Qalt5

Genómica Estructural
Mapeo Genético en Plantas
Aplicaciones de los marcadores moleculares al Análisis de
Genomas Vegetales:
1. Diversidad genética:
Evaluación de Germoplasma
Identificación y Protección Varietal
2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico:
Caracteres simples
Caracteres Complejos
MAPAS
Mapeo
Comparativo
Clonaje
Posicional
MAS
Mapa Genético
Tipos de mapas genéticos
• Mapa genético de ligamiento
Descripción lineal de los marcadores/genes en un determinado
cromosoma (marcadores próximos se heredan juntos).
• Mapa físico
Localización física de regiones del cromosoma
Mapa
de
ligamiento
La frecuencia de recombinantes depende de la distancia fisica entre los loci
A
B
a1
a1
a2
a2
b1
b1
b2
b2
Homocigotos
(Padres)
Meiosis
a1
b1
X
a2
Gametos
b2
F1
a1
Meiosis
Sobrecruzamiento
Heterocigotos
a2
a1
a1
a2
b2
1/2 (1-r)
b1
1/2 r
(F1)
b2
b1
b1
a2
b2
1/2 r
1/2 (1-r)
Σ=1
r = frecuencia de recombination
La frecuencia de recombinantes depende de la distancia física entre los loci
a1
b1
+
b2
a2
r=
a1
b2
a1
b1
+
+
a2
b1
+
a2
b2
• nº recombinantes = nº parentales
r = 0,5: NO ligamiento
• nº recombinantes < nº parentales
r < 0,5: Ligamiento
• nº recombinantes ~ 0
r ~ 0: Ligamiento completo
Mapeo Genético
Estimación del orden y distancias entre marcadores
Dos marcadores cercanos en un cromosoma tienden a
heredarse juntos
La frecuencia con que esto ocurre permite estimar la
distancia entre ambos
Mapeo Genético
Construcción de mapas multiloci
1) Construir grupos de ligamiento calculando distancias
entre parejas de loci (LOD>3)
2) Ordenar los marcadores del mismo grupo de
ligamiento (máxima verosimilitud).
3) Estimar las distancias entre los marcadores
MAPMAKER
> Análisis de ligamiento para marcadores dominantes, recesivos y
codominantes
• tipo de cruzamiento, número de marcadores, número de individuos
genotipados, genotipo…
• detecta grupos de ligamiento por análisis de dos puntos
• análisis de tres puntos para calcular el orden más probable
• calcula los LOD scores (verosimulitud del ligamiento) entre todos los
pares posibles
• Construye un mapa genético con distancias para cada grupo de
ligamiento
Mapeo Genético
Programas disponibles
• MAPMAKER
• JOINMAP
• LINKEM
• MAPMANAGER
• COMBIN
• LINKAGE
• CRIMAP
• MULTIMAP
• CARTHAGENE
Mapa Genético
Requerimientos del Mapeo de ligamiento
1) Marcadores
2) Poblaciones (diseños experimentales)
Mapeo Genético
Requerimientos del Mapeo de ligamiento
1) Marcadores
- Cuantos más mejor
- Dominancia vs Codominancia
Mapeo Genético
Requerimientos del Mapeo de ligamiento
2) Poblaciones
- F2
- Retrocruzamiento
- NILs, RILs
-…
Aproximación clásica
• Mapeo General con Poblaciones segregantes
• Cruzamientos entre individuos muy “diferentes”
Retrocruzamiento, F2, Pseudo F2...
Muestreo de Marcadores al azar
Caracteres de interés
↓
Marcadores estrechamente ligados
↓
Mapas Saturados
↑ descendencias
↑ individuos
↑ marcadores
Aproximaciones alternativas
Muestreo de Marcadores en regiones específicas
• Líneas casi isogénicas (NILs)
- Retrocruzamientos recurrentes
- Subproducto de Mejora
• Líneas Consanguíneas recombinantes (RILs)
- Mapa previo
- NO Subproducto de Mejora
• Análisis de bloques segregantes (BSA)
Desarrollo de líneas casi isogénicas (NILs)
x
x
x
x
Desaparición de la cromatina “no deseada” en función del
número de retrocruzamientos.
40
35
30
cM
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
nº de Retrocruzamientos
Hanson, 1959. Genetics 44: 833-7
10
Material empleado para el mapeo genético en Plantas
R
r
P1 X P2
F1
Gametos (H)
Colchicina
Cultivo In vitro
Autofecundación
Rr
F2F2
Dobles Haploides
(DH)
Retrocruzamiento con P2
(BC)
Rr
rr
RR
Rr
Rr
Autofecundación
Rr
Rr
F5
Rr
Autofecundación
Near isogenic lines
(NILs)
RR
rr
Recombinant
inbred lines (RILs)
rr
RR
Resultado final de la generación de una población segregante para
un carácter monogénico
planta: 1 2 3 4 5 6 7 8 ....
1 2 3 4 5 6 7 8 ......
Cromosoma 5
r
R
Fenotipo
T
S
Parentales
BSA
x
F1
F2
T
S
Bloques
T
S
“Mapa Genético en Centeno (Secale cereale L.)”
Cruzamientos en centeno
A1 X R
A2 X R
A3 X R
A4 X R
A6 X R
AR1
AR2
AR3
AR4
AR6
AR3.14
AR4.18
AR6.17
⊗
⊗
⊗
⊗
3:1
3:1
3:1
3:1
AR1.5 AR1.7 AR1.11 AR1.13 AR1.15 AR2.6 AR2.14
X
X
X
X
R
R
R
R
1:1
9:7
3:1
⊗
⊗
3:1
15:1
1:1
Ligamiento a isoenzimas localizados en el cromosoma 6R
RAPDs ligados a la Tolerancia al Aluminio
OpB03655
OpR01600
Transformación a SCAR
OpB03655
OpB15790
OpR01600
Loci
Alt1, OpA08415
Alt1, Aco1
Alt1, Est6
Alt1, Est8
Alt1, Ndh2
Alt1,OpB03655
Alt1,OpB15790
Alt1,OpR01600
T,11
22
8
T,+
58
53
58
64
46
72
Distribución de la descendencia
s,11
T,12
s,12
T,22
2
42
9
9
16
43
6
22
T,s,+
15
21
20
12
15
11
9
7
27
24
1
1
s,22
13
2
s,3
12
13
17
0
23
X2
cM
18,75***
31,17***
33,5
24,6
0,75
3,18
9,94**
31,51***
12,28***
86,64***
46,4
21,9
0
2,2
Relaciones de ligamiento obsevadas entre el locus Alt1 y
otros loci localizados en 6R
6RS
2,1 cM
OpR01600
Alt1
5,5 cM
OpB15790
←Centrómero
16,1 cM
Aco1
4,8 cM
OpB03655
10,0 cM
OpA08415
6,4 cM
Ndh2
24,0 cM
6RL
0,7 cM
Est6
Est8
7RS
0
SCARQ4283
15
SCIM823853
SCIM8811422
23
25
26
27
28
29
OPO2984
SCIM8111376
OPO2633
OPO7666
SCIM8191434
OPQ4725
31
32
34
40
46
51
SCIM812626
59
OPJ171245
63
65
SCM40 OPF20483
SCM86
71
74
OPD1858
OPJ3857
79
82
84
SCIM810621
OPF20579
OPF20709
ScALMT1
OPQ4578
SCIM8121138
SCIM8232826
OPN1667
OPN1708
←Centromere
Identificación de Caracteres Cuantitativos con
Efecto sobre Caracteres de Interés Agronómico en
Plantas Cultivadas
Mendel
Fisher
Haldane
Wright
Genética
Genética
Mendeliana
Cuantitativa
Caracteres
Caracteres
Discretos
Contínuos
Tipo
Grado
Individuos
Poblaciones
Gen único
Cualitativo
Cuantitativo
Poligénico
Ambiental
Mapeo de Loci de Caracteres Cuantitativos
(QTLs)
Que es un QTL?
• Es la localización de un gen que afecta a un carácter cuantitativo
El mapeo de caracteres cuantitativos no es tan simple como el de
cualitativos
En los 1920’s Fisher y Wright desarrollaron los conceptos de
Genética Cuantitativa y QTLs
El mapeo de QTLs se ha vuelto una realidad en los últimos
años por el desarrollo de los marcadores moleculares
•
Cantidad ilimitada
•
Sin influencia ambiental
•
Análisis en fases tempranas
•
Sencillos, rápidos y objetivos
Análisis de QTL
¿Hay asociación entre el genotipo para el marcador y el
fenotipo para el carácter cuantitativo?
