína soluble.
Alimentos ricos en proteínas. Leche y huevo Seminarios:
Antibióticos en leche.
Carne y productos cárnicos.
Seminarios Nitratos y nitritos, Trimetilamina, Anabólicos.
3a EVALUACION PARCIAL
Carbohidratos. Métodos generales.
Polisacáridos. Seminarios Almidón y Celulosa.
Fibra.
Alimentos ricos en carbohidratos. Azucares y mieles.
Cereales y sus derivados. Seminario Aflatoxinas,
Pruebas reológicas de las masas
Componentes asociados a cereales. Seminarios.
Mejoradores y blanqueadores, Vitaminas complejo B.
4a EVALUACION PARCIAL