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ecf-practicas2004.doc PRACTICAS DE ECOFISIOLOGÍA Y DIVERSIDAD BACTERIANAS MATERIAL POR PUESTO DE TRABAJO En cada puesto (mechero): − asa de siembra recta. − asa de siembra con extremo en anillo. − pinza de madera. − gradilla para tubos. Común a los dos microscopios: − un bote plástico con aceite de inmersión. − un frasco de vidrio con etanol:éter (3:7) para limpiar exclusivamente las lentes frontales de los objetivos. Común a los dos mecheros de una misma mesa: − cubeta con colorantes. − bandeja con portaobjetos. − cubo amarillo para desechar objetos de vidrio (portaobejtos). − cubeta amarilla par desechar puntas de pipeta (conos) plásticas y otros plásticos desechables. − rollo de papel absorbente. NORMAS DE TRABAJO 1. Seguridad en el Laboratorio de Microbiología (ver Apéndice I). 2. Orden y Limpieza: DESECHOS Y RECICLAJE DE MATERIAL CONTAMINADO Para seguridad del personal de limpieza y protección del ambiente, se seguirán las siguientes normas. 1. 2. Las papeleras (de color blanco o gris) serán sólo para papeles o desechos semejantes. Para los siguientes materiales, existen recipientes específicos: a. pipetas de vidrio sucias o contaminadas: pipeteros verticales etiquetados situados en los pasillos centrales. b. puntas plásticas (conos amarillos y azules) de pipetas automáticas, contaminadas o no: cubos amarillos sobre los estantes de trabajo. c. portaobjetos sucios o contaminados: cubos amarillos sobre los estantes de trabajo. d. placas de Petri y plásticos de un solo uso (excepto puntas de pipeta): bolsa rojas en soportes colocadas al fondo de los pasillos centrales; estas bolsas no pueden llenarse más de dos tercios, pues si no corren el riesgo de romperse durante el transporte al crematorio. e. tubos de vidrio con agar o caldo, diluciones, etc.: pucheros en la campana situada al fondo del laboratorio que mira al Campus. Hay recipientes marcados según el contenido del tubos. 3. Para otros materiales se seguirán las normas generales de la Universidad (Tablas en la parte delantera del Laboratorio). AL TERMINAR LA PRÁCTICA − dejar las placas de Petri que se van a incubar en la gradilla correspondiente situada en la mesa del profesor − los tubos con diluciones, bacterias control, etc. que se van a volver a usar, se colocan en las gradillas situadas en la mesa del profesor. − recoger mesa de trabajo: todo debe quedar ordenado y listo para la práctica siguiente. − recoger microscopios: luz apagada, microscopio limpio, objetivo de menor aumento emplazado, cubierta del micrscopio recogida. − recoger sillas. − rellenar los frascos de alcohol-acetona. 1 ecf-practicas2004.doc BACTERIAS DE COLECCIÓN Bacteria Azotobacter chroococcum Bacillus polymyxa Bacillus stearotermophilus Bacillus subtilis Escherichia coli Paracoccus denitrificans Pseudomonas aeruginosa Salmonella spp. Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Código 35 33 39 8 1 37 4 31 15 7 medio, temp., tiempo W12; 28 ºC, 24 h N6-2; 28 ºC, 24 h N6-2; 55 ºC; 24 h N6-2 (>N6-4); 28 ºC, 24 h N6-3 (o TSA, N6-2, …); 37 ºC, 24 h. N6-2; 28 ºC, 24 h TSA, N6-2, 37ºC N6-3 (o TSA, N6-2, …); 37 ºC, 24 h. N6-3 (o TSA, N6-2, …); 37 ºC, 24 h. TSA, 37ºC, 24 h MEDIOS Medio carente de nitrógeno (W12) Agar-Sabouraud-cloranfenicol (S-24; bioMerieux 51078) Sacarosa .....................................20,0 g extracto de levadura .................0.005 g MgSO4 .........................................0.2 g NaCl.............................................0.2 g CaSO4 ..........................................0.1 g K2HPO4 ......................................0.5 g FeSO4 ......................................0.004 g Na2MoO4 ................................0.001 g CaCO3 .........................................5.0 g Agar ...........................................15,0 g H2O dest...........................................1 l peptona pancreática de caseína ..... 