laboratorio
campo
computadora
Mapeo por Intervalos
La presencia de un QTL y su efecto se estima en función de
los marcadores que flanquean el intervalo que acotan
Software
•Mapmaker/QTL: Interval mapping -> http//www-genome.wi.mit.edu/
•Mapmaker/SIBS: Sib-pair data -> http//www-genome.wi.mit.edu/
•QTL cartographer: Para los tres métodos cartografía
http://www2.ncsu.edu/ncsu/CIL/stat-genetics
•MapQTL: Parte de JoinMap, un paquete de análisis de ligamiento e-mail:
j.w.vanooijen@cpro.agro.nl
•MQTL: Permite test de permutaciones para establecer el umbral de
significación (no análisis de F2)
ftp://gnome.agrenv.mcgill.ca/pub/Genetics/software/MQTL
•LINKAGE: Programa de análisis de ligamiento de marcadores que
también incluye la información fenotípica
ftp://linkage.cpmc.columbia.edu/software/linkage
¿Por qué es tan difícil caracterizar un QTL?
• Imprecisión del mapeo
• Poca capacidad para detectar QTLs de pequeño efecto o
bajas heredabilidades
Factores
• Poblaciones empleadas para mapeo de al menos 500
individuos
• Clasificación del carácter muy exacta
• Repeticiones (distintos años, poblaciones y ambientes)
QTL de Tolerancia al Aluminio en centeno
AR1
10
8
6
n
4
2
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
cm
3
3,5
4
4,5
QTL de Tolerancia al Aluminio en centeno
S
F2
T
12
10
8
n 6
4
2
0
0
0,5
1
1,5
2
cm
2,5
3
3,5
4
QTL de Tolerancia al Aluminio en centeno
7RS
• Ailés es portador del Alelo MÁS Tolerante para Qalt4
•Riodeva es portador del alelo MÁS Tolerante para Qalt5
Índice de
Recrecimiento de
la Raíz (cm.)
Qalt5
Qalt5 Ailés
Qalt5 Ailés
Qalt5 Ailés
Qalt5 Riodeva
Qalt5 Riodeva
Qalt5 Riodeva
Qalt4
Qalt4 Riodeva
Qalt4 Riodeva
Qalt4 Riodeva
Qalt4 Ailés
Qalt4 Ailés
Qalt4 Ailés
4,03
21,24
-
5,30
25,43
26,24
-
26,00
29,65
• Ailés es portador del Alelo MÁS Tolerante para Qalt4
•Riodeva es portador del alelo MÁS Tolerante para Qalt5
Índice de Recrecimiento de
la Raíz (cm.)
Qalt4
Qalt4 Riodeva
Qalt4 Riodeva
Qalt5
Qalt5 Ailés
Qalt5Riodeva
Ailés
Qalt5 Ailés
Qalt5 Riodeva
Qalt5 Riodeva
Qalt5 Riodeva
Qalt4 Riodeva
Qalt4 Ailés
21,24
no 4,03
es tan “sensible”
Qalt4 Ailés
Qalt4 Ailés
-
5,30
25,43
26,24
-
26,00
29,65
Mapas físicos
Mapas físicos
La distancia entre marcadores es una distancia
física real, basada en pb.
• Baja resolución: Marcadores citogenéticos
• Alta resolución: Mapas de restricción,
secuenciación DNA
Mapeo físico
Cariotipo
Genómica Comparativa
Aplicaciones de los marcadores moleculares al Análisis de
Genomas Vegetales:
1. Diversidad genética:
Evaluación de Germoplasma
Identificación y Protección Varietal
2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico:
Caracteres simples
Caracteres Complejos
MAPAS
Mapeo
Comparativo
Clonaje
Posicional
MAS
Especie ancestral
Especie 1
Mutaciones
Especie 2 Especie 3
Especie 4
– ¿Para que comparamos?
– ¿Que podemos comparar?
– ¿Qué información obtenemos?
¿Para que comparamos?
VISTA Genome Browser
La conservación a lo largo de distancias evolutivas
importantes indica una constricción funcional útil
para detectar genes de interés
¿Para que comparamos?
CMTV Comparative Map and Trait Viewer
La caracterización de diferencias entre organismos indica
el mecanismo del cambio
¿Para que comparamos?
Podemos trasladar la
información de especies
modelo a especies de
interés económico
A.
thaliana
Medicago
truncatula
Soja
¿Que comparamos en la actualidad?
•
Marcadores genéticos (mapas comparativos)
•
Secuencias parciales y completas de genomas
1. Mapas comparativos
Especie 1
1
1
5
3
2
4
4
Especie 2
2
5
2. Secuencias
 Líneas de datos donde cada elemento puede ser una de
cuatro letras (A, C, G o T).
 Las líneas pueden ser muy largas – miles de millones de
letras.
 Las secuencias pueden ser de todo tipo.
Especie 1: caggaaaacacacactcacatacatgaacaatatctc
||||| || |||||
|||||||| |||| || ||
Especie 2: caggataatgcacac
catacatgcacaaaat tc
Servidores y programa de alineamiento
• NCBI BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
• WU-BLAST blast.wustl.edu/
• BLASTZ www.psc.edu/general/software/packages/blastz/
• BLAT www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
• LAGAN lagan.stanford.edu/lagan_web/index.shtml
• mAVID baboon.math.berkeley.edu/mAVID
• MUMMer www.tigr.org/software/mummer
• SSAHA www.sanger.ac.uk/Software/analysis/SSAHA/
Visualización Comparativa de Genomas
•Apollo www.gmod.org/apollo.shtml
•CMap www.gmod.org/cmap
•CMTV www.ncgr.org/cmtv
•Ensembl www.ensembl.org
•NCBI Map Viewer www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/
•PipMaker pipmaker.bx.psu.edu/pipmaker
•SOCKEYE www.bcgsc.bc.ca/sockeye
•UCSC Genome Browser www.genome.ucsc.edu
•VISTA www-gsd.lbl.gov/vista/
•ECR Browser ecrbrowser.dcode.org/
•Virtual Comparative Map rgd.mcw.edu/VCMAP
Con la secuenciación completa de genomas
se “reinventó” la Genómica Comparativa
Vertebrados
BACs
Shotgun
Margulies y Birney, 2008
Completa
Anotación de genomas
• Obviamente, para comparar genomas es extremadamente
importante identificar donde están localizados los genes
Genómica Comparativa
• La comparación entre genomas es una herramienta
adicional para la identificación de genes.
• Por otra parte, la identificación de genes es una
herramienta para la comparación de genomas.
Genes Candidato
Genes Candidato
El objetivo en los análisis del genoma de especies de interés
económico es identificar los genes responsables de los
caracteres de interés
Genes Candidato
Gen Candidato Biológico -Gen con una función biológica
conocida relacionada con el desarrollo o la fisiología del
carácter
Gen Candidato Posicional - gen mapeado previamente en una
región en la que se ha identificado un QTL
Gen Candidato Posicional comparativo - Gen candidato
mapeado en otra especie en una región de sintenia conservada
que corresponde a la región del QTL.
Genes Candidato
Metodología
1) Elección del gen candidato.
2) Obtención de secuencias (primers) para amplificar el gen.
3) Búsqueda de polimorfismos en genes candidatos.
4) Desarrollo de métodos de genotipado.
5) Identificación de poblaciones para el estudio de asociación.
6) Estudio de asociación del gen con el fenotipo.
7) Comprobación de asociaciones.
Genes Candidato
1) Elección del gen candidato
1) Aspectos biológicos o fisiológicos.
2) Efectos mutacionales en otras especies
3) Localización cromosómica
4) Localización en otras especies
Genes Candidato
2) Obtención de primers para PCR
•Información de secuencia en bases de datos:
-Genbank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
-EMBL
http://srs.ebi.ac.uk
•Información de distintas especies  secuencia consenso
•Software standard para:
-Comparar secuencias
-Diseño de primers
•Secuenciación del producto de PCR
Genes Candidato
3) Búsqueda de polimorfismos en genes candidatos
•Cualquier polimorfismo puede utilizarse (1/500pb)
Genes Candidato
4) Desarrollo de métodos de genotipado a gran escala
•PCR-RFLP
•SNPs:
Primer extension
Pirosecuenciación
Chips
Genes Candidato
5) Poblaciones para el estudio de asociación
•Cualquier población con variación genética
Variedades
Líneas comerciales
Líneas de selección
…
Genes Candidato
6) Comprobación de asociaciones
• Repetir el análisis en otros materiales
Ejemplo de Aproximación
por Gen Candidato
P
F1
F2
Ailés (T)
X
Riodeva (NT)
X
Riodeva (NT)
Genética de la tolerancia en centeno
1R
2R
3R
4R
5R
6R
7R
Alt4
Alt1
Alt3
Qatl5
Genes Candidatos
1. Colección de ESTs obtenidas de raíces de centeno
tratadas con Al.
2. Genes ya descritos con patrones de expresión
diferentes entre genotipos sensibles y tolerantes al Al.
3. Canales de exudación de ácidos orgánicos de arroz y
Arabidopsis.
Gen ScALMT1 de centeno: Localización
7RS
Alt1
M 1R 2R 3R 4R 5R 6R 7R 7RS 7RL CS CSI
ScALMT1 está en 7RS
I
M
MI
Gen ScALMT1 de centeno: Mapeo
M A
R
T
NT
M
7R
Alt1=ALMT1
MI
ScALMT1 está completamente ligado a Alt1
7RS
0
SCARQ4283
15
SCIM823853
SCIM8811422
23
25
26
27
28
29
OPO2984
SCIM8111376
OPO2633
OPO7666
SCIM8191434
OPQ4725
31
32
34
40
46
51
SCIM812626
59
OPJ171245
63
65
SCM40 OPF20483
SCM86
71
74
OPD1858
OPJ3857
79
82
84
SCIM810621
OPF20579
OPF20709
ScALMT1
OPQ4578
SCIM8121138
SCIM8232826
OPN1667
OPN1708
←Centromere
Transportador
de Malato
Gen ScALMT1 de centeno: Expresión
• ScALMT1 es inducido por Al en los ápices de la raíz
• Mayor expresión en las raíces de las plantas tolerantes
17
11
μmol/g-1
Nivel de expresión ScALMT1
23
3h
5
6h
9h
12h
24h
1
-1
NT
T
0 min
NT
T
30 min
NT
T
1 hora
NT
T
6 horas
NT
T
24 horas
Clonaje posicional, Genes Candidatos y
QTLs
QTLs
↑↑↑ generaciones
↑↑↑ número de individuos
↑↑↑ número de marcadores
↓
Análisis de Bloques Segregantes, NILs, RILs
Análisis de bloques segregantes (BSA)
Diferentes combinaciones de Genes y
Ambientes pueden ser responsables de los
fenotipos “extremos”
Mapas de alta resolucion para clonar un QTL
Análisis del caracter cuantitativo
Análisis de marcadores
Detección de QTLs y ligamiento
Relleno de huecos
(Más marcadores en la región)
Más individuos
(Más recombinantes en la region)
QTL de Espigado en arroz
Selección Asistida por Marcadores (MAS)
Los Caracteres de Interés y el apoyo en los
Marcadores Moleculares
Caracteres de interés
Gen Gen Gen Gen Gen
Estudio
Mejora
QTL QTL QTL QTL QTL
Marcadores estrechamente ligados
MAS
Uso de MMs estrechamente ligados a un carácter de
interés para sustituir o apoyar los test de campo
Asumimos que los MMs pueden predecir de
manera fiable el fenotipo para el carácter
MAS
P1
x
NT
P2
T
F1
F2
MAS
Utilidades de los MMs en Mejora
• Gestión y uso de los Recursos Genéticos
• Selección de los individuos mejores
• Transferencia de los factores genéticos a líneas élite
Retrocruzamiento asistido por MMs
Control segmento a introducir
Recuperación genotipo receptor
Ventajas
• Método rápido y “barato” de selección
• Selección en fases tempranas
• Fiabilidad
– No hay efectos ambientales
– Discriminación entre homocigotos y
heterocigotos
Selección del tipo de MM
•
•
•
•
•
•
Complejidad metodológica
Fiabiliadad
Grado de polimorfismo
Cantidady calidad del DNA necesario
Coste
...
Integración de la Tecnología Molecular en la Mejora
Vegetal
• Hay muchos artículos científicos sobre mapas y muy pocos
ejemplos de MAS
• Retos:
– Mejorar la comunicación entre Biólogos Moleculares y
Mejoradores
– Simplificar las tecnologías moleculares
– Abaratar los costes de los MMs
Aplicaciones de los marcadores moleculares al Análisis de
Genomas Vegetales:
1. Diversidad genética:
Evaluación de Germoplasma
Identificación y Protección Varietal
2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico:
Caracteres simples
Caracteres Complejos
MAPAS
Mapeo
Comparativo
Clonaje
Posicional
MAS