3 g peptona papaínica de soja ..............3 g extracto de levadura ........................2 g extracto de malta .............................1 g Glucosa .........................................19 g KH2PO4 .......................................0.5 g Na2HPO4 .....................................0.5 g Agar ..............................................15 g cloranfenicol ................................0,5 g H2O dest.......................................... 1 l Caldo Nutritivo (N6-2, Oxoid CM67) Extracto de carne (beef)................10 g Peptona .........................................10 g NaCl................................................5 g H2O dest. .........................................1 l Caldo Nutritivo-Sal. Caldo nutritivo + 110 g de NaCl por litro Agar Nutritivo. Caldo nutritivo + 15 g agar por litro. Agar Nutritivo-azida de sodio. Agar nutritivo + 0,2 g NaN3 por litro. Agar o caldo nutritivo-almidón. Agar o caldo nutritivo + 1,5 g de almidón soluble por litro. Agar de triptona y soja (TSA) (T-12 Difco 0370) peptona pancreática de caseína ... 17 g peptona papaínica de soja ..............3 g Glucosa ........................................2.5 g K2HPO4 ......................................2.5 g NaCl................................................5 g Agar ..............................................15 g H2O dest. .........................................1 l Agar triptona y soja-sal. TSA + 110 g NaCl/litro. (pH 6,4) Caldo-nitrato (W6 [Difco 0268-01-6, modificado*]) extracto de carne (Bacto-beef) ........3 g peptona (Bacto-peptona).................5 g KNO3 ..............................................1 g H2O dest. ........................................ 1 l La modificación es añadir al medio comercial: *glucosa ..........................................1 g *Na2HPO4 .......................................2 g *agar ...............................................1 g Caldo-nitrato con campana Durham Medio Tioglicolato-glucosa (T4-Difco 0256-17-2) peptona de caseína ........................15 g glucosa .........................................5,5 g extracto de levadura .....................5,0 g NaCl .............................................2,5 g L-cisteína ...................................0,25 g tioglicolato sódico........................0.5 g agar ...........................................0.75 g resazurina .................................0.001 g H2O ................................................. 1 l 2 Estreptomicetos (A-16; Difco 0957-17-4) glicerol ...................................... 5 g caseinato sódico ........................ 2 g asparagina .............................. 0,1 g propionato sódico...................... 4 g K2HPO4 ......................................0,5 g MgSO4 .........................................0,1 g FeSO4 ......................................0,001 g agar ...............................................15 g H2O ...................................................... 1 l. MRVP (M-7, Biolife 401735) peptona de carne .............................7 g K2HPO4 .........................................5 g Glucosa ...........................................5 g H2O dest. .........................................1 l ecf-practicas2004.doc SPS (Selective perfringens agar; S-14; Merck 1.10235) 3 peptona de caseína ........................15 g extracto de levadura ......................10 g citrato férrico................................0,5 g sulfito sódico................................0,5 g sulfato de polimixina B..............0.01 g sulfadiazina sódica .....................0,12 g agar ...............................................14 g H2O dest. .............................................. 1 l Medio Gelatina (G5-Difco 0011-01, modificado*) extracto de carne (beef)...................3 g peptona............................................5 g gelatina........................................120 g H2O dest. ........................................ 1 l La modificación es añadir al medio comercial: *extracto de levadura ......................2 g * glucosa ..........................................1g APÉNDICE I. NORMAS DE SEGURIDAD EN LABORATORIO DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA 1. ACCESO AL LABORATORIO Sólo pueden acceder al laboratorio los alumnos que estén matriculados en la Universidad de Navarra y que cursen asignaturas cuya enseñanza práctica se imparta en el laboratorio de Microbiología. 2. NORMA GENERAL En cualquier laboratorio, la seguridad depende de los conocimientos y del compromiso ético de no dañar a otras personas (o a sí mismo) o al ambiente. La norma más importante de seguridad es pensar en los demás y ser responsable en el trabajo. 3. NORMAS ELEMENTALES PROPIAS DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Seguridad en Microbiología significa que hay que trabajar sin contaminar (instalaciones, utensilios, personal, ambiente externo [desagües, etc.]), ni contaminarse con microorganismos. Para ello: 1. Vaya en todo momento provisto de bata. 2. No fume, coma o beba en el laboratorio. 3. Cumpla estrictamente las normas de trabajo aséptico. En particular: a. esterilice el asa antes de tomar el inóculo e inmediatamente después de sembrar. b. no deje sobre la mesa ningún objeto (asa, tapones, pipetas, etc.) que haya estado en contacto con microorganismos y no haya sido esterilizado (si es posible). c. deje el material contaminado en un recipiente adecuado (hay recipientes específicos para pipetas, puntas de pipetas, portaobjetos, placas de Petri y tubos). d. nunca use la fregadera para deshacerse de material contaminado. e. en caso de rotura o derrame del contenido de un tubo o recipiente que contenga microorganismos, avise inmediatamente al instructor, dejando a una persona que vigile para evitar que otros se contaminen. Si no encontrase al instructor, cubra el derrame con un desinfectante de los disponibles en el laboratorio (habitación de autoclaves, estante encima de los fregaderos). f. si la contaminación es sobre una persona, avise al instructor. 4. Evite movimientos bruscos que generen corrientes de aire en la proximidad de los mecheros, o el trabajar con ventanas abiertas. 5. Durante el trabajo no se toque con las manos la boca, ojos, nariz u oídos. 6. Hay que lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio. 7. Mantenga la zona de trabajo limpia y ordenada. Deje el laboratorio recogido al terminar (mesas de trabajo y de microscopios). ecf-practicas2004.doc 4 4. FUEGOS Son un peligro importante en el laboratorio de prácticas. Llaves de paso del gas. Hay cuatro llaves de control del gas: (1), la del propio mechero; (2), la llave de un sólo paso (de seguridad) a la que está conectado el tubo plástico del mismo; (3), la de la mesa, bajo los fregaderos; y (4), la general del laboratorio, que está en el exterior de la ventana más próxima a la pizarra del laboratorio que mira al Campus. Las llaves 1 y 2 son para el manejo del mechero. La 3 debe ser cerrada inmediatamente en el caso de fuego sobre la mesa. La 4 debe ser cerrada ante la menor sospecha de fuga de gas a cualquier nivel o ante el descubrimiento de un mechero abierto sin llama. El instructor les enseñará la posición de las llaves. Manejo de mecheros Bunsen. Estos mecheros tienen un regulador de la entrada del aire (pida al instructor que se lo enseñe) para obtener una mezcla adecuada de aire-gas. En Microbiología, la llama debe tener una temperatura suficiente sin ser invisible (las llamas "frías" son anaranjadas, despiden hollín y se ven bien, pero no esterilizan eficientemente; las llamas muy "calientes" son de un azul casi invisible). Accidentes con mecheros. Los peligros más comunes se resumen a continuación. A. Posición del mechero. Antes de encenderlo, verifique su posición sobre la mesa. No debe estar nunca debajo del estante de los colorantes, sino con el tubo de plástico extendido hacia afuera, de forma que la llama no caliente o toque el estante. B. Mechero abierto, pero sin llama. Un mechero puede apagarse por una corriente o por exceso de aire en el regulador aire-gas. Esto ocurre más fácilmente nada más encenderlo (cuando el tubo de salida de la llama aún está frío), pero también después. Puesto que el gas seguiría saliendo, hay un riesgo serio de explosión en el área de trabajo. Por lo tanto, hay que vigilar los mecheros y esto se facilita si la llama es correcta y visible. Ante la sospecha, cierre la llave de paso de la mesa y la del laboratorio y ventílelo. C. Pelo. El pelo largo y suelto es un riesgo en la proximidad del mechero. Llévelo siempre recogido hacia atrás. D. Quemadura directa por la llama. Ocurre por trabajo apresurado o descuidado y, también, por manejo incorrecto del mechero Bunsen. Si se quema, aplique agua fría abundante sobre la quemadura y haga que avisen al instructor. E. Quemadura por contacto. Ocurre con el asa de siembra o con otro material (normalmente la boca de un tubo) que ha sido flameado. Sea consciente de estos problemas y trabaje con calma. Si se quema, aplique agua fría abundante sobre la quemadura y haga que avisen al instructor (hay pomada de quemaduras en el botiquín situado en la habitación de los autoclaves). F. Incendio de disolventes. En el puesto de trabajo hay recipientes para las tinciones. Algunos contienen disolventes inflamables (alcohol-acetona). Por lo tanto, apague los mecheros si no los necesita y no deje nunca esos recipientes sobre la mesa, sino sobre el estante, dentro de la bandeja. Sistemas para incendios. Además de detectores de humo, el laboratorio dispone de extintores y de mantas ignífugas, ambos visibles desde el pasillo central de los dos laboratorios. Los extintores se emplean sobre objetos, pero por su potencia pueden derribar los recipientes con disolventes, extender un disolvente derramado hacia los mecheros, o apagar estos, por lo que, antes de su uso conviene cerrar el gas de la zona (llave 4 y, si es posible, llave de la mesas). Las mantas son para uso sobre personal cuya ropa se haya incendiado o sobre el que ha caído un disolvente inflamado. 5. OPERACIONES CON RIESGO Pipeteo. Siempre que tenga que emplear una pipeta convencional, verifique que su capacidad es adecuada y emplee un dispositivo manual (pre-pipeta). No use nunca la boca cuando pipetee bacterias. Aerosoles. Uno de los riesgos principales en un laboratorio de Microbiología es la generación de aerosoles que contengan microorganismos y que son fácilmente inhalados. Todas las operaciones bruscas en las que se manejan líquidos pueden generar aerosoles. Estas incluyen centrifugaciones, vertidos rápidos (pipeteos, trasvases, etc.) y el manejo rápido del asa de cultivo. Por lo tanto, trabaje con calma y, si es necesario, en una campana de seguridad biológica. Transporte y almacenamiento de placas y recipientes con cultivos. Representan un riesgo evidente. Un lugar conflictivo son las habitaciones estufa. Entre en ellas el menor número de veces posible con objeto de evitar un tráfico excesivo de personas en la puerta. Para ello, saque de la estufa en una sola vez todo el material que va a emplear en la práctica, y acumule aquello que se deba incubar para introducirlo junto al final de la práctica. Además, coloque las placas, etc. de forma segura (en la estufa del laboratorio de prácticas hay dispositivos para colocar las placas de forma que éstas no se caigan). Autoclaves y hornos Pasteur. Tienen instrucciones específicas. Sólo deben emplearse bajo supervisión directa del instructor. ecf-practicas2004.doc DIA 1 5 ecf-practicas2004.doc 6 ecf-practicas2004.doc DIA 2 7 ecf-practicas2004.doc DIA 3 8 ecf-practicas2004.doc 9 ecf-practicas2004.doc DIA 4 10 ecf-practicas2004.doc 11 ecf-practicas2004.doc DIA 5 12 ecf-practicas2004.doc DIA 6 13 ecf-practicas2004.doc DIA 7 14 ecf-practicas2004.doc DIA 8 15 ecf-practicas2004.doc 16 PREGUNTAS SOBRE LAS PRÁCTICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. ¿Qué es lo más importante en la seguridad en un laboratorio? ¿Cuál es la norma elemental de seguridad en un laboratorio de Microbiología? ¿Cuál es el factor común a la mayoría de los riesgos en un laboratorio de Microbiología? ¿Qué es la parafocalidad de un microscopio? ¿Por qué es importante regular la mezcla aire-gas en un mechero Bunsen? ¿Qué medios sintéticos se han usado en prácticas? ¿En qué se diferencian las peptonas usadas en prácticas? ¿Para qué sirve el carbonato cálcico añadido a un medio de cultivo? ¿Para qué se pone Na2MoO4 en el medio de los fijadores del nitrógeno? ¿Qué bacteria de las empleadas en prácticas produjo un glicocálix muy manifiesto? ¿Con qué componente del medio de cultivo guarda relación? ¿Por qué hay grandes diferencias en el contenido en extracto de levadura de los distintos medios? ¿Qué es un cultivo de enriquecimiento? Ponga tres ejemplos tomados de las prácticas y explique su fundamento. ¿En qué se basa el enriquecimiento en fijadores del N2 de la tierra? ¿Qué ventajas tiene el empleo del piruvato en el enriquecimiento directo de fijadores del N2? ¿Por qué contiene almidón y peptona el medio para enriquecer esporulados? ¿Por qué se emplea caldo nutritivo para enriquecer bacterias termorresistentes de la tierra? ¿Guarda relación con lo observado en las placas con piruvato? ¿Por qué hay termófilos en los horizontes superiores de la tierra? ¿Qué es un cultivo selectivo? Ponga un ejemplo tomado de las prácticas y explique su fundamento. ¿Por qué se resiembran los aislamientos del enriquecimiento por calor? ¿Qué tipos de morfología colonial se han observado? ¿Los hay característicos? ¿Qué bacterias producen micelios? ¿Son típicos de algún tipo de hábitat? ¿Qué bacterias producían formas de resistencia? Estas formas, ¿tenían en todos los casos las mismas propiedades? ¿Qué bacterias de las aisladas en prácticas producen exoenzimas? ¿Para qué les sirven los exoenzimas detectados? ¿Guardan relación con el hábitat? ¿Cómo se detecta la presencia de proteasas? ¿Cómo era la catalasa en Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Bacillus sp. y Enterococcus faecalis? ¿Qué explicación tiene? ¿Para qué se emplearon jarras de Gas-Pack? ¿Cómo era la atmósfera dentro y qué la generaba? ¿Para qué bacterias no es tóxica la azida de sodio y por qué? La pigmentación de las colonias expuestas a la luz ¿cumple alguna función útil para las bacterias? ¿Ha observado la producción de pigmentos difusibles por alguna bacteria? ¿Qué papeles posibles pueden cumplir? ¿Cómo era la oxidasa en E. coli, Pseudomonas aeruginosa y Paracoccus denitrificans? ¿Qué explicación tiene? ¿Por qué hay anaerobios en los horizontes de tierra en contacto con el aire? ¿Todas las bacterias que crecieron en el medio de anaerobios son fermentadoras? ¿Por qué? ¿Qué bacterias de las estudiadas respiraban nitratos? ¿Cómo sabe que no era una reducción asimilativa? ¿Por qué se da la respiración de los nitratos en medios que no eran específicamente anaerobios? ¿Qué tipo de gas observable produjo Paracoccus denitrificans? ¿Qué es la amonificación y en qué práctica se observó? ¿En qué bacterias se ha observado la fermentación con producción de ácidos o de acetoína? ¿Por qué se hierven los medios de tioglicolato y SPS antes de su uso? ¿Qué componente(s) del medio de cultivo de anaerobios modifican el Eo’? ¿Por qué se ponen sulfatos o tiosulfatos en el medio SPS para anaerobios? ¿Por qué algunas bacterias forman precipitados negros en anaerobiosis y en presencia de hierro? ¿Guarda relación con algo que Vd. pueda observar en la naturaleza? ¿Cómo se detecta la reducción desasimilativa de los sulfatos? ¿Qué bacterias produjeron H2 y en qué condiciones? ¿Por qué se observa fácilmente la producción de H2 y no la de CO2? Si aceptamos que el NaCl es el responsable principal del la tensión osmótica en los medios agar nutritivo y agar nutritivo-sal ¿qué presión osmótica tienen ambos medios? ¿Es fisiológica? Además de su efecto sobre la presión osmótica, ¿tiene la sal algún otro efecto